Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

تقدم هذه المخطوطة طريقة حقن صب مهندس microvessels أن ألخص الخصائص الفسيولوجية للالبطانة. العملية المستندة ميكروفلويديك تخلق شبكات الأوعية الدموية براءات الاختراع 3D مع الظروف tailorable، مثل تدفق والتكوين الخلوي، والهندسة، والتدرجات الكيميائية الحيوية. ووصف عملية التصنيع وأمثلة من التطبيقات المحتملة.

Abstract

في منصات المختبر لدراسة الخلايا البطانية والبيولوجيا الوعائية تقتصر إلى حد كبير إلى 2D زراعة الخلايا البطانية، وتدفق غرف مع البوليمر أو ركائز الزجاج مقرها، والمقايسات تشكيل أنبوب القائم على هيدروجيل. هذه المقايسات، في حين بالمعلومات، لا ألخص الهندسة التجويف، المصفوفة خارج الخلية المناسبة، والقرب عديد الخلايا، التي تلعب دورا رئيسيا في تحوير وظيفة الأوعية الدموية. توضح هذه المخطوطة طريقة الحقن لتوليد الأوعية هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة Microvessels من البذر الخلايا البطانية في قناة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من ضمن نوع أصلي أنا الكولاجين هيدروجيل. من خلال دمج الخلايا متني داخل المصفوفة الكولاجين السابقة لتوجيه تشكيل، microenvironments الأنسجة محددة يمكن أن تكون على غرار ودراستها. التحويرات إضافية من خصائص وسائل الإعلام الهيدروديناميكية تكوين تسمح للسيطرة على وظيفة الأوعية الدموية المعقدة داخل المكروية المطلوب.هذا البرنامج يسمح لدراسة توظيف ماحول الأوعية الخلايا، التفاعلات الدم البطانة، استجابة التدفق، والتفاعلات الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة. microvessels هندسيا توفر القدرة على عزل تأثير من المكونات الفردية من مكانة الأوعية الدموية وعلى وجه التحديد المكافحة الكيميائية والميكانيكية والخصائص البيولوجية لدراسة علم الأحياء الأوعية الدموية في كل من الصحة والمرض.

Introduction

في الأوعية الدموية الدقيقة في كل جهاز يساعد على تحديد المكروية الأنسجة، والحفاظ على توازن الأنسجة وتنظيم التهاب، النفاذية، تخثر الدم، وانحلال الفيبرين 1،2. البطانة الاوعية الدموية الدقيقة، على وجه الخصوص، هو واجهة بين تدفق الدم والأنسجة المحيطة بها، وبالتالي تلعب دورا حاسما في تحوير الأوعية الدموية وظيفة الجهاز استجابة للمؤثرات مثل القوات الهيدروديناميكية والسيتوكينات تعميم والهرمونات 3-5. فهم التفاعلات مفصلة بين البطانة، والدم، والمكروية الأنسجة المحيطة هامة لدراسة البيولوجيا الوعائية وتطور المرض. ومع ذلك، فقد أعاقت التقدم في دراسة هذه التفاعلات التي تقتصر في أدوات المختبر التي لا ألخص في بنية الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وتعمل 6،7. ونتيجة لذلك، اعتمدت الميدان والتقدم العلاجي بشكل كبير على تكلفة وقت-تستهلك النماذج الحيوانية التي غالبا ما تفشل في ترجمة النجاح في البشر 8-10. بينما في النماذج الحية لا تقدر بثمن في دراسة آليات المرض وظائف الأوعية الدموية، فهي معقدة وغالبا ما تفتقر إلى مراقبة دقيقة من الأفراد الخلوي، والكيمياء الحيوية، والعظة الفيزيائية الحيوية.

الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجسم يمتلك بنية هرمية ناضجة بالتعاون مع أسرة الشعرية توسعية، وتوفير نضح الأمثل ونقل المواد الغذائية في وقت واحد 11. في البداية، أشكال الأوعية الدموية كما ضفيرة البدائية التي تعيد ترتيب لشبكة متفرعة هرميا خلال التنمية في وقت مبكر 12،13. على الرغم من أن العديد من إشارات تشارك في هذه العمليات مفهومة جيدا 14-16، فإنه لا يزال بعيد المنال كيف يمكن لهذا يتم تحديد الزخرفة الوعائية 15. بدوره، تلخص هذه العملية في المختبر لمهندس شبكات الأوعية الدموية المنظمة لديها النحلن العديد من في المختبر المنصات الموجودة صعبة. لنموذج الأوعية الدموية، مثل اثنين من الأبعاد مزارع الخلايا البطانية، تفتقر إلى الخصائص المهمة مثل القرب عديد الخلايا، ثلاث الهندسة اللمعية الأبعاد، تدفق، والمصفوفة خارج الخلية. وقد استخدمت 19 أو غزو المقايسات 20،21 لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في 3D وتفاعلاتها مع غيرها من الأوعية الدموية 17،22 أو خلية الأنسجة أنواع 23 - أنبوب المقايسات تشكيل في الهلاميات المائية 3D (الكولاجين أو الفيبرين) 17. ومع ذلك، وتجميعها شمعة في هذه المقايسات تفتقر إلى الترابط، وتدفق الدورة الدموية، ونضح المناسب. وعلاوة على ذلك، والميل للتراجع الأوعية الدموية في هذه أنبوب المقايسات تشكيل 24 يمنع الثقافة على المدى الطويل والنضج مما يحد من درجة الدراسات الفنية التي يمكن القيام بها. وبالتالي، هناك حاجة المتزايدة لمهندس في المختبر منصات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي يمكن أن نموذج بشكل مناسب أونdothelial خصائص وقابلة للثقافة على المدى الطويل.

ظهرت مجموعة متنوعة من تقنيات الهندسة الأوعية الدموية على مر السنين للتطبيقات الطبية لاستبدال أو السفن تجاوز المتضررة في المرضى الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية. وكان سفن القطر كبيرة مصنوعة من مواد تركيبية مثل البولي اثيلين البولي (PET)، وتترافلوروإيثيلين (EPTFE) نجاح علاجي كبير مع طويلة المدى المباح (متوسط ​​95٪ المباح أكثر من 5 سنوات) 25. على الرغم من القطر الصغير الطعوم الاصطناعية (<6 ملم) تواجه عادة مضاعفات مثل تضخم باطنة وتكون الصفيحات 26 - 28، الأنسجة المهندسة الطعوم صغيرة قطرها المصنوع من المواد البيولوجية قد حققت تقدما كبيرا 29،30. وعلى الرغم من التقدم من هذا النوع، وظلت السفن هندسيا على الميكروسكيل تحديا. لنموذج بشكل كاف الأوعية الدموية الدقيقة، فمن الضروري لتوليد أنماط شبكة معقدة مع SUFficient القوة الميكانيكية للحفاظ على المباح ومع تكوين مصفوفة التي تسمح لكل من نفاذ المواد الغذائية للخلايا متني وإعادة عرض الخلوية.

ويعرض هذا البروتوكول الاصطناعية شبكة الأوعية perfusable الرواية التي يحاكي مواطن في الجسم الحي وضع مع الانضباطي والسيطرة عليها المكروية 31-34. الطريقة الموصوفة يولد microvessels هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة microvessels التي صممتها perfusing الخلايا البطانية من خلال قناة ميكروفلويديك مضمن ضمن نوع لينة أنا الكولاجين هيدروجيل. هذا النظام لديه القدرة على توليد شبكات نمط مع هيكل اللمعية مفتوحة، وتكرار التفاعلات متعددة الخلايا، تعدل خارج الخلية تكوين مصفوفة، وتطبيق قوات الدورة الدموية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التصنيع الدقيق من منقوشة ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع تصميم شبكة

  1. رقاقة تلفيق لإنشاء قالب سلبي من تصميم شبكة
    1. خلق نمط الشبكة باستخدام أي تصميم (CAD) البرمجيات بمساعدة الكمبيوتر. تأكد من أن البعد قطري بين مدخل ومخرج تطابق المسافة بين مدخل ومخرج الخزانات على الأجهزة السكن في الخطوات المستقبلية (انظر 2.1.1).
      ملاحظة: تصميم نمط نفسها اعتمادا الجمركية على أهداف بحثية محددة من قبل المستخدم (انظر الشكل 1 على سبيل المثال أنماط).
    2. توليد قناع نمط الشبكة باستخدام عالية الدقة الطباعة أو طلب الضوئية الرئيسية الكروم من مورد تجاري. بروتوكول أكثر تفصيلا لعملية ضوئيه متاح في أماكن أخرى 35.
    3. تنظيف ويفر 8 "السيليكون لمدة 5 دقائق في 100 واط مع العلاج الأكسجين البلازما.
    4. صب ما يكفي من مقاومة للضوء سلبي (SU-82100 يعمل بشكل جيد) على الرقاقة بحيث مقاومة أشكال وجبة بوظة مع قطر 2.5 سم. باستخدام المغطي تدور، وتدور الرقاقة عند 500 دورة في الدقيقة مع 100 دورة في الدقيقة / ثانية منحدر وصيانة لمدة 10 ثانية. ثم المنحدر حتى 1600 دورة في الدقيقة مع 300 دورة في الدقيقة / ثانية، والحفاظ على لمدة 30 ثانية. ملاحظة: سرعة ومنحدر تحتاج إلى الأمثل لكل حالة المختبر أن تسفر عن مقاومة سماكة 150 ميكرون.
    5. لينة خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، المنحدر تصل إلى 95 درجة مئوية مع 360 ° C / ساعة، والحفاظ على لمدة 45 دقيقة. تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة على طبق ساخن. بصمة نمط السفينة على الرقاقة المغلفة عن التعرض إلى 365 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية تحت الضوئية الرئيسية الكروم، مع التعرض ثلاثة أضعاف ذلك من توصية الشركة الصانعة (350 ميغا جول / سم 2 لسمك SU-8 من حوالي 150 ميكرون).
      ملاحظة: منذ SU-8 هو سلبي مقاومة، فإن المناطق التي تعرضت (كل شيء ما عدا تصميم نمط) تصبح غير قابلة للذوبان للمطور في الخطوة 1.1.7.
    6. من الصعب خبز الرقاقة يتعرض في 65درجة مئوية لمدة 5 دقائق والطريق المنحدر تصل إلى 95 درجة مئوية مع 360 ° C / ساعة وصيانة لمدة 25 دقيقة، ثم السماح لتبرد ببطء إلى RT على طبق ساخن.
    7. تزج الرقاقة في SU-8 المطور ل10-15 دقيقة ليغسل غير مصورة مقاومة، ثم نظيفة مع ايزوبروبيل والجافة تحت تدفق النيتروجين المضغوط. افحص النقش تحت المجهر الضوئي لضمان المستعبدين جيدا إلى الرقاقة على SU-8 مقاومة (ابحث عن تقشير غير المرغوب فيها وفقاعات).
    8. قياس سمك ميزات نمط باستخدام profilometer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 36. خلال اكتساب القياس، وتجنب مناطق هيكل التي لا غنى عنها من أجل وظيفة شبكة (أي مدخل ومخرج قنوات) باعتباره profilometer الاتصال القائم يمكن أن تهدد سلامة الهيكلية للميزات نمط على الرقاقة. بدلا من ذلك، استخدام أسلوب عدم الاتصال (أي profilometer البصرية) لتجنب هذه المشكلة تماما.
  2. شركة جنرال الكتريكneration من منقوشة وشقة لقوالب صب الكولاجين
    ملاحظة: التعامل مع silanes داخل غطاء الدخان الكيميائية.
    1. وضع رقاقة في مجفف مع 100 ميكرولتر من ثلاثي كلورو (3،3،3-trifluoropropyl) سيلاني لمدة 2 ساعة لsilanize السطح.
    2. نقل رقاقة silanized إلى 120 × 120 مم مربع طبق بيتري. صب وكيل المختلط وبالغاز دي PDMS المطاط الصناعي وعلاج (10: 1 ث / ث نسبة) على الرقاقة لتحقيق 4-6 مم سماكة. صب PDMS إضافية إلى 120 × 120 ملم مربع طبق منفصل بيتري لتوليد القوالب المسطحة دون الأنماط. علاج عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. تخرج من الفرن والسماح للPDMS ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام مشرط قطع بعناية مربع حول SU-8 وقشر ببطء قبالة العفن PDMS من رقاقة. تقليم حواف إلى 30 ملم × 30 ملم. لقوالب مسطحة، وقطع الشفاء PDMS دون نمط مطبوع إلى قطع مربعة حوالي 40 ملم × 40 ملم.

2. أجهزة الإسكان

  1. Fabricatأيون من أعلى وأسفل قطعة الإسكان
    1. افتعال الإسكان سفينة باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA). الى افتعال، تأمر أجزاء من متجر للآلات القياسية مع العددية الكمبيوتر التي تسيطر عليها (CNC) قدرات الطحن. انظر الشكل 1 لالتخطيطي من القطع العلوية والسفلية.
    2. تصميم قطعة أعلى الإسكان (1D الشكل) لتشمل 20 ملم × 20 ملم بشكل جيد على الجانب السفلي من الجهاز وعلى عمق 1 ملم، واثنين من منافذ حقن الكولاجين (قطر 4 مم) في الجزء العلوي من الجهاز الموجود في زوايا من الساحة جيدا، وهما مدخل ومخرج الخزانات مع 6 أقطار ملم، وأربعة ثقوب المسمار (مم 3) في الأركان الأربعة للجهاز.
      ملاحظة: قد يتم حفر ثقوب إضافية على هامش قطعة لأغراض التعامل معها.
    3. تصميم قطعة سكنية السفلي (الشكل 1E) لتشمل ثقب مربع في الوسط (أبعاد 15 ملم × 15 ملم) مع المحيطة 25 ملم × 25 ملمالرف وعلى عمق 0.25 مم. حفر 4 فتحات المسامير مع 4-40 الموضوع. ضمان فتحات المسامير في الجزء السفلي، ووأعلى القطع محاذاة معا خلال الخطوات التجمع في المستقبل.

3. Microvessel تصنيع الأجهزة

  1. إعداد المواد
    1. غسل وتعقيم مجموعتين من ملاقط، ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ، وهو سائق المسمار شقة صغيرة، ومسامير الصلب غير القابل للصدأ، والعديد من دبابيس وتد الفولاذ المقاوم للصدأ. لتصنيع السفن، كما الأوتوكلاف قوالب PDMS micropatterned، PDMS الساحات مسطحة، coverslips الزجاج (22 × 22 ملم)، وقطع القطن.
    2. تعقيم القطع PMMA السكن في التبييض لمدة لا تقل عن 1 ساعة، ثم يشطف بالماء تعقيمها في نسيج الثقافة هود مرتين، والسماح للهواء الجاف في أطباق زراعة الأنسجة عقيمة (150 ملم × 25 ملم).
  2. معقم Polyethyleneimine-غلوتارالدهيد (جزيرة الأمير إدوارد - GA) طلاء
    1. علاج الآبار الداخلية للتعقيم قطع PMMA الجافةمع البلازما لحوالي 1 دقيقة. إضافة 1٪ Polyethyleneimine (PEI) على الآبار الداخلية (20 ملم جيدا مربع على أعلى والجرف مربع 25 ملم على الجزء السفلي) من القطع PMMA لمدة 10 دقيقة. شطف مع العقيمة H 2 O والسماح ليجف في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: الوقت اللازم للعلاج البلازما هي متغيرة تبعا الجهاز المستخدم - يجب على جزيرة الأمير إدوارد ينتشر بسهولة مما يدل على سطح ماء. إذا لم يكن كذلك، قد يكون من الضروري معالجة البلازما إضافية.
    2. تطبيق 0.1٪ غلوتارالدهيد (GA) على جزيرة الأمير إدوارد تعامل أسطح القطع PMMA لمدة 30 دقيقة. شطف مرتين مع الماء المعقم والسماح ليجف.
      ملاحظة: في الخطوات المستقبلية، والكولاجين التمسك السطح المطلي من خلال يشابك الكولاجين غلوتارالدهيد. هذا يساعد على تأمين هلام في مكان داخل الجهاز أثناء خطوات الجمعية في المستقبل وطوال الفترة الثقافة الجهاز.
  3. إعداد جل الكولاجين
    1. صنع السفن التي تستخدم 0.6٪ - 1٪ الكولاجينالحلول. لجعل 0.75٪ الكولاجين لتصنيع السفن، ومزيج من النوع الأول الكولاجين حل سهم (1.5٪ - معزولة عن الفئران ذيول 37) مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، 10X وسائل الإعلام الملحق (M199)، وسائل الإعلام والثقافة الخلية. إبقاء جميع الحلول على الجليد.
    2. تحديد حجم الكولاجين عن طريق المعادلة التالية، حيث V ƒinal هو الحجم النهائي من هلام المطلوبة (عادة 1 مل من الكولاجين في الجهاز هي كافية)، والخامس الكولاجين الأسهم هو حجم الكولاجين الأسهم المطلوبة، والكولاجين الأسهم C هو تركيز من الكولاجين الأوراق المالية، وC ƒinal الكولاجين هو التركيز المطلوب من الكولاجين في السفينة.
      المعادلة 1
    3. استخدام حقنة 1 مل لنقل حجم مناسب من الكولاجين الأسهم إلى 30 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تحديد كميات من هيدروكسيد الصوديوم تحييد (V هيدروكسيد الصوديوم)، M199 10X ملحق سائل الإعلام(V 10 X)، وسائل الإعلام والثقافة الخلية (V 1 X) على النحو التالي وتخلط بشكل منفصل في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل:
      المعادلة 2
    4. يضاف خليط من تحييد الكواشف (V 10 X، V هيدروكسيد الصوديوم، V 1 X) إلى الكولاجين aliquoted، واستخدام ملعقة صغيرة من المزيج بلطف الحل حتى يتم الحصول على هلام متجانسة. تجنب إدخال فقاعات عن طريق اثارة ببطء وبلطف.
    5. لدمج الخلايا في المصفوفة على التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 0،5-20٬000٬000 خلية / مل)، إضافة الخلايا إلى حل الكولاجين بعد مزجه مع الكواشف تحييد، والاستمرار في اثارة حتى يتم توزيع خلايا متجانس.
    6. عندما تضاف الخلايا، وضبط حجم وسائل الإعلام ثقافة الخلية لاستيعاب الحجم الإضافي، على النحو الذي تحدده المعادلة التالية، حيث خلايا V </ دون> هو حجم المطلوب من تعليق الخلية، C كثافة الخلايا ƒinal هي كثافة المطلوب من الخلايا في السفينة، والكثافة C تعليق خلية هي كثافة الخلايا في المحلول.
      المعادلة 3
  4. الكولاجين حقن - قطعة الأعلى
    1. مكان القالب PDMS micropatterned في 100 ملم × 20 ملم طبق. البلازما تنظيف العفن PDMS لمدة 1 دقيقة.
    2. محاذاة قطعة أعلى PMMA على رأس القالب PDMS بحيث الخزانات مربع على العفن هي التي تخضع مباشرة لمدخل ومخرج الخزانات (انظر الشكل 1D - الخطوط المتقطعة). وضع المقاوم للصدأ المسامير الفولاذية وتد في مدخل ومخرج الثقوب الخزان على رأس PMMA قطعة للحفاظ على وصول واضح من الخزانات إلى نمط.
    3. استخدام حقنة 1 مل لاستخراج ~ 0،5-0،6 مل الكولاجين. ضمان بقاء عدم وجود فقاعات في المحقنة.
    4. اضغط لأسفل لightly مع ملاقط على السكن كبير لضمان اتصال مطاردة بين قطعة العلوي والعفن PDMS. حقن الكولاجين ببطء من خلال منفذ الحقن في أعلى PMMA قطعة. تأكد من الكولاجين يملأ في 20 ملم نطاق × 20 مم فوق نمط ولا يتسرب.
    5. إغلاق طبق دون تتصارع المسامير وتد والسماح لهلام في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. حقن الكولاجين - قطعة القاع
    1. وضع ساترة زجاج 22 × 22 مم في وسط أسفل قطعة. استخدام حقنة 1 مل الاستغناء ~ 0.25 مل الكولاجين بالتساوي على شريحة زجاجية. انخفاض بلطف PDMS مربع مسطح على الكولاجين، وضمان PDMS مسطح ضد PMMA وعدم وجود فقاعات المحاصرين. السماح لهلام في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. الجمعية الجهاز
    1. بعد دبق، إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني حول قطعة PDMS شقة في أسفل قطعة لتطويق PDMS (حوالي 1 مل). استخدام ملاقط لإزالة أي بريدxcess الكولاجين حول الحواف، وببطء تقشر قطعة PDMS. إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني على رأس الكولاجين للحفاظ على الماء.
    2. لإعداد أكبر قطعة، استخدام ملاقط لالتقاط أكبر PMMA قطعة واقلبها بحيث القالب PDMS على أعلى. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني إلى الواجهة، ثم سرعان ما وإزالة بحزم العفن PDMS من كبار PMMA قطعة.
