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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Abstract

In piattaforme vitro per studiare le cellule endoteliali e biologia vascolare sono in gran parte limitati a colture di cellule endoteliali 2D, il flusso camere con polimeri o substrati di vetro a base, e saggi di formazione del tubo di idrogel a base. Questi test, mentre informativo, non ricapitolano la geometria del flusso luminoso, matrice extracellulare corretta, e la vicinanza multicellulare, che svolgono un ruolo chiave nel modulare la funzione vascolare. Questo manoscritto descrive un metodo di stampaggio ad iniezione per generare navi ingegnerizzate con diametri dell'ordine di 100 micron. Microvasi sono fabbricati da semina cellule endoteliali in un canale microfluidica incorporato all'interno di un tipo nativo collagene idrogel. Incorporando cellule parenchimali all'interno della matrice di collagene prima di incanalare la formazione, microambienti tessuti specifici possono essere modellati e studiati. Ulteriori modulazioni di proprietà e dei media idrodinamica composizione consentono il controllo della funzione vascolare complessa all'interno del microambiente desiderato.Questa piattaforma permette lo studio del reclutamento perivascolari cellule, interazioni sangue-endotelio, risposta flusso, e le interazioni microvascolotessutali. microvasi Engineered offrono la possibilità di isolare l'influenza da singoli componenti di una nicchia vascolare e precisamente controllare i suoi chimiche, meccaniche e biologiche per studiare biologia vascolare sia in salute e malattia.

Introduction

Il microcircolo in ogni organo aiuta a definire il microambiente del tessuto, mantenere l'omeostasi tissutale e regolare l'infiammazione, la permeabilità, la trombosi, e fibrinolisi 1,2. Endotelio microvascolare, in particolare, è l'interfaccia tra il flusso di sangue e di tessuto circostante e svolge quindi un ruolo fondamentale nella modulazione vascolare e la funzione degli organi in risposta a stimoli quali forze idrodinamiche e citochine circolanti e ormoni 3 - 5. La comprensione delle interazioni approfondite tra l'endotelio, sangue e il microambiente tessuto circostante è importante per lo studio della biologia vascolare e la progressione della malattia. Tuttavia, i progressi nello studio di queste interazioni è stato ostacolato dalla limitata in vitro strumenti che non ricapitolano nella struttura microvascolare vivo e funzionano 6,7. Come risultato, il campo e il progresso terapeutico è affidato molto costoso e tempo-consumare modelli animali, che spesso non riescono a tradurre in successo negli esseri umani 8 - 10. Mentre modelli in vivo sono preziosi nello studio dei meccanismi di malattia e funzioni vascolari, sono complessi e spesso non preciso controllo dell cellulari, biochimici e biofisici spunti.

Vascolarizzazione in tutto il corpo possiede una struttura gerarchica maturo in collaborazione con letti capillari espansive, fornendo perfusione ottimizzato e trasporto dei nutrienti simultaneamente 11. Inizialmente, le forme vascolarizzazione come un plesso primitiva che riorganizza a una rete ramificata gerarchicamente durante lo sviluppo precoce 12,13. Sebbene molti dei segnali coinvolti in questi processi sono ben comprese 14 - 16, rimane elusiva come tale modello vascolare viene determinato 15. A sua volta, ricapitolando questo processo in vitro per progettare reti vascolari organizzate ha apen. Molte piattaforme difficili esistenti in vitro per modellare vascolare, come due colture di cellule endoteliali dimensionali, mancano caratteristiche importanti quali la vicinanza multicellulare, tre geometria tridimensionale luminale, flusso, e la matrice extracellulare. Saggi del tubo di formazione in idrogel 3D (collagene o di fibrina) 17 - 19 o invasione saggi 20,21 sono stati utilizzati per studiare la funzione endoteliale in 3D e le loro interazioni con altri vascolari 17,22 o di cellule del tessuto tipo 23. Tuttavia, assemblati lumen in questi saggi mancano di interconnessione, il flusso emodinamico, e perfusione adeguata. Inoltre, la propensione per la regressione vascolare in questi saggi formazione del tubo 24 impedisce coltura a lungo termine e maturazione che limita il grado di studi funzionali che possono essere eseguite. Pertanto, vi è la necessità crescente di progettare piattaforme in vitro di reti microvascolari che possono opportunamente modellare itendoteliale caratteristiche e sono capaci di coltura a lungo termine.

Una varietà di tecniche di ingegneria vascolari sono emerse nel corso degli anni per le applicazioni mediche per sostituire o vasi di bypass colpite nei pazienti con malattia vascolare. Vasi di grande diametro realizzati con materiali sintetici come il polietilene tereftalato (PET), e politetrafluoroetilene (ePTFE) hanno avuto un notevole successo terapeutico con termine pervietà a lungo (in media il 95% pervietà oltre 5 anni) 25. Anche se piccolo diametro innesti sintetici (<6 mm) in genere affrontare complicazioni quali iperplasia intimale e trombopoiesi 26 - 28, di ingegneria tessutale innesti di piccolo diametro realizzati con materiale biologico hanno compiuto progressi significativi 29,30. Nonostante i progressi di questo genere, vasi ingegnerizzati su microscala sono rimaste una sfida. Per modellare adeguatamente il microcircolo, è necessario generare modelli di rete complessa con sufficiente resistenza meccanica a mantenere la pervietà e con una composizione matrice che permette sia permeazione nutrienti per le cellule parenchimali e rimodellamento cellulare.

Questo protocollo rappresenta una rete di vasi romanzo artificiale perfusable che imita un nativo in vivo impostazione con un sintonizzabile e controllabile microambiente 31 - 34. Il metodo descritto genera microvasi ingegnerizzate con diametri dell'ordine di 100 micron. microvasi Engineered sono fabbricati mediante perfusione cellule endoteliali attraverso un canale microfluidica che è incorporato all'interno di tipo morbido collagene idrogel. Questo sistema ha la capacità di generare reti di fantasia con struttura luminale aperto, replicare le interazioni multi-cellulari, modulare la composizione della matrice extracellulare, e applicare fisiologicamente rilevanti forze emodinamiche.

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Protocol

1. Microfabbricazione di Patterned Polidimetilsilossano (PDMS) con Network Design

  1. Wafer creare un modello negativo del Design Network
    1. Creare un modello di rete utilizzando qualsiasi software per computer-aided design (CAD). Assicurarsi che la dimensione diagonale tra ingresso e uscita corrisponde alla distanza tra i serbatoi di ingresso e di uscita dei dispositivi di alloggiamento a passi successivi (vedi 2.1.1).
      Nota: Il disegno del modello stesso è personalizzato a seconda degli obiettivi di ricerca specifiche dell'utente (si veda la Figura 1 per segni di esempio).
    2. Genera una maschera del modello di rete utilizzando la stampa ad alta risoluzione o ordinare un fotomaschere cromato da un fornitore commerciale. Un protocollo più dettagliata del processo di fotolitografia è disponibile altrove 35.
    3. Pulire un wafer di 8 "di silicio per 5 minuti a 100 W con trattamento al plasma di ossigeno.
    4. Versare abbastanza fotoresist negativo (SU-82.100 funziona bene) sul wafer tale che la forma resist un ciuffo con diametro di 2,5 cm. Utilizzando un dispositivo a induzione rotazione, far girare il wafer a 500 rpm con 100 rpm rampa / sec e mantenere per 10 sec. Poi rampa fino a 1.600 rpm con 300 giri / sec e mantenere per 30 sec. Nota: La velocità e la rampa deve essere ottimizzato per ogni condizione di laboratorio per dare uno spessore di 150 pm resistere.
    5. Soft-bake il wafer a 65 ° C per 7 minuti, rampa fino a 95 ° C a 360 ° C / hr, e mantenere per 45 min. Lentamente raffreddare a temperatura ambiente su piastra calda. Imprimere il modello di nave sul wafer rivestito da esposizione a 365 nm luce UV sotto un fotomaschera cromato, con tripla esposizione quella della raccomandazione del produttore (350 mJ / cm 2 per uno spessore SU-8 di circa 150 micron).
      Nota: Poiché SU-8 è resistere ad un negativo, le regioni esposte (tutto tranne il modello di progettazione) diventerà insolubile per lo sviluppatore nel passaggio 1.1.7.
    6. Duro-cuocere il wafer esposta a 65° C per 5 min e rampa fino a 95 ° C a 360 ° C / ora e mantenere per 25 minuti, poi lasciar raffreddare lentamente verso RT sulla piastra calda.
    7. Immergere il wafer di SU-8 sviluppatore per 10 - 15 minuti per lavare via impressionate resistere, poi pulire con alcool isopropilico e asciutto sotto un flusso di azoto compresso. Controllare il motivo sotto un microscopio ottico per garantire la SU-8 resist è ben aderenti al wafer (cercare peeling indesiderati e bolle).
    8. Misurare lo spessore delle funzioni di ripetizione utilizzando un profilometro secondo le istruzioni del produttore 36. Durante l'acquisizione di misura, evitando regioni della struttura che sono essenziali per la funzione di rete (cioè, ingresso e condotti di uscita) come un profilometro contatto basato possano compromettere l'integrità strutturale delle caratteristiche modellata sul wafer. In alternativa, utilizzare un metodo senza contatto (vale a dire, profilometro ottico) per evitare questo problema del tutto.
  2. Generazione di modellato e Flat Stampo da collagene Molding
    Nota: maneggiare silani all'interno di una cappa.
    1. Posizionare il wafer in un essiccatore con 100 ml di tricloro (3,3,3-trifluoropropyl) silano per 2 ore al silanizzata superficie.
    2. Trasferimento wafer silanizzata in un 120 x 120 mm quadrati capsula di Petri. Versare agente misto e de-gasati PDMS elastomero e polimerizzazione (10: 1 w / w ratio) sul wafer per ottenere 4 - 6 mm di spessore. Versare PDMS aggiuntivi in ​​un 120 x 120 mm quadrati Petri piatto separato per generare forme piatte, senza modelli. Polimerizzare a 65 ° C per 2 ore.
    3. Togliere dal forno e lasciare il PDMS raffreddare a temperatura ambiente. Usando un bisturi con attenzione tagliare un quadrato attorno al SU-8 e lentamente staccare lo stampo PDMS dal wafer. Tagliare i bordi a 30 mm x 30 mm. Per stampi piane, taglio PDMS curata senza un pattern impresso in pezzi quadrati di circa 40 mm x 40mm.

2. Dispositivi Housing

  1. fabricationi di superiore e inferiore dell'alloggiamento Pezzi
    1. Realizzare abitazioni vaso utilizzando poli (metilmetacrilato) (PMMA). Per fabbricare, ordinare i pezzi da un negozio di macchina standard con il computer numerici capacità di fresatura a controllo (CNC). Nella figura 1 uno schema delle parti superiore e inferiore.
    2. Progettare la piece alloggiamento superiore (Figura 1D) per includere da 20 mm x 20 mm e sul lato inferiore del dispositivo con una profondità di 1 mm, due fori di iniezione di collagene (diametro 4 mm) sulla parte superiore del dispositivo si trova in corrispondenza degli angoli del quadrato ben, due serbatoi entrata e di uscita con diametro di 6 mm, e quattro fori (3 mm di diametro) ai quattro angoli del dispositivo.
      Nota: fori supplementari possono essere praticati sulla periferia del pezzo per scopi di manipolazione.
    3. Progettare il pezzo alloggiamento inferiore (Figura 1E) per includere un foro quadrato al centro (Dimensioni 15 mm x 15 mm) con un circostanti di 25 mm x 25 mmmensola con una profondità di 0,25 mm. Drill 4 fori per le viti con 4-40 thread. Assicurarsi che i fori per le viti nella parte inferiore e superiore pezzi si allineano insieme durante le future fasi di montaggio.

3. microvasi fabbricazione di dispositivi

  1. Preparazione dei Materiali
    1. Lavare e autoclave due serie di pinzette, una spatola in acciaio inossidabile, un piccolo cacciavite piatto, viti in acciaio inox, e parecchi perni di centraggio in acciaio inox. Per la fabbricazione dei vasi, autoclave anche PDMS micropatterned stampi, PDM piazze piatte, vetrini (22 x 22 mm), e pezzi di cotone.
    2. Sterilizzare i pezzi abitative PMMA in candeggina per almeno 1 ora, quindi risciacquare con acqua autoclavato nella cappa coltura tissutale due volte, e lasciare asciugare all'aria in piatti di coltura tissutale sterile (150 mm x 25 mm).
  2. Sterile Polyethyleneimine-glutaraldeide (PEI - GA) Rivestimento
    1. Trattare pozzi interni di pezzi PMMA secco sterilizzaticon plasma per circa 1 min. Aggiungere 1% Polyethyleneimine (PEI) sui pozzi interni (20 mm quadrati e sulla parte superiore e la mensola piazza 25 millimetri sul fondo) dei pezzi PMMA per 10 min. Risciacquare con sterili H 2 O e lasciare asciugare nel cappuccio coltura di tessuti.
      Nota: Il tempo necessario per il trattamento al plasma è variabile a seconda del dispositivo utilizzato - PEI deve diffondersi facilmente indica una superficie idrofila. In caso contrario, il trattamento al plasma supplementare può essere necessario.
    2. Applicare 0,1% glutaraldeide (GA) su PEI superfici dei pezzi PMMA trattata per 30 min. Sciacquare due volte con acqua sterile e lasciare asciugare.
      Nota: Nei passaggi futuri, collagene aderirà alla superficie rivestita con reticolazione collagene-glutaraldeide. Ciò consente di proteggere il gel in posizione all'interno del dispositivo durante future fasi di montaggio e durante il periodo di coltura dispositivo.
  3. Collagene Gel di Preparazione
    1. Realizzare le navi che utilizzano 0,6% - 1% del collagenesoluzioni. Per rendere il collagene 0,75% per la fabbricazione nave, di tipo mix collagene soluzione di riserva (1,5% - isolati da ratto code 37) con idrossido di sodio (NaOH), 10x media Supplement (M199), e mezzi di coltura cellulare. Mantenere tutte le soluzioni su ghiaccio.
    2. Determinare il volume di collagene dalla seguente equazione, dove V ƒinal è il volume finale di gel richiesto (tipicamente, 1 ml di collagene per dispositivo è sufficiente), V stock collagene è il volume di magazzino collagene necessario, C archivio di collagene è la concentrazione dello stock collagene, collagene e C ƒinal è la concentrazione desiderata del collagene nel recipiente.
      Equazione 1
    3. Utilizzare una siringa da 1 ml di trasferire il volume appropriato di magazzino collagene per un nuovo 30 ml tubo conico. Determinare i volumi della neutralizzazione NaOH (V NaOH), M199 10x mezzi supplemento(V 10 X), e mezzi di coltura cellulare (V 1 X) come segue e miscelare separatamente in un tubo da 15 ml:
      Equazione 2
    4. Aggiungere la miscela dei reagenti neutralizzanti (V 10 X, V NaOH, V 1 X) al collagene aliquotati e utilizzare una piccola spatola per mescolare lentamente la soluzione fino ad ottenere un gel omogeneo. Evitare l'introduzione di bolle mescolando lentamente e delicatamente.
    5. Per incorporare celle nella matrice alla concentrazione desiderata (ad esempio, 0,5 - 20 milioni di cellule / ml), aggiungere le cellule alla soluzione di collagene dopo averlo miscelato con i reagenti di neutralizzazione, e continuare a mescolare fino a quando le cellule sono omogeneamente distribuiti.
    6. Quando vengono aggiunti cellule, regolare il volume del supporto di coltura cellulare per accogliere il volume supplementare, come determinato dalla seguente equazione, dove le cellule V </ sub> è il volume richiesto di sospensione cellulare, C densità cellulare ƒinal è la densità di celle desiderato nel serbatoio, la densità delle cellule C sospensione è la densità delle cellule in soluzione madre.
      Equazione 3
  4. Il collagene Iniezione - Top Pezzo
    1. Mettere lo stampo PDMS micropatterned in da 100 mm x 20 mm piatto. PLASMA pulire lo stampo PDMS per 1 min.
    2. Allineare il pezzo superiore PMMA sulla sommità dello stampo PDMS in modo che i serbatoi quadrati stampo sono direttamente sotto i serbatoi di ingresso e uscita (vedere Figura 1D - linee tratteggiate). Posizionare i perni di riferimento in acciaio inox in entrata e uscita fori serbatoio sul pezzo PMMA superiore per mantenere l'accesso chiaro dai serbatoi al modello.
    3. Utilizzare una siringa da 1 ml per estrarre ~ 0.5 - 0,6 ml di collagene. Assicurarsi che non rimangano bolle nella siringa.
    4. Premere lightly con le pinzette sul corpo superiore per assicurare il contatto a filo tra la parte superiore e lo stampo PDMS. Iniettare collagene lentamente attraverso una porta di iniezione sul pezzo PMMA superiore. Verificare che il collagene riempie in 20 millimetri dominio x 20 mm sopra il modello e non perde fuori.
    5. Chiudere il piatto senza spintoni le spine di centraggio e lasciare gelificare in un incubatore a 37 ° per 30 min.
  5. Il collagene Iniezione - inferiore Pezzo
    1. Collocare un vetrino di vetro 22 x 22 mm al centro del pezzo inferiore. Utilizzare una siringa da 1 ml per dispensare ~ 0,25 ml di collagene in modo uniforme sul vetrino. Abbassare delicatamente il PDMS quadrata piatta sopra il collagene, garantendo il PDMS è piatto contro il PMMA e non ci sono la formazione di bolle. Lasciare gel a 37 ° C per 30 min.
  6. Montaggio dispositivo
    1. Dopo gelificazione, aggiungere abbastanza PBS attorno al pezzo PDMS piatta sul pezzo inferiore a circondare il PDMS (circa 1 ml). Utilizzare le pinzette per rimuovere qualsiasi ecollagene Xcess intorno ai bordi, e lentamente staccare il pezzo PDMS. Aggiungere più PBS in cima al collagene per mantenere l'idratazione.
    2. Per preparare il pezzo superiore, utilizzare pinzette per raccogliere il pezzo PMMA superiore e capovolgerla in modo che lo stampo PDMS è in cima. Aggiungere qualche goccia di PBS all'interfaccia, poi rapidamente e rimuovere saldamente lo stampo PDMS dal pezzo PMMA superiore.
    3. Rimuovere delicatamente spine in acciaio inox dal lato opposto della custodia PMMA con un altro paio di pinzette. Aggiungere qualche goccia di più PBS sul collagene micropatterned. Capovolgere il pezzo superiore PMMA in modo che il collagene rivolto verso il basso e inserire 4 viti nei fori d'angolo.
    4. Delicatamente fissare la parte superiore sulla parte superiore del pezzo inferiore, allineando le viti con i fori d'angolo sul pezzo inferiore. Evitare che i due pezzi di scorrere uno contro l'altro. Utilizzare un cacciavite per stringere le viti utilizzando un tocco delicato. Non stringere eccessivamente.
    5. Aspirare il PBS che circonda le superfici PMMA e posizionare una piccola piece cotone sotto un bordo del dispositivo. Usando una pipetta, rimuovere PBS dai serbatoi e sostituirli con mezzi di coltura cellulare. Consentire al dispositivo di gel insieme in un incubatore a 37 ° per almeno 1 ora.
  7. Semina delle cellule
    1. Vena ombelicale umano cellule endoteliali (Culture HUVECs) in terreni di crescita endoteliale a 37 ° C (CO 2, O 2) a confluenza 38. Se possibile, utilizzare i passaggi tra 4 e 7.
    2. Trypsinize cellule endoteliali lavando il pallone di coltura con 6 ml di PBS e quindi aggiungendo 2 ml di 0,05% tripsina a 37 ° C per dissociare le cellule. Lasciare le cellule in tripsina finché la maggior parte delle adesioni focali hanno staccato e le cellule sono arrotondati (questo richiede in genere circa 2 - 3 min). Arrestare la reazione tripsina con l'aggiunta di 4 ml di terreni di crescita endoteliale contenente siero fetale bovino (FBS). Lavare il pallone con più volte mezzi per garantire le cellule vengono staccate dal pallone e raccoglierein un tubo conico.
    3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere ad una densità di 10 milioni di cellule per ml. Rimuovere tutti i terreni di coltura delle cellule dai serbatoi di entrata e uscita. Utilizzando un 200 microlitri gel loading punta, aggiungere 10 ml di sospensione cellulare al centro del serbatoio di ingresso. Le cellule devono iniziare a fluire nella rete immediatamente e cappotto rete.
    4. Aggiungere 200 microlitri mezzi ugualmente ad entrambi i serbatoi e lasciare che le cellule si attaccano e si diffondono all'interno della rete per almeno 1 ora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Culture il dispositivo con flusso per gravità guidato attraverso la rete aggiungendo 200 ml di mezzo di coltura al serbatoio di ingresso e 50 microlitri al serbatoio di uscita. Con questo metodo di cultura, sostituire i media ogni 12 ore per mantenere la vitalità endoteliale.
      Nota: Se le condizioni di coltura di flusso continuo sono desiderabili (per mantenere costante sforzo di taglio, raccogli supporto in uscita, ecc) un syrpompa Inge può essere usato al posto della cultura gravità guidato.
    2. Lasciare le cellule endoteliali seminate almeno 24 ore per fissare e stabilizzare prima di applicare a flusso continuo. Prima di configurazione flusso continuo, mantenere i dispositivi con la gravità guidato condizioni di flusso.
      NOTA: Le condizioni di media per il flusso applicata differiscono dalla cultura gravità guidato. L'aggiunta di un espansore del plasma, come destrano, ai media stabilizza microrecipienti ingegnerizzati e previene il collasso vascolare durante la perfusione sostenuta 39.
    3. Per rendere supporto per la configurazione a flusso continuo, sciogliere 3,5% Destrano (70 kDa) in terreni di crescita endoteliale per la cultura ottimale nave. Usando una tecnica sterile, riempire 10 ml siringhe con mezzi di crescita endoteliale con 3,5% destrano.
    4. Preparare un piatto di coltura sterile per flusso fondendo fori nella parete laterale di un piatto Petri utilizzando un saldatore.
    5. Attaccare 12 "tubo in silicone (1/32" ID) per un blocco di accoppiamento Luer (Donna, 1/16 "ID), e un 1 /16 "connettore diritto tubo-tubo con un 1" segmento di tubo sull'altra estremità. Inserire una "ago smussato 20G (staccato dal mozzo dell'ago) per l'estremità libera del 1" 1/4 segmento. Anche preparare un "segmento di tubo attaccato ad un 90 ° congiunta tronchetto tubo-tubo (da nel tubo di custodia). Nei passi successivi, il tubo più lungo sarà infilato attraverso il piatto preparato e fissato al 3 3 "segmento tramite l'ago 20 G. tubo di uscita dovrebbe rispecchiare tubo di ingresso, con una estremità libera, invece di un innesto blocco Luer. Autoclavare tutti i segmenti prima dell'uso.
    6. Attacco ingresso autoclavato e tubo di uscita attraverso i fori nel piatto preparato. Fissare 3 "segmenti a Inner 20 aghi G. Attaccare il giunto Luer lock per la siringa supporto pieno e profumato dei media attraverso il tubo con la pompa a siringa impostata ad una portata elevata. Verificare che non vi siano bolle nella tubazione o connettori, poichè questi impedire il flusso alla nave.
    7. Inserire il connector congiunta nella presa custodia. Impostare la pompa a siringa alla portata desiderata e iniziare la perfusione.
      NOTA: Questo può essere regolata a seconda della geometria del serbatoio e condizioni sperimentali di forze di taglio applicate. Per un canale diametro di 100 micron, un flusso di 3 ml / min funziona bene.
    8. Se lo si desidera, raccogliere perfusato con preparato tubo di uscita inserito in una sterile 5 ml in polistirolo tubo tondo in basso contenente 500 ml di media.
      Nota: Una piccola quantità di materiale viene aggiunto al tubo di raccolta per evitare la formazione di bolle che possono bloccare il flusso.
    9. A seconda della velocità di flusso, la siringa può avere bisogno di essere riempito dopo 24-36 ore. Questo viene fatto rimuovendo il connettore dalla presa custodia, sostituendo la siringa, e permettendo media per perfusione ad una portata elevata per diversi minuti. Questa sequenza assicura che bolle non vengono introdotti al tubo. Ripristinare la pompa alla portata desiderata per la cultura, inserire il connettore nella presa custodia, etornare alla incubatore.

Analisi 4. Dispositivo

  1. Analisi permeabilità
    1. Utilizzare 40 kDa FITC-destrano per visualizzare la permeabilità del vaso in situ. Inserire l'alloggiamento recipiente su un microscopio confocale e concentrarsi sul piano vaso. Aggiungere 5 pM 40 kDa FITC-destrano per l'ingresso e l'immagine a 4X, 25 msec tempo di esposizione, e ad 1 frame per secondo per 10 min.
    2. Analizzare la serie di immagini con il codice di analisi per valutare la permeabilità Destrano attraverso la parete dei vasi in collagene (micron / sec) sulla base di un modello pubblicato da Zheng et. al. 31.
  2. Analisi Immunocolorazione & Imaging confocale
    1. Per risolvere i vasi, profumato con il 3,7% di formaldeide attraverso l'ingresso per 20 minuti e lavare mediante perfusione PBS per tre volte (20 min a lavaggio). Block anticorpo legame non specifico con il 2% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5% Triton X-100 perfused attraverso la rete per 1 ora. Profumato soluzioni anticorpo primario notte a 4 ° C e lavare tre volte con PBS. Profumato soluzioni anticorpo secondario per 1 - 2 ore, e lavare ancora con PBS nello stesso modo.
    2. Prendere immagini di immunofluorescenza di microvasi in situ utilizzando un microscopio confocale con una z-passo di 1 micron. Immagine dei microvasi con un ingrandimento di 4X, 10X, 20X o.
      Nota: 4x fornirà informazioni globale struttura di rete, mentre 10X e 20X immagini ingrandite forniranno dettagli cellulari come l'allungamento, la formazione di giunzione, ecc.
    3. Analizzare le pile di immagini utilizzando ImageJ con proiezioni Z (Immagine / Stacks / Z-progetto), sezioni trasversali (Immagine / vista Stacks / ortogonale), e ricostruzioni 3D (Immagine / Pile / Progetto 3D).
  3. Scanning Electron Microscopy Imaging
    1. Per l'analisi di microscopia elettronica, fissare in situ mediante perfusione mezza forza sol di Karnovskyution (2% paraformaldeide / 2,5% di glutaraldeide in 0,2 M tampone cacodilato) durante la notte. Smontare il vaso e separare accuratamente i due pezzi. Tagliare i bordi e completamente immersi nella soluzione fissativo per diversi giorni.
    2. Immergere la parte superiore di spessore del recipiente nel 25% glutaraldeide per 20 minuti e sciacquare tre volte con PBS (2 min ciascuna). Disidratare in lavaggi etanolo seriali di 50%, 70%, 85% (2 min ciascuno) e due lavaggi in 100% di etanolo (5 min ciascuna).
    3. Preparare il campione per l'analisi con un ulteriore disidratazione dal punto di essiccazione critica seguendo il protocollo 40 del produttore. Sputter cappotto nave oro-palladio (7 nm) e analizzare al microscopio elettronico a scansione con una tensione di accelerazione di 5 kV, dimensione del punto 3.

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Representative Results

La piattaforma nave progettata crea microcircolo funzionale incorporato all'interno di un tipo di collagene naturale I MATRIX e permette di stretto controllo dell'ambiente cellulare, biofisici e biochimici in vitro. Per realizzare microvasi ingegnerizzati, vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) sono perfusi attraverso la rete microfluidica collagene-embedded in cui essi attribuiscono a formare un lume di brevetto e confluenti endotelio. Come illustrato in figura 1A-C, la geometria del serbatoio può essere specificamente progettato per rispondere a domande riguardanti portata, tortuosità, e la ramificazione angoli, tra gli altri. Modulando la portata attraverso i microvasi fornisce una panoramica della shear stress risposta delle cellule endoteliali. In precedenza, fabbricazione attenzione si è concentrata principalmente su navi nell'intervallo 100 micron dimensioni, tuttavia microvasi fino a 500 micron o, in alcuni casi, piccolo come 50 micron di diametro sono stati successfully fatto e colta. Esempi di pervietà a lungo termine sono mostrati come pure la sopravvivenza dei microvasi coltivate sotto flusso per gravità condotto (Figura 2A) e il flusso continuo applicata (Figura 2B). Le proprietà in vivo -come di microvasi ingegnerizzati possono essere dimostrati in diversi modi. Diverse funzioni endoteliali possono essere misurati usando questa piattaforma, compresa la funzione di barriera (figura 3A), le interazioni cellula-cellula e di segnalazione (Figura 3B), e il rimodellamento angiogenica (Figura 3C). Una caratteristica fondamentale di questi microvasi è la loro capacità di rispondere a stimoli infiammatori in maniera biologicamente rilevanti. Questo è meglio dimostrato attraverso la loro interazione con sangue intero in Figura 4A-C dove endotelio non attivato è quiescente (Figura 4B) e endotelio attivato induce formazione di trombi (Figura 4C). Coltivando le cellule endoteliali dei differing origini all'interno di questa piattaforma, è possibile comprendere l'eterogeneità funzionale tra cellule endoteliali da fonti diverse. Figura 5A-C illustra un esempio di questa eterogeneità con due differenti tipi di cellule endoteliali derivati ​​dalle cellule staminali umana che quando coltivate sul display dell'impianto microrecipiente drasticamente differenti fenotipi 41. Con messa a punto dei profili di flusso, la composizione delle cellule, e le condizioni di coltura, microvasi ingegnerizzati forniscono un potente strumento in vitro per studiare biologia endoteliale e microcircolo sia in salute e malattia.

Figura 1
Figura 1. Schema di Creazione di reti e il protocollo Microchannel Fabrication. La geometria della rete vascolare può essere configurata specificamente per generare differenti modelli di flusso. A. Per esempio, un progetto ramificato sarà diminuito fltariffe ow vicino al centro (una riduzione di 8 volte in un 3 per 3 griglia) con conseguente regioni di varia shear stress sull'endotelio all'interno dello stesso recipiente 31. B. Una griglia altamente ramificato segue lo stesso principio del modello precedente ma con plesso grandi. Con questo progetto, -1 possono osservare gli effetti di una riduzione del 50 volte il tasso di flusso, con una conseguente riduzione della frequenza di taglio da 10 a 500 sec quando una caduta di pressione di 1.000 Pa viene applicata attraverso la rete 32. C. I disegni più complessi come una rete tortuosa con spigoli vivi 32 possono essere utilizzati per rispondere a domande riguardanti risposta endoteliale interruzioni flusso laminare, che spesso si verificano in contesti patologici 42. Microvasi in queste modelli avranno un diametro di 100 -. 150 micron D. Ci sono tre fasi principali durante microcanali fabbricazione. In primo luogo, la parte superiore della maschera alloggiamento è collocato sulla parte superiore del PDMS modellato muffa rete tale che l'ingresso e l'uscita sono allineate. Collagene I viene quindi iniettato nello spazio chiuso attraverso le porte di iniezione (freccia nera). Tipicamente, una miscela 0,75% collagene I è utilizzato per la fabbricazione. Successful microvasi fabbricazione può essere raggiunto con partire da 0,6% collagene, tuttavia meno dello 0,6% provoca tipicamente insufficiente resistenza meccanica e collasso canale. E. Un sottile strato di collagene viene aggiunto al pezzo inferiore sulla parte superiore del vetrino e appiattito con un altro pezzo PDMS. F. Dopo gelificazione a 37 ° C, i PDMS stampi vengono rimossi e la superiore e inferiore maschere abitative sono avvitate insieme per racchiudere la rete. si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
> Figura 2. microvasi coltivate con i profili flusso controllato. A. HUVECs seminati in microvasi coltivate in condizioni di flusso guidato gravità e B. applicata flusso continuo ad una velocità di 3 ml / min. Culture sotto flusso applicata è meglio realizzato con l'aggiunta di 3,5% Destrano ai media che ha dimostrato di stabilizzare microvasi a base di collagene microfluidici esercitando pressioni fisiche all'interno del lume che migliorano la formazione di giunzione, sebbene l'esatto meccanismo di guida questo effetto è chiaro 39 . Microvasi sono state colorate per il CD31 endoteliale proteina giunzione o cluster di differenziazione 31 (rosso) e fattore di von Willebrand (vWF) granuli (verdi). A ', B'. In entrambe le condizioni, HUVECs espresso marcatori endoteliali di giunzioni cellula-cellula e VWF granuli. a ", B". viste ortogonali mostrano brevetti e lumen arrotondati dopo 6 giorni di coltura.arge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Engineered microvasi per lo studio della funzione endoteliale. Un. Funzione di barriera endoteliale può essere valutata dopo perfusione di FITC (fluoresceina isotiocianato) coniugata destrano attraverso le reti (in alto) e la successiva valutazione della sua diffusione nel collagene di massa (in basso). Utilizzando il codice personalizzato, i video delle perfusione possono essere analizzati per tracciare intensità dei pixel su una regione di interesse all'interno della struttura nel corso del tempo per determinare il coefficiente di permeabilità K (micron / sec) della FITC-destrano. Precedenti pubblicazioni di laboratorio hanno dimostrato che la permeabilità di questi vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella della ex vivo mammiferi vasi 31,43. B. interazioni delle cellule endoteliali con perivcellule ascular o supporto possono essere analizzati in questa piattaforma modulando la composizione cellulare della matrice di collagene. Qui, un esempio di queste interazioni cellula-cellula può essere visto quando le cellule muscolari lisce sono incorporate all'interno del collagene che circonda i vasi. Dopo 14 giorni di coltura, le cellule muscolari lisce (colorate per actina alfa del muscolo liscio (αSMA) in verde) associato con l'endotelio e estendere i processi lungo la parete del vaso e agiscono come cellule perivascolari come si vede nelle proiezioni ortogonali 31. Immagini come da tabella A e B sono riproduzioni da una precedente pubblicazione 31. C. germinazione angiogenica e il rimodellamento possono essere valutati in microvasi ingegnerizzati modificando il terreno di coltura per includere stimoli angiogenici. Senza stimoli angiogenici, HUVECs mostrano germinazione minima (a sinistra); con stimoli angiogenici (1 micron inibitore piccola molecola di GSK-3, 20 ng / ml fattore di crescita endoteliale vascolare, e 20 ng / ml gro fibroblasti di basewth factor), HUVECs prontamente germogliare nella matrice come si vede in alto verso il basso proiezioni e viste ortogonali (a destra). La lunghezza del germoglio e il numero è facilmente quantificabile con il software ImageJ 41. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Interazioni sangue-endotelio. Engineered microvasi sono quiescenti e rispondere adeguatamente agli stimoli infiammatori. A. Un non modificato, HUVEC nave colta fotografato vicino all'ingresso mostra forte colorazione CD31 giunzionale (rosso) e un giro, lume aperto. A '. Ortogonale è mostrata vista del lume. B. Quando citrato sangue intero con piastrine CD41a-etichettati (verde) è perfuso attraverso un vaso simile di riposo, ad minimasi osserva coesio delle piastrine (verde) per l'endotelio. C. Con l'esposizione a stimoli infiammatori come forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA, 50 ng / ml) per il supporto, la perfusione dei risultati di sangue intero nella formazione di grandi trombi (CD41a-etichettato, verde) all'interno del canale e adesione dei leucociti (CD45 + etichettato, bianco) alla parete del vaso 31. Immagini visto qui sono tratti da una pubblicazione precedente 31. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. microvasi generato con staminali umane cellulari derivate-EC. Le fonti di cellule endoteliali possono essere utilizzati per generare microvasi ingegnerizzati. All'inizio di quest'anno, Palpant et. al. hanno dimostrato che due distinti sottotipi ocellula cellule derivate f umane staminali embrionali endoteliali può essere ottenuto manipolando Wnt / segnalazione β-catenina durante la differenziazione: cellule endoteliali hemogenic (caratterizzata da espressione di Hand1 e un elevato potenziale hemogenic) e cellule endoteliali endocardico-like (caratterizzati in parte da espressione di NFATC1 e GATA4) 41. A. Quando semi e coltivate in vaso piattaforma 3D, EC hemogenic subire alcune germinazione angiogenico. B. Tuttavia, la endocardico simile EC sono molto più angiogenica e migratori, suggerendo differenze funzionali, forse in risposta a flusso, tra i due sottotipi di EC (questo lavoro è presentato in dettaglio in una precedente pubblicazione 41). Entrambi i tipi di cellule esprimono CD31 proteine ​​giunzionale (rosso) e un po 'di VWF (verde). Viste ortogonali di entrambi mostrano lumen di brevetto. C. Un'immagine microscopio elettronico a scansione del endocardico simil-EC all'interno del vaso mostra un germoglio angiogenica come si è vistodal lato luminale. Immagini presentate nei pannelli A e B sono riproduzioni da Palpant et. al. 41. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Microvasi ingegnerizzati sono un modello in vitro in cui sono presenti e sintonizzabile caratteristiche fisiologiche come la geometria luminale, forze idrodinamiche, e le interazioni multi-cellulari. Questo tipo di piattaforma è potente in quanto offre la possibilità di modellare e studiare il comportamento endoteliale in una varietà di contesti in cui le condizioni di coltura in vitro in può essere abbinata a quella del microambiente in questione. Ad esempio, i meccanismi di guida processi endoteliali, come angiogenesi, sono noti a verificarsi in modo diverso in diversi organi e in diversi stati patologici, quali la salute e la malattia 44. Per questo motivo, coltura cellulare endoteliale planare è costantemente inadeguata 6 e come tale il campo ha fatto affidamento su modelli animali lungo e costoso.

I modelli animali, mentre informativo ed essenziale per il progresso della ricerca biologica, non sempre si traducono bene alla clinica.Questo è stato in gran parte attribuito alle differenze tra murine e biologia umana, in particolare per quanto riguarda la loro risposta agli stimoli 9,45. E 'quindi essenziale per essere in grado di costruire modelli in vitro che possono fornire dati specifici umane supplementari per integrare le informazioni raccolte da modelli animali. In vitro piattaforme hanno il potenziale per imitare il microambiente di interessi con la capacità aggiuntiva per accordare tale ambiente. Caratteristiche chiave di un tale sistema dovrebbe includere struttura tridimensionale e la geometria, composizione della matrice extracellulare (ECM), la vicinanza delle cellule parenchimali e l'interazione, il flusso di sangue, e gli stimoli biochimici. microvasi Engineered hanno la capacità di incorporare tutti questi parametri. Questo può essere fatto contemporaneamente per creare un modello onnicomprensivo, o aggiunti in modo saggio passo per isolare le risposte individuali e interazioni.

Un aspetto potente di microvasi ingegnerizzati è la capacità diflusso di controllo e manipolare le forze idrodinamiche esercitate sull'endotelio. Come esempio, il dispositivo può essere coltivato in gravità guidato condizioni di flusso o con perfusione continua (Figura 2). L'entità dello sforzo di taglio sulla parete del vaso può essere modulata in entrambe le condizioni mediante cambiamenti nella portata e la geometria del serbatoio. La differenza principale tra le due condizioni è la distribuzione temporale della sollecitazione di taglio entro il recipiente. In gravità guidato condizioni di flusso, la sollecitazione di taglio non è costante nel tempo. La portata e la sollecitazione di taglio sono più elevati immediatamente dopo una modifica del supporto quando il serbatoio è pieno di ingresso. Come i canali di scolo dei media, la sollecitazione di taglio diminuirà. Questo porta ad una serie di sollecitazioni di taglio nel corso di 12 ore. Esperimenti che richiedono un controllo preciso sulle proprietà idrodinamiche (ad esempio, per studiare gli effetti di sollecitazione di taglio sulla endotelio) dovrebbero utilizzare condizioni di coltura flusso continuo.

Emicrovasi ngineered possono essere adattati per rispondere a una vasta gamma di domande con relativamente semplici modifiche. Diversi tipi di cellule, sia parenchimale e endoteliale, possono essere utilizzate per modellare sistemi di diversi organi. Oltre a fabbricare microvasi con semina delle cellule endoteliali, cellule epiteliali possono invece essere utilizzati per rivestire il canale per studi relativi alla mucosa intestinale, alveoli polmonari, tubulo renale, ecc. Una volta che il microambiente è definita da composizione cellulare, la soluzione nutritiva (cioè, media, sangue, fattori di crescita, o altro fluido biologicamente rilevante) che viene utilizzato per perfusione dispositivo può essere modificato per rispondere a domande complesse circa segnalazione cellulare, quiescenza, shear stress , nutrienti, risposta ai farmaci, e altro ancora. Inoltre, la geometria del vaso può essere specificamente progettato per investigare risposta endoteliale alle sollecitazioni di taglio e tortuosità. Come esempio, una recente pubblicazione da Zheng et. al. hanno dimostrato che le cellule endoteliali hanno increasEd VWF la secrezione e l'assemblaggio di fibre nelle regioni microvasi con elevato sforzo di taglio e l'accelerazione del flusso. In particolare, VWF bundle tipicamente formata in angoli e curve a gomito all'interno della rete. La geometria di rete può anche essere progettato per fabbricare tubuli multicellulari. Ad esempio, un disegno che contiene due canali paralleli ciascuno con il proprio ingresso e uscita potrebbe essere usato per generare un gradiente di concentrazione o per modellare un ambiente tubulo adiacente (ad esempio, vaso linfatico con microvasi adiacente). Le strutture a griglia di disegni rete correnti (mostrati nella Figura 1A-C) sono vantaggiosi per la modellazione computazionale di fluido e per l'integrità strutturale durante la fabbricazione, ma non sono indicativi della struttura vascolare nel corpo. In studi futuri, dovrebbero essere utilizzati i modelli di rete più fisiologici, quali quelli con ramificazione gerarchica e angoli arrotondati.

Mentre tutti i passaggi descritti in questa procedura sono importanti, cisono diversi passaggi critici che sono necessari per il successo la fabbricazione dei microvasi ingegnerizzato. Il gel di collagene deve essere miscelato con cura per ottenere una soluzione omogenea, ed è essenziale non introdurre bolle durante questa fase. Ciò è essenziale per la vitalità delle cellule e la funzione fisiologica, particolarmente per gli esperimenti che includono cellule parenchimali nella matrice di collagene. Se una miscela uniforme del collagene è difficile da ottenere, controllare il pH della soluzione per assicurarsi che sia neutra. Se il problema persiste, è possibile che il collagene magazzino deve essere sostituito. Un altro passo importante è l'assemblaggio dei pezzi superiore e inferiore delle abitazioni - è fondamentale non usare forza eccessiva in quanto ciò può causare i canali a crollare. Diversi giri di pratica possono essere necessari per ottenere un senso della quantità di forza necessaria per applicare ruotando viti. Se il canale crollo o Smashing continua a verificarsi anche dopo le prove, è possibile la rete di PDMS è diventato deformato a causa di absorptione di umidità. A partire con stampi PDMS appena fatte aiuterà a risolvere questo problema. fori filettati non correttamente nel dispositivo di fondo può anche causare il collasso del canale. Se le viti non sono in grado di ruotare agevolmente durante il montaggio, forza aggiuntiva deve essere applicata spesso con conseguente cedimento strutturale. L'ultimo passo fondamentale che deve essere sottolineato è l'importanza di poppate frequenti, in genere ogni 12 ore. Ciò è essenziale per mantenere l'endotelio e impedendo il dispositivo si secchi. Nel caso in cui seminate cellule endoteliali appaiono insalubri o staccano dalla parete collagene, potenziali modi per migliorare la salute endoteliale sono per alimentare i vasi più spesso, utilizzare una pompa a siringa per applicare flusso continuo, o controllare il pH del gel di collagene per assicurare che è ad un livello fisiologico.

Attualmente, questa piattaforma è limitato alla fabbricazione di matrice extracellulare rigidità appropriate per mantenere l'integrità strutturale del canale durante il montaggio. co densellagen uguale o maggiore di 6 mg / ml è sufficiente, ma collagene meno di 6 mg / ml e altre matrici come matrice decellularized da organi interi sono troppo deboli. Questo può essere superato utilizzando una miscela di collagene con la matrice in questione. microvasi ingegnerizzati sono anche limitati dalla loro scala di calibro. Le navi possono essere fabbricate ad un limite inferiore di circa 100 um, ma dovrebbero essere applicate per ottenere una scala più piccola modifiche sostanziali. Sebbene microvasi ingegnerizzati creano un tre lume dimensionale, la rete stessa è planare. Per creare un plesso vascolare veramente tridimensionale, ulteriori modifiche dovrebbero essere applicate come la creazione di una rete multistrato impilando più vasi ingegnerizzati.

I risultati rappresentativi presentati in questo metodo dimostrano come microvasi Engineered può essere utilizzato per valutare la funzione di barriera, la segnalazione cellula-cellula (assunzione periciti e stabilizzazione vascolare), angiogenesi, e trombosi. highlicombatte di questi studi sono presentati qui con le presentazioni più dettagliate in precedenti pubblicazioni 31,32. Questi studi mostrano come periciti migrano e cappotto l'endotelio dei microvasi ingegnerizzati 31, le piastrine aderiscono alla endotelio attivato 31, e il fluido shear stress modula attivazione endoteliale e VWF la secrezione e di montaggio 32. Microvasi Engineered possono inoltre essere utilizzate per costruire i tessuti vascolarizzati e sistemi organo-specifiche modello, come il rene 33 o cuore 34. La capacità di replicare queste interazioni sangue-endotelio fisiologiche e sintonizzare il microambiente rispetto alle sollecitazioni di taglio, geometria, ECM e composizione cellulare consentirà futuri studi di malattie vascolari.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il Lynn e Mike Garvey Imaging Laboratory presso l'Istituto per cellule staminali e la medicina rigenerativa, nonché il Fondo di Washington Nanofabbricazione presso l'Università di Washington. Essi riconoscono anche il sostegno finanziario del National Institute of Health concede DP2DK102258 (a YZ), e la formazione concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D
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Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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