Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Dette håndskrift præsenterer en sprøjtestøbning metode til at konstruere mikrokar der rekapitule- fysiologiske egenskaber endotel. Den mikro-baseret proces skaber patent 3D vaskulære netværk med skræddersys betingelser, såsom strømning, cellulær sammensætning, form og biokemiske gradienter. Fabrikationsprocessen og eksempler på potentielle anvendelser er beskrevet.

Abstract

In vitro platforme til at studere endotelceller og vaskulære biologi er stort set begrænset til 2D endotel cellekultur, flow kamre med polymer eller glas substrater, og hydrogel-baserede rørdannelse assays. Disse analyser, mens informative, ikke rekapitulere lumen geometri, ordentlig ekstracellulære matrix, og multi-cellulære nærhed, som spiller en afgørende rolle i modulerende vaskulær funktion. Dette håndskrift beskriver en sprøjtestøbeproces metode til at generere manipuleret fartøjer med diametre i størrelsesordenen 100 um. Mikrokar er fremstillet ved podning endotelceller i en mikrofluid kanal indlejret i en nativ type I collagen hydrogel. Ved at inkorporere parenchymale celler i collagenmatrix før kanaldannelse kan specifikke væv mikromiljøer modelleres og undersøgt. Yderligere modulationer af hydrodynamisk egenskaber og medier sammensætning muliggør styring af komplekse vaskulær funktion inden for det ønskede mikromiljø.Denne platform muliggør studiet af perivaskulær celle rekruttering, blod-endotel-interaktioner, flow respons, og vævs-mikrovaskulære interaktioner. Udviklet mikrokar tilbyder muligheden for at isolere påvirkningen fra enkelte komponenter i en vaskulær niche og præcist kontrollere sine kemiske, mekaniske og biologiske egenskaber til at studere vaskulær biologi i både sundhed og sygdom.

Introduction

Mikrovaskulaturen i hvert organ til at definere vævet mikromiljø, vedligeholde vævshomeostase og regulere inflammation, permeabilitet, trombose og fibrinolyse 1,2. Mikrovaskulær endotel, især er grænsefladen mellem blodgennemstrømningen og det omgivende væv og derfor spiller en kritisk rolle i modulering vaskulære og organfunktion som reaktion på stimuli, såsom hydrodynamiske kræfter og cirkulerende cytokiner og hormoner 3 - 5. Forståelse af de detaljerede interaktioner mellem endotelet, blod og det omgivende væv mikromiljø er vigtig for studiet af vaskulær biologi og sygdomsprogression. Men fremskridt i at studere disse interaktioner er blevet hæmmet ved begrænset in vitro værktøjer, der kun gentages i vivo mikrovaskulær struktur og funktion 6,7. Som et resultat, har feltet og terapeutiske avancement var stærkt afhængig af dyre og tids-forbrugende dyremodeller, der ofte ikke oversætte til succes i mennesker 8 - 10. Mens in vivo modeller er uvurderlig i studiet af sygdomsmekanismer og vaskulære funktioner, de er komplekse og ofte mangler præcis styring af individuelle cellulære, biokemiske og biofysiske signaler.

Kar i hele kroppen besidder en moden hierarkisk struktur i forbindelse med ekspansiv kapillar senge, der giver optimal perfusion og stoftransport samtidigt 11. Oprindeligt vaskulatur former som en primitiv plexus, som reorganiserer til en hierarkisk forgrenet netværk under tidlig udvikling 12,13. Selv om mange af de involverede i disse processer signaler godt forstået 14-16, er det stadig undvigende, hvordan en sådan vaskulær mønster bestemmes 15. Til gengæld den gentog denne proces in vitro til ingeniør organiserede vaskulære netværk har bin vanskelige. Mange eksisterende in vitro platforme til at modellere vaskulatur, såsom todimensionale endotheliale cellekulturer, mangler vigtige egenskaber såsom multi-cellulære nærhed, tredimensionelle luminal geometri, flow, og ekstracellulære matrix. Tube dannelse analyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 - 19 eller invasion assays 20,21 er blevet brugt til at studere endotel funktion i 3D og deres samspil med andre vaskulære 17,22 eller væv celletyper 23. Men samlet lumen i disse analyser mangler sammenkobling, hæmodynamisk flow, og passende perfusion. Endvidere tilbøjeligheden for vaskulær regression i disse kanaldannelse assays 24 forhindrer langtidsdyrkning og modning hvilket begrænser graden af funktionelle undersøgelser, der kan udføres. Således er der et spirende behov for at konstruere in vitro platforme af mikrovaskulære netværk, der passende kan modellere dadothelial egenskaber og er i stand til langtidsdyrkning.

En række af vaskulære teknikker er opstået i årenes løb til medicinske anvendelser til at erstatte eller bypass påvirket fartøjer i patienter med vaskulær sygdom. Stor diameter fartøjer fremstillet af syntetiske materialer, såsom polyethylenterephthalat (PET), og polytetrafluorethylen (ePTFE) har haft en betydelig terapeutisk succes med langsigtede åbenhed (gennemsnit 95% åbenhed over 5 år) 25. Selv om små diameter syntetiske transplantater (<6 mm) typisk står komplikationer såsom intimahyperplasi og trombopoiese 26 - 28, manipuleret væv lille diameter transplantater lavet med biologisk materiale har gjort betydelige fremskridt 29,30. Trods fremskridt af denne art, har manipuleret fartøjer på mikroskala forblevet en udfordring. For på tilfredsstillende vis at modellere mikrovaskulaturen, er det nødvendigt at generere komplekse netværk mønstre med til-strækkelig mekanisk styrke til at opretholde åbenheden og med en matrix sammensætning, som giver mulighed for både næringsstoffer permeation for parenchymale celler og cellulær remodeling.

Denne protokol udgør en roman kunstigt perfusable fartøj netværk, der efterligner en indfødt in vivo omgivelser med en justerbar og kontrollerbar mikromiljø 31-34. Den beskrevne metode genererer manipuleret mikrokar med diametre i størrelsesordenen 100 um. Manipulerede mikrokar er fremstillet ved perfusion endotelceller via en mikrofluid kanal, der er indlejret i blød type I collagen hydrogel. Dette system har kapacitet til at generere mønstrede netværk med åben luminal struktur, replikere multi-cellulære interaktioner, modulere ekstracellulær matrix sammensætning, og anvende fysiologisk relevante hæmodynamiske kræfter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mikrofabrikation af Mønstret Polydimethylsiloxan (PDMS) med Network Design

  1. Wafer Fabrication oprettes en negativ skabelon af netværket Design
    1. Opret et netværk mønster ved hjælp af en computer-aided design (CAD) software. Sørg for, at den diagonale dimension mellem ind- og udløb matche afstanden mellem indløbs- og ud- reservoirer på huset enheder i fremtidige skridt (se 2.1.1).
      Bemærk: Udformningen af det mønster, selv er custom afhængigt af de specifikke forskningsmål for brugeren (se figur 1 for eksempel mønstre).
    2. Generer en maske af netværket mønster ved hjælp af høj opløsning trykning eller bestille en krom fotomaske fra en kommerciel leverandør. En mere detaljeret protokol af fotolitografi proces er tilgængelig andre steder 35.
    3. Rens en 8 "siliciumskive i 5 minutter ved 100 W med oxygenplasma behandling.
    4. Hæld nok negativ fotoresist (SU-82.100 fungerer godt) på skiven, således at modstå danner en klat med diameter på 2,5 cm. Ved hjælp af en spin-coater, dreje waferen ved 500 rpm med 100 rpm / sek rampe og vedligeholde i 10 sek. Så rampe op til 1600 rpm med 300 rpm / sek og vedligeholde i 30 sek. Bemærk: Hastigheden og rampe skal optimeres for hvert laboratorium betingelse for at give et modstå tykkelse på 150 um.
    5. Soft-bage wafer ved 65 ° C i 7 min, rampe op til 95 ° C med 360 ° C / time, og vedligeholde i 45 min. afkøle langsomt til stuetemperatur på den varme plade. Aftryk fartøjet mønsteret på den coatede wafer ved udsættelse for 365 nm UV lys under en krom fotomaske, med eksponering tredobbelt den for producentens anbefaling (350 mJ / cm2 for en SU-8 tykkelse på omkring 150 um).
      Bemærk: Da SU-8 er en negativ modstå, vil de udsatte regioner (alt undtagen mønster design) bliver uopløseligt til udvikleren i trin 1.1.7.
    6. Hard-bage den udsatte wafer ved 65° C i 5 minutter og rampe op til 95 ° C med 360 ° C / time og opretholde i 25 minutter, derefter lade det langsomt afkøle til stuetemperatur på den varme plade.
    7. Fordyb wafer i SU-8 udvikler for 10 - 15 minutter til at vaske væk eksponerede modstå, så ren med isopropylalkohol og tør under en komprimeret nitrogen flow. Undersøg mønsteret under et lysmikroskop for at sikre SU-8 modstå er godt bundet til skiven (se efter uønsket afskalning og bobler).
    8. Måle tykkelsen på det mønster funktioner ved hjælp en profilometer ifølge producentens anvisninger 36. Under måling erhvervelse, undgå områder af struktur, der er afgørende for netværk funktion (dvs. indløbs- og udløbsledninger) som en kontakt baseret profilometer kan kompromittere den strukturelle integritet af de mønstrede funktioner på wafer. Alternativt kan du bruge en berøringsfri metode (dvs. optisk profilometer) for at undgå dette problem helt.
  2. Gesom betales af Mønstrede og Flat forme til Collagen Molding
    Bemærk: Håndter silaner inden et stinkskab.
    1. Placer skiven i en ekssikkator med 100 pi trichlor (3,3,3-trifluorpropyl) silan i 2 timer til silanize overfladen.
    2. Overfør silaniserede wafer i en 120 x 120 mm firkantet petriskål. Hæld blandet og afgasset PDMS elastomer og hærdningsmiddel (10: 1 vægt / vægt-forhold) over skiven for at opnå 4 - 6 mm tykkelse. Hæld yderligere PDMS i en separat 120 x 120 mm firkantet petriskål at generere flade forme uden mønstre. Hærde ved 65 ° C i 2 timer.
    3. Fjern fra ovnen og lad de PDMS at afkøle til stuetemperatur. Ved hjælp af en skalpel skæres forsigtigt en firkant omkring SU-8 og langsomt skrælle PDMS mug fra waferen. Trim kanterne til 30 mm x 30 mm. Til flade forme, skære helbredt PDMS uden påtrykt mønster i firkantede stykker omkring 40 mm x 40 mm.

2. Boliger Devices

  1. fabrication af top og bund Boliger Pieces
    1. Fabrikere fartøj boliger anvendelse af poly (methylmethacrylat) (PMMA). For at fremstille, bestille dele fra en standard maskine shop med computer numeriske kontrolleret (CNC) fræsning kapaciteter. Se figur 1 for en skematisk af de øverste og nederste stykker.
    2. Design det øvre hus stykke (figur 1 D) for at inkludere en 20 mm x 20 mm brønd på undersiden af indretningen med en dybde på 1 mm, to collagen injektionsporte (4 mm diameter) på toppen af enheden placeret i hjørnerne af pladsen godt, to indløbs- og ud- reservoirer med 6 mm diameter, og fire skruehuller (3 mm diameter) ved de fire hjørner af enheden.
      Bemærk: Yderligere huller kan bores på periferien af ​​emnet for håndtering formål.
    3. Design det nedre hus stykke (figur 1E) for at inkludere et firkantet hul i midten (dimensionerne 15 mm x 15 mm) med en omgivende 25 mm x 25 mmhylde med en dybde på 0,25 mm. Bor 4 skruehuller med 4-40 tråd. Sørg skruehullerne i bunden og toppen stykker vil bringe sammen under fremtidige forsamling trin.

3. mikrokar Device Fabrication

  1. Udarbejdelse af materialer
    1. Vask og autoklaveres to sæt pincet, en rustfri stål spatel, en lille flad skruetrækker, rustfrit stål skruer, og flere rustfrit stål dyvler. For fremstilling af skibene, også autoklaveres mikromønstrede PDMS forme, PDMS flade, kvadratiske, dækglas (22 x 22 mm), og bomuld stykker.
    2. Sterilisere PMMA boliger stykker i blegemiddel i mindst 1 time, derefter skylles med autoklaveret vand i vævskultur hætte to gange, og lad det lufttørre i sterilt vævskulturskåle (150 mm x 25 mm).
  2. Steril Polyethylenimin-glutaraldehyd (PEI - GA) Coating
    1. Behandle indre brønde i steriliserede tørre PMMA stykkermed plasma i ca. 1 min. Tilsæt 1% polyethylenimin (PEI) på de indre brønde (20 mm ligge godt på toppen og 25 mm kvadratisk hylde på bunden) af PMMA stykker for 10 min. Skyl med sterilt H2O og henstår til tørring i vævskultur hætte.
      Bemærk: Den nødvendige for plasma behandling tid er variabel afhængigt af den enhed, der bruges - PEI bør spredes nemt indikerer en hydrofil overflade. Hvis ikke, kan yderligere plasma behandling være nødvendig.
    2. Påfør 0,1% glutaraldehyd (GA) på PEI behandlede overflader af PMMA stykker i 30 minutter. Skyl to gange med sterilt vand og lad det tørre.
      Bemærk: I fremtidige skridt, vil kollagen klæbe til den coatede overflade gennem collagen-glutaraldehyd-krydsbinding. Dette hjælper fastgøre gel på plads i indretningen under fremtidige monteringstrin og hele enheden dyrkningsperioden.
  3. Collagen Gel Fremstilling
    1. Fabrikere fartøjer, der anvender 0,6% - 1% kollagenløsninger. For at gøre 0,75% kollagen til fartøj fabrikation, bland type I collagen stamopløsning (1,5% - isoleret fra glyse 37) med natriumhydroxid (NaOH), 10x Media Supplement (M199), og celledyrkningsmedier. Hold alle løsninger på is.
    2. Bestemme mængden af kollagen ved følgende ligning, hvor V ƒinal er slutvolumenet af gel kræves (typisk 1 ml collagen per enhed er tilstrækkelig), V stock kollagen er rumfanget af bestanden collagen nødvendig, C stock kollagen er koncentrationen af bestanden kollagen, og C ƒinal kollagen er den ønskede koncentration af collagen i beholderen.
      ligning 1
    3. Brug en 1 ml sprøjte til at overføre det passende volumen af ​​lager kollagen til en ny 30 ml konisk rør. Bestem mængden af den neutraliserende NaOH (V NaOH), M199 10x medier supplement(V 10 X), og celledyrkningsmedier (V 1 X) som følger og blandes separat i en 15 ml konisk rør:
      ligning 2
    4. Tilsæt blanding af neutraliserende reagenser (V 10 X, V NaOH, V 1 X) til alikvoteret collagen, og bruge en lille spatel til forsigtigt blande opløsningen indtil en homogen gel er opnået. Undgår at indføre bobler ved omrøring langsomt og forsigtigt.
    5. At indarbejde celler i matrixen i den ønskede koncentration (f.eks 0,5 - 20 millioner celler / ml), tilsættes cellerne til kollagenopløsningen efter at det er blandet med det neutraliserende reagenser, og fortsætte med at røre indtil cellerne er homogent fordelt.
    6. Når der tilsættes celler, justere lydstyrken på cellekultur medier til at rumme den yderligere mængde, som bestemt ved følgende ligning, hvor V celler </ sub> er det påkrævede volumen af cellesuspensionen, C ƒinal celledensitet er den ønskede densitet af celler i fartøjet, C suspension celledensitet er massefylden af cellerne i stamopløsningen.
      ligning 3
  4. Collagen Injection - Top Piece
    1. Placer mikromønstrede PDMS formen i en 100 mm x 20 mm skål. Plasma rengøre PDMS formen i 1 min.
    2. Juster den øverste PMMA stykke på toppen af PDMS mug, så de firkantede reservoirer på formen er direkte under indløbs- og ud- reservoirer (se figur 1D - stiplede linjer). Placer rustfrit stål dyvler ind i indløbet og udløbet reservoir huller øverst PMMA stykke for at opretholde en klar adgang fra reservoirerne til mønsteret.
    3. Brug en 1 ml sprøjte til at udtrække -0,5 - 0,6 ml collagen. Sikre, at ingen bobler forbliver i sprøjten.
    4. Tryk ned lightly med pincet på toppen boliger for at sikre flush kontakt mellem øverste stykke og PDMS mug. Injicer collagen langsomt gennem en injektionsport på øverste PMMA stykke. Kontroller at kollagen udfylder 20 mm x 20 mm domæne over mønster og ikke lække ud.
    5. Luk skål uden skubbet styrestifterne og tillade at gelere i en 37 ° C inkubator i 30 min.
  5. Collagen Injection - bundstykke
    1. Placer en 22 x 22 mm dækglas i centrum af bundstykket. Brug en 1 ml sprøjte til at dispensere ~ 0,25 ml collagen jævnt på objektglasset. Sænk forsigtigt PDMS flad firkant over kollagen, sikre PDMS ligger fladt mod PMMA og der er ingen indespærrede bobler. Tillad at gelere ved 37 ° C i 30 minutter.
  6. Device Assembly
    1. Efter gelering, tilføje nok PBS omkring det flade PDMS brik på bundstykket at omgive PDMS (ca. 1 ml). Brug en pincet til at fjerne enhver eXcess collagen omkring kanterne, og langsomt skrælle PDMS stykket. Tilføje mere PBS på toppen af ​​kollagen at opretholde væskebalancen.
    2. For at forberede det øverste stykke, bruge pincet til at afhente den øverste PMMA brik og vend det, så PDMS mug er på toppen. Tilsæt et par dråber PBS til grænsefladen, derefter hurtigt og kraftigt fjerne PDMS mug fra toppen PMMA stykke.
    3. Fjern forsigtigt rustfrit stål dyvler fra den anden side af PMMA boliger ved hjælp af en anden pincet. Tilføj flere flere dråber PBS på mikromønstrede kollagen. Vend PMMA topstykke over, så at kollagen vender nedad og placere 4 skruer ind i hjørnet huller.
    4. Læg forsigtigt topstykket oven på bundstykket, tilpasse skruerne med hjørnet huller på det nederste stykke. Lad ikke de to stykker til at glide mod hinanden. Brug en skruetrækker til at stramme skruerne ved hjælp af en blid berøring. Stram ikke.
    5. Aspirer PBS omgiver PMMA overflader og placere en lille piece bomuld under en kant af enheden. Ved hjælp af en pipette, fjerne PBS fra reservoirerne og erstatte med cellekulturmedier. Lad enheden gel sammen i en 37 ° C inkubator i mindst 1 time.
  7. Cell Seedning
    1. Kultur humane navlevene endotelceller (HUVEC'er) i endotelvækstfaktor medier ved 37 ° C (CO 2, O 2) til konfluens 38. Når det er muligt, skal du bruge mellem passager 4 og 7.
    2. Trypsinisér endotelceller ved at vaske dyrkningskolbe med 6 ml PBS og derefter tilsætte 2 ml 0,05% trypsin ved 37 ° C for at dissociere cellerne. Lad cellerne i trypsin, indtil de fleste af de fokale sammenvoksninger har løsrevet og cellerne rundet op (dette typisk tager omkring 2 - 3 i min). Standse trypsin reaktionen ved tilsætning af 4 ml endotelvækstfaktor medier indeholdende føtalt bovint serum (FBS). kolben med medierne vaskes flere gange for at sikre cellerne frigjort fra kolben og samlei et konisk rør.
    3. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og resuspender dem ved en densitet på 10 millioner celler per ml. Fjern alle cellekultur medier fra indløbs- og ud- reservoirer. Ved hjælp af en 200 pi gel loading tip, tilsættes 10 pi af cellesuspensionen i midten af ​​indløbet reservoir. Cellerne bør begynde at strømme ind i netværket straks og pels netværket.
    4. Tilføj 200 pi medier samme måde for begge reservoirer og lad celler vedhæfte og spredes i netværket i mindst 1 time.
  8. Device Kultur
    1. Kultur indretningen med tyngdekraften drevne strømning gennem netværket ved tilsætning af 200 pi celledyrkningsmedier til indløbet reservoir og 50 pi til reservoiret stikkontakt. Med denne metode af kultur, erstatter medier hver 12 timer til at opretholde endotel levedygtighed.
      Bemærk: Hvis kontinuerlig flow dyrkningsbetingelser er ønskelige (for at opretholde konstant forskydningsspænding, indsamle medier ved udløbet, etc.) en syringe pumpe kan anvendes i stedet for tyngdekraften drevne kultur.
    2. Tillad seedede endotelceller mindst 24 timers at vedhæfte og stabilisere før du anvender kontinuerlig strøm. Forud for kontinuerligt flow setup, vedligeholde enhederne med tyngdekraften drevne strømningsforhold.
      BEMÆRK: Betingelserne for anvendt flow medier adskiller sig fra tyngdekraften drevne kultur. Tilsætningen af et plasma expander, såsom dextran, til medierne stabiliserer de manipulerede mikrokar og forhindrer vaskulær kollaps under vedvarende perfusion 39.
    3. For at gøre medier til kontinuerligt flow setup, opløses 3,5% Dextran (70 kDa) i endotel vækstmedier til optimal fartøj kultur. Under anvendelse af steril teknik fylde 10 ml sprøjter med endotelvækstfaktor medier med 3,5% Dextran.
    4. Forbered en steril dyrkningsskål for flow ved at smelte huller i sidevæggen af ​​en petriskål ved anvendelse af en loddekolbe.
    5. Vedhæfte 12 "silicium rør (1/32" ID) til en Luer lock kobling (Kvinde, 1/16 "ID), og en 1 /16 "lige rør-til-rør stik med en 1" segment af slange på den anden ende. Indsæt en 1/4 "20G stump nål (villa fra nålenavet) til den frie ende af den 1" segment. Ligeledes udarbejder en 3 "segment af slangen er fastgjort til et rør-til-rør 90 ° bøjet forbindelsesrør led (til montering i huset indløb). I efterfølgende trin, vil den længere rør føres gennem den klargjorte digel og knyttet til 3 "segment via 20 G nål. Outlet slanger bør afspejle indløbsslangen, med en fri ende i stedet for en Luer lock kobling. Autoklavér alle segmenter før anvendelse.
    6. Tråd autoklaveret indløb og udløb rør gennem huller i den forberedte skålen. Vedhæft 3 "segmenter til indre 20 G kanyler. Monter Luer lock kobling til medierne fyldt injektionssprøjte og perfundere medier gennem slangen ved hjælp af sprøjtepumpen fastsættes på et højt flow. Sørg for, at der ikke er nogen bobler i slangen eller stik, da disse vil hindre strømning til beholderen.
    7. Indsæt connector fælles ind i huset indløb. Indstil sprøjtepumpen til den ønskede strømningshastighed og begynde perfusion.
      BEMÆRK: Denne kan justeres afhængigt af skibet geometri og eksperimentelle betingelser for belastninger anvendte shear. For en kanal 100 um diameter, en strømningshastighed på 3 pi / min fungerer godt.
    8. Hvis det ønskes, indsamle perfusat med forberedt outlet rør indsat i en steril 5 ml polystyren rundbundet rør indeholdende 500 pi medier.
      Bemærk: En lille mængde medium tilsættes til indsamlingsenheden røret for at forhindre bobledannelse der kan blokere strømning.
    9. Afhængigt af strømningshastighed kan sprøjten skal genfyldes efter 24 til 36 timer. Dette gøres ved at fjerne stikket fra huset indløb, der erstatter sprøjten, og lade medierne til at perfundere ved en høj strømningshastighed for flere minutter. Denne sekvens sikrer, at bobler ikke introduceres til slangen. Nulstil pumpen til den ønskede flow for kultur, sæt stikket ind i huset indløb, ogvende tilbage til inkubatoren.

Analyse 4. Enhed

  1. permeabilitet Analysis
    1. Brug 40 kDa FITC-dextran at visualisere permeabiliteten af fartøjet in situ. Placer beholderen boliger på en konfokal mikroskop og fokus på skibet flyet. Tilsæt 5 uM 40 kDa FITC-dextran til indløbet og billedet ved 4X forstørrelse, 25 msek eksponeringstid, og på 1 frame per sekund i 10 min.
    2. Analyser billedserien med analyse kode at estimere permeabiliteten af Dextran tværs karvæggen i collagen (um / sek) baseret på en model offentliggjort af Zheng et. al. 31.
  2. Immunfarvning & Konfokal Imaging Analysis
    1. For at rette fartøjer, perfundere med 3,7% formaldehyd gennem indløbet i 20 minutter og vask ved perfusion PBS tre gange (20 min per vask). Blok-specifik antistofbinding med 2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Triton X-100 PErfused gennem netværket i 1 time. Perfundere primære antistofopløsninger natten over ved 4 ° C og vask tre gange med PBS. Perfundere sekundære antistof løsninger til 1 - 2 timer, og vask igen med PBS på samme måde.
    2. Tag immunofluorescensteknikker billeder af mikrokar in situ ved anvendelse af et konfokalt mikroskop med en z-trin med 1 um. Billede mikrokarrene ved en forstørrelse på 4X, 10X, eller 20X.
      Bemærk: Forstørrelse af 4X vil give globale netværk struktur oplysninger, mens 10X og 20X forstørrede billeder vil give cellulære detaljer såsom forlængelse, junction dannelse osv.
    3. Analyser billedstakke hjælp ImageJ med Z fremskrivninger (Billede / Stacks / Z-projektet), tværsnit (Billede / Stacks / Orthogonal view), og 3D rekonstruktioner (Billede / Stacks / 3D Project).
  3. Scanning Electron Microscopy Imaging
    1. Til elektronmikroskopi analyse, fix in situ ved perfusion halv styrke Karnovsky s solution (2% paraformaldehyd / 2,5% glutaraldehyd i 0,2 M cacodylatbuffer) natten over. Skil beholderen og omhyggeligt adskille de to stykker. Trim kanter og fordyb i fikseringsopløsning i flere dage.
    2. Nedsænkes tykke øverste del af beholderen i 25% glutaraldehyd i 20 minutter og skylles tre gange med PBS (2 min hver). Dehydrer i serielle ethanol vaskninger med 50%, 70%, 85% (2 min hver) og to vaske i 100% ethanol (5 min hver).
    3. Forbered prøven til analyse med yderligere dehydrering af kritiske punkt tørring efter fabrikantens protokol 40. Sputter coat fartøjet med guld-palladium (7 nm) og analysere under et scanningselektronmikroskop med en accelererende spænding på 5 kV, pletstørrelse 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den konstruerede beholder platform skaber funktionelle mikrovaskulatur indlejret i en naturlig collagen type I matrix og giver mulighed for stram styring af det cellulære, biofysiske og biokemiske miljø in vitro. For at fabrikere manipuleret mikrokar, er humane navleveneendotelceller (HUVEC'er) perfunderet gennem collagen-embedded mikrofluid netværk, hvor de tillægger danne et patent lumen og sammenflydende endotel. Som illustreret i figur 1A-C, kan fartøjet geometri være specielt designet til at besvare spørgsmål vedrørende strømningshastighed, snoning, og forgrening vinkler, blandt andre. Modulering af strømningshastigheden gennem mikrokar giver indsigt i forskydningsspændingen-respons af endotelceller. Tidligere har fabrikation fokuseret primært på skibe i 100 um størrelsesområde imidlertid mikrokar op til 500 um, eller i nogle tilfælde så lille som 50 um i diameter har været successfully lavet og dyrket. Eksempler på lang sigt åbenhed er vist såvel som overlevelsen af mikrokar dyrket under tyngdekraften drevne flow (figur 2A) og kontinuerlig påførte strøm (figur 2B). De in vivo-lignende egenskaber manipuleret mikrokar kan påvises på flere måder. Forskellige endoteliale funktioner kan måles ved hjælp af denne platform, herunder barrierefunktion (figur 3A), celle-celle-interaktioner og signalering (figur 3B) og angiogen remodeling (figur 3C). En kritisk træk ved disse mikrokar er deres evne til at reagere på inflammatoriske stimuli i en biologisk relevant måde. Dette illustreres bedst gennem deres interaktion med fuldblod i figur 4A-C, hvor ikke-aktiveret endotel er hvilende (figur 4B) og aktiveret endotel inducerer thrombedannelse (figur 4C). Ved dyrkning endotelceller differing oprindelser under denne platform, er det muligt at forstå den funktionelle heterogenitet mellem endotelceller fra forskellige kilder. Figur 5A-C viser et eksempel på denne heterogenitet med to forskellige humane stamceller afledt endotelceller celletyper, når de dyrkes i mikrokar systemdisplay drastisk anderledes fænotyper 41. Ved tuning strømnings- profiler, cellesammensætning, og dyrkningsbetingelser, manipulerede mikrokar tilvejebringe et effektivt in vitro værktøj til at studere endotel biologi og mikrovaskulaturen i både sundhed og sygdom.

figur 1
Figur 1. Skematisk af netværksdesign og Microchannel Fabrication-protokollen. Det vaskulære netværk geometri kan specielt designet til at generere forskellige strømningsmønstre. A. For eksempel en forgrenet design vil være faldet flOW satser nær centrum (en 8 fold reduktion i en 3 af 3 gitter) resulterer i områder af varieret forskydningsspænding på endotel i samme beholder 31. B. Et stærkt forgrenet gitter følger det samme princip som det tidligere design, men med en større plexus. Med dette design, virkningerne af en 50 gange reduktion i strømningshastighed, hvilket resulterer i en forskydningshastighed reduktion fra 10 til 500 sek-1 kan observeres, når et trykfald på 1,000 Pa påtrykkes over netværket 32. C. Mere komplekse mønstre såsom en snoet netværk med skarpe hjørner 32 kan bruges til at besvare spørgsmål om endothelial reaktion på afbrydelser laminar strømning, der forekommer i patologiske kontekster 42. Mikrokar fremstillet af disse mønstre vil have en diameter på 100 -. 150 um D. Der er tre store trin under mikrokanalplade fabrikation. Først er den øverste del af huset jig placeret på toppen af ​​PDMS mønstret netværk skimmel, således at indløbet og udløbet er tilpasset. Kollagen I injiceres derefter i det lukkede rum gennem indsprøjtningsåbningerne (sort pil). Typisk er en collagen I blanding 0,75% anvendt til fabrikation. Vellykket mikrokar fabrikation kan opnås med så lavt som 0,6% collagen, men mindre end 0,6% typisk resulterer i utilstrækkelig mekanisk styrke og kanal sammenbrud. E. Et tyndt lag af kollagen tilsættes til det nederste stykke oven på dækglasset, og affladet med en anden PDMS brik. F. Efter gelering ved 37 ° C, er PDMS forme fjernes, og de ​​øverste og nederste boliger jigs skruet sammen for at vedlægge netværket. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
> Figur 2. mikrokar dyrket med kontrolleret gennemstrømning Profiler. A. HUVEC'er podet i mikrokar dyrket under tyngdekraften drevne flow og B. anvendt kontinuerlig strøm med en hastighed på 3 pl / min. Kultur under anvendelse strømning opnås bedst ved tilsætning af 3,5% Dextran til mediet, som har vist sig at stabilisere mikrofluid collagen-baserede mikrokar ved at udøve fysiske tryk i hulrummet, der kan forbedre junction dannelse, selv om den nøjagtige mekanisme bag denne virkning er uklar 39 . Mikrokar blev farvet for endotel junction protein CD31 eller klynge af differentiering 31 (rød) og von Willebrand faktor (vWF) granulat (grøn). A ', B'. I begge betingelser, HUVEC'er udtrykt endoteliale markører for celle-celle vejkryds og VWF granulat. A ", B". Ortogonale visninger viser patent og afrundede lumen efter 6 dage i kultur.arge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Engineered mikrokar for Studiet af endotelfunktion. A. Endothelial barrierefunktion kan vurderes efter perfusion af FITC (fluorescein isothiocyanat) -konjugeret Dextran gennem nettene (øverst) og efterfølgende måling af dets diffusion ind i det indre kollagen (nederst). Brug af brugerdefineret kode, kan videoer af perfusionen analyseres for at plotte pixel intensitet over et område af interesse i rammen over tid for at bestemme permeabilitetskoefficienten K (um / sek) af FITC-dextran. Tidligere udgivelser fra laboratoriet har vist, at permeabiliteten af disse konstruerede skibe er sammenlignelig med ex vivo pattedyr fartøjer 31,43. B. Endotelcelle interaktioner med perivascular eller støtteceller kan analyseres i denne platform ved at modulere cellulære sammensætning af collagen matrix. Her kan et eksempel på disse celle-celle interaktioner ses, når glatte muskelceller er indlejret i kollagen omkring beholderne. Efter 14 dage i kultur, de glatte muskelceller (farvet for alpha glatmuskelactin (αSMA) med grønt) associeret med endotelet og udvide processer langs karvæggen og fungere som perivaskulære celler som set i de retvinklede projektioner 31. Billeder, der er vist i panel A og B er gengivelser fra en tidligere publikation 31. C. Angiogen spiring og remodellering kan evalueres i manipulerede mikrokar ved at modificere dyrkningsmedierne til at omfatte angiogene stimuli. Uden angiogene stimuli, HUVEC'er viser minimal spiring (til venstre); med angiogene stimuli (1 uM lille molekyle inhibitor af GSK-3, 20 ng / ml vaskulær endotelvækstfaktor og 20 ng / ml basisk fibroblast groGJ faktor), HUVEC'er let spire ind i matrixen, som ses i top down fremskrivninger og ortogonale visninger (til højre). Den spire længde og antallet er let kvantificerbare med ImageJ software 41. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Blod-endotel Interaktioner. Udviklet mikrokar er inaktiv og reagere hensigtsmæssigt på inflammatoriske stimuli. A. En umodificeret, HUVEC dyrket fartøj fotograferet nær fjorden viser stærk CD31 junktionel farvning (rød) og en rund, åben lumen. A '. Orthogonal visning af hulrummet er vist. B. Når citratbehandlet helblod med CD41a-mærkede blodplader (grøn) perfunderes gennem en tilsvarende hvilende fartøj, minimal annoncesamhørighedslandene af blodplader (grønne) til endotelet observeres. C. Med udsættelse for inflammatoriske stimuli, såsom phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA, 50 ng / ml) til medierne, perfusion af helblod resulterer i dannelse af store thromber (CD41a-mærket, grøn) inde i kanalen og adhæsion af leukocytter (CD45 + mærket, hvid) til karvæggen 31. Billeder ses her er gengivet fra en tidligere publikation 31. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. mikrokar Dannet med menneskelige stamceller Afledt-EC'er. Yderligere endotel celle kilder kan bruges til at generere manipuleret mikrokar. Tidligere på året, Palpant et. al. viste, at to distinkte undertyper of humane embryonale stamceller afledt endotelceller kan opnås ved at manipulere wnt / β-catenin signalering under differentiering: hemogenic endotelceller (karakteriseret ved ekspression af HAND1 og en høj hemogenic potentiale) og endokardiale-lignende endotelceller (kendetegnet delvist af ekspression af NFATC1 og GATA4) 41. A. Når seedet og dyrkes i 3D fartøj platform, hemogenic EC'er undergår nogle angiogene spiring. B. Men den endokardiale-lignende EC'er er langt mere angiogene og vandrende, hvilket tyder på funktionelle forskelle, måske som svar på flow, mellem de to undertyper af EC'er (dette arbejde præsenteres mere detaljeret i en tidligere publikation 41). Begge celletyper udtrykker CD31 forbindelsesepitoper proteiner (rød) og nogle VWF (grøn). Ortogonale af både viser patent lumen. C. et scanningselektronmikroskop billede af den endokardiale-lignende EC'er i karret viser en angiogen spire som setfra den luminale side. Billeder præsenteret i panel A og B er gengivelser fra Palpant et. al. 41. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Manipulerede mikrokar er en in vitro model, hvor fysiologiske karakteristika såsom luminal geometri, hydrodynamiske kræfter, og multi-cellulære interaktioner er til stede og afstemmelige. Denne type platform er stærk, idet den giver mulighed for at modellere og studere endothelial adfærd i mange forskellige sammenhænge, ​​hvor in vitro-dyrkningsbetingelser kan matches til den for mikromiljøet pågældende. For eksempel de mekanismer køre endoteliale processer, såsom angiogenese, vides at forekomme forskelligt i forskellige organer og på forskellige patologiske tilstande, såsom sundhed og sygdom 44. Af denne grund, plane endotelcelle kultur er konsekvent utilstrækkelig 6 og som sådan det område har været kraftigt baseret dyre og tidskrævende dyremodeller.

Dyremodeller, mens informativ og afgørende for udviklingen af ​​den biologiske forskning, ikke altid oversætte godt til klinikken.Dette er stort set tilskrives forskelle mellem murine og humanbiologi, navnlig med hensyn til deres reaktion på stimuli 9,45. Det er derfor vigtigt at være i stand til at bygge in vitro modeller, der kan give yderligere menneskelige-specifikke data til at supplere oplysninger og erfaringer fra dyremodeller. In vitro platforme har potentiale til at efterligne mikromiljø interesse med den ekstra kapacitet til at tune dette miljø. Vigtige kendetegn ved et sådant system bør omfatte tredimensionelle struktur og geometri, ekstracellulær matrix sammensætning (ECM), parenkym celle nærhed og interaktion, blodgennemstrømning, og biokemiske stimuli. Manipulerede mikrokar har kapacitet til at optage alle disse parametre. Dette kan gøres samtidig for at skabe en altomfattende model, eller tilsættes i en trinvis måde for at isolere individuelle svar og interaktioner.

En kraftig aspekt af industrielt mikrokar er evnen til atkontrol flow og manipulere de hydrodynamiske kræfter, der udøves på endotel. Som et eksempel kan indretningen dyrkes under tyngdekraft drevne strømningsforhold eller med kontinuerlig perfusion (figur 2). Størrelsen af ​​forskydningsspændingen på karvæggen kan moduleres i begge betingelser gennem ændringer i strømningshastighed og fartøjet geometri. Den væsentligste forskel mellem de to betingelser er den tidsmæssige fordeling af forskydningsspænding inden i beholderen. I gravity drevet strømningsforhold, forskydningsspændingen ikke er konstant over tid. Strømningshastigheden og forskydningsspændinger er højest umiddelbart efter et medie ændring, når indløbet reservoir er fuld. Som medierne afløb, vil forskydningsspændingen falde. Dette fører til en række forskydningsspænding i løbet af 12 timer. Eksperimenter, der kræver præcis kontrol over de hydrodynamiske egenskaber (for eksempel for at undersøge virkningerne af forskydningsspænding på endothelium) bør anvende kontinuerlige flow dyrkningsbetingelser.

Engineered mikrokar kan indstilles til at besvare en lang række spørgsmål med relativt lette modifikationer. Forskellige celletyper, både parenchymale og endotel- kan bruges til at modellere forskellige organsystemer. Ud over fremstilling mikrokar med endotelcelle podning kunne epitelceller i stedet anvendes til at fore kanalen for undersøgelser vedrørende tarmens slimhinde, lungealveoler, nyre tubulus, osv. Når mikromiljø er defineret ved celle præparat, næringsopløsningen (dvs. medier, blod, vækstfaktorer eller andre biologisk relevant væske), der bruges til at perfundere indretningen kan ændres til at besvare komplekse spørgsmål om cellesignalering, ubevægelighed, forskydningsspænding , næringsstoffer, narkotika respons, og meget mere. Endvidere kan geometrien af ​​fartøjet være specielt designet til at undersøge endothel reaktion på forskydningsspænding og snoning. Som et eksempel kan en nylig publikation fra Zheng et. al. viste, at endotelceller har i stigendeed VWF sekretion og fiber forsamling i mikrokarrør regioner med høj shear stress og flow acceleration. Specifikt VWF bundter typisk dannet ved hjørner og skarpe sving i netværket. Netværket geometri kan også konstrueret til fremstilling af flercellede tubuli. For eksempel kunne et design, der indeholder to parallelle kanaler med hver deres indløb og udløb anvendes til at danne en koncentrationsgradient eller til at modellere et tilstødende tubulus miljø (f.eks lymfekar med tilstødende mikrokar). De grid-lignende strukturer af de nuværende netværk design (vist i figur 1A-C) er fordelagtige for Computational Fluid modellering og for strukturel integritet under fabrikation, men er ikke tegn på vaskulær struktur i kroppen. I fremtidige studier, bør anvendes mere fysiologiske netværk mønstre såsom dem med hierarkisk forgrening og afrundede hjørner.

Mens alle de trin, der er skitseret i denne procedure er vigtige, er derer flere kritiske trin, der kræves for en vellykket manipuleret mikrokar opspind. Kollagengelen skal blandes grundigt for at opnå en homogen opløsning, og det er vigtigt ikke at indføre bobler under dette trin. Dette er vigtigt for cellelevedygtighed og fysiologiske funktion, især til forsøg, der omfatter parenchymale celler i kollagenmatrixen. Hvis det er vanskeligt at opnå en ensartet blanding af collagen, kontrollere pH af opløsningen for at sikre den er neutral. Hvis problemet fortsætter, er det muligt kollagen bestanden skal udskiftes. Et andet afgørende skridt er samlingen af ​​den øverste og nederste indeslutningsdele - det er vigtigt ikke at bruge unødig kraft, da dette kan forårsage kanalerne til at kollapse. Adskillige praksis runder kan være nødvendigt at få en fornemmelse af den mængde kraft er nødvendig for at anvende, mens roterende skruer. Hvis kanal kollaps eller smashing fortsætter med at forekomme selv efter praksis, er det muligt at PDMS-netværket er blevet skæv pga absorption af fugt. Startende med frisklavede PDMS forme vil hjælpe med at løse dette problem. Forkert gevindskårne huller i bunden indretning kan også forårsage kanal kollaps. Hvis skruerne ikke er i stand til at rotere jævnt under samling, skal ekstra kraft påføres ofte resulterer i strukturelle fejl. Det sidste kritiske trin, der skal understreges, er vigtigheden af ​​hyppig fodring, typisk hver 12 timer. Dette er afgørende for at opretholde endothelium og forhindrer enheden i at tørre ud. I tilfælde af at podet endotelceller synes usunde eller løsnes fra kollagen væg, potentielle måder at forbedre endotel sundhed at fodre fartøjer oftere, anvendes en sprøjtepumpe at anvende kontinuerlig strømning, eller kontrollere pH i kollagengelen at sikre det er ved en fysiologisk niveau.

I øjeblikket er denne platform begrænset til fabrikation med ekstracellulær matrix af passende stivhed til at opretholde strukturel integritet af kanalen under samling. tæt samarbejdellagen på eller større end 6 mg / ml er tilstrækkelig, men collagen under 6 mg / ml og andre matricer, såsom decellulariserede matrix fra hele organer er for svage. Dette kan overvindes ved anvendelse af en blanding af collagen med matrixen pågældende. Udviklet mikrokar er også begrænset af deres størrelse skala. Fartøjer kan fremstilles til en lavere grænse på ca. 100 um, men væsentlige ændringer vil skulle anvendes for at opnå en mindre skala. Selvom manipuleret mikrokar skabe en tredimensionelle lumen, selve netværket er plant. For at skabe en virkelig tredimensionel vaskulær plexus, ville yderligere ændringer skal anvendes, såsom at skabe et flerlaget netværk ved at stable flere manipuleret fartøjer.

De repræsentative resultater, der præsenteres i denne metode viser, hvordan manipuleret mikrokar kan anvendes til at vurdere barrierefunktion, celle-celle-signalering (pericyt rekruttering og vaskulær stabilisering), angiogenese, og thrombose. Highlights af disse undersøgelser præsenteres her med mere detaljerede præsentationer i tidligere udgivelser 31,32. Disse undersøgelser viser, hvordan pericytter migrerer og pels endotelet af industrielt mikrokar 31, blodplader klæber til aktiveret endotel 31, og væske forskydningsspænding modulerer endotel aktivering og VWF sekretion og samling 32. Manipulerede mikrokar kan yderligere anvendes til at bygge vaskulariserede væv og model organspecifikke systemer, såsom nyren 33 eller hjertet 34. Evnen til at replikere disse fysiologiske blod-endotel-interaktioner og tune mikromiljøet med hensyn til forskydningsspænding, geometri, ECM, og cellulær sammensætning vil muliggøre fremtidige studier af vaskulære sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institut for Stamcelleforskning og regenerativ medicin samt Washington nanofabrikation Facility på University of Washington. De erkender også økonomisk støtte fra National Institute of Health giver DP2DK102258 (til YZ), og uddannelse giver T32EB001650 (til SSK og MAR) og T32HL007312 (til MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Bioengineering vævsmanipulering mikrovaskulaturen endotelceller vaskulære engineering 3D cellekultur micropatterning
Micropatterning og Samling af 3D mikrokar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter