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Bioengineering

Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि microvessels कि endothelium के शारीरिक गुणों पुनरावृत्ति इंजीनियर को एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि प्रस्तुत करता है। microfluidic आधारित प्रक्रिया में इस तरह के प्रवाह, सेलुलर संरचना, ज्यामिति, और जैव रासायनिक ढ़ाल के रूप में tailorable शर्तों के साथ पेटेंट 3 डी संवहनी नेटवर्क बनाता है। निर्माण की प्रक्रिया और संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण वर्णित हैं।

Abstract

इन विट्रो प्लेटफार्मों में अध्ययन करने के लिए endothelial कोशिकाओं और नाड़ी जीव विज्ञान मोटे तौर पर 2 डी endothelial सेल संस्कृति के लिए सीमित कर रहे हैं, बहुलक या कांच आधारित substrates, और हाइड्रोजेल आधारित ट्यूब गठन assays के साथ कक्षों प्रवाह। ये assays, जबकि जानकारीपूर्ण, लुमेन ज्यामिति, उचित बाह्य मैट्रिक्स, और बहु-कोशिकीय निकटता, जो नाड़ी समारोह नियमन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते पुनरावृत्ति नहीं है। यह पांडुलिपि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर वाहिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि का वर्णन है। Microvessels एक देशी प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड एक microfluidic चैनल में endothelial कोशिकाओं बोने द्वारा गढ़े हैं। कोलेजन मैट्रिक्स गठन चैनल से पहले के भीतर parenchymal कोशिकाओं को शामिल करके, विशिष्ट ऊतक microenvironments मॉडलिंग की है और अध्ययन किया जा सकता है। hydrodynamic गुण और मीडिया रचना के अतिरिक्त modulations वांछित microenvironment के भीतर जटिल नाड़ी समारोह के नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं।इस मंच परिवाहकीय सेल भर्ती, खून-endothelium बातचीत, प्रवाह प्रतिक्रिया, और ऊतक microvascular बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इंजीनियर microvessels एक संवहनी आला के व्यक्तिगत घटकों से प्रभाव को अलग करने की क्षमता प्रदान करते हैं और ठीक दोनों स्वास्थ्य और रोग में नाड़ी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अपने रासायनिक, यांत्रिक, और जैविक गुणों नियंत्रित करते हैं।

Introduction

प्रत्येक अंग में microvasculature ऊतक microenvironment को परिभाषित है, ऊतक homeostasis को बनाए रखने और सूजन, पारगम्यता, घनास्त्रता, और फाइब्रिनोलयन 1,2 विनियमित मदद करता है। 5 - माईक्रवैस्कुलर endothelium, विशेष रूप से, रक्त प्रवाह और आसपास के ऊतकों और इसलिए बीच इंटरफेस ऐसे hydrodynamic बलों और घूम साइटोकिन्स और हार्मोन 3 के रूप में उत्तेजनाओं के जवाब में संवहनी और अंग समारोह नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। endothelium, रक्त के बीच विस्तृत बातचीत को समझने, और आसपास के ऊतक microenvironment संवहनी जीव विज्ञान और रोग प्रगति के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन मुलाकातों के अध्ययन में प्रगति के द्वारा इन विट्रो उपकरण है कि इन विवो microvascular संरचना में पुनरावृत्ति नहीं है और 6.7 से काम में सीमित रुकावट किया गया है। नतीजतन, क्षेत्र और चिकित्सीय उन्नति महंगा है और समय पर भारी भरोसा हैलेने वाली पशु मॉडल है कि अक्सर मनुष्य 8 में सफलता के लिए अनुवाद करने के लिए असफल - 10। जबकि इन विवो मॉडल रोग तंत्र और नाड़ी कार्यों के अध्ययन में अमूल्य हैं, वे जटिल होते हैं और अक्सर biophysical संकेतों व्यक्तिगत सेलुलर, जैव रासायनिक के सटीक नियंत्रण, और की कमी है।

पूरे शरीर में Vasculature अनुकूलित छिड़काव और पोषक तत्व परिवहन एक साथ 11 उपलब्ध कराने, विशाल केशिका बेड के साथ संयोजन के रूप में एक परिपक्व सौपानिक संरचना के पास। प्रारंभ में, एक आदिम जाल जो प्रारंभिक विकास 12,13 के दौरान एक पदानुक्रम branched नेटवर्क से reorganizes के रूप में वाहिका रूपों। हालांकि इन प्रक्रियाओं में शामिल संकेतों से कई अच्छी तरह से समझ रहे हैं 14 - 16 है, यह मायावी बनी हुई है कि कैसे इस तरह के संवहनी patterning चुना गया है 15। बदले में, इन विट्रो में इस प्रक्रिया recapitulating इंजीनियर को संगठित संवहनी नेटवर्क मधुमक्खी हैn मुश्किल है। कई मौजूदा इन विट्रो प्लेटफार्मों वाहिका मॉडल करने के लिए, इस तरह के दो आयामी endothelial सेल संस्कृतियों के रूप में, इस तरह के बहु-कोशिकीय निकटता, तीन आयामी ल्यूमिनल ज्यामिति, प्रवाह, और बाह्य मैट्रिक्स के रूप में महत्वपूर्ण विशेषताओं की कमी है। ट्यूब 3 डी हाइड्रोजेल में गठन assays (कोलेजन या आतंच) 17 - 19 या आक्रमण assays 20,21 अन्य संवहनी 17,22 या ऊतक प्रकार की कोशिकाओं 23 के साथ 3 डी और उनकी बातचीत में endothelial समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इकट्ठे इन assays में lumens इंटरकनेक्टिविटी, रक्तसंचारप्रकरण प्रवाह, और उचित छिड़काव की कमी है। इसके अलावा, इन ट्यूब गठन assays के 24 में संवहनी प्रतिगमन के लिए प्रवृत्ति लंबे समय तक संस्कृति और परिपक्वता जो कार्यात्मक अध्ययन है कि प्रदर्शन किया जा सकता है की डिग्री की सीमा से बचाता है। इस प्रकार, वहाँ एक तेजी से बढ़ते इंजीनियर को microvascular नेटवर्क है कि उचित मॉडल कर सकते हैं एन के इन विट्रो प्लेटफार्मों की जरूरत हैविशेषताओं dothelial और लंबी अवधि संस्कृति में सक्षम हैं।

संवहनी इंजीनियरिंग तकनीक की एक किस्म चिकित्सा अनुप्रयोगों को बदलने के लिए या रोग के साथ रोगियों में बाईपास प्रभावित जहाजों के लिए पिछले कुछ वर्षों में उभरा है। बड़े व्यास वाहिकाओं ऐसे पॉलीथीन terephthalate (पीईटी), और polytetrafluoroethylene (ePTFE) के रूप में सिंथेटिक सामग्री से बनाया दीर्घकालिक प्रत्यक्षता (औसत 95% प्रत्यक्षता पर 5 साल), 25 के साथ काफी चिकित्सीय सफलता मिली है। हालांकि छोटे व्यास सिंथेटिक ग्राफ्ट (<6 मिमी) आम तौर पर इस तरह के intimal हाइपरप्लासिया और thrombopoiesis 26 के रूप में जटिलताओं का सामना - 28, ऊतक छोटे व्यास जैविक सामग्री के साथ किया ग्राफ्ट इंजीनियर महत्वपूर्ण प्रगति 29,30 बना दिया है। इस तरह की प्रगति के बावजूद, microscale पर इंजीनियर वाहिकाओं एक चुनौती बनी हुई है। पर्याप्त रूप से microvasculature मॉडल के लिए, यह SUF साथ जटिल नेटवर्क पैटर्न उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैficient यांत्रिक शक्ति प्रत्यक्षता और एक मैट्रिक्स संरचना है कि parenchymal कोशिकाओं और सेलुलर remodeling के लिए दोनों पोषक तत्व पारगमन के लिए अनुमति देता है के साथ बनाए रखने के लिए।

34 - इस प्रोटोकॉल एक उपन्यास कृत्रिम perfusable पोत नेटवर्क है कि एक ट्यून करने योग्य और चलाया microenvironment 31 के साथ सेटिंग विवो में एक देशी mimics प्रस्तुत करता है। वर्णित विधि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर microvessels उत्पन्न करता है। इंजीनियर microvessels एक microfluidic चैनल है कि मुलायम प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड है के माध्यम से endothelial कोशिकाओं perfusing द्वारा गढ़े हैं। इस प्रणाली की क्षमता, खुले luminal संरचना के साथ नमूनों नेटवर्क उत्पन्न दोहराने बहु सेलुलर बातचीत बाह्य मैट्रिक्स रचना मिलाना, और physiologically प्रासंगिक रक्तसंचारप्रकरण बलों लागू करने के लिए है।

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Protocol

1. नमूनों polydimethylsiloxane (PDMS) नेटवर्क डिजाइन के साथ की Microfabrication

  1. निर्माण मे नेटवर्क डिजाइन की एक नकारात्मक टेम्पलेट बनाने के लिए
    1. किसी भी कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक नेटवर्क पैटर्न बनाएँ। सुनिश्चित करें कि इनलेट और आउटलेट के बीच विकर्ण आयाम भविष्य कदम (2.1.1 देखें) में आवास उपकरणों पर इनलेट और आउटलेट जलाशयों के बीच की दूरी मेल खाते हैं।
      नोट: पैटर्न ही कस्टम उपयोगकर्ता के विशिष्ट अनुसंधान लक्ष्यों पर निर्भर करता है की डिजाइन (उदाहरण के पैटर्न के लिए चित्रा 1 देखें)।
    2. उच्च संकल्प मुद्रण का उपयोग कर नेटवर्क पैटर्न के एक मुखौटा उत्पन्न या एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से एक क्रोम photomask आदेश। फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया के एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और 35 उपलब्ध है।
    3. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के साथ 100 डब्ल्यू पर 5 मिनट के लिए एक 8 "सिलिकॉन वेफर साफ करें।
    4. पर्याप्त नकारात्मक photoresist डालो (SU-82,100 वेफर पर काम करता है अच्छी तरह से) कि इस तरह के रूपों 2.5 सेमी व्यास के साथ एक बड़ा टूकड़ा का विरोध। एक स्पिन coater का प्रयोग, 100 rpm / सेकंड रैंप के साथ 500 rpm पर वेफर स्पिन और 10 सेकंड के लिए बनाए रखें। तब 300 rpm / सेकंड के साथ 1,600 rpm के लिए रैंप और 30 सेकंड के लिए बनाए रखें। नोट: गति और रैंप 150 माइक्रोन की मोटाई के विरोध उपज के लिए प्रत्येक प्रयोगशाला हालत के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता।
    5. शीतल सेंकना 7 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर, ऊपर 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 360 डिग्री सेल्सियस / घंटा के साथ रैंप, और 45 मिनट के लिए बनाए रखें। धीरे-धीरे गर्म थाली पर कमरे के तापमान को शांत हो जाओ। एक क्रोम photomask के तहत 365 एनएम यूवी प्रकाश के संपर्क से लेपित वेफर पर पोत पैटर्न छाप, जोखिम के साथ कि निर्माता की सिफारिश (350 MJ / लगभग 150 माइक्रोन के एक सु-8 मोटाई के लिए 2 सेमी) की ट्रिपल।
      नोट: चूंकि र -8 एक नकारात्मक विरोध है, उजागर क्षेत्रों (पैटर्न डिजाइन के अलावा सब कुछ) चरण 1.1.7 में डेवलपर के लिए अघुलनशील हो जाएगा।
    6. हार्ड-सेंकना 65 में अवगत कराया वेफर5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस और 360 डिग्री सेल्सियस / घंटा के साथ 95 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप और 25 मिनट के लिए बनाए रखना है, तो यह धीरे-धीरे गर्म थाली पर आरटी को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. SU-8 डेवलपर में विसर्जित कर दिया वेफर 10 - 15 मिनट दूर धोने के लिए unexposed का विरोध, तो isopropyl शराब के साथ साफ और शुष्क एक संकुचित नाइट्रोजन प्रवाह के तहत। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पैटर्न का निरीक्षण सुनिश्चित करने के लिए SU-8 विरोध में अच्छी तरह से वेफर को बंधुआ है (अवांछित छीलने और बुलबुले के लिए देखो)।
    8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 36 एक profilometer का उपयोग कर पैटर्न सुविधाओं की मोटाई मापने। माप अधिग्रहण के दौरान, संरचना है कि नेटवर्क समारोह (यानी, इनलेट और आउटलेट नाली) एक संपर्क आधारित profilometer वेफर पर नमूनों सुविधाओं के संरचनात्मक अखंडता समझौता कर सकता है के रूप में के लिए आवश्यक हैं के क्षेत्रों से बचें। वैकल्पिक रूप से, इस मुद्दे पर पूरी तरह से बचने के लिए एक गैर संपर्क विधि (यानी, ऑप्टिकल profilometer) का उपयोग करें।
  2. जीईकोलेजन मोल्डिंग के लिए नमूनों और फ्लैट Molds के neration
    नोट: एक रासायनिक धूआं हुड के भीतर silanes संभाल लेना।
    1. सतह silanize को 2 घंटे के लिए trichloro (3,3,3-trifluoropropyl) silane के 100 μl के साथ एक desiccator में वेफर रखें।
    2. एक 120 x 120 मिमी वर्ग पेट्री डिश में silanized वेफर स्थानांतरण। 6 मिमी मोटाई - 4 हासिल करने के लिए वेफर ओवर: मिश्रित और de-मार डाला PDMS elastomer और इलाज एजेंट (1 डब्ल्यू डब्ल्यू अनुपात / 10) डालो। पैटर्न के बिना फ्लैट नए नए साँचे उत्पन्न करने के लिए एक अलग से 120 x 120 मिमी वर्ग पेट्री डिश में अतिरिक्त PDMS डालो। 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इलाज।
    3. ओवन से निकालें और PDMS कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। एक छुरी का प्रयोग सावधानी से SU-8 के चारों ओर एक वर्ग में कटौती और धीरे-धीरे वेफर से PDMS ढालना बंद छील। 30 मिमी x 30 मिमी करने के लिए किनारों ट्रिम। फ्लैट molds के लिए, कट 40 मिमी x 40 मिमी के बारे में चौकोर टुकड़ों में एक अंकित पैटर्न के बिना ठीक PDMS।

2. आवास डिवाइसेज

  1. fabricatशीर्ष के आयन और नीचे हाउसिंग मोहरे
    1. पोत आवास पाली (मिथाइल methacrylate) का उपयोग (PMMA) बनाना। , बनाना कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रित (सीएनसी) मिलिंग क्षमताओं के साथ एक मानक मशीन की दुकान से भागों आदेश। ऊपर और नीचे के टुकड़े का एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें।
    2. डिजाइन शीर्ष आवास टुकड़ा (चित्रा -1) एक 20 मिमी x 20 मिमी शामिल करने के कोनों पर स्थित डिवाइस के शीर्ष पर 1 मिमी की गहराई के साथ डिवाइस के नीचे, दो कोलेजन इंजेक्शन बंदरगाहों (4 मिमी व्यास) पर अच्छी तरह से वर्ग की अच्छी तरह से, 6 मिमी व्यास के साथ दो इनलेट और आउटलेट जलाशयों, और डिवाइस के चारों कोनों पर चार पेंच छेद (3 मिमी व्यास)।
      नोट: अतिरिक्त छेद से निपटने के प्रयोजनों के लिए टुकड़ा की परिधि पर drilled किया जा सकता है।
    3. डिजाइन नीचे आवास टुकड़ा (चित्रा 1E) बीच में एक वर्ग छेद शामिल करने के लिए (आयाम 15 मिमी x 15 मिमी) एक आसपास के 25 मिमी x 25 मिमी के साथ0.25 मिमी की गहराई के साथ शेल्फ। ड्रिल 4-40 धागे के साथ 4 पेंच छेद। तल में पेंच छेद को सुनिश्चित करने और शीर्ष टुकड़े भविष्य विधानसभा चरणों के दौरान एक साथ पंक्ति में होगा।

3. microvessel उपकरण निर्माण

  1. सामग्री की तैयारी
    1. धो और चिमटी के दो सेट, एक स्टेनलेस स्टील रंग, एक छोटे से फ्लैट स्क्रू ड्राइवर, स्टेनलेस स्टील स्क्रू, और कई स्टेनलेस स्टील dowel पिन आटोक्लेव। जहाजों के निर्माण के लिए भी micropatterned PDMS नए नए साँचे आटोक्लेव, फ्लैट चौराहों, कांच coverslips (22 x 22 मिमी), और कपास टुकड़े PDMS।
    2. कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लीच में PMMA आवास टुकड़े जीवाणुरहित, तो दो बार टिशू कल्चर हुड में autoclaved पानी से कुल्ला, और बाँझ टिशू कल्चर व्यंजन में शुष्क हवा (150 मिमी x 25 मिमी) करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. बाँझ Polyethyleneimine-glutaraldehyde (पी - जीए) कोटिंग
    1. निष्फल सूखी PMMA टुकड़े के भीतरी कुओं समझोलगभग 1 मिनट के लिए प्लाज्मा के साथ। 1% Polyethyleneimine (पी) भीतरी कुओं 10 मिनट के लिए PMMA टुकड़े (20 मिमी वर्ग अच्छी तरह से ऊपर और 25 मिमी तल पर वर्ग शेल्फ) पर जोड़ें। साथ बाँझ एच 2 ओ कुल्ला और टिशू कल्चर हुड में सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: समय प्लाज्मा उपचार के लिए आवश्यक प्रयुक्त उपकरण पर निर्भर चर रहा है - पी आसानी से एक हाइड्रोफिलिक सतह का संकेत फैल चाहिए। यदि नहीं, तो अतिरिक्त प्लाज्मा उपचार के लिए आवश्यक हो सकता है।
    2. 0.1% glutaraldehyde (जीए) पर पी 30 मिनट के लिए इलाज किया PMMA टुकड़े की सतहों को लागू करें। बाँझ पानी के साथ दो बार कुल्ला और सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: भविष्य चरणों में, कोलेजन कोलेजन glutaraldehyde crosslinking के माध्यम से लेपित सतह का पालन करना होगा। यह भविष्य विधानसभा चरणों के दौरान और डिवाइस संस्कृति अवधि के दौरान डिवाइस के भीतर जगह में जेल को सुरक्षित मदद करता है।
  3. कोलेजन जेल तैयारी
    1. 1% कोलेजन - 0.6% का उपयोग वाहिकाओं बनानासमाधान की। पोत निर्माण के लिए 0.75% कोलेजन बनाने के लिए, मिश्रण प्रकार मैं शेयर समाधान कोलेजन (1.5% - चूहे से अलग पूंछ 37) सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH), 10x मीडिया अनुपूरक (M199), और सेल संस्कृति मीडिया के साथ। बर्फ पर सभी समाधान रखें।
    2. निम्न समीकरण, जहां वी ƒinal आवश्यक जेल की अंतिम मात्रा है द्वारा कोलेजन की मात्रा का निर्धारण (आमतौर पर, डिवाइस प्रति कोलेजन के 1 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त है), वी शेयर कोलेजन शेयर की जरूरत कोलेजन की मात्रा है, सी कोलेजन शेयर एकाग्रता है शेयर कोलेजन की, और सी ƒinal कोलेजन के बर्तन में कोलेजन के वांछित एकाग्रता है।
      1 समीकरण
    3. एक नया 30 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब शेयर कोलेजन की उचित मात्रा हस्तांतरण करने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। निष्क्रिय NaOH (वी NaOH) की मात्रा का निर्धारण करते हैं, M199 10x मीडिया के पूरक(वी 10 एक्स), और सेल संस्कृति मीडिया (वी 1 एक्स) के रूप में इस प्रकार के और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अलग से मिश्रण:
      2 समीकरण
    4. निष्क्रिय अभिकर्मकों (वी 10 एक्स, वी NaOH, वी 1 एक्स) aliquoted कोलेजन के मिश्रण जोड़ें, और एक छोटा सा रंग का उपयोग धीरे समाधान मिश्रण करने के लिए जब तक एक सजातीय जेल प्राप्त की है। और धीरे धीरे सरगर्मी से बुलबुले शुरू करने से बचें।
    5. - (20 मिलियन कोशिकाओं / एमएल जैसे, 0.5) के बाद यह निष्क्रिय अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है कोलेजन समाधान करने के लिए कोशिकाओं को जोड़ने, और हलचल जब तक कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं जारी रखने के लिए वांछित एकाग्रता में मैट्रिक्स में कोशिकाओं को शामिल करने के लिए।
    6. जब कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं, के रूप में निम्न समीकरण, जहां वी कोशिकाओं द्वारा निर्धारित, अतिरिक्त मात्रा को समायोजित करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया की मात्रा समायोजित </ उप> सेल निलंबन के लिए आवश्यक मात्रा है, सी ƒinal सेल घनत्व के बर्तन में कोशिकाओं के वांछित घनत्व है, सी निलंबन सेल घनत्व शेयर समाधान में कोशिकाओं का घनत्व है।
      3 समीकरण
  4. कोलेजन इंजेक्शन - शीर्ष टुकड़ा
    1. एक 100 मिमी x 20 मिमी डिश में micropatterned PDMS मोल्ड रखें। प्लाज्मा 1 मिनट के लिए PDMS मोल्ड साफ।
    2. PDMS मोल्ड के शीर्ष पर शीर्ष PMMA टुकड़ा संरेखित इतना है कि मोल्ड पर वर्ग जलाशयों इनलेट और आउटलेट जलाशयों के तहत सीधे कर रहे हैं (देखें चित्र -1 डी - धराशायी लाइनों)। इनलेट में स्टेनलेस स्टील dowel पिन की जगह और शीर्ष PMMA टुकड़े पर जलाशय छेद आउटलेट पैटर्न के लिए जलाशयों से स्पष्ट पहुँच बनाए रखने के लिए।
    3. 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें ~ निकालने के लिए 0.5 - 0.6 मिलीलीटर कोलेजन। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले सिरिंज में रहते हैं।
    4. एल नीचे प्रेसightly शीर्ष आवास पर चिमटी के साथ शीर्ष टुकड़ा और PDMS मोल्ड के बीच फ्लश संपर्क सुनिश्चित करने के लिए। शीर्ष PMMA टुकड़े पर एक इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से धीरे-धीरे कोलेजन इंजेक्षन। जाँच करें कि कोलेजन पैटर्न ऊपर 20 मिमी x 20 मिमी डोमेन में भर जाता है और बाहर लीक नहीं करता है।
    5. dowel पिन jostling के बिना पकवान बंद करो और 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जेल के लिए अनुमति देते हैं।
  5. कोलेजन इंजेक्शन - नीचे टुकड़ा
    1. नीचे टुकड़ा के केंद्र में एक 22 x 22 मिमी गिलास coverslip रखें। गिलास स्लाइड पर समान रूप से वितरित करने के लिए ~ 0.25 मिलीग्राम कोलेजन 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। धीरे कोलेजन के ऊपर PDMS फ्लैट वर्ग के लिए कम, यह सुनिश्चित करना PDMS PMMA के खिलाफ फ्लैट है और कोई फंस बुलबुले हैं। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जेल की अनुमति दें।
  6. विधानसभा डिवाइस
    1. जमाना के बाद, नीचे टुकड़ा पर फ्लैट PDMS टुकड़ा के आसपास काफी पीबीएस जोड़ने PDMS (लगभग 1 मिलीलीटर) को चारों ओर। किसी भी ई दूर करने के लिए चिमटी का प्रयोग करेंकिनारों के आसपास Xcess कोलेजन, और धीरे धीरे PDMS टुकड़ा दूर छील। कोलेजन हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए के शीर्ष पर अधिक पीबीएस जोड़ें।
    2. शीर्ष टुकड़ा तैयार करने के लिए, शीर्ष PMMA टुकड़ा लेने के लिए और यह फ्लिप इतना है कि PDMS मोल्ड शीर्ष पर है चिमटी का उपयोग करें। फिर जल्दी इंटरफ़ेस करने के लिए पीबीएस की कुछ बूँदें जोड़ें, और मजबूती से शीर्ष PMMA टुकड़े से PDMS मोल्ड को हटा दें।
    3. धीरे चिमटी की एक और जोड़ी का उपयोग PMMA आवास के दूसरी तरफ से स्टेनलेस स्टील dowel पिन निकाल दें। पीबीएस के कई अधिक बूँदें micropatterned कोलेजन पर जोड़ें। खत्म PMMA शीर्ष टुकड़ा फ्लिप इतना है कि कोलेजन नीचे का सामना करना पड़ता है और कोने छेद में 4 शिकंजा जगह है।
    4. धीरे नीचे टुकड़ा के शीर्ष पर शीर्ष टुकड़ा रखना, नीचे टुकड़ा पर कोने छेद के साथ शिकंजा संरेखित। दो टुकड़े एक दूसरे के खिलाफ स्लाइड करने के लिए अनुमति न दें। एक कोमल स्पर्श का उपयोग कर शिकंजा कसने के लिए एक शराबी का प्रयोग करें। अधिक मत कसो।
    5. पीबीएस आसपास के PMMA सतहों Aspirate और एक छोटी सी गड़बड़ी जगहडिवाइस के एक किनारे के तहत कपास की ईसीई। एक विंदुक का प्रयोग, जलाशयों से किसी भी पीबीएस निकालें और सेल संस्कृति मीडिया के साथ बदलें। डिवाइस में कम से कम 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक साथ जेल की अनुमति दें।
  7. सेल बोने
    1. संस्कृति मानव नाल की शिरा endothelial 37 डिग्री सेल्सियस पर endothelial वृद्धि मीडिया में कोशिकाओं (HUVECs) (सीओ 2, हे 2) confluency 38 करने के लिए। जब भी संभव हो, मार्ग 4 और 7 के बीच का उपयोग करें।
    2. पीबीएस के 6 मिलीलीटर के साथ संस्कृति कुप्पी धोने और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ने 0.05% trypsin के 2 मिलीलीटर कोशिकाओं को अलग कर देना द्वारा endothelial कोशिकाओं Trypsinize। trypsin में कोशिकाओं को छोड़ दें जब तक फोकल adhesions के सबसे अलग है और कोशिकाओं को गोल कर रहे हैं (यह आमतौर पर के बारे में 2 लेता है - 3 मिनट)। भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त endothelial वृद्धि मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़कर trypsin प्रतिक्रिया बंद करो। मीडिया में कई बार साथ फ्लास्क धो सुनिश्चित कोशिकाओं कुप्पी से अलग कर रहे हैं और इकट्ठा करने के लिएएक शंक्वाकार ट्यूब में।
    3. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और उन्हें मिलीलीटर प्रति 10 लाख की कोशिकाओं के घनत्व पर resuspend। इनलेट और आउटलेट जलाशयों से सभी सेल संस्कृति मीडिया निकालें। एक 200 μl जेल लोड हो रहा टिप का उपयोग करना, इनलेट जलाशय के केंद्र में सेल निलंबन के 10 μl जोड़ें। कोशिकाओं नेटवर्क तुरंत और कोट नेटवर्क में प्रवाह करने के लिए शुरू करना चाहिए।
    4. दोनों जलाशयों के लिए समान रूप से 200 μl मीडिया जोड़ें और दो कोशिकाओं देते हैं और कम से कम 1 घंटे के लिए नेटवर्क के भीतर फैल गया।
  8. डिवाइस संस्कृति
    1. संस्कृति इनलेट जलाशय में सेल संस्कृति मीडिया के 200 μl और आउटलेट जलाशय के लिए 50 μl जोड़कर नेटवर्क के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह के साथ डिवाइस। संस्कृति के इस विधि के साथ, मीडिया endothelial व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए हर 12 घंटे की जगह।
      नोट: सतत प्रवाह संस्कृति की स्थिति वांछनीय हैं (, लगातार कतरनी तनाव बनाए रखने के लिए दुकान, आदि पर मीडिया इकट्ठा) एक SYRइंगे पंप गुरुत्वाकर्षण संचालित संस्कृति के बजाय प्रयोग किया जा सकता है।
    2. वरीय endothelial कोशिकाओं में कम से कम 24 घंटा देते हैं और सतत प्रवाह लागू करने से पहले स्थिर करने की अनुमति दें। सतत प्रवाह सेटअप करने से पहले, गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह की स्थिति के साथ उपकरणों को बनाए रखने।
      नोट: एप्लाइड प्रवाह के लिए मीडिया की स्थिति गुरुत्वाकर्षण संचालित संस्कृति से भिन्न होते हैं। ऐसे dextran के रूप में एक प्लाज्मा विस्तारक, के अलावा, मीडिया के लिए इंजीनियर microvessels स्थिर और सतत छिड़काव 39 के दौरान संवहनी पतन रोकता है।
    3. सतत प्रवाह स्थापना के लिए मीडिया बनाने के लिए, इष्टतम पोत संस्कृति के लिए endothelial वृद्धि मीडिया में 3.5% dextran (70 केडीए) भंग। बाँझ तकनीक का उपयोग करना, 3.5% dextran साथ endothelial वृद्धि मीडिया के साथ 10 मिलीलीटर सीरिंज भरें।
    4. एक टांका लोहे का उपयोग कर एक पेट्री डिश की ओर दीवार में छेद के पिघलने से प्रवाह के लिए एक बाँझ संस्कृति पकवान तैयार करें।
    5. एक Luer ताला युग्मन (महिला, 1/16 "आईडी) के लिए 12" सिलिकॉन टयूबिंग (1/32 "आईडी) देते हैं, और एक 1 /16 दूसरे छोर पर ट्यूबिंग के खंड "सीधे एक 1 के साथ ट्यूब करने वाली ट्यूब कनेक्टर"। खंड एक 1/4 "1 से मुक्त करने के लिए अंत 20G कुंद सुई (सुई हब से अलग)" डालें। इसके अलावा (आवास इनलेट में फिट किया जा सकता है)। बाद के चरणों में, अब ट्यूबिंग तैयार पकवान के माध्यम से पिरोया जाएगा और 3 से जुड़ी एक ट्यूब करने वाली ट्यूब 90 ° कोहनी कनेक्टर संयुक्त से जुड़ी टयूबिंग की एक 3 "खंड तैयार 20 जी सुई के माध्यम से "खंड। आउटलेट ट्यूबिंग इनलेट ट्यूबिंग दर्पण चाहिए, एक मुक्त अंत के बजाय एक Luer ताला युग्मन के साथ। सभी वर्गों का उपयोग करने से पहले आटोक्लेव।
    6. तैयार पकवान में छेद के माध्यम autoclaved इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग थ्रेड। 3 "भीतर 20 जी सुइयों के लिए खंडों संलग्न। मीडिया से भरे सिरिंज Luer ताला युग्मन देते हैं और ट्यूबिंग सिरिंज पंप एक उच्च प्रवाह दर पर सेट का उपयोग कर के माध्यम से मीडिया छिड़कना। सुनिश्चित ट्यूबिंग या कनेक्टर्स में कोई बुलबुले देखते हैं कि, इन के रूप में पोत के लिए प्रवाह को रोकना होगा।
    7. ग डालेंonnector आवास इनलेट में संयुक्त। वांछित प्रवाह की दर के लिए सिरिंज पंप सेट और छिड़काव शुरू करते हैं।
      नोट: इस पोत ज्यामिति और लागू कतरनी तनाव की प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। एक 100 मीटर व्यास चैनल के लिए, 3 μl के प्रवाह की दर / मिनट अच्छी तरह से काम करता है।
    8. अगर वांछित, तैयार आउटलेट ट्यूबिंग एक बाँझ 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे मीडिया के 500 μl युक्त ट्यूब में डाला साथ perfusate इकट्ठा।
      नोट: मीडिया की एक छोटी राशि बुलबुला गठन कि प्रवाह को ब्लॉक कर सकते हैं रोकने के लिए ट्यूब का संग्रह करने के लिए जोड़ा गया है।
    9. प्रवाह की दर पर निर्भर करता है, सिरिंज 24 से 36 घंटे के बाद refilled किया जाना पड़ सकता है। इस आवास प्रवेश से कनेक्टर को हटाने, सिरिंज की जगह है, और मीडिया के कई मिनट के लिए एक उच्च प्रवाह दर पर छिड़कना करने की अनुमति देकर किया जाता है। इस क्रम सुनिश्चित करता है कि बुलबुले ट्यूबिंग के लिए पेश नहीं कर रहे हैं। , संस्कृति के लिए वांछित प्रवाह की दर के लिए पंप रीसेट आवास इनलेट में कनेक्टर डालें, औरइनक्यूबेटर में लौटने।

4. डिवाइस विश्लेषण

  1. पारगम्यता विश्लेषण
    1. बगल में पोत की पारगम्यता कल्पना करने के लिए 40 केडीए FITC-dextran का प्रयोग करें। एक confocal खुर्दबीन पर पोत आवास की जगह और पोत विमान पर ध्यान केंद्रित। 4X बढ़ाई, 25 मिसे जोखिम समय पर प्रवेश और छवि के लिए 5 माइक्रोन के 40 केडीए FITC-dextran जोड़ें, और 10 मिनट के लिए प्रति सेकंड 1 फ्रेम पर।
    2. विश्लेषण कोड के साथ छवि श्रृंखला का विश्लेषण एक मॉडल झेंग एट द्वारा प्रकाशित के आधार पर कोलेजन (माइक्रोन / सेक) में पोत दीवार के पार dextran की पारगम्यता का अनुमान है। अल। 31।
  2. Immunostaining और Confocal इमेजिंग विश्लेषण
    1. वाहिकाओं को ठीक करने के लिए, पीबीएस तीन बार (धोने प्रति 20 मिनट) perfusing से 20 मिनट और धोने के लिए प्रवेश के माध्यम से 3.7% formaldehyde के साथ छिड़कना। ब्लॉक अविशिष्ट एंटीबॉडी 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.5% ट्राइटन X-100 पीई के साथ बाध्यकारी1 घंटे के लिए नेटवर्क के माध्यम से rfused। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान छिड़कना और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। 1 के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान छिड़कना - 2 घंटा, और एक ही तरीके से पीबीएस के साथ फिर से धो लें।
    2. 1 माइक्रोन की एक z कदम के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग बगल में microvessels के immunofluorescence छवियों ले लो। छवि 4X, 10X, 20X या के एक बढ़ाई microvessels।
      नोट: 4X की बढ़ाई, वैश्विक नेटवर्क संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करेगा, जबकि 10X और 20x बढ़ाया छवियों ऐसे बढ़ाव, जंक्शन गठन, आदि के रूप में सेलुलर विवरण प्रदान करेगा।
    3. जेड अनुमानों (छवि / ढेर / जेड परियोजना), पार वर्गों (छवि / ढेर / विषयेतर देखें), और 3 डी पुनर्निर्माण (छवि / ढेर / 3 डी परियोजना) के साथ ImageJ का उपयोग कर छवि के ढेर का विश्लेषण।
  3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
    1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, आधा ताकत perfusing Karnovsky के सोल से बगल में ठीकसंविधान (2% 0.2 एम cacodylate बफर में paraformaldehyde / 2.5% glutaraldehyde) रातोंरात। पोत जुदा और ध्यान दो टुकड़े अलग। किनारों ट्रिम और पूरी तरह से कई दिनों के लिए लगानेवाला समाधान में विसर्जित कर दिया।
    2. 20 मिनट के लिए 25% glutaraldehyde में पोत की मोटी शीर्ष भाग को विसर्जित कर दिया और पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला (2 मिनट प्रत्येक)। 50%, 70%, 85% (2 मिनट प्रत्येक) और 100% इथेनॉल (5 मिनट प्रत्येक) में दो washes के धारावाहिक इथेनॉल washes में निर्जलीकरण।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल 40 निम्नलिखित महत्वपूर्ण बिंदु सूखने से आगे निर्जलीकरण के साथ विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करें। सोने-पैलेडियम (7 एनएम) के साथ कोट पोत धूम और 5 केवी, स्थान आकार 3 की एक त्वरक वोल्टेज के साथ एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण।

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Representative Results

इंजीनियर पोत मंच कार्यात्मक microvasculature एक प्राकृतिक कोलेजन प्रकार मैं मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड बनाता है और इन विट्रो में, सेलुलर biophysical और जैव रासायनिक पर्यावरण की तंग नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। इंजीनियर microvessels बनाना, मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कोलेजन एम्बेडेड microfluidic नेटवर्क है, जहां वे एक पेटेंट लुमेन और मिला हुआ endothelium फार्म को देते माध्यम से भरकर रखा जाता है। जैसा कि चित्र 1 ए सी में सचित्र, पोत ज्यामिति विशेष कोण शाखाओं में बंटी, दूसरों के बीच में प्रवाह की दर, टेढ़ा-मेढ़ापन के बारे में सवालों का जवाब देने के लिए तैयार किया जा सकता है, और। microvessels के माध्यम से प्रवाह की दर नियमन endothelial कोशिकाओं की कतरनी तनाव प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इससे पहले, निर्माण फोकस व्यास में 50 माइक्रोन के रूप में मुख्य रूप से 100 माइक्रोन आकार सीमा में जहाजों पर किया गया है, हालांकि 500 ​​माइक्रोन तक की microvessels या कुछ मामलों में, छोटे रूप में succ किया गया हैessfully बनाया और सुसंस्कृत। दीर्घकालिक प्रत्यक्षता के उदाहरण गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह (2A चित्रा) और सतत प्रवाह एप्लाइड (चित्रा 2 बी) के तहत सुसंस्कृत microvessels के अस्तित्व के साथ ही दिखाए जाते हैं। इंजीनियर microvessels के vivo तरह गुण कई मायनों में प्रदर्शन किया जा सकता है। विभिन्न कार्यों endothelial इस मंच का उपयोग, बाधा समारोह (चित्रा 3), सेल सेल बातचीत और संकेत (चित्रा 3 बी), और एन्जियोजेनिक remodeling (चित्रा 3 सी) सहित मापा जा सकता है। इन microvessels की एक महत्वपूर्ण विशेषता उनकी एक जैविक रूप से प्रासंगिक ढंग से भड़काऊ उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया करने की क्षमता है। यह सबसे अच्छा चित्रा -4 ए सी में पूरे रक्त जहां गैर-सक्रिय endothelium मौन है (चित्रा 4 बी) के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से प्रदर्शन किया है और सक्रिय endothelium thrombus गठन (चित्रा 4C) लाती है। di के endothelial कोशिकाओं संवर्धन द्वाराइस मंच के भीतर मूल ffering, यह अलग स्रोतों से endothelial कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक विविधता को समझने के लिए संभव है। चित्रा 5 ए-सी दो अलग अलग मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न endothelial सेल प्रकार के साथ इस विविधता का एक उदाहरण दिखाता है कि जब microvessel प्रणाली प्रदर्शन में सुसंस्कृत काफी अलग phenotypes 41। प्रवाह प्रोफाइल, सेल संरचना, और संस्कृति की स्थिति ट्यूनिंग, इंजीनियर microvessels endothelial जीव विज्ञान और दोनों के स्वास्थ्य और रोग में microvasculature अध्ययन करने के लिए इन विट्रो उपकरण में एक शक्तिशाली प्रदान करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. नेटवर्क के योजनाबद्ध डिजाइन और निर्माण Microchannel प्रोटोकॉल। संवहनी नेटवर्क ज्यामिति विशेष रूप से विभिन्न प्रवाह पैटर्न उत्पन्न करने के लिए तैयार किया जा सकता। ए उदाहरण के लिए, एक branched डिजाइन FL कमी आई है जाएगाकेंद्र के पास ओउ दर (एक 3 से 3 ग्रिड में एक 8 गुना कमी) एक ही पोत 31। बी भीतर endothelium पर विविध कतरनी तनाव के क्षेत्रों में जिसके परिणामस्वरूप। एक अत्यधिक branched ग्रिड पिछले डिजाइन के रूप में, लेकिन एक बड़ा जाल के साथ एक ही सिद्धांत को मानता है। इस डिजाइन के साथ, प्रवाह की दर में 50 गुना कमी, 500 सेकंड के लिए 10 से एक कतरनी दर में कमी में जिसके परिणामस्वरूप के प्रभाव -1 जब 1,000 पा के एक दबाव ड्रॉप नेटवर्क भर में लागू किया जाता है मनाया जा सकता है 32 सी। और अधिक जटिल डिजाइन इस तरह के तेज कोनों के साथ एक कपटपूर्ण नेटवर्क के रूप में 32 लामिना का प्रवाह करने के लिए रुकावट है, जो अक्सर रोग संदर्भों 42 में होने की endothelial प्रतिक्रिया के बारे में सवालों का जवाब देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वहाँ microchannel निर्माण के दौरान तीन प्रमुख कदम उठाए हैं 150 माइक्रोन डी -। इन नमूनों से बना microvessels 100 की एक व्यास होगा। सबसे पहले, आवास जिग के शीर्ष भाग PDM के शीर्ष पर रखा गया हैएस नमूनों नेटवर्क ढालना है कि इस तरह इनलेट और आउटलेट जुड़ रहे हैं। कोलेजन मैं तो इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से संलग्न अंतरिक्ष (काला तीर) में इंजेक्ट किया जाता है। आमतौर पर, एक 0.75% कोलेजन मैं मिश्रण निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। सफल microvessel निर्माण के रूप में कम के रूप में 0.6% कोलेजन के साथ प्राप्त किया जा सकता है, तथापि से कम 0.6% आम तौर पर अपर्याप्त यांत्रिक शक्ति और चैनल पतन का परिणाम है। कोलेजन की ई एक पतली परत coverslip के शीर्ष पर नीचे टुकड़ा करने के लिए जोड़ा जाता है, और चपटा 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और PDMS टुकड़ा। एफ जमाना के बाद से, PDMS नए नए साँचे को हटा रहे हैं और ऊपर और नीचे आवास जिग्स एक साथ खराब नेटवर्क संलग्न करने के लिए कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
> चित्रा 2. microvessels नियंत्रित प्रवाह प्रोफाइल के साथ सुसंस्कृत। ए HUVECs गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह के तहत सुसंस्कृत microvessels में वरीयता प्राप्त और बी 3 μl / मिनट की दर से सतत प्रवाह लागू होता है। लागू किया प्रवाह के तहत संस्कृति सबसे अच्छा, मीडिया जो लुमेन कि जंक्शन के गठन को बढ़ाने के भीतर शारीरिक दबावों exerting द्वारा microfluidic कोलेजन आधारित microvessels को स्थिर करने के लिए दिखाया गया है 3.5% dextran के अलावा के साथ हासिल की है, हालांकि सटीक व्यवस्था इस आशय ड्राइविंग स्पष्ट नहीं है 39 । Microvessels endothelial जंक्शन प्रोटीन CD31 या भेदभाव 31 (लाल) और वॉन Willebrand कारक के क्लस्टर के लिए दाग थे (VWF) कणिकाओं। (हरा) ए ',' बी '। दोनों स्थितियों में, HUVECs सेल सेल जंक्शनों और VWF के endothelial मार्करों व्यक्त कणिकाओं। ए ', बी "। विषयेतर विचारों पेटेंट और संस्कृति में 6 दिन बाद गोल lumens दिखा।arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Endothelial समारोह के अध्ययन के लिए इंजीनियर microvessels। एक। Endothelial बाधा समारोह FITC (Fluorescein आइसोथियोसाइनेट) के छिड़काव के बाद मूल्यांकन किया जा सकता नेटवर्क (ऊपर) और थोक कोलेजन (नीचे) में अपने प्रसार के बाद माप के माध्यम से Dextran संयुग्मित। कस्टम कोड का उपयोग करना, छिड़काव के वीडियो FITC-dextran की पारगम्यता गुणांक कश्मीर (माइक्रोन / सेक) निर्धारित करने के लिए समय के साथ सीमा के भीतर ब्याज की एक क्षेत्र पर पिक्सेल तीव्रता साजिश करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। लैब द्वारा पिछले प्रकाशनों दिखा दिया है कि इन इंजीनियर वाहिकाओं की पारगम्यता पूर्व vivo स्तनधारी वाहिकाओं 31,43। बी के बराबर है। periv साथ endothelial सेल बातचीतascular या समर्थन कोशिकाओं को इस मंच में कोलेजन मैट्रिक्स के सेलुलर संरचना नियमन से विश्लेषण किया जा सकता है। इधर, इन सेल सेल बातचीत का एक उदाहरण है, जब चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं वाहिकाओं आसपास के कोलेजन के भीतर एम्बेडेड रहे हैं देखा जा सकता है। संस्कृति में 14 दिनों के बाद, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं endothelium साथ एसोसिएट (हरे रंग में अल्फा चिकनी पेशी actin (αSMA) के लिए दाग) और पोत दीवार के साथ प्रक्रियाओं का विस्तार और के रूप में ओर्थोगोनल अनुमानों 31 के रूप में देखा perivascular कोशिकाओं काम करते हैं। पैनल ए और बी में दिखाया छवियां पहले के एक प्रकाशन 31। सी से प्रतिकृतियां हैं। एन्जियोजेनिक अंकुरण और remodeling संस्कृति मीडिया को संशोधित एन्जियोजेनिक उत्तेजनाओं को शामिल करने से इंजीनियर microvessels में मूल्यांकन किया जा सकता है। एन्जियोजेनिक उत्तेजनाओं के बिना, HUVECs न्यूनतम अंकुरण (बाएं) दिखाने; एन्जियोजेनिक उत्तेजनाओं (जीएसके-3, 20 एनजी / एमएल संवहनी endothelial वृद्धि कारक के 1 माइक्रोन से छोटे अणु अवरोध, और 20 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast gro साथकारक wth), HUVECs आसानी से मैट्रिक्स में के रूप में अनुमानों नीचे ऊपर और orthogonal दृश्य (दाएं) में देखा अंकुर। अंकुर लंबाई और संख्या ImageJ सॉफ्टवेयर 41 के साथ आसानी से quantifiable है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. रक्त-endothelium सहभागिता। इंजीनियर microvessels 'मौन हैं और भड़काऊ उत्तेजनाओं को उचित जवाब। ए एक असंशोधित, HUVEC सुसंस्कृत पोत इनलेट के पास फोटो खिंचवाने मजबूत CD31 जंक्शनल धुंधला (लाल) और एक दौर, खुले लुमेन से पता चलता है। एक। विषयेतर लुमेन के मद्देनजर दिखाया गया है। बी जब CD41a लेबल प्लेटलेट्स (हरा) के साथ पूरे रक्त citrated एक इसी तरह मौन पोत के माध्यम से भरकर रखा जाता है, कम से कम विज्ञापनendothelium को प्लेटलेट्स (हरा) के hesion मनाया जाता है। सी। इस तरह के मीडिया के लिए phorbol-12-myristate-13-एसीटेट (पीएमए, 50 एनजी / एमएल), बड़े thrombi के गठन में पूरे रक्त परिणामों के छिड़काव के रूप में भड़काऊ उत्तेजनाओं लिए जोखिम के साथ (CD41a लेबल, हरा) चैनल के भीतर और पोत दीवार से 31 ल्यूकोसाइट्स (CD45 + लेबल, सफेद) के आसंजन। यहाँ देखा छवियों पहले के एक प्रकाशन 31 से reproduced हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. मानव स्टेम सेल अतिरिक्त endothelial सेल के सूत्रों व्युत्पन्न ईसीएस। साथ उत्पन्न microvessels इंजीनियर microvessels उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इससे पहले इस साल, Palpant एट। अल। दिखा दिया है कि दो अलग उपप्रकार ओएफ मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं भेदभाव के दौरान wnt / β-catenin सिगनल से छेड़छाड़ के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है: hemogenic endothelial कोशिकाओं और endocardial-तरह endothelial कोशिकाओं (HAND1 और एक उच्च hemogenic क्षमता की अभिव्यक्ति की विशेषता) (अभिव्यक्ति के हिस्से में विशेषता NFATC1 और GATA4) 41। ए की जब वरीयता प्राप्त और 3 डी पोत मंच में सुसंस्कृत, hemogenic ईसीएस कुछ एन्जियोजेनिक अंकुरण से गुजरना। बी हालांकि, endocardial-तरह ईसीएस, बहुत अधिक एन्जियोजेनिक और प्रवासी हैं कार्यात्मक मतभेद का सुझाव है, शायद के जवाब में प्रवाह, ईसीएस के दो उपप्रकार के बीच (यह काम एक पिछले प्रकाशन 41 में और अधिक विस्तार में प्रस्तुत किया जाता है)। दोनों प्रकार की कोशिकाओं CD31 जंक्शनल प्रोटीन (लाल) और कुछ VWF (हरा) व्यक्त करते हैं। दोनों के orthogonal विचारों पेटेंट lumens दिखा। सी पोत के भीतर endocardial-तरह ईसीएस के एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि एक एन्जियोजेनिक अंकुर पता चलता है के रूप में देखाल्यूमिनल तरफ से। पैनल के ए और बी में प्रस्तुत छवियों Palpant एट से प्रतिकृतियां हैं। अल। 41। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इंजीनियर microvessels इन विट्रो मॉडल जहां इस तरह ल्यूमिनल ज्यामिति, hydrodynamic बलों, और बहु सेलुलर बातचीत के रूप में शारीरिक विशेषताओं वर्तमान और ट्यून करने योग्य हैं। मंच के इस प्रकार में है कि यह मॉडल और संदर्भों जहां इन विट्रो संस्कृति की स्थिति में सवाल microenvironment की है कि मिलान किया जा सकता है की एक किस्म में endothelial व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है शक्तिशाली है। उदाहरण के लिए, इस तरह के रूप में angiogenesis endothelial प्रक्रियाओं, ड्राइविंग तंत्र, विभिन्न अंगों में और इस तरह के स्वास्थ्य और रोग 44 के रूप में विभिन्न रोग राज्यों में अलग होने के लिए जाना जाता है। इस कारण से, तलीय endothelial सेल संस्कृति लगातार अपर्याप्त 6 और ऐसे क्षेत्र महंगा है और समय लेने वाली पशु मॉडल पर भारी भरोसा दिया है।

पशु मॉडल, जबकि जानकारीपूर्ण और जैविक अनुसंधान की प्रगति के लिए आवश्यक है, हमेशा अच्छी तरह से क्लिनिक के लिए अनुवाद नहीं है।यह काफी हद तक विशेष रूप से 9,45 उत्तेजनाओं को उनकी प्रतिक्रिया के बारे में murine और मानव जीव विज्ञान के बीच अंतर करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। यह इसलिए इन विट्रो मॉडल है कि अतिरिक्त मानव विशिष्ट डेटा पशु मॉडल से gleaned जानकारी पूरक करने के लिए प्रदान कर सकते हैं में निर्माण करने में सक्षम होना करने के लिए आवश्यक है। इन विट्रो प्लेटफार्मों संभावित धुन करने के लिए अतिरिक्त क्षमता है कि पर्यावरण के साथ ब्याज की microenvironment नकल करने के लिए है। एक ऐसी प्रणाली की मुख्य विशेषताओं तीन आयामी संरचना और ज्यामिति, बाह्य मैट्रिक्स संरचना (ईसीएम), parenchymal सेल निकटता और बातचीत, रक्त प्रवाह, और जैव रासायनिक उत्तेजनाओं को शामिल करना चाहिए। इंजीनियर microvessels क्षमता इन सभी मापदंडों को शामिल किया है। यह एक सब को शामिल मॉडल बनाने के लिए एक साथ किया जा सकता है, या एक कदम बुद्धिमान तरीके अलग-अलग प्रतिक्रियाएं और बातचीत को अलग करने में जोड़ा।

इंजीनियर microvessels का एक शक्तिशाली पहलू करने की क्षमता हैनियंत्रण प्रवाह और हेरफेर hydrodynamic बलों endothelium पर लगाए गए। एक उदाहरण के रूप में, डिवाइस गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह की शर्तों के तहत या निरंतर छिड़काव (चित्रा 2) के साथ संवर्धित किया जा सकता। पोत दीवार पर कतरनी तनाव की भयावहता प्रवाह दर और पोत ज्यामिति में परिवर्तन के माध्यम से दोनों स्थितियों में संग्राहक जा सकता है। दो स्थितियों के बीच मुख्य अंतर यह पोत के भीतर कतरनी तनाव के अस्थायी वितरण है। गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह की स्थिति में, कतरनी तनाव समय के साथ स्थिर नहीं है। प्रवाह दर और कतरनी तनाव एक मीडिया परिवर्तन के बाद उच्चतम तुरंत कर रहे हैं जब इनलेट जलाशय भरा है। मीडिया नालियों के रूप में, कतरनी तनाव में कमी होगी। यह 12 घंटे के पाठ्यक्रम पर कतरनी तनाव की एक सीमा की ओर जाता है। प्रयोगों जो (endothelium पर कतरनी तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उदाहरण के लिए,) hydrodynamic गुण पर सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है सतत प्रवाह संस्कृति की स्थिति का उपयोग करना चाहिए।

एngineered microvessels अपेक्षाकृत आसान संशोधनों के साथ सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब देने के लिए देखते जा सकता है। विभिन्न कोशिकाओं प्रकार, दोनों parenchymal और endothelial, विभिन्न अंग प्रणालियों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Endothelial सेल बोने के साथ microvessels fabricating के अलावा, उपकला कोशिकाओं के बजाय पेट के अस्तर, फेफड़ों एलवियोली गुर्दे की छोटी नली, आदि से संबंधित अध्ययन के लिए चैनल लाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक बार जब microenvironment सेल संरचना, पोषक तत्व समाधान द्वारा परिभाषित किया गया है (यानी, मीडिया, रक्त, वृद्धि कारक है, या अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक तरल पदार्थ) है कि इस उपकरण छिड़कना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कोशिका संकेतन, निष्क्रियता, कतरनी तनाव के बारे में जटिल सवालों का जवाब देना बदला जा सकता है , पोषक तत्वों, दवा प्रतिक्रिया, और अधिक। इसके अलावा, पोत की ज्यामिति विशेष endothelial जवाब की जांच करने के लिए तनाव और टेढ़ा-मेढ़ापन वंचित करने के लिए तैयार किया जा सकता। एक उदाहरण है, झेंग एट से एक हाल ही में प्रकाशन के रूप में। अल। पता चला है कि endothelial कोशिकाओं बढ़ाने के लिए हैएड VWF स्राव और उच्च कतरनी तनाव और प्रवाह तेजी के साथ microvessel क्षेत्रों में फाइबर विधानसभा। विशेष रूप से, VWF आमतौर पर नेटवर्क के भीतर कोनों और तेजी से बदल जाता पर गठित बंडलों। नेटवर्क ज्यामिति भी बहु-कोशिकीय नलिकाओं के निर्माण के लिए तैयार किया जा सकता। उदाहरण के लिए, एक डिजाइन कि अपने स्वयं के इनलेट और आउटलेट के साथ दो समानांतर चैनलों प्रत्येक शामिल एक एकाग्रता ढाल उत्पन्न करने के लिए या एक आसन्न छोटी नली पर्यावरण (जैसे, आसन्न microvessel साथ लसीका वाहिका) मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मौजूदा नेटवर्क डिजाइन की ग्रिड की तरह संरचनाओं (चित्रा 1 ए सी में दिखाया गया है) कम्प्यूटेशनल तरल मॉडलिंग के लिए और निर्माण के दौरान संरचनात्मक अखंडता के लिए फायदेमंद हैं, लेकिन शरीर में नाड़ी संरचना का संकेत नहीं हैं। भविष्य के अध्ययनों में, इस तरह श्रेणीबद्ध शाखाओं में बंटी और गोल कोनों के साथ लोगों के रूप में अधिक शारीरिक नेटवर्क पैटर्न इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

जबकि सभी कदम इस प्रक्रिया में उल्लिखित महत्वपूर्ण हैं, वहाँकई महत्वपूर्ण कदम है कि सफल इंजीनियर microvessel निर्माण के लिए आवश्यक हैं। कोलेजन जेल अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए, और यह इस कदम के दौरान बुलबुले परिचय नहीं आवश्यक है। यह सेल व्यवहार्यता और शारीरिक समारोह, विशेष रूप से प्रयोगों जो कोलेजन मैट्रिक्स में parenchymal कोशिकाओं को शामिल करने के लिए के लिए आवश्यक है। कोलेजन के एक समान मिश्रण प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, तो समाधान के पीएच की जांच यह तटस्थ है सुनिश्चित करने के लिए। समस्या बनी रहती है, यह संभव है कोलेजन शेयर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम ऊपर और नीचे के आवास के टुकड़े की विधानसभा है - यह अनुचित बल का उपयोग नहीं करने के रूप में इस चैनलों पतन का कारण बन सकता है आवश्यक है। कई अभ्यास दौर बल की राशि शिकंजा घूर्णन जबकि लागू करने की जरूरत की भावना प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। चैनल पतन या मुंहतोड़ अभ्यास के बाद भी फिर भी रहती है, यह संभव है PDMS नेटवर्क absorpt के कारण विकृत हो गया हैनमी की आयन। ताजा बना PDMS नए नए साँचे के साथ शुरू इस समस्या को हल करने में मदद करेगा। नीचे डिवाइस में अनुचित तरीके से पिरोया छेद भी चैनल पतन हो सकता है। शिकंजा विधानसभा के दौरान सुचारू रूप से बारी बारी से करने में सक्षम नहीं हैं, तो अतिरिक्त बल अक्सर संरचनात्मक विफलता में जिसके परिणामस्वरूप लागू किया जाना चाहिए। पिछले महत्वपूर्ण कदम है कि जोर दिया जाना चाहिए लगातार खिला, आमतौर पर हर 12 घंटा के महत्व है। इस endothelium को बनाए रखने और बाहर सुखाने से डिवाइस को रोकने के लिए आवश्यक है। घटना वरीयता प्राप्त है कि endothelial कोशिकाओं अस्वस्थ दिखाई देते हैं या कोलेजन दीवार से अलग, endothelial स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए अधिक बार वाहिकाओं को खिलाने के लिए, एक सिरिंज पंप का उपयोग सतत प्रवाह लागू करने के लिए, या कोलेजन जेल के पीएच की जांच यह सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं संभावित मायनों में एक शारीरिक स्तर पर है।

वर्तमान में, इस मंच उचित कठोरता के बाह्य मैट्रिक्स विधानसभा के दौरान चैनल के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के साथ निर्माण तक सीमित है। घने सहपर llagen या अधिक से अधिक से अधिक 6 मिलीग्राम / एमएल के लिए पर्याप्त है, लेकिन कोलेजन कम से कम 6 मिलीग्राम / एमएल और इस तरह पूरे अंगों से decellularized मैट्रिक्स के रूप में अन्य matrices भी कमजोर कर रहे हैं। इस सवाल में मैट्रिक्स के साथ कोलेजन का एक मिश्रण का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। इंजीनियर microvessels भी उनके आकार पैमाने द्वारा सीमित हैं। वेसल्स के बारे में 100 माइक्रोन की एक निचली सीमा को गढ़े जा सकते हैं, लेकिन पर्याप्त संशोधनों के एक छोटे पैमाने को प्राप्त करने के लिए आवेदन करने की आवश्यकता होगी। हालांकि इंजीनियर microvessels एक तीन आयामी लुमेन बनाने के लिए, नेटवर्क खुद तलीय है। वास्तव में एक तीन आयामी नाड़ी जाल बनाने के लिए, अतिरिक्त संशोधनों के कई इंजीनियर वाहिकाओं stacking द्वारा एक बहुपरती नेटवर्क बनाने के रूप में इस तरह लागू किया जा करने की आवश्यकता होगी।

इस विधि में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम कैसे इंजीनियर microvessels बाधा समारोह, सेल सेल संकेतन (pericyte भर्ती और नाड़ी स्थिरीकरण), angiogenesis, और घनास्त्रता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। Highliइन अध्ययनों के ghts पिछले प्रकाशनों 31,32 में अधिक विस्तृत प्रस्तुतियों के साथ यहां प्रस्तुत कर रहे हैं। इन अध्ययनों से कैसे pericytes विस्थापित और कोट इंजीनियर microvessels 31 के endothelium, प्लेटलेट्स सक्रिय endothelium 31 का पालन करना, और तरल पदार्थ कतरनी तनाव endothelial सक्रियण और VWF स्राव और विधानसभा 32 modulates दिखा। इंजीनियर microvessels आगे इस तरह के गुर्दे 33 या 34 के रूप में दिल vascularized ऊतकों और मॉडल अंग विशेष प्रणाली, निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सम्मान के साथ इन शारीरिक रक्त-endothelium बातचीत और धुन microenvironment दोहराने की क्षमता तनाव, ज्यामिति, ईसीएम वंचित करने के लिए, और सेलुलर संरचना संवहनी रोगों के भविष्य के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा के साथ ही वाशिंगटन विश्वविद्यालय में वाशिंगटन Nanofabrication सुविधा के लिए लिन और माइक Garvey इमेजिंग प्रयोगशाला संस्थान में स्वीकार करना चाहते हैं। उन्होंने यह भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते अनुदान DP2DK102258 (yz करने के लिए), और प्रशिक्षण अनुदान T32EB001650 और T32HL007312 (मार्च को) (एसएसके और मार्च के लिए)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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जैव अभियांत्रिकी अंक 115 ऊतक इंजीनियरिंग microvasculature endothelial कोशिकाओं नाड़ी इंजीनियरिंग 3 डी सेल संस्कृति micropatterning
Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा
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Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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