    3. إزالة بلطف دبابيس الصلب غير القابل للصدأ المسمار من الجانب الآخر من PMMA الإسكان باستخدام زوج آخر من الملقط. إضافة عدة قطرات أكثر من برنامج تلفزيوني على الكولاجين micropatterned. الوجه PMMA قطعة أعلى أكثر من ذلك أن يواجه الكولاجين أسفل ووضع 4 مسامير في الثقوب الزاوية.
    4. وضع بلطف قطعة كبار على رأس قطعة القاع، ومواءمة مسامير مع ثقوب الزاوية على قطعة القاع. لا تسمح قطعتين إلى الانزلاق ضد بعضها البعض. استخدام مفك البراغي لتشديد الخناق استخدام لمسة رقيقة. لا تبالغ.
    5. نضح في برنامج تلفزيوني المحيطة السطوح PMMA ووضع بي الصغيرةاللجنة الاقتصادية لأوروبا من القطن تحت حافة واحدة من الجهاز. باستخدام ماصة، وإزالة أي برنامج تلفزيوني من الخزانات واستبدالها مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية. ودع الجهاز حتى هلام معا في الحاضنة 37 درجة مئوية على الأقل 1 ساعة.
  7. البذر الخلية
    1. ثقافة الخلايا البشرية الوريد السري البطانية (HUVECs) في وسائل الإعلام نمو بطانة عند 37 درجة مئوية (CO 2، O 2) لconfluency 38. كلما أمكن ذلك، استخدم بين الممرات 4 و 7.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا البطانية عن طريق غسل القارورة الثقافة مع 6 مل من برنامج تلفزيوني ثم إضافة 2 مل من التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا. ترك الخلايا في التربسين حتى أكثر من الالتصاقات البؤرية يكون فصل ويتم تقريب الخلايا حتى (وهذا يستغرق عادة حوالي 2-3 دقائق). وقف رد الفعل التربسين بإضافة 4 مل من وسائط النمو البطاني المحتوية على مصل بقري جنيني (FBS). غسل القارورة مع وسائل الإعلام عدة مرات للتأكد من فصل الخلايا من القارورة وجمعفي أنبوب مخروطي الشكل.
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات و resuspend لهم في مناطق ذات كثافة من 10 مليون خلية لكل مليلتر. إزالة كافة وسائل الإعلام ثقافة الخلية من مدخل ومخرج الخزانات. باستخدام 200 ميكرولتر طرف جل التحميل وإضافة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في وسط الخزان مدخل. وينبغي أن تبدأ الخلايا في التدفق إلى شبكة فورا ومعطف الشبكة.
    4. إضافة 200 ميكرولتر وسائل الإعلام بشكل متساو على كل من الخزانات والسماح خلايا نعلق وانتشرت داخل الشبكة لا يقل عن 1 ساعة.
  8. الثقافة الجهاز
    1. ثقافة الجهاز مع تدفق الجاذبية مدفوعة من خلال شبكة من خلال إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى خزان مدخل و 50 ميكرولتر إلى خزان منفذ. مع هذا الأسلوب الثقافة واستبدال وسائل الاعلام كل 12 ساعة للمحافظة على سلامة بطانة الأوعية الدموية.
      ملاحظة: إذا كانت الظروف الثقافة التدفق المستمر مرغوبة (للحفاظ على إجهاد القص المستمر، وجمع وسائل الاعلام عند مخرج، الخ) وSYRويمكن استخدام إنجي مضخة بدلا من ثقافة الجاذبية مدفوعة.
    2. السماح للخلايا البطانية المصنف 24 على الأقل ساعة لنعلق وتستقر قبل تطبيق التدفق المستمر. قبل الإعداد تدفق مستمر، والحفاظ على الأجهزة مع خطورة مدفوعة ظروف التدفق.
      ملاحظة: شروط وسائل الاعلام لتدفق التطبيقية تختلف من ثقافة الجاذبية مدفوعة. إضافة المتوسع البلازما، مثل ديكستران، إلى وسائل الإعلام تستقر microvessels هندسيا ويمنع انهيار الأوعية الدموية خلال نضح المستدام 39.
    3. جعل وسائل الإعلام من أجل الإعداد تدفق مستمر، حل 3.5٪ ديكستران (70 كيلو دالتون) في وسائل الإعلام نمو بطانة للثقافة سفينة المثلى. باستخدام تقنية معقمة، وملء 10 مل المحاقن مع وسائل الاعلام نمو الخلايا البطانية مع 3.5٪ ديكستران.
    4. إعداد طبق ثقافة عقيمة لتدفق ذوبان ثقوب في الجدار الجانبي من طبق بيتري باستخدام حام الحديد.
    5. نعلق 12 "السيليكون أنابيب (1/32" ID) لقفل اقتران لور (أنثى، 1/16 "ID)، و 1 /16 "على التوالي أنبوب موصل إلى أنبوب مع 1" جزء من الأنابيب على الطرف الآخر. إدراج "إبرة حادة 20G (بعيدة عن محور إبرة) إلى نهاية خالية من 1" 1/4 القطاع. أيضا بإعداد "الجزء 3 من أنابيب موصولة إلى أنبوب إلى أنبوب 90 درجة موصل الكوع مشتركة (لتركيبها في مدخل السكن). وفي خطوات لاحقة، سيتم الخيوط أنابيب أطول من خلال طبق استعداد وتعلق على 3 "الجزء عن طريق إبرة G 20. أنابيب المخرج يجب أن تعكس أنابيب مدخل، مع نهاية خالية بدلا من قفل اقتران لور. الأوتوكلاف جميع شرائح قبل استخدامها.
    6. كاتب الموضوع مدخل تعقيمها وأنابيب مخرج من خلال ثقوب في الطبق المعد. نعلق 3 "شرائح لالداخلية 20 الإبر G. إرفاق قفل اقتران لور إلى حقنة مليئة سائل الإعلام ويروي وسائل الاعلام من خلال الأنبوب باستخدام ضخ حقنة وضعت في معدل تدفق عالية. تأكد من عدم وجود فقاعات في أنابيب أو وصلات، وهذه سوف تعيق تدفق للسفينة.
    7. إدراج جonnector مشتركة في مدخل السكن. تعيين ضخ حقنة لمعدل التدفق المطلوب والبدء نضح.
      ملاحظة: هذه يمكن تعديلها تبعا لهندسة السفن والظروف التجريبية من اجهادات القص المطبقة. لقناة قطر 100 ميكرون، ومعدل التدفق من 3 ميكرولتر / دقيقة يعمل بشكل جيد.
    8. إذا رغبت في ذلك، وجمع سائل الإرواء مع أنابيب منفذ استعداد إدراجها في العقيمة البوليسترين 5 مل أنبوب أسفل جولة تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
      ملاحظة: يتم إضافة كمية صغيرة من وسائل الإعلام إلى أنبوب جمع لمنع تشكيل فقاعة التي يمكن منع التدفق.
    9. اعتمادا على معدل التدفق، قد تحتاج إلى إعادة ملئها بعد 24 إلى 36 ساعة الحقنة. ويتم ذلك عن طريق إزالة الموصل من مدخل السكن، لتحل محل حقنة، والسماح لوسائل الإعلام ليروي بمعدل تدفق عالية لعدة دقائق. هذا التسلسل يضمن أن الفقاعات لا أدخلت على الأنابيب. إعادة تعيين المضخة إلى معدل التدفق المطلوب للثقافة وإدراج الموصل في مدخل السكن، والعودة إلى الحاضنة.

تحليل 4. جهاز

  1. تحليل نفاذية
    1. استخدام 40 كيلو دالتون FITC-ديكستران لتصور نفاذية السفينة في الموقع. وضع الإسكان سفينة على المجهر متحد البؤر والتركيز على الطائرة السفينة. إضافة 5 ميكرومتر 40 كيلو دالتون FITC-ديكستران إلى مدخل والصورة في 4X التكبير، 25 مللي ثانية وقت التعرض، وفي 1 إطار في الثانية لمدة 10 دقيقة.
    2. تحليل سلسلة صورة مع رمز تحليل لتقدير نفاذية ديكستران عبر جدار الوعاء الدموي في الكولاجين (ميكرون / ثانية) على أساس نموذج نشرتها تشنغ وآخرون. آل 31.
  2. تحليل المناعية ومتحد البؤر التصوير
    1. لإصلاح السفن، يروي مع 3.7٪ الفورمالديهايد من خلال مدخل لمدة 20 دقيقة ويغسل من قبل perfusing برنامج تلفزيوني ثلاث مرات (20 دقيقة لكل غسل). كتلة الأجسام المضادة غير محدد ملزم مع 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.5٪ تريتون X-100 بيrfused من خلال الشبكة لمدة 1 ساعة. يروي حلول الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يروي حلول الأجسام المضادة الثانوية 1 - 2 ساعة، ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني بنفس الطريقة.
    2. التقاط صور المناعي من microvessels في الموقع باستخدام المجهر متحد البؤر مع خطوة ض 1 ميكرون. صورة microvessels في التكبير من 4X، 10X، أو 20X.
      ملاحظة: سوف التكبير من 4X تقديم معلومات هيكل الشبكة العالمية، في حين 10X 20X والصور المكبرة ستقدم تفاصيل الخلوية مثل استطالة، وتشكيل تقاطع، الخ.
    3. تحليل مداخن صورة باستخدام يماغيج مع التوقعات Z (صورة / الأكوام / Z-المشروع)، المقاطع العرضية (صورة / عرض الأكوام / متعامد)، وإعادة البناء 3D (صورة / الأكوام / مشروع 3D).
  3. المجهر الإلكتروني التصوير
    1. لتحليل المجهر الإلكتروني، وتحديد في الموقع من قبل perfusing نصف القوة سول Karnovsky لution (2٪ امتصاص العرق / 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.2 م العازلة كاكوديلات) بين عشية وضحاها. تفكيك السفينة وفصل بعناية قطعتين. تقليم حواف وتزج تماما في حل تثبيتي لعدة أيام.
    2. تزج الجزء العلوي سميكة من السفينة في 25٪ غلوتارالدهيد لمدة 20 دقيقة وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (2 دقيقة لكل منهما). يذوى في يغسل الإيثانول المسلسل من 50٪، 70٪، 85٪ (2 دقيقة لكل منهما) واثنين من يغسل في الإيثانول٪ 100 (5 دقائق لكل منهما).
    3. تحضير العينة للتحليل مع مزيد من الجفاف عن طريق التجفيف نقطة حرجة بعد بروتوكول الشركة المصنعة 40. تفل معطف السفينة مع الذهب والبلاديوم (7 نانومتر) وتحليل تحت المجهر الإلكتروني الماسح مع الجهد المتسارع لل5 كيلو فولت، حجم البقعة 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

منصة سفينة المهندسة يخلق الأوعية الدموية الدقيقة وظيفي جزءا لا يتجزأ من ضمن نوع الكولاجين الطبيعي أنا المصفوفة، ويسمح لرقابة مشددة من البيئة الخلوية، الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية في المختبر. لافتعال microvessels هندسيا، و perfused الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) من خلال شبكة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من الكولاجين حيث نعلق على تشكيل التجويف براءات الاختراع والبطانة متموجة. كما هو موضح في الشكل 1A-C، هندسة السفن يمكن أن تكون مصممة خصيصا للرد على أسئلة بشأن معدل التدفق، تعرج، والمتفرعة الزوايا وغيرها. تحوير معدل التدفق من خلال microvessels رؤية ثاقبة لالقص الإجهاد استجابة الخلايا البطانية. سابقا، وقد تم التركيز في المقام الأول على تصنيع السفن في حدود 100 ميكرون الحجم، ولكن microvessels يصل إلى 500 ميكرون أو، في بعض الحالات، صغيرة مثل 50 ميكرون في القطر كانت succجعل essfully ومثقف. وترد أمثلة من المباح المدى الطويل وكذلك بقاء microvessels مثقف تحت تدفق الجاذبية يحركها (الشكل 2A) وتدفق التطبيقي المستمر (الشكل 2B). يمكن أن يظهر خصائص في الجسم الحي تشبه من microvessels هندسيا في عدة طرق. ويمكن قياس وظائف البطانية المختلفة باستخدام هذه المنصة، بما في ذلك وظيفة الحاجز (الشكل 3A)، والتفاعلات خلية خلية والإنذار (الشكل 3B)، وإعادة عائية (الشكل 3C). وهناك ميزة هامة من هذه microvessels هي قدرتها على الاستجابة للمحفزات للالتهابات وذلك بطريقة مناسبة من الناحية البيولوجية. ويتجلى هذا أفضل من خلال تفاعلها مع الدم كله في الشكل 4A-C حيث البطانة غير المفعلة هي هادئة (الشكل 4B) والبطانة تنشيط يدفع تشكيل خثرة (الشكل 4C). بواسطة زراعة الخلايا البطانية ديffering أصول في هذا المنبر، فمن الممكن أن نفهم عدم التجانس الوظيفي بين الخلايا البطانية من مصادر مختلفة. الشكل 5A-C يوضح مثال على هذا التجانس مع اثنين من مختلف الجذعية أنواع الخلايا البطانية المشتقة من خلية عند المثقف في عرض نظام microvessel الظواهر المختلفة بشكل كبير 41. من خلال ضبط التشكيلات التدفق، وتكوين الخلايا، والظروف والثقافة، وتوفر microvessels المهندسة قوية في أداة المختبر لدراسة البيولوجيا البطانية والأوعية الدموية الدقيقة في كل من الصحة والمرض.

شكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي للشبكة تصاميم وبروتوكول متناهية التصنيع، وهندسة شبكة الأوعية الدموية يمكن أن تكون مصممة خصيصا لتوليد أنماط التدفق مختلفة. أ. على سبيل المثال، تصميم متفرعة وانخفضت فلوريدامعدلات آه بالقرب من المركز (تخفيض 8 أضعاف في 3 من 3 الشبكة) مما أدى إلى مناطق إجهاد القص المتنوع على البطانة داخل السفينة نفسها 31. ب. وشبكة متفرعة للغاية تتبع نفس المبدأ التصميم السابق ولكن مع الضفيرة أكبر. مع هذا التصميم، والآثار المترتبة على انخفاض بنسبة 50 أضعاف في معدل التدفق، مما أدى إلى انخفاض معدل القص 10-500 ثانية -1 يمكن ملاحظتها عند تطبيق انخفاض ضغط 1000 با عبر الشبكة 32. C. تصاميم أكثر تعقيدا مثل شبكة مضنية مع زوايا حادة 32 يمكن استخدامها للرد على أسئلة بشأن استجابة البطانية إلى انقطاع تدفق الصفحي، والتي غالبا ما تحدث في ظروف مرضية 42. سوف Microvessels المصنوعة من هذه الأنماط وقطرها من 100 - 150 ميكرون D. هناك ثلاث خطوات رئيسية خلال تلفيق متناهية. أولا، يتم وضع الجزء العلوي من رقصة الإسكان على رأس الحركة الديمقراطية الشعبيةS نمط القالب الشبكة بحيث مدخل ومخرج والانحياز. أنا الكولاجين ثم يتم حقنها في مكان مغلق من خلال الموانئ حقن (السهم الأسود). عادة، يتم استخدام 0.75٪ الكولاجين أنا الخليط لتلفيق. ناجح microvessel تلفيق لا يمكن أن يتحقق مع ما يصل الى 0.6٪ الكولاجين، ولكن أقل من 0.6٪ النتائج عادة في القوة الميكانيكية كافية وانهيار قناة. يضاف E. طبقة رقيقة من الكولاجين لأسفل قطعة على رأس ساترة، وسوت مع قطعة PDMS آخر. F. بعد دبق عند 37 درجة مئوية، وثمل في PDMS تتم إزالة قوالب والعلوية والسفلية الرقص السكن معا أن أرفق الشبكة. انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
> الشكل 2. Microvessels مثقف مع لمحات تدفق التحكم. المصنفة A. HUVECs في microvessels مثقف تحت خطورة تدفق مدفوعة وB. تطبيق تدفق مستمر بمعدل 3 ميكرولتر / دقيقة. ويتحقق الثقافة تحت تدفق تطبيق أفضل مع إضافة 3.5٪ ديكستران إلى وسائل الإعلام وهو ما ثبت لتحقيق الاستقرار microvessels المعتمدة على الكولاجين ميكروفلويديك من خلال ممارسة الضغوط المادية داخل تجويف التي تعزز تشكيل تقاطع، على الرغم من أن الآلية الدقيقة يقود هذا التأثير غير واضح 39 . كانت ملطخة Microvessels لCD31 البطانية البروتين تقاطع أو مجموعة من التمايز 31 (الحمراء)، وعامل فون ويلبراند (VWF) حبيبات (الخضراء). A '، ب'. وفي كل الظروف، أعرب HUVECs علامات البطانية من التقاطعات خلية خلية وVWF حبيبات. أ "، ب". اظهار اراء المتعامدة براءات الاختراع وشمعة مدورة بعد 6 أيام في الثقافة.arge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المهندسة Microvessels لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية. ويمكن تقييم A. وظيفة حاجز غشائي بعد نضح من FITC (فلوريسئين ثيوسيانات) -conjugated ديكستران من خلال شبكات (أعلى) والقياس اللاحق من انتشارها في الكولاجين بالجملة (القاع). باستخدام تعليمات برمجية مخصصة، وأشرطة الفيديو من نضح يمكن تحليلها لرسم كثافة بكسل على المنطقة من اهتمام في إطار بمرور الوقت لتحديد K معامل نفاذية (ميكرون / ثانية) من FITC-ديكستران. وقد أظهرت المنشورات السابقة من قبل مختبر أن نفاذية هذه السفن هندسيا هي مماثلة لتلك التي خارج الحي الثدييات السفن 31،43. ب. تفاعلات الخلايا البطانية مع perivويمكن تحليل ascular أو دعم الخلايا في هذا المنبر عن طريق تحوير تكوين الخلايا من مصفوفة الكولاجين. هنا، يمكن رؤية مثال على هذه التفاعلات خلية خلية عندما يتم تضمين الخلايا العضلية الملساء داخل الكولاجين المحيطة السفن. بعد 14 يوما في الثقافة، وخلايا العضلات الملساء (الملون لالأكتين ألفا العضلات الملساء (αSMA) باللون الأخضر) الزميلة مع البطانة وتوسيع العمليات على طول جدار الوعاء الدموي وتعمل الخلايا كما المحيطة بالأوعية كما رأينا في الإسقاطات المتعامدة 31. الصور المعروضة في لوحة A و B هي نسخ من منشور في وقت سابق 31. C. تنتشر عائية وإعادة عرض يمكن تقييمها في microvessels التي صممتها تعديل سائل الإعلام والثقافة لتشمل محفزات عائية. دون محفزات عائية، HUVECs إظهار الحد الأدنى من البكتيريا (يسار)؛ مع المثيرات عائية (1 ميكرومتر جزيء صغير المانع من GSK-3، 20 نانوغرام / مل الأوعية الدموية عامل النمو البطاني، و 20 نانوغرام / مل غرو الليفية الأساسيةوث عامل)، HUVECs تنبت بسهولة في المصفوفة كما رأينا في أعلى إلى أسفل التوقعات والآراء المتعامدة (يمين). طول برعم والعدد قابل للقياس بسهولة مع برنامج ImageJ 41. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تفاعلات الدم البطانة. المهندسة microvessels هي هادئة والاستجابة بشكل مناسب لمحفزات للالتهابات. أ يحظر إسقاط معدلة، HUVEC سفينة مثقف تصويرها بالقرب من مدخل معارض قوي تلطيخ CD31 موصلي (الحمراء)، وجولة، التجويف المفتوح. أ ". متعامد ويظهر بالنظر إلى التجويف. B. عندما سيتراتي الدم الكامل مع الصفائح الدموية المسمى CD41a (الأخضر) وperfused من خلال سفينة هادئة على نحو مماثل، الحد الأدنى من الإعلاناتلوحظ hesion الصفائح الدموية (الخضراء) على البطانة. C. مع التعرض لمحفزات للالتهابات مثل phorbol-12-ميريستيت-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية، 50 نانوغرام / مل) إلى وسائل الإعلام، نضح من نتائج فحص الدم كلها في تكوين الجلطة الدموية الكبيرة (CD41a المسمى والأخضر) داخل القناة و التصاق الكريات البيض (CD45 + المسمى، أبيض) لجدار الوعاء الدموي 31. وترد الصور ينظر هنا من نشر في وقت سابق 31. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. Microvessels ولدت مع الجذعية الخلايا البشرية المستمدة-ECS. مصادر الخلايا البطانية إضافية يمكن استخدامها لتوليد microvessels هندسيا. في وقت سابق من هذا العام، Palpant وآخرون. آل. أظهرت أن نوعين متميزين سويمكن الحصول الجذعية الجنينية الخلايا البطانية و الإنسان المستمدة من الخلايا عن طريق التلاعب WNT / β-كاتينين الإشارات أثناء التمايز: الخلايا البطانية مكون للدم (تتميز تعبير عن HAND1 وإمكانية مكون للدم عالية) والخلايا البطانية مثل الشغاف (تميزت في جزء من التعبير من NFATC1 وGATA4) 41. أ عند المصنف والمثقف في منصة سفينة 3D، ECS مكون للدم تخضع بعض تنتشر عائية. ب. ومع ذلك، فإن مثل الشغاف ECS أكثر وعائي المنشأ الكثير والمهاجرة، مما يشير إلى الاختلافات الوظيفية، ربما استجابة ل تدفق، بين اثنين من الأنواع الفرعية من ECS (يتم تقديم هذا العمل بمزيد من التفصيل في منشور السابق 41). كلا النوعين الخلية تعبر عن CD31 البروتينات صلي (الحمراء)، وبعض VWF (الخضراء). وجهات النظر المتعامدة على حد سواء تظهر شمعة براءات الاختراع. C. صورة المجهر الإلكتروني من مثل الشغاف ECS داخل الوعاء ويظهر في برعم عائية كما رأينامن الجانب اللمعية. الصور المعروضة في لوحات A و B هي نسخ من Palpant وآخرون. آل 41. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

microvessels المهندسة هي نموذج في المختبر حيث الخصائص الفسيولوجية مثل الهندسة اللمعية، قوات الهيدروديناميكية، والتفاعلات متعددة الخلايا موجودة والانضباطي. هذا النوع من منصة قوية لأنه يوفر القدرة على نموذج ودراسة السلوك البطانية في مجموعة متنوعة من السياقات التي يمكن أن تكون مطابقة في المختبر الظروف والثقافة إلى أن من المكروية في السؤال. على سبيل المثال، وآليات القيادة عمليات البطانية، مثل الأوعية الدموية، ومن المعروف أن تحدث بشكل مختلف في مختلف الأجهزة وفي الحالات المرضية المختلفة، مثل الصحة والمرض 44. لهذا السبب، مستو زراعة الخلايا البطانية هي دائما غير كافية (6) وعلى هذا النحو الميدان وتعتمد بشكل كبير على النماذج الحيوانية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا.

النماذج الحيوانية، في حين مفيدة وضرورية لتقدم الأبحاث البيولوجية، لا يترجم دائما بشكل جيد إلى العيادة.ويعزى ذلك إلى حد كبير إلى الاختلافات بين الفئران والبيولوجيا البشرية، ولا سيما فيما يتعلق استجابتها لمثيرات 9،45. ولذا فمن الضروري أن تكون قادرة على بناء نماذج في المختبر التي يمكن أن توفر البيانات الخاصة بشرية إضافية لاستكمال المعلومات المستقاة من النماذج الحيوانية. في المختبر منصات لديها القدرة على تقليد المكروية في المصالح مع قدرة إضافية لضبط تلك البيئة. وينبغي أن تتضمن الخصائص الرئيسية لهذا النظام ثلاثة هيكل الأبعاد والهندسة، وتكوين مصفوفة خارج الخلية (ECM)، متني قرب الخلية والتفاعل، وتدفق الدم، والمحفزات الكيميائية الحيوية. microvessels هندسيا لديها القدرة على دمج كل هذه المعايير. ويمكن القيام بذلك في وقت واحد لخلق نموذج شامل للجميع، أو إضافتها بطريقة حكيمة خطوة لعزل الاستجابات الفردية والتفاعلات.

وهناك جانب قوي من microvessels هندسيا هو القدرة علىالتحكم في التدفق والتلاعب قوات الهيدروديناميكية تمارس على البطانة. وكمثال على ذلك، فإن الجهاز يمكن تربيتها تحت الجاذبية مدفوعة ظروف التدفق أو مع نضح المستمر (الشكل 2). حجم إجهاد القص على جدار الوعاء الدموي يمكن أن يكون منظم في كل الظروف من خلال التغيرات في معدل تدفق وهندسة السفن. والفرق الرئيسي بين الشرطين هو التوزيع الزمني للإجهاد القص داخل الوعاء. في الجاذبية مدفوعة ظروف التدفق، وإجهاد القص ليست ثابتة على مر الزمن. معدل التدفق وإجهاد القص وأعلى فورا بعد تغيير وسائل الاعلام عندما الخزان مدخل ممتلئ. كما تستنزف وسائل الإعلام، فإن إجهاد القص نقصان. وهذا يؤدي إلى مجموعة من إجهاد القص على مدار 12 ساعة. يجب أن التجارب التي تتطلب مراقبة دقيقة على الخصائص الهيدروديناميكية (على سبيل المثال، لدراسة آثار إجهاد القص على البطانة) استخدام الظروف والثقافة تدفق مستمر.

هيمكن ضبطها microvessels ngineered للرد على مجموعة واسعة من الأسئلة مع بعض التعديلات سهلة نسبيا. خلايا أنواع مختلفة، سواء متني والبطانية، ويمكن استخدامها لنموذج أجهزة الجسم المختلفة. بالإضافة إلى افتعال microvessels مع البذر الخلايا البطانية، يمكن بدلا من ذلك تستخدم الخلايا الظهارية المبطنة للقناة لللدراسات المتعلقة بطانة الأمعاء، الحويصلات الهوائية في الرئة، أنبوبية الكلى وغيرها. مرة واحدة يتم تعريف المكروية التي كتبها تكوين الخلايا، المحلول المغذي (أي، وسائل الإعلام، والدم، عوامل النمو، أو السوائل الأخرى ذات الصلة من الناحية البيولوجية) التي تستخدم ليروي الجهاز يمكن تغيير للرد على أسئلة معقدة حول الإشارات الخلوية، هدوء، إجهاد القص والمغذيات، الاستجابة للدواء، وأكثر من ذلك. وعلاوة على ذلك، هندسة السفينة يمكن أن تكون مصممة خصيصا لتحقيق استجابة البطانية لإجهاد القص وتعرج. وكمثال على ذلك، نشر مؤخرا من تشنغ وآخرون. أظهر الله. أن الخلايا البطانية لها الزيادهإفراز إد VWF والتجمع الألياف في المناطق microvessel مع إجهاد القص عالية وتسريع التدفق. على وجه التحديد، حزم VWF شكلت عادة في الزوايا والمنعطفات الحادة داخل الشبكة. ويمكن أيضا هندسة الشبكة أن تكون مصممة لصنع الأنابيب متعددة الخلايا. على سبيل المثال، والتصميم الذي يحتوي على اثنين من قنوات موازية لكل منها مدخل الخاصة بهم ومنفذ يمكن استخدامه لتوليد التدرج تركيز أو لنموذج بيئة أنبوب صغير المجاورة (على سبيل المثال، سفينة اللمفاوية مع microvessel المجاور). هياكل تشبه شبكة من تصاميم الشبكة الحالية (كما هو موضح في الشكل 1A-C) هي مفيدة لنمذجة السوائل الحسابية والسلامة الهيكلية خلال تلفيق، ولكن ليست مؤشرا على بنية الأوعية الدموية في الجسم. في الدراسات المستقبلية، وأنماط الشبكة أكثر الفسيولوجية مثل تلك التي تحتوي المتفرعة الهرمي وتدوير زوايا وينبغي أن تستخدم.

في حين أن جميع الخطوات المبينة في هذا الإجراء هي مهمة، هناكتتوفر العديد من الخطوات الحاسمة المطلوبة لنجاح تلفيق microvessel هندسيا. جل الكولاجين يجب أن تكون مختلطة بدقة لتحقيق حل متجانسة، وأنه من الضروري عدم إدخال فقاعات خلال هذه الخطوة. وهذا أمر ضروري لبقاء الخلية وظيفة فسيولوجية، ولا سيما بالنسبة للتجارب التي تتضمن خلايا متني في مصفوفة الكولاجين. إذا كان خليط الموحد للالكولاجين من الصعب الحصول عليها، والتحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول للتأكد من أنه محايد. إذا استمرت المشكلة، فمن الممكن أن يتم استبدال الأسهم الكولاجين. خطوة حاسمة أخرى هي التجمع من أعلى وأسفل قطعة سكنية - من الضروري عدم استخدام القوة بصورة غير ضرورية لأن ذلك يمكن أن يسبب القنوات للانهيار. قد تكون عدة جولات ممارسة الضروري الحصول على شعور من مقدار القوة اللازمة لتطبيق حين تناوب مسامير. وإذا استمر قناة انهيار أو تحطيم تحدث حتى بعد الممارسة، فمن الممكن شبكة PDMS أصبح مشوه بسبب absorptأيون من الرطوبة. وبدءا من قوالب PDMS تقدم طازجة مساعدة في حل هذه المشكلة. ثقوب مترابطة بشكل غير صحيح في الجهاز السفلي يمكن أيضا أن يسبب انهيار قناة. إذا كانت مسامير ليست قادرة على تدوير بسلاسة خلال التجمع، ويجب أن تطبق قوة إضافية في كثير من الأحيان مما أدى إلى انهيار. الخطوة الأخيرة الفاصلة التي ينبغي التأكيد عليها هي أهمية التغذية بشكل متكرر، عادة كل 12 ساعة. وهذا أمر ضروري للحفاظ على البطانة ومنع الجهاز من الجفاف. في حال المصنف الخلايا البطانية يبدو غير صحية أو فصل من الجدار الكولاجين، والسبل الممكنة لتحسين الصحة البطانية ولتغذية الأوعية في كثير من الأحيان، واستخدام مضخة الحقن لتطبيق التدفق المستمر، أو تحقق من درجة الحموضة في جل الكولاجين لضمان هو في المستوى الفيزيولوجي.

حاليا، يقتصر هذا النظام الأساسي لتلفيق مع المصفوفة خارج الخلية من صلابة المناسبة للحفاظ على السلامة الهيكلية للقناة خلال التجمع. شارك كثيفllagen في أو أكبر من 6 ملغ / مل يكفي، ولكن الكولاجين أقل من 6 ملغ / مل وغيرها من المصفوفات مثل مصفوفة decellularized من الأجهزة كلها ضعيفة جدا. يمكن التغلب على ذلك باستخدام مزيج من الكولاجين مع المصفوفة في السؤال. تقتصر microvessels المهندسة أيضا على نطاق وحجمها. السفن يمكن أن تكون ملفقة إلى الحد الأدنى من حوالي 100 ميكرون، ولكن سيكون من الضروري تطبيقها لتحقيق نطاق أصغر تعديلات جوهرية. على الرغم من microvessels المهندسة خلق ثلاثة التجويف الأبعاد، الشبكة نفسها هي مستو. لإنشاء الضفيرة الوعائية حقا ثلاثية الأبعاد، سوف تحتاج إلى أن تطبق مثل إنشاء شبكة متعددة الطبقات من التراص السفن المهندسة متعددة تعديلات إضافية.

تظهر نتائج تمثيلية الواردة في هذا الأسلوب كيفية microvessels هندستها يمكن استخدامها لتقييم وظيفة الحاجز، مما يشير الى خلية خلية (تجنيد خلية حوطية والاستقرار الأوعية الدموية)، الأوعية الدموية، وتجلط الدم. مضيئةوتعرض ghts هذه الدراسات هنا مع عروض أكثر تفصيلا في المنشورات السابقة 31،32. وتشير هذه الدراسات كيف pericytes تهاجر ومعطف البطانة من microvessels المهندسة 31، الصفائح الدموية تلتصق بطانة تنشيط 31، وإجهاد القص السائل ينظم تفعيل البطانية وإفراز VWF والتجمع (32). يمكن أن يزيد من microvessels المهندسة استخدامها لبناء الأنسجة أوعية دموية ونظم جهاز معين نموذج، مثل الكلى 33 أو قلب 34. القدرة على تكرار هذه الفسيولوجية تفاعلات الدم البطانة وضبط المكروية فيما يتعلق إجهاد القص، والهندسة، وإدارة المحتوى في المؤسسة، وسوف تكوين الخلايا تمكين الدراسات المستقبلية من أمراض الأوعية الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه لين ومختبر التصوير غارفي مايك في معهد الخلايا الجذعية والطب التجديدي وكذلك مرفق واشنطن Nanofabrication في جامعة واشنطن. كما ينوه بالدعم المالي من المعهد الوطني للصحة منح DP2DK102258 (لYZ)، والتدريب يمنح T32EB001650 (لSSK وMAR) وT32HL007312 (لMAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 115، هندسة الأنسجة، الأوعية الدموية الدقيقة، والخلايا البطانية، والهندسة الأوعية الدموية، وزراعة الخلايا 3D، micropatterning
Micropatterning وجمعية Microvessels 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter