Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Abstract

בשנת פלטפורמות במבחנה ללמוד בתאי האנדותל וביולוגיה וסקולרית מוגבלים במידה רבה לתרבות תא האנדותל 2D, לזרום תאים עם פולימר או מצעים מלוחים וזכוכית, מבחני היווצרות צינור מבוסס הידרוג'ל. מבחנים אלו, תוך אינפורמטיבי, לא לשחזר גיאומטרית לומן, מטריקס ראויה, קרבה רבה תאית, אשר ממלאת תפקידים מרכזיים ויסות תפקוד כלי דם. כתב יד זה מתאר שיטת הזרקה לייצר כלי Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. Microvessels מיוצרים על ידי זריעת לתאי אנדותל ערוץ microfluidic מוטבע בתוך סוג יליד שאני קולגן הידרוג'ל. על ידי שילוב תאי parenchymal בתוך המטריצה ​​קולגן לפני לתעל היווצרות, microenvironments רקמות הספציפי יכול להיות מודל ולומד. מודולציות נוסף של הרכב נכסים ומדיה הידרודינמית לאפשר בקרה של תפקוד כלי הדם מורכב במיקרו-סביבה של הרצוי.פלטפורמה זו מאפשרת לחקר גיוס תא perivascular, אינטראקציות האנדותל דם, תגובת זרימה, ואינטראקציות-כלי דם לרקמות. microvessels המהונדס מציע את היכולת לבודד את השפעת מרכיבים בודדים של נישת כלי דם ולשלוט הכימיים שלה בדיוק, מכאניות, ואת תכונות ביולוגיות ללמוד ביולוגיה וסקולרית בשתי בריאות ומחלות.

Introduction

על נימי הדם הזעירים בכל איבר עוזר להגדיר את microenvironment רקמות, לשמור על הומאוסטזיס רקמות לווסת דלקת, חדירות, פקקת, ו פירוק פיברין 1,2. האנדותל כלי הדם, בפרט, הוא ממשק בין זרימת הדם ואת הרקמה שמסביב ועל כן היא משחקת תפקיד קריטי בויסות וסקולרית ותפקוד איברים בתגובה לגירויים כגון כוחות הידרודינמית במחזור ציטוקינים והורמונים 3 - 5. הבנת יחסי הגומלין המפורט בין האנדותל, הדם, ואת המיקרו-סביבת הרקמה הסובבת חשובה לחקר ביולוגיה של כלי דם ואת התקדמות מחלה. עם זאת, התקדמות בחקר אינטראקציות אלה התעכבה בשל מוגבלות כלים במבחנה שאינו לשחזר במבנה כלי דם vivo ולתפקד 6,7. כתוצאה מכך, השדה והקידום טיפולי הסתמכו בכבדות על יקר הזמן-רב במודלים של בעלי חיים כי לעיתים קרובות אינם מצליחים לתרגם להצלחה בבני אדם 8 - 10. בעוד מודלים in vivo הם לא יסולא בפז בחקר מנגנוני המחלה ופונקציות וסקולרית, הם מורכבים ולעיתים קרובות חסרי שליטה מדויקת של הסלולר, ביוכימיים הפרט, רמזים biophysical.

כלי דם בכל הגוף הוא בעל מבנה היררכי בוגר בשיתוף עם מיטות נימי מרחיבה, מתן זלוף אופטימיזציה תחבורה מזין 11 בו זמנית. בתחילה, טפסים בכלי דם כמו מקלעת פרימיטיבית אשר מארגנת מחדש לרשת מסועפת באופן היררכי במהלך ההתפתחות מוקדמת 12,13. למרות שרבים מן האותות מעורבים בתהליכים אלה מובנים היטב 14 - 16, הוא נשאר חמקמק איך כגון דפוסים של כלי דם נקבעו 15. בתורו, משחזר את התהליך הזה במבחנה להנדס רשתות כלי דם מאורגנות יש דבוריםn קשה. פלטפורמות רבות הקיימות במבחנת מודל בכלי דם, כגון שתי תרבויות תא האנדותל ממדיות, חסרות מאפיינים חשובים כגון קרבה רבה תאית, שלוש גיאומטריה לומינל ממדי, זרימה, ואת מטריקס. מבחני היווצרות צינור ב הידרוג 3D (קולגן או הפיברין) 17 - 19 או הפלישה מבחני 20,21 שימשו ללמוד את תפקוד האנדותל ב -3 D ויחסי הגומלין שלהם עם 17,22 או תא רקמה וסקולרית אחרים סוגי 23. עם זאת, התאסף לומן מבחנים אלה חסרים גומלין, זרימת המודינמי, ו זלוף המתאים. יתר על כן, הנטייה לרגרסיה וסקולרית מבחני היווצרות צינור אלה 24 מונעת תרבות לטווח ארוכה והתבגרות המגבילה את מידת מחקרים פונקציונליים שניתן לבצע. לפיכך, יש צורך המתפתח להנדס במבחנת פלטפורמות של רשתות כלי דם שיכול מודל כראוי endothelial מאפיינים ומסוגלים התרבות לטווח ארוך.

מגוון של טכניקות הנדסה וסקולרית צמח במשך השנים ליישומים רפואיים להחליף או כלי מושפע מעקפים בחולים עם מחלת כלי דם. כלי בקוטר גדול מחומרים סינתטיים כגון terephthalate פוליאתילן (PET), ו polytetrafluoroethylene (ePTFE) נחלו הצלחה טיפולית ניכר עם patency לטווח ארוך (patency 95% בממוצע על פני 5 שנים) 25. למרות שתלי סינתטי קטן בקוטר (<6 מ"מ) בדרך כלל להתמודד עם סיבוכים כגון היפרפלזיה intimal ואת thrombopoiesis 26 - 28, רקמות מהונדסות שתלי בקוטר קטן עשה עם חומר ביולוגי יש התקדמות משמעותית 29,30. למרות התקדמות מסוג זה, כלי מהונדסים על microscale נותרו אתגר. כדי לעצב את microvasculature כראוי, יש צורך ליצור דפוסי רשת מורכבים עם הסוףחוזק מכני ficient כדי לשמור patency ועם רכב מטריקס המאפשר כאחד חלחול מזין עבור תאי parenchymal שיפוץ הסלולר.

פרוטוקול זה מציג רשת כלי perfusable מלאכותית רומן מחקה יליד in vivo הגדרה עם microenvironment מתכונן לשליטה 31 - 34. השיטה המתוארת יוצרת microvessels Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. microvessels המהונדס מיוצר על ידי מרוסס תאי אנדותל דרך ערוץ microfluidic שמוטבע בתוך הסוג רך אני קולגן הידרוג'ל. מערכת זו יש את היכולת ליצור רשתות בדוגמת עם מבנה לומינל פתוח, לשכפל אינטראקציות רבות תאיות, לווסת רכב תאי מטריקס, ולהחיל כוחות המודינמי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Microfabrication 1. Patterned polydimethylsiloxane (PDMS) עם רשת עיצוב

  1. ייצור פרוסות סיליקון כדי ליצור תבנית שלילית של עיצוב הרשת
    1. צור דפוס רשת באמצעות כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). ודא כי הממד האלכסוני בין הכניסה והיציאה להתאים את המרחק בין מאגרי הכניסה ויציאה על מכשירי דיור שבשלבים הבאים (ראה 2.1.1).
      הערה: העיצוב של התבנית עצמה היא בהתאם מותאם אישית על מטרות המחקר הספציפי של המשתמש (ראה איור 1 עבור דפוסים לדוגמה).
    2. צור מסכה של דפוס רשת באמצעות הדפסה ברזולוציה גבוהה או להזמין photomask כרום מן הספק מסחרי. פרוטוקול מפורט יותר של תהליך photolithography זמין במקום אחר 35.
    3. לניקוי פרוס סיליקון 8 "במשך 5 דקות ב 100 W עם טיפול פלזמת חמצן.
    4. יוצקים מספיק photoresist השלילי (SU-82,100 עובד היטב) על גבי פרוסות סיליקון כך להתנגד צורות מנה עם קוטר של 2.5 ס"מ. באמצעות coater ספין, ספין את פרוסות סיליקון ב 500 סל"ד עם 100 סל"ד / sec הרמפה ולשמור למשך 10 שניות. ואז הרמפה עד 1,600 סל"ד עם 300 סל"ד / sec ולשמור למשך 30 שניות. הערה: מהירות רמפה צריך להיות מותאם עבור כל תנאי מעבדה להניב עובי להתנגד של 150 מיקרומטר.
    5. Soft-אופים את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, הרמפה עד 95 מעלות צלזיוס עם 360 ° C / שעה, ולשמור במשך 45 דקות. לאט להתקרר לטמפרטורת החדר על פלטה חשמלית. חותם את דפוס כלי על גבי פרוסות סיליקון מצופה על ידי חשיפה לאור UV 365 ננומטר תחת photomask כרום, עם חשיפה משולשת כי המלצת היצרן (350 mJ / 2 ס"מ על עובי SU-8 של כ -150 מיקרומטר).
      הערה: מאז SU-8 הם שלילי להתנגד, באזורים החשופים (הכל מלבד עיצוב הדפוס) יהפכו בלתי מסיסים היזם בשלב 1.1.7.
    6. Hard-לאפות את רקיק חשוף ב 65מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו רמפה עד 95 מעלות צלזיוס עם 360 ° C / שעה ולשמור במשך 25 דקות, ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר לאט RT על הפלטה החשמלית.
    7. לטבול את פרוסות סיליקון ב מפתח SU-8 עבור 10 - 15 דקות כדי לשטוף שלא נחשפו להתנגד, ואז לנקות עם אלכוהול איזופרופיל ויבש תחת זרם חנקן דחוס. בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח את SU-8 להתנגד היא ערובה גם אל רקיק (לחפש פילינג רצויות ובועות).
    8. מדוד את עובי של תכונות התבנית באמצעות profilometer פי הוראות היצרן 36. במהלך רכישת מדידה, להימנע אזורים של המבנה, כי הם חיוניים לתפקוד רשת (כלומר, כניסה וצינורות לשקע) בתור profilometer קשר מבוסס עלולים לסכן את השלמות המבנית של התכונות בדוגמת על פרוסות סיליקון. לחלופין, להשתמש בשיטה ללא מגע (כלומר, אופטי profilometer) כדי למנוע בעיה זו לחלוטין.
  2. Generation של תבניות Patterned ושטוח ליציקת קולגן
    הערה: ידית silanes בתוך במנדף כימי.
    1. מניחים את פרוסות ייבוש עם 100 μl של trichloro (3,3,3-trifluoropropyl) silane במשך שעה 2. כדי silanize פני השטח.
    2. עבר רקיק silanized לתוך 120 x 120 מ"מ צלחת פטרי רבועה. יוצקים אלסטומר PDMS מעורב בגז דה סוכן ריפוי (10: 1 w / פרופורציות) על פרוסות סיליקון להשיג 4 - 6 מ"מ עובי. יוצקי PDMS נוסף לתוך צלחת מרובע נפרדת 120 x 120 מ"מ פטרי ליצור תבניות שטוחות ללא דפוסים. Cure על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. מוציאים מהתנור ולאפשר PDMS כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. באמצעות אזמל בזהירות לחתוך ריבוע סביב SU-8 ולאט לאט לקלף עובש PDMS מן רקיק. חתוך קצוות עד 30 מ"מ x 30 מ"מ. לתבניות שטוחות, לחתוך נרפא PDMS ללא דפוס טבוע לחתיכות מרובעות על 40 מ"מ x 40 מ"מ.

התקנים והשיכון 2.

  1. fabricatיון של למעלה וחלקי שיכון תחתיים
    1. לפברק דיור כלי שיט באמצעות פולי (methacrylate מתיל) (PMMA). כדי לפברק, להורות על החלקים מחנות מכונה סטנדרטית עם מבוקרת מחשב נומרית יכול כרסום (CNC). ראה איור 1 עבור סכמטי של חתיכות העליונות ותחתונות.
    2. לעצב את פיסת דיור העליון (1D איור) לכלול מ"מ 20 מ"מ x 20 גם על החלק התחתון של המכשיר עם עומק של 1 מ"מ, שתי יציאות הזרקת קולגן (4 בקטרים ​​מ"מ) בחלק העליון של המכשיר ממוקם בפינות הכיכר היטב, שני מאגרי כניסה ויציאה עם 6 בקטרי מ"מ, וארבעה חורי ברגים (3 מ"מ קוטר) בארבע הפינות של המכשיר.
      הערה: חורים נוספים נקדחים בשולי היצירה למטרות טיפול.
    3. לעצב את פיסת דיור התחתון (איור 1E) לכלול חור מרובע באמצע (מידות 15 מ"מ x 15 מ"מ) עם הסובבים 25 מ"מ x 25 מ"ממדף עם עומק של 0.25 מ"מ. מקדחה 4 חורי ברגים עם 4-40 חוט. ודא את חורי ברגים בתחתית וחתיכות עליונות תהיינה ליישר יחד במהלך שלבי הרכבה בעתיד.

3. ייצור מכשיר כלי דם קטן

  1. הכנת חומרים
    1. לשטוף ו חיטוי שני סטים של פינצטה, מרית נירוסטה, מברג שטוח קטן, ברגי נירוסטה, וכמה סיכות מסמרת נירוסטה. עבור הייצור של הכלי, גם חיטוי תבניות PDMS micropatterned, PDMS ריבועים שטוחים, coverslips זכוכית (22 x 22 מ"מ), וחתיכות כותנה.
    2. לעקר את החלקים דיור PMMA באקונומיקה לפחות 1 שעה, ולאחר מכן לשטוף עם מים autoclaved בשכונה בתרבית רקמה פעמיים, ולאפשר לאוויר יבש במנות בתרבית רקמה סטרילית (150 מ"מ x 25 מ"מ).
  2. ציפוי - (GA PEI) Polyethyleneimine-glutaraldehyde סטרילי
    1. פנק בארות פנימיות של חתיכות PMMA יבשות מעוקרותעם פלזמה עבור כ 1 דקות. הוסף 1% Polyethyleneimine (PEI) על בארות פנימי (20 מ"מ מרובע היטב בחלק העליון ו -25 מ"מ מדף מרובע בחלק התחתון) של חתיכות PMMA במשך 10 דקות. לשטוף עם O סטרילי H 2 ולאפשר לו להתייבש בשכונה בתרבית רקמה.
      הערה: משך הזמן הנדרש לטיפול פלזמה הוא משתנה בהתאם למכשיר להשתמש - PEI צריך להפיץ מציין משטח הידרופילי בקלות. אם לא, טיפול פלזמה נוסף עשוי להיות נחוץ.
    2. החל 0.1 glutaraldehyde% (GA) על PEI מטופלים משטחים של חתיכות PMMA למשך 30 דקות. יש לשטוף פעמיים עם מים סטריליים ולאפשר לו להתייבש.
      הערה: שבשלבים הבאים, קולגן ידבק המשטח המצופה דרך crosslinking קולגן glutaraldehyde. זה עוזר לאבטח את הג'ל במקום בתוך המכשיר במהלך שלבי הרכבה בעתיד, ובמשך כל תקופת תרבות מכשיר.
  3. קולגן ג'ל הכנה
    1. לפברק כלי באמצעות 0.6% - 1% קולגןפתרונות. כדי להפוך 0.75% קולגן עבור ייצור כלי, לערבב סוג אני קולגן פתרון המניות (1.5% - מבודד עכברוש זנבות 37) עם נתרן הידרוקסידי (NaOH), 10x מוסף מדיה (M199), ומדיה תרבית תאים. שמור את כל הפתרונות על הקרח.
    2. לקבוע את עוצמת הקול של קולגן על ידי המשוואה הבאה, כאשר V ƒinal הוא הנפח הסופי של ג'ל הנדרש (בדרך כלל, 1 מיליליטר של קולגן לכל מכשיר מספיק), V קולגן המניות הוא הנפח של קולגן המניות צורכים, C מניות קולגן הוא הריכוז של קולגן המניות, קולגן ƒinal C הוא הריכוז הרצוי של הקולגן כלי השיט.
      משוואה 1
    3. השתמש מזרק 1 מ"ל להעביר נפח מתאים של קולגן המניות צינור חרוטי 30 מ"ל חדש. קבע את הכרכים של הנטרול NaOH (V NaOH), תוספת תקשורת M199 10x(V 10 X), ו תרבית תאים מדיה (V 1 X) כדלקמן ומערבבים בנפרד צינור חרוטי 15 מ"ל:
      משוואה 2
    4. מוסיפים את תערובת של חומרים כימיים נטרול (V 10 X, V NaOH, V 1 X) אל קולגן aliquoted, ולהשתמש מרית קטנה לערבב בעדינות את הפתרון עד ג'ל הומוגנית מתקבל. הימנע החדרת בועות על ידי ערבוב לאט ובעדינות.
    5. כדי לשלב תאים לתוך המטריצה ​​בריכוז הרצוי (למשל, 0.5 - 20 מיליון תאים / מ"ל), להוסיף את התאים הפתרון קולגן לאחר הוא מעורבב עם חומרים כימיים נטרול, את האש וממשיכים לטגן עד שהתאים מופצים בצורה הומוגנית.
    6. כאשר תאים מתווספים, להתאים את עוצמת הקול של תקשורת תרבית תאים כדי להכיל את הנפח הנוסף, כפי שנקבע על ידי המשוואה הבאה, שבה תא V <תת /> הוא נפח נדרש השעית התא, צפיפות תאי ƒinal C היא הצפיפות הרצויה של תאים בתוך הכלי, צפיפות תאי השעית C היא צפיפות תאי פתרון המניות.
      משוואה 3
  4. הזרקת קולגן - Piece למעלה
    1. מניחים את התבנית PDMS micropatterned בצלחת מ"מ 100 מ"מ x 20. פלזמה לנקות עובש PDMS דקות 1.
    2. יישר את פיסת PMMA העליונה על גבי עובש PDMS כך המאגרים המרובעים על העובש הם ישירות תחת מאגרי הכניסה ויציאה (ראה 1D איור - קווים מקווקווים). מניחים את סיכות מסמרת נירוסטה לתוך הכניסה והיציאה חורים המאגר על פיסת PMMA העליון כדי לשמור על גישה ברורה מהמאגרים לדפוס.
    3. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לחלץ ~ 0.5 - 0.6 מ"ל קולגן. ודא כי אין בועות להישאר בתוך המזרק.
    4. לחץ כלפי מטה lightly עם פינצטה על הדיור העליון לאפשר יצירת קשר סומק בין היצירה העליונה עובש PDMS. להזריק קולגן לאט דרך יציאת זריקה על פיסת PMMA העליונה. בדוק כי קולגן ממלא את תחום 20 מ"מ x 20 מ"מ מעל המרקם ואינו לדלוף החוצה.
    5. סגור את המנה ללא דוחף את הסיכות המסמרות ולאפשר ג'ל בתוך 37 ° C חממה עבור 30 דקות.
  5. הזרקת קולגן - Piece התחתית
    1. מניחים coverslip זכוכית 22 x 22 מ"מ במרכז היצירה התחתונה. השתמש מזרק 1 מ"ל לוותר ~ 0.25 מ"ל קולגן באופן שווה על גבי שקופיות הזכוכית. הורד בעדינות את PDMS מרובע שטוח על קולגן, הבטחת PDMS הוא שטוח נגד PMMA ואין בועות לכודים. אפשר הג'ל על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  6. עצרת תקן
    1. לאחר gelation, להוסיף מספיק PBS ברחבי חתיכת PDMS שטוח על פיסת התחתון להקיף את PDMS (כ 1 מ"ל). להשתמש בפינצטה כדי להסיר כל דוארקולגן xcess מסביב לקצוות, ולאט לאט לקלף את פיסת PDMS. הוסף עוד PBS על גבי קולגן לשמור על הידרציה.
    2. כדי להכין את הפיסה העליונה, להשתמש בפינצטה כדי להרים את פיסת PMMA העליונה והפוך אותה כך עובש PDMS הוא על העליונה. הוסף כמה טיפות של PBS לממשק, ולאחר מכן במהירות ובתקיפות להסיר את התבנית PDMS מן היצירה PMMA העליון.
    3. הוצא בעדינות סיכות מסמרת נירוסטה מהצד השני של דיור PMMA באמצעות זוג אחר של פינצטה. להוסיף עוד כמה טיפות של PBS על קולגן micropatterned. תהפוך את פיסת PMMA העליונה מעל כך קולגן יפנה כלפי מטה ומניח 4 ברגים לתוך החורים בפינה.
    4. בעדינות להניח את הפיסה העליונה על גבי הפיסה התחתונה, ליישר את הברגים עם החורים בפינה על הפיסה התחתונה. אל תאפשר את שני החלקים להחליק אחד נגד השני. השתמש במברג כדי להדק את הברגים באמצעות מגע עדין. אל תהדק.
    5. לשאוב PBS סביב משטחי PMMA ומקום pi קטןECE כותנה תחת קצה אחד של המכשיר. בעזרת פיפטה, להסיר כל PBS מהמאגרים ולהחליף עם תקשורת תרבית תאים. אפשר להתקן ג'ל יחד באינקובטור 37 ° C במשך שעה לפחות 1.
  7. תא מתזמן
    1. תאי אנדותל הטבור וריד האדם תרבות (HUVECs) בתקשורת צמיחה אנדותל ב 37 ° C (CO 2, O 2) כדי confluency 38. במידת האפשר, השתמש בין קטעים 4 ו -7.
    2. Trypsinize לתאי אנדותל על ידי שטיפת בקבוק תרבות עם 6 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.05% ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים. השאר את תאי טריפסין עד שרוב הידבקויות מוקד יש מנותקת והתאים מעוגלים כלפי מעלה (זה בדרך כלל לוקח בערך 2 - 3 דקות). עצור את התגובה טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של התקשורת צמיחה אנדותל המכילה סרום שור העובר (FBS). לשטוף את הבקבוק עם זמן התקשורת השונה בכדי להבטיח את התאים מנותקים מהבקבוק ולאסוףצינור חרוטים.
    3. ספירת התאים באמצעות hemocytometer ו resuspend אותם בצפיפות של 10 מיליון תאים לכל מיליליטר. הסר את כל תרבית תאי התקשורת ממאגרי הכניסה ויציאה. בעזרת קצה טעינת ג'ל 200 μl, להוסיף 10 μl של השעית תא אל מרכז מאגר המפרצון. התאים צריכים להתחיל לזרום אל תוך הרשת מיד מעיל הרשת.
    4. הוסף 200 μl מדיה באופן שווה לבני שני המאגרים ולתת תאים לצרף ולהפיץ ברשת לפחות שעה 1.
  8. תרבות התקן
    1. תרבות המכשיר עם זרימת מונע הכבידה דרך הרשת על ידי הוספת 200 μl של התקשורת בתרבות התא אל המאגר כניסת 50 μl למאגר לשקע. באמצעות שיטה זו של התרבות, להחליף התקשורת כל 12 שעות כדי לשמור על כדאיות האנדותל.
      הערה: אם תנאי תרבות זרימה רציפה רצויים (כדי לשמור על מתח גזירה מתמיד, לאסוף מדיה במוצא, וכו ') א SYRמשאבת אינגה ניתן להשתמש במקום התרבות המונעת הכבידה.
    2. אפשר תאי אנדותל זורעים לפחות 24 השעות כדי לצרף ולייצב לפני יישום זרימה רציפה. לפני התקנת זרימה רציפה, לשמור על המכשירים עם תנאי זרימה מנע הכבידו.
      הערה: תנאי מדיה עבור זרימה שימושית להשתנות מתרבות מונעות הכבידו. התוספת של הרחבת פלזמה, כגון dextran, לתקשורת מייצבת את microvessels המהונדס ומונעת קריסה וסקולרית במהלך זלוף מתמשכת 39.
    3. כדי להפוך את התקשורת עבור התקנת זרימה רציפה, לפזר 3.5% Dextran (70 KDA) בתקשורת צמיחה אנדותל לתרבות כלי אופטימלית. באמצעות טכניקה סטרילית, למלא 10 מ"ל מזרקים עם תקשורת צמיחה אנדותל עם 3.5% Dextran.
    4. הכן צלחת תרבות סטרילי עבור זרימה ידי המסת חורים בקיר בצד של צלחת פטרי באמצעות מלחם.
    5. צרף 12 "צינורות סיליקון (1/32" ID) כדי צימוד מנעול Luer (נקבה, 1/16 "ID), ו- 1 /16 "ישר צינור אל צינור המחבר עם 1" קטע של צינורות בצד השני. הכנס "מחט קהה 20G (מנותקת רכזת המחט) אל הקצה החופשי של 1" 1/4 המגזר. כמו כן להכין 3 "קטע של צינור המחובר לצינור אל צינור 90 ° מרפק מחבר משותף (כדי להיות מצויד בכניסת הדיור). בשלבים הבאים, הצינורות כבר יהיו מושחל דרך הצלחת המוכנה ומצורפים 3 "קטע דרך המחט 20 G. צינורות Outlet צריכים לשקף צינורות יניקה, עם קצה חופשי במקום צימוד מנעול Luer. חיטוי בכל המגזרי לפני השימוש.
    6. מפרסם כניסת autoclaved ו לשקע צינורות דרך חורים בצלחת המוכנה. צרף 3 "מגזרים למחטים פנימיות 20 G. צרף את צימוד lock Luer מזרק התקשורת המלאה ו perfuse תקשורת דרך הצינורות באמצעות משאבת המזרק להגדיר בקצב זרימה גבוה. ודא שאין בועות בצינור או מחברים, כמו אלה יקשה זרימת לכלי השיט.
    7. הכנס את גonnector משותף לתוך כניסת דיור. הגדר את משאבת מזרק לשיעור הזרימה הרצויה ולהתחיל זלוף.
      הערה: זה יכול להיות מותאם בהתאם גיאומטרית כלי תנאי ניסוי מדגיש גזירה מיושמת. עבור ערוץ בקוטר 100 מיקרומטר, בקצב זרימה של 3 μl / min עובד היטב.
    8. אם תרצה, לאסוף perfusate עם צינורות לשקע מוכן מוכנס לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן סטרילי סביב התחתון המכיל 500 μl של התקשורת.
      הערה: כמות קטנה של מדיה מתווספת צינור האיסוף כדי למנוע היווצרות בועה שיכולה לחסום זרימה.
    9. בהתאם קצב הזרימה, את המזרק ייתכן שיהיה צורך ומילא לאחר 24 עד 36 שעות. הדבר נעשה על ידי הסרת מחבר מכניסת הדיור, החלפת המזרק, ומאפשר תקשורת perfuse בקצב זרימה גבוהה במשך כמה דקות. רצף זה מבטיח כי בועות אינן הציגו את הצינורות. אפס את המשאבה לשיעור הזרימה הרצויה לתרבות, להוסיף את המחבר לתוך כניסת דיור,לחזור אל האינקובטור.

ניתוח Device 4.

  1. ניתוח חדיר
    1. השתמש 40 kDa FITC-dextran לדמיין את החדירות של כלי באתרו. מניח את דיור הכלי על מיקרוסקופ confocal ולהתמקד במישור הכלי. הוסף 5 מיקרומטר 40 kDa FITC-dextran אל מפרצון ותמונה בהגדלה 4X, 25 זמן חשיפה msec, ו 1 מסגרת לכל שניות למשך 10 דקות.
    2. לנתח הסדרה תמונה עם קוד ניתוח להעריך את החדירות של Dextran ברחבי בדפנות כלי הדם לתוך קולגן (מיקרומטר / sec) בהתבסס על מודל בהוצאת נג et. al. 31.
  2. ניתוח הדמיה Immunostaining & Confocal
    1. כדי לתקן כלי, perfuse עם פורמלדהיד 3.7% דרך הכניסה במשך 20 דקות ולשטוף ידי מרוססת PBS שלוש פעמים (20 דקות לכל לשטוף). בלוק נוגדן ספציפי מחייב עם 2% אלבומין בסרום שור (BSA) ו -0.5% Triton X-100 PErfused דרך הרשת עבור שעה 1. Perfuse פתרונות נוגדן ראשוני לילה ב 4 מעלות צלזיוס, לשטוף שלוש פעמים עם PBS. Perfuse פתרונות נוגדנים משני 1 - 2 שעות, ולשטוף שוב עם PBS באותו אופן.
    2. קח תמונות immunofluorescence של microvessels באתרו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם z-צעד של 1 מיקרומטר. הדמיית את microvessels בהגדלה של 4X, 10X, או 20X.
      הערה: גדלה של 4X תספק מידע מבנה הרשת הגלובלי, בעוד תמונות מוגדלות 10X ו 20X תספקנה פרטים סלולריים כמו התארכות, היווצרות צומת, וכו.
    3. נתח את ערימות התמונה באמצעות ImageJ עם תחזיות Z (תמונה / ערימות / Z-פרויקט), חתכים (תמונה / ערימות / אורתוגונלית נוף), ו 3D שחזורים (תמונה / ערימות / 3D הפרויקט).
  3. הדמית מיקרוסקופ אלקטרוני סורק
    1. לקבלת ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים, לתקן באתרו על ידי מרוססת חצי כוח הסול של Karnovskyution (2% paraformaldehyde / 2.5% glutaraldehyde חיץ 0.2 M cacodylate) לילה. לפרק את כלי ובזהירות להפריד בין שני החלקים. חתוך בקצוות לטבול מלא בפתרון מקבע במשך כמה ימים.
    2. לטבול את החלק העליון העבה של כלי השיט ב glutaraldehyde 25% למשך 20 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם PBS (2 דקות כל אחד). מייבשים ב שוטף אתנול סדרתי של 50%, 70%, 85% (2 דקות כל אחד) ושני שוטף באתנול 100% (5 דקות כל אחד).
    3. הכן את המדגם עבור ניתוח עם התייבשות נוספת על ידי ייבוש לנקודה קריטית בעקבות פרוטוקול של היצרן 40. גמגום מעיל הספינה עם-פלדיום זהב (7 ננומטר) ולנתח תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם מתח מאיץ של 5 קילו וולט, במקום גודל 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמת הכלים המהונדסת יוצרת microvasculature הפונקציונלי מוטבע בתוך סוג קולגן טבעי שאני מטריקס ומאפשרת שליטה צפופה של הקהילה הסלולר, biophysical ו ביוכימיים במבחנה. כדי לפברק microvessels מהונדסים, תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVECs) הם perfused דרך הרשת microfluidic-מוטבע קולגן איפה שהם מייחסים יוצרים לומן פטנט ו האנדותל ומחוברות. כמו באיור 1 א-ג, גיאומטרית הכלי ניתן שתוכננה במיוחד כדי לענות על שאלות לגבי קצב זרימה, tortuosity, הסתעפות זוויות, בין יתר. ויסות קצב הזרימה דרך microvessels מספק תובנה על מתח בתגובה גזירה של תאי האנדותל. בעבר, ההתמקדות ייצור התאפיין ברובו על כלי בטווח 100 מיקרומטר בגודל, לעומת זאת microvessels עד 500 מיקרומטר או, במקרים מסוימים, קטן ככל 50 מיקרומטר בקוטר היו successfully עשה ותרבותי. דוגמאות patency לטווח ארוכה מוצגות כמו גם את ההישרדות של microvessels המתורבת תחת זרם מונע הכבידה (איור 2 א) ותזרים שימושי רציף (איור 2 ב). תפקידיו של מוסד vivo הנכסים-כמו של microvessels המהונדס ניתן להדגים בכמה דרכים. ניתן למדוד פונקציות אנדותל שונות באמצעות פלטפורמה זו, כולל תפקוד מחסום (איור 3 א), תאי תאי אינטראקציות, אזעקה (איור 3 ב), שיפוץ angiogenic (איור 3 ג). תכונה קריטית של microvessels אלה היא היכולת שלהם להגיב לגירויים דלקתיים באופן ביולוגי רלוונטי. זו באה לידי ביטוי בצורה הטובה ביותר באמצעות האינטראקציה שלהם עם כל הדם באיור 4 א-C שבו האנדותל הלא פעיל הוא שקט (איור 4B) ו האנדותל הופעל גורם היווצרות פקיק (איור 4C). על ידי culturing לתאי אנדותל של differing מקורותיה בתוך פלטפורמה זו, אפשר להבין את ההטרוגניות התפקודית בין תאי האנדותל ממקורות שונים. איור 5 א-ג ממחיש דוגמא ההטרוגניות הזאת עם שני גזע אנושי שונים סוגי תאי אנדותל תאים שמקורם שכאשר בתרבית תצוגת מערכת microvessel פנוטיפים שונים באופן דרסטי 41. על ידי כוונון פרופילי זרימה, רכב תא, ותנאי תרבות, microvessels המהונדס לספק עצמת כלי במבחנה ללמוד ביולוגית האנדותל microvasculature בשתי בריאות ומחלות.

איור 1
איור 1. סכמטי של רשת עיצובי microchannel ייצור פרוטוקול. גיאומטרית רשת כלי הדם ניתן שתוכנן במיוחד כדי ליצור תבניות זרימה שונות. א לדוגמה, עיצוב קנים יהיה נמוך יותר flשיעורי ow בסמוך למרכז (הפחתה של פי 8 ברשת 3 על 3) גורם להיווצרות אזורים של מתח גזירה שונה ומגוונת על האנדותל בתוך אותה ספינה 31. ב. רשת מסועפת מאוד כדלקמן אותו העיקרון כמו העיצוב הקודם אבל עם מקלעת גדולה. עם עיצוב זה, את ההשפעות של ירידה של 50 קפל קצב זרימה, וכתוצאה מכך לירידה בשיעור גזירת 10-500 שניות -1 ניתן להבחין כאשר נפילת לחץ של 1,000 אבא מוחלת על פני הרשת 32. ג עיצובים מורכבים יותר כגון רשת ומפותלת עם פינות חדות 32 יכולים לשמש כדי לענות על שאלות לגבי תגובה האנדותל הפרעות הזרימה למינרית, אשר לעתים קרובות להתרחש בהקשרים פתולוגי 42. Microvessels עשה מדפוסים אלה יהיה בקוטר של 100 -. 150 מיקרומטר D. ישנם שלושה שלבים עיקריים במהלך ייצור microchannel. ראשית, בחלק העליון של לנענע דיור מושם על גבי PDMS בדוגמת עובש רשת כזו כי הכניסה והיציאה מיושרות. קולגן אני מוזרק אז אל תוך החלל הסגור דרך יציאות הזרקה (חץ שחור). בדרך כלל, תערובת ואני קולגן 0.75% משמשת לצורך הייצור. ניתן להשיג ייצור microvessel מוצלח עם נמוך כמו קולגן 0.6%, אולם פחות מ -0.6% תוצאות בדרך כלל חוזק מכאני מספיק וקריסת ערוץ. E. שכבה דקה של קולגן מתווספת החתיכה התחתונה על גבי coverslip, ושטח עם עוד חתיכת PDMS. פ לאחר gelation ב 37 מעלות צלזיוס, PDMS תבניות יוסרו כושונים הדיור העליונים ותחתונים הם דפוקים יחד כדי לתחום את הרשת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
> איור 2. microvessels תרבותי עם פרופילי זרימה מבוקרים. א HUVECs זרע microvessels מתורבת תחת זרם הכבידה מונע ו- B. להחיל זרימה רציפה בשיעור של 3 μl / min. תרבות תחת זרם להחיל מושגת בצורה הטובה ביותר עם ​​תוספת של 3.5% Dextran לתקשורת אשר הוכח לייצב microvessels microfluidic מבוססי קולגן באמצעות הפעלת לחצים פיזיים בתוך לומן המשפרים היווצרות צומת, למרות שהמנגנון המדויק נהיגה בתוקף לכך אינה חד משמעית 39 . Microvessels הוכתמו עבור CD31 חלבון צומת האנדותל או מקבץ של בידול 31 (אדום) גורם פון Willebrand (VWF) גרגירים (ירוק). א ', ב'. בשני התחומים, HUVECs הביע סמנים האנדותל של צמתים תאים תאים ו VWF גרגירים. א ', ב'. נופים אורתוגונלית להראות פטנטים לומן מעוגלות לאחר 6 ימים בתרבות.arge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. Engineered microvessels לחקר תפקוד האנדותל. א. תפקוד המחסום האנדותל ניתן להעריך לאחר זלוף של FITC (isothiocyanate והעמסת) מצומדות Dextran דרך רשתות (למעלה) המדידה העוקבת של דיפוזיה שלה לתוך קולגן בתפזורת (למטה). באמצעות קוד מותאם אישית, קטעי וידאו של זלוף ניתן לנתח כדי להתוות עוצמת פיקסל מעל אזור של אינטרס בתוך המסגרת לאורך זמן על מנת לקבוע את K מקדם חדירות (מיקרומטר / sec) של FITC-dextran. פרסומים קודמים על ידי המעבדה הראו כי החדירות של כלי מהונדסים אלה דומה לזו של vivo לשעבר יונקים כלי 31,43. B. אינטראקציות תא האנדותל עם perivתאי ascular או תמיכה ניתן לנתח פלטפורמה זו על ידי ויסות הרכב הסלולר של מטריצת קולגן. הנה, דוגמא של אינטראקציות תאי תאים אלה ניתן לראות כאשר תאי שריר חלק מוטבעים בתוך קולגן המקיף את הכלי. לאחר 14 ימים בתרבות, תאי שריר החלק (מוכתמים עבור יקטין שריר חלק אלפא (αSMA) בירוק) לקשר עם האנדותל ולהרחיב תהליכים לאורך קיר הכלי ולפעול תאי perivascular כמו לראות את התחזיות המאונכות 31. תמונות המוצגות פנל ו- B הן רפרודוקציות פרסום מוקדם 31. ג. הנבטת שיפוץ angiogenic ניתן להעריכם microvessels מהונדס על ידי שינוי תרבות התקשורת לכלול גירויי angiogenic. ללא גירויי angiogenic, HUVECs להראות הנבטה מינימאלית (משמאל); עם גירויים angiogenic (מעכב מולקולה קטנה 1 מיקרומטר של GSK-3, 20 ng / פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם מ"ל, ו 20 ng / Gro פיברובלסטים בסיסי מ"לwth גורם), HUVECs לנבוט בקלות לתוך המטריצה ​​כפי שניתן לראות מלמעלה למטה תחזיות ונוף מאונך (מימין). אורכו ומספר הניבט ניתן לכמת בקלות עם תוכנת ImageJ 41. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. אינטראקציות דם האנדותל תכנון הנדסי. Microvessels הם שקטים ולהגיב בהתאם לגירויים דלקתיים. .א ללא שינוי, כלי תרבותי HUVEC צילם ליד כניסת תערוכות מכתים junctional CD31 חזק (אדום) ואת סיבוב, לומן פתוח. א '. אורתוגונלית לאור לומן מוצג. B. כאשר citrated דם שלם עם טסיות שכותרתו CD41a (ירוק) הוא perfused דרך כלי שקט באופן דומה, מודעות מינימאליותhesion של טסיות (ירוק) כדי האנדותל הוא ציין. C. עם חשיפה לגירויים דלקתיים כגון phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA, 50 ng / ml) לתקשורת, טפטוף של תוצאות דם שלם ביצירת thrombi גדול (CD41a שכותרתו, ירוק) בתוך הערוץ עצמו הידבקות של לויקוציטים (+ CD45 שכותרתו, לבן) אל קיר כלי 31. תמונות שנראו כאן מובאות מתוך פרסום מוקדם 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. microvessels Generated עם נגזר-ECS תאי גזע האדם. מקורות תא האנדותל נוספים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור microvessels מהונדסים. מוקדם יותר השנה, Palpant et. al. הוכיח כי שני סוגים נבדלים oגזע אנושיים f עובריים תאים שמקורם בתאי האנדותל ניתן להשיג על ידי מניפולציה איתות Wnt / β-קטנין במהלך התמיינות: תאי אנדותל hemogenic (המאופיינת ביטוי HAND1 ופוטנציאל hemogenic גבוהה) ותאי אנדותל דמוי endocardial (מאופיין בחלקו על ידי הביטוי 41 של NFATC1 ו GATA4). א כאשר זורעים ותרבותי במצע כלי 3D, ECS hemogenic לעבור כמה הנבטה angiogenic. B. עם זאת, ECS דמוי endocardial הם הרבה יותר angiogenic ו נודדות, דבר המצביע על ההבדלים הפונקציונליים, אולי בתגובה לזרום, בין שני תת-סוגים של ECS (עבודה זו מוצגת בפירוט רב יותר בפרסום הקודם 41). שני סוגי התאים לבטא חלבוני junctional CD31 (אדום) וכמה VWF (ירוק). צפיות מאונך של שניהם מראים לומן פטנט. ג תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של ECS דמוי endocardial בתוך הכלי מציג נבט angiogenic כפי שניתן לראותמהצד לומינל. תמונות שהוצגו לוחות A ו- B הן רפרודוקציות Palpant et. al. 41. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microvessels המהונדס מהווה מודל במבחנה שבה מאפיינים פיסיולוגיים כגון גיאומטריה לומינל, כוחות הידרודינמית, ואינטראקציות רבות תאיות קיימים מתכונן. סוג של פלטפורמה זו היא בעלת עוצמה בכך שהיא מציעה את היכולת לבנות מודל ללמוד את ההתנהגות אנדותל במגוון הקשרים בהם התנאים תרבות חוץ גופית ניתן להתאים לזה של המיקרו-סביבה המדובר. לדוגמה, מנגנוני נהיגה תהליכים אנדותל, כגון אנגיוגנזה, ידועים להתרחש באופן שונה באיברים שונים וב מצבים פתולוגיים שונים, כגון בריאות ומחלה 44. מסיבה זו, תרבית תאי מישוריים האנדותל היא עקבי לקוי 6 ו כשדה כגון הסתמך במידה רבה על מודלים של בעלי חיים רב יקרים וזמן.

במודלים של בעלי חיים, תוך אינפורמטיבי חיוני בהתקדמות המחקר הביולוגי, לא תמיד לתרגם גם למרפאה.זו יוחסה בעיקר להבדלים בין murine וביולוגיה אנושית, במיוחד לגבי תגובתם לגירויים 9,45. לכן זה חיוני כדי להיות מסוגל לבנות במודלים חוץ גופית שיכולים לספק נתונים על בני אדם ספציפיים נוספים כדי להשלים מידע שלוקטו במודלים של בעלי חיים. במבחנה פלטפורמות יש פוטנציאל לחקות את המיקרו-סביבה של ריבית עם קיבולת נוספת לכוון סביבה. מאפיינים מרכזיים של מערכת כזו צריכים לכלול מבנה התל ממדים וגיאומטריה, רכב תאי מטריקס (ECM), קרבת תא parenchymal ואינטראקציה, זרימת דם, וגירויים ביוכימיים. יש microvessels מהונדס את היכולת לשלב את כל הפרמטרים הללו. ניתן לעשות זאת בעת ובעונה אחת כדי ליצור מודל ומקיף, או להוסיף באופן צעד חכם לבודד תגובות ואינטראקציות פרט.

היבט חזק של microvessels המהונדס הוא היכולתזרימה מלאה לתפעל את הכוחות הידרודינמית המופעל על האנדותל. כדוגמא, המכשיר יכול להיות מתורבת בתנאי זרימת מונע הכביד או עם זלוף הרציף (איור 2). סדר הגודל של לחץ הגזירה על קיר הכלי יכול להיות מווסת בשני התנאים באמצעות שינויים בקצב זרימה ואת גיאומטרית הכלי. ההבדל העיקרי בין שני התנאים הוא החלוקה הזמנית של מאמץ גזירה בתוך הכלי. בתנאי זרימת מונע הכביד, מאמץ הגזירה אינו קבוע לאורך זמן. קצב הזרימה ואת לחץ גזירה הם גבוהים ביותר מייד לאחר שינוי תקשורת כאשר מאגר הכניסה מלא. ככל מנקז התקשורת, מאמץ הגזירה יקטן. זה מוביל מגוון של מאמץ גזירה במשך 12 שעות. ניסויים הדורשים שליטה מדויקת את המאפיינים הידרודינמית (למשל, כדי לחקור את ההשפעות של לחץ גזירה על האנדותל) צריכים להשתמש תנאי תרבות זרימה רציפים.

Emicrovessels ngineered יכול להיות מכוון לענות על מגוון רחב של שאלות עם שינויים קלים יחסית. סוגי תאים שונים, הן parenchymal ו האנדותל, יכולים לשמש מודל מערכות איברים שונים. בנוסף בודה microvessels עם זריעת תא האנדותל, תאי אפיתל יכול במקום לשמש לריפוד הערוץ עבור מחקרים הנוגעים לרירית המעי, alveoli ריאות, אבובית הכליה, וכו '. לאחר microenvironment מוגדר על ידי רכב תא, הפתרון התזונתי (כלומר, תקשורת, דם, גורמי גדילה, או ביולוגי אחר נוזל רלוונטי) המשמש perfuse המכשיר יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות מורכבות על איתות תא, קפאון, מאמץ גזירה חומרים מזינים,, תגובה לתרופה, ועוד. יתר על כן, את הגיאומטריה של הכלי ניתן שתוכננה במיוחד כדי לחקור בתגובת אנדותל גזירת מתח tortuosity. כדוגמה, הפרסום האחרון מ נג et. al. הראה שיש לתאי אנדותל ועלייההפרשת ed VWF והרכבת סיבים באזורי microvessel עם לחץ גזירה גבוה ואצת זרימה. באופן ספציפי, VWF חבילות נוצר בדרך כלל בפינות פניות חדות בתוך הרשת. גיאומטרית הרשת יכולה גם להיות מתוכננת לפברק tubules רב תאי. לדוגמא, עיצוב המכיל שני ערוצים מקבילים אחד עם הכניסה והיציאה שלהם יכול לשמש כדי ליצור מפל ריכוזים או מודל בסביבת אבובית סמוכה (למשל, כלי הלימפה עם microvessel הסמוך). המבנים לרשת כמו של עיצובי רשת נוכחיים (שמוצגים באיור 1 א-ג) הם יתרון עבור מודלים נוזלים חישובית עבור שלמות מבנית במהלך ייצור, אך הם אינם מעידים על מבנה כלי דם בגוף. במחקרים עתידיים, דפוסי רשת פיסיולוגיים יותר כגון אלה עם הסתעפויות היררכיות ופינות מעוגלות אמורים לשמש.

בעוד כל השלבים המתוארים בהליך זה חשוב, שםמספר צעדים קריטיים הנדרשים עבור ייצור microvessel מהונדס מוצלח. ג'ל קולגן חייב להיות מעורב באופן יסודי כדי להשיג פתרון הומוגני, והוא חיוני לא להכניס בועות במהלך שלב זה. זה חיוני עבור כדאיות התא ותפקוד פיזיולוגי, במיוחד עבור ניסויים הכוללים תאים parenchymal במטריצה ​​קולגן. אם תערובת אחידה של קולגן הוא קשה להשיג, לבדוק את ה- pH של התמיסה כדי להבטיח שהוא נייטרלי. אם הבעיה נמשכת, אפשר את מניית קולגן צריכה להיות מוחלפת. עוד צעד קריטי הוא ההרכבה של חתיכות הדיור העליונות ותחתונות - זה הכרחי לא להשתמש בכוח מופרז כמו זה יכול לגרום הערוצים להתמוטט. סיבובים בפועל כמה עשוי להיות נחוץ כדי להשיג תחושה של כמות הכוח הנדרשת ליישום תוך כדי סיבוב הברגים. אם התמוטטות או ניפוץ הערוץ ממשיך להתרחש גם אחרי האימון, זה אפשרי ברשת PDMS הפכה מעוותת בשל absorptיון של לחות. החל תבניות טריות PDMS יעזור לפתור את הבעיה הזו. חורי הליכים אינם נאות במכשיר התחתון גם יכולים לגרום לקריסת ערוץ. אם את הברגים אינם מסוגלים לסובב בצורה חלקה בזמן ההרכבה, כוח נוסף חייב להיות מיושם לעתים קרובות וכתוצאה מכך כשל מבנים. השלב הקריטי האחרון יודגש הוא החשיבות של האכלה תכופה, בדרך כלל כל 12 שעות. זה חיוני לשמירה על האנדותל ומניעת המכשיר מהתייבשות. בכל מקרה שבו זורעים לתאי אנדותל להופיע בריא או לנתק מהקיר קולגן, דרכים אפשריות לשיפור הבריאות האנדותל הם להאכיל את כלי לעתים קרובות יותר, השתמש משאבת מזרק כדי להחיל זרימה רציפה, או לבדוק את ה- pH של ג'ל קולגן כדי להבטיח שהוא היא ברמה פיזיולוגית.

נכון לעכשיו, פלטפורמה זו מוגבלת ייצור עם תאי מטריקס של קשיחות המתאימה כדי לשמור על שלמות מבנית של הערוץ במהלך עצרת. שיתוף צפוףllagen בבית או יותר מ -6 מ"ג / מ"ל ​​מספיקה, אך קולגן פחות מ 6 מ"ג / מ"ל ​​ומטריצות אחרים כגון מטריקס decellularized מאיברים כולו חלשים מדי. זו ניתן להתגבר באמצעות תערובת של קולגן עם מטריקס מדובר. microvessels המהונדס מוגבל גם על ידי הגודל בקנה המידה שלהם. כלי יכול להיות מפוברק על גבול תחתון של כ -100 מיקרומטר, אך שינויים משמעותיים היו צריכים להיות מיושמים כדי להשיג בקנה מידה קטנה יותר. למרות microvessels מהונדסים ליצור שלושה לומן ממדי, הרשת עצמה היא מישוריים. כדי ליצור מקלעת כלי דם תלת ממדים באמת, שינויים נוספים היו צריכים להיות מיושמים כגון יצירת רשת רבה שכבתי ידי ערמת כלי מהונדסים מרובים.

תוצאות נציג המוצגים שיטה זו להדגים כיצד microvessels מהונדסים יכולים לשמש כדי להעריך תפקוד המחסום, איתות תאים תאים (גיוס pericyte וייצוב וסקולרית), אנגיוגנזה, פקקת. מוארghts המחקרים הללו מוצגים כאן עם הצגה מפורטת יותר בפרסומים קודמים 31,32. מחקרים אלו מראים כיצד pericytes להעביר ומעיל האנדותל של microvessels מהונדסים 31, טסיות לדבוק האנדותל מופעל 31, ומתח גזירה נוזל מודולציה ההפעלה האנדותל הפרשת VWF והרכבה 32. Microvessels המהונדס ניתן להשתמש כדי להמשיך לבנות רקמות כלי דם ומערכות איבר ספציפי מודל, כגון כליות 33 או בלב 34. היכולת לשכפל אלה אינטראקציות הפיזיולוגיות דם האנדותל ולכוון את המיקרו-הסביבה ביחס מאמץ הגזירה, גיאומטריה, ECM, ורכב הסלולר יאפשר מחקרים עתידיים של מחלות לב וכלי דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לין ומייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע ורפואה רגנרטיבית וכן מתקן Nanofabrication וושינגטון באוניברסיטת וושינגטון. הם גם מכירים את התמיכה הכספית של המכון הלאומי לבריאות מעניקה DP2DK102258 (כדי YZ), והכשרה מעניקה T32EB001650 (כדי SSK ו MAR) ו T32HL007312 (כדי MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Bioengineering גיליון 115 הנדסת רקמות microvasculature תאי אנדותל הנדסת כלי דם תרבית תאים 3D micropatterning
Micropatterning והרכבת 3D microvessels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter