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Bioengineering

微細と3D微小血管の組立

doi: 10.3791/54457 Published: September 9, 2016
* These authors contributed equally

Summary

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。

Abstract

インビトロプラットフォームでは 、内皮細胞および血管生物学の大部分は、2D内皮細胞培養物に限定されている研究するポリマー又はガラスベースの基板、及びヒドロゲルベース管形成アッセイを用いてチャンバを流れます。これらのアッセイは、有益ながら、血管機能の調節に重要な役割を果たしルーメンジオメトリ、適切な細胞外マトリックス、および多細胞近接性を、再現しません。この原稿は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された血管を生成するための射出成形方法を説明します。微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンネイティブ型内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルに内皮細胞を播種することによって作製されます。形成チャネルの前に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を組み込むことによって、特定の組織の微小環境をモデル化し、研究することができます。流体力学的特性および培地組成の追加の変調は、所望の微小環境内での複雑な血管機能の制御を可能にします。このプラットフォームは、血管周囲細胞動員、血液 - 内皮相互作用、フロー応答、および組織微小血管相互作用の研究を可能にします。操作された微小血管は、血管ニッチの個々の成分の影響を単離する能力を提供し、正確に健康と病気の両方に血管生物学を研究するために、その化学的、機械的、および生物学的特性を制御します。

Introduction

各器官における微小血管系は、組織微小環境を定義する組織の恒常性を維持し、炎症、透過性、血栓症、および線維素溶解1,2を制御するのに役立ちます。 5 -微小血管内皮細胞は、特に、従って血流と周辺組織との間の界面は、流体力及び循環サイトカインおよびホルモン3などの刺激に応答した血管および臓器機能の調節において重要な役割を果たしています。内皮、血液、および周囲の組織の微小環境との間の詳細な相互作用を理解することは、血管生物学と疾患の進行の研究のために重要です。しかし、これらの相互作用を研究の進展は、 生体内微小血管構造再現し、6,7を機能しない試験管ツールに制限することによって妨げられてきました。その結果、フィールドと治療の進歩は、高価で、時間に大きく依存してきました10 -しばしば人間8の成功に変換することができない動物モデルを消費します。 in vivoモデルは、病気のメカニズムと血管機能の研究に貴重であるが、それらは複雑であり、多くの場合、携帯個々の生化学的、および生物物理学的手がかりの正確な制御を欠いています。

体全体の血管系は、同時に11を最適化灌流および栄養素の輸送を提供し、広大な毛細血管床と一緒に成熟した階層構造を有しています。最初は、初期の開発12,13の間に階層的に分枝状のネットワークに再編成し、プリミティブ叢などの血管系が形成されます。これらのプロセスに関与するシグナルの多くはウェル14に理解されていますが- 16を 、そのような血管のパターニングは15どのように決定されるかとらえどころのないままになります。ターンでは、組織化血管ネットワークを設計するためにインビトロでこのプロセスを反復することは蜂を持っていますnは難しい多くの既存のin vitroでのプラットフォームは、このような2次元の内皮細胞培養物として、このような多細胞近接、3次元管腔ジオメトリ、流れ、および細胞外マトリックスのような重要な特性を欠いている、血管系をモデル化します。 3Dハイドロゲル(コラーゲンまたはフィブリン)における管形成アッセイ17から19または浸潤アッセイ20,21は、他の血管17,22または組織細胞型23と3Dとの相互作用における内皮機能を研究するために使用されてきました。しかし、これらのアッセイにおいてルーメン相互接続性、血行動態の流れ、および適切な灌流を欠いて組み立てました。さらに、これらのチューブ形成アッセイ24における血管退行の傾向を行うことができる機能的研究の程度を制限する長期培養および成熟を ​​妨げます。このように、適切にモデル化することができる微小血管ネットワーク専用のin vitroでのプラットフォームを設計する急成長が必要です特性をdothelialし、長期培養が可能です。

血管工学技術の様々な血管疾患を有する患者で交換する医療用途やバイパス影響を受けた船舶のために年間で浮上しています。ポリエチレンテレフタレート(PET)、およびポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)などの合成材料から作製された大径の容器は、長期開存性(平均95%開通5年以上)25と、かなりの治療成功を収めています。小径合成移植片(<6ミリメートル)は、典型的には、内膜過形成および血小板新生26などの合併症に直面するが- 28を 、生物学的材料で作られた組織工学小径移植片は大きな進展29,30を行っています。この種の進歩にもかかわらず、マイクロスケールに設計された血管は、チャレンジを続けています。適切微小血管系をモデル化するために、SUFで複雑なネットワークパターンを生成する必要がありますficient機械的強度が開通し、実質細胞および細胞リモデリングのための両方の栄養浸透を可能にするマトリックス組成物を維持します。

34 -このプロトコルは、調整可能かつ制御可能な微小環境31に設定し、in vivoでのネイティブを模倣小説人工灌流血管ネットワークを提供します。記載されている方法は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された微小血管を生成します。操作された微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンソフトタイプ内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルを介して内皮細胞を灌流することによって作製されます。このシステムは、開いた管腔構造のパターニングされたネットワークを生成する多細胞相互作用を複製する細胞外マトリックス組成物を調節する、および生理学的に関連する血行力学的力を適用する能力を有します。

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Protocol

ネットワークデザインとパターン化ポリジメチルシロキサン(PDMS)の1微細加工

  1. ネットワーク設計の負のテンプレートを作成するためのウェハ製造
    1. 任意のコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、ネットワークのパターンを作成します。 (2.1.1を参照)入口と出口との間の対角寸法は、将来のステップの住宅デバイスの入口と出口の貯水池の間の距離と一致していることを確認してください。
      注:パターン自体の設計は、カスタム(例えばパターンについては図1を参照)、ユーザの特定の研究の目標に依存します。
    2. 高解像度印刷を使用して、ネットワークのパターンのマ​​スクを生成したり、商業的供給業者からクロムフォトマスクを注文。フォトリソグラフィ工程のより詳細なプロトコルは、他の場所で35入手可能です。
    3. 酸素プラズマ処理と、100Wで5分間、8 "シリコンウェハを清掃してください。
    4. 十分なネガ型フォトレジスト(SU-8を注ぎ2100は直径2.5cmでフォーム塗るに抵抗するようにウエハ上に)うまく動作します。スピンコーターを用いて、100回転/秒の勾配で500rpmでウエハを回転し、10秒間維持します。その後、300回転数/秒で1600回転まで上昇し、30秒間維持します。注:速度及び150μmのレジスト厚を得るために、各実験室の条件のために最適化される必要があるランプ。
    5. ソフトベーク7分間65℃でウエハ、360℃/時間で95℃まで上昇し、45分間維持します。ゆっくりとホットプレート上で室温まで冷却。トリプルそのメーカーの推奨(約150ミクロンのSU-8の厚さのためには350mJ / cm 2)での暴露で、クロムフォトマスクの下で365 nmのUV光への曝露によって塗布されたウェハ上に血管パターンをインプリント。
      注:SU-8は、ネガ型レジストであるので、露光領域(パターン設計を除くすべてが)ステップ1.1.7で開発者に不溶となります。
    6. ハードベーク65で露光されたウェハ°5分間Cと、それはゆっく​​りとホットプレート上で室温まで冷却することができ、その後、360℃/時間で95℃まで上昇し、25分間維持します。
    7. 未露光は、圧縮窒素気流下でイソプロピルアルコールで清浄で乾燥した後、レジストを洗い流すために15分 - 10用のSU-8現像液にウェハを浸し。 SU-8レジストを確実にするために、光学顕微鏡下でパターンを検査することは、十分にウエハ(不要な剥がれや気泡を探してください)​​に接合されています。
    8. パターンの厚さを測定し、製造元の指示36に従ってプロフィルを使用しています。測定の取得時には、ウエハ上にパターン化機能の構造的完全性を損なう可能性接触ベースのプロフィルなどのネットワーク機能( すなわち、入口と出口導管)のために不可欠な構造の領域を避けます。また、完全にこの問題を回避するために、非接触方式( すなわち、光学プロフィルメータ)を使用します。
  2. Geのコラーゲン成形のためのパターン化とフラット金型のneration
    注:化学ヒュームフード内にシランを処理します。
    1. 表面をsilanizeする2時間トリクロロ(3,3,3-トリフルオロプロピル)シランを100μlとデシケーターにウェハを置きます。
    2. 120×120ミリメートルの正方形のペトリ皿にシラン化ウェハを転送します。 6ミリメートルの厚さ - 4を達成するために、ウェハ上:(1ワット/ワット比10)を混合注ぎ、脱気したPDMSエラストマーと硬化剤。パターンのない平坦な金型を生成するために、独立した120×120ミリメートルの正方形のペトリ皿に追加PDMSを注ぎます。 2時間65℃で硬化します。
    3. オーブンから取り出して、PDMSを室温に戻します。メスを用いて慎重にSU-8の周りの正方形をカットし、ゆっくりとウエハからPDMSモールドを剥がします。 X 30ミリメートル30ミリメートルの縁をトリミングします。平らな金型の場合、カットは、x 40ミリメートル40ミリメートル程度の正方形片にインプリントされたパターンなしPDMSを硬化させました。

2.住宅機器

  1. Fabricatトップとボトム住宅個のイオン
    1. ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)を使用して容器ハウジングを製作。製造するために、コンピュータ数値制御(CNC)フライス機能を備えた標準的な機械工場から部品を注文。トップとボトムピースの概略については、 1を参照してください。
    2. 隅に位置デバイスの上に、1mmの深さで装置の下側ウェル×20から20mmミリメートル含むように上部ハウジング部( 図1D)を設計2のコラーゲン注入口(4ミリメートル直径)正方形のウェル6ミリメートルの直径を有する2つの入口と出口リザーバ、及び装置の四隅に4つのネジ穴(直径3mm)。
      注意:追加の穴は、目的を処理するための部品の周囲に穿孔されてもよいです。
    3. 周囲25ミリメートル×25 mmの真ん中に四角い穴が含まれるように底部ハウジング片( 図1E)を設計(寸法は15ミリメートル×15 mm)の0.25ミリメートルの深さに棚。 4-40糸で4ネジ穴を開けます。底部にあるネジ穴を確認し、トップピースは、将来の組み立て工程に一緒に配置されます。

3.微小血管デバイスの製造

  1. 材料の調整
    1. ウォッシュとピンセットのオートクレーブ2セット、ステンレス製のへら、小さな平らなスクリュードライバー、ステンレス鋼製ねじ、およびいくつかのステンレス鋼ダウエルピン。容器の製造のために、また、マイクロパターンPDMS金型をオートクレーブ、平らな正方形、ガラスカバースリップ(22×22 mm)で、綿片をPDMS。
    2. 2回組織培養フード中でオートクレーブ滅菌水ですすいで、少なくとも1時間、漂白剤でPMMAハウジング片を滅菌し、無菌の組織培養皿で空気乾燥(150ミリメートル×25ミリメートル)に許可します。
  2. 無菌のポリエチレンイミン-グルタルアルデヒド(PEI - GA)コーティング
    1. 滅菌乾燥PMMA片の内側の井戸を扱います約1分間のプラズマで。 10分間のPMMA個の(上部と下部に25ミリメートルの正方形の棚の上の正方形も20ミリメートル)の内側ウェルに1%ポリエチレンイミン(PEI)を追加します。滅菌H 2 Oで洗浄し、組織培養フード内で乾燥させます。
      注:プラズマ処理に必要な時間は、使用するデバイスに応じて可変である - PEIは、親水性表面を示す容易に広がる必要があります。そうでない場合、追加のプラズマ処理を必要とすることができます。
    2. PEIを30分間PMMA片の表面を処理した上で、0.1%グルタルアルデヒド(GA)を適用します。滅菌水で2回すすぎ、乾燥させます。
      注:将来のステップでは、コラーゲンは、コラーゲン、グルタルアルデヒド架橋により被覆された表面に付着します。これは、将来の組み立て工程には、デバイスの培養期間を通して装置内の所定の位置にゲルを固定するのに役立ちます。
  3. コラーゲンゲルの準備
    1. 0.6%を使用して血管を作製 - 1%のコラーゲンソリューション。水酸化ナトリウム(NaOH)、10倍メディアサプリメント(M199)、および細胞培養培地を用いて- (単離されたラットから37をテール1.5%)容器の製造のための0.75%コラーゲンを作るために、私は原液型コラーゲンを混ぜます。氷の上のすべてのソリューションをしてください。
    2. Vのƒinal必要なゲルの最終容量で、次式、により、コラーゲンの量を決定する(典型的には、デバイスごとにコラーゲン1mlのが十分である)、V ストックコラーゲンが必要な在庫コラーゲンの量は、C ストックコラーゲン濃度であります在庫コラーゲン、およびCƒinalコラーゲンは血管内のコラーゲンの所望の濃度です。
      式(1)
    3. 新しい30ミリリットルコニカルチューブに株式コラーゲンの適切な量を転送するために1ミリリットル注射器を使用してください。中和のNaOH(V のNaOH)、M199 10倍メディアサプリメントのボリュームを決定(V 10 X)、および細胞培養培地(V 1 X)は、以下のように、そして15mlのコニカルチューブに別々に混合します。
      式(2)
    4. 中和試薬等分コラーゲン(V 1 X V 10 X、V のNaOH)の混合物を追加し、均一なゲルが得られるまで溶液を穏やかに混合するために、小さなへらを使用しています。ゆっくりと穏やかに攪拌することにより気泡を導入することは避けてください。
    5. 、 - (20万細胞/ mlで、例えば、0.5)は、中和試薬と混合した後、コラーゲン溶液に細胞を加え、細胞を均一に分散されるまで攪拌し続け、所望の濃度でマトリックスに細胞を組み込みます。
    6. セルが追加されると、以下の式、V 細胞によって決定されるように、追加のボリュームを収容するために細胞培養培地の体積を調整</サブ>細胞懸濁液の必要量であり、Cƒinal細胞密度は、容器内の細胞の所望の密度であり、C 懸濁細胞密度は、ストック溶液中の細胞の密度です。
      式3
  4. コラーゲン注射-トップワンピース
    1. 100ミリメートル×20 mmディッシュにマイクロパターンPDMSモールドを配置します。 1分間PDMSモールドをプラズマ洗浄。
    2. モールド上の正方形貯水池は、入口と出口の貯水池の直下にあるように、( -破線図1Dを参照)PDMSモールドの上にトップPMMAピースを合わせます。入口にステンレス製のノックピンを配置し、パターンに貯水池から明らかなアクセスを維持するために、トップPMMA片に貯留穴出口。
    3. 0.6ミリリットルのコラーゲン - 〜0.5を抽出するために、1ミリリットル注射器を使用してください。気泡がシリンジ内に残っていないことを確認してください。
    4. リットルダウンプレスightly上部筐体にピンセットでトップピースとPDMSモールド間のフラッシュの接触を確実にします。トップPMMAピース上の注入口からゆっくりとコラーゲンを注入します。そのコラーゲンがパターンの上20ミリメートル×20ミリメートルのドメインに記入し、漏れないか確認してください。
    5. ノックピンを目白押しずに料理を閉じて、30分間37℃のインキュベーターでゲル化することを可能にします。
  5. コラーゲン注射-ボトムワンピース
    1. 底部片の中央に22×22ミリメートルのガラスカバースリップを置きます。スライドガラス上に均等〜0.25ミリリットルのコラーゲンを分配するために1ミリリットル注射器を使用してください。静かにPDMSは、PMMAに対して平らであり、トラップされた気泡が存在しない確実に、コラーゲンの上にPDMS平らな正方形を下げます。 30分間37℃でゲル化することを可能にします。
  6. デバイス組立
    1. ゲル化後、PDMS(約1ml)を囲むように底部片の上に平らにPDMSピースの周りに十分なPBSを追加します。任意の電子メールを削除するためにピンセットを使用して、エクセスのエッジの周りのコラーゲン、およびゆっくりはPDMSピースをはがします。水和を維持するために、コラーゲンの上に複数のPBSを追加します。
    2. トップ片を作成するには、トップPMMAピースをピックアップし、PDMSモールドが上になるようにそれを裏返しするためにピンセットを使用しています。その後すぐに、インターフェイスにPBSの数滴を追加し、しっかりとトップPMMAピースからPDMSモールドを削除します。
    3. 静かにピンセットの別のペアを使用して、PMMAハウジングの反対側からステンレス製のノックピンを削除します。マイクロパターンコラーゲン上にPBSのより多くの数滴を追加します。コラーゲンはダウン向くようにPMMAトップピースを裏返し、コーナーの穴に4本のネジを配置します。
    4. 静かに底部片の角穴にネジを合わせて、底部片の上にトップピースを置きます。 2個が互いに摺動することはできません。優しいタッチを使用してネジを締めドライバを使用します。締めすぎないようにしてください。
    5. PMMA表面を囲むPBSを吸引し、小さなパイを配置デバイスの一方の縁の下に綿のECE。ピペットを用いて、貯水池から任意のPBSを除去し、細胞培養培地と交換してください。デバイスは、少なくとも1時間、37℃のインキュベーター中で一緒にゲル化することを可能にします。
  7. 細胞播種
    1. 37℃での内皮細胞増殖培地中で培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(CO 2、O ​​2)コンフルエント38。可能な限り、通路4と7の間で使用しています。
    2. PBSを6 mlの培養フラスコを洗浄した後、細胞を解離するために37℃で、0.05%トリプシンを2mlを添加することによって、内皮細胞をトリプシン処理。接着斑の大部分が剥離しており、細胞が切り上げされるまで、( - 3分これは典型的には約2かかります)、トリプシンで細胞を残します。ウシ胎児血清(FBS)を含有する内皮増殖培地を4mlを添加することによりトリプシン化反応を停止させます。細胞がフラスコから分離されていることを確認し、収集するメディア数回フラスコを洗いますコニカルチューブインチ
    3. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、1mlあたり1000万個の細胞の密度で再懸濁します。入口と出口の貯水池からのすべての細胞培養培地を除去します。 200μlのゲルローディングチップを使用して、入口リザーバの中央に10μlの細胞懸濁液を追加します。細胞は、直ちにネットワークとコートのネットワークに流入を開始する必要があります。
    4. 均等に両方の貯水池に200μlの培地を加え、細胞が付着し、少なくとも1時間、ネットワーク内で広がってみましょう。
  8. デバイスの文化
    1. 入口リザーバと出口リザーバ50μlに細胞培養培地を200μlを添加することによって、ネットワークを通る流れを駆動重力とともに培養装置。文化のこの方法では、内皮生存率を維持するために12時間毎にメディアを交換してください。
      注:連続流培養条件が望ましい場合(一定のせん断応力を維持出口でメディアを収集する)SYRインゲポンプの代わりに重力駆動の培養を用いてもよいです。
    2. 少なくとも24時間播種された内皮細胞が連続した流れを適用する前に添付して安定させます。連続フローの設定に先立ち、重力駆動流の条件を備えたデバイスを維持します。
      注:適用されたフローのための培地条件は、重力駆動の文化とは異なります。メディアへのデキストランのような血漿増量の添加は、操作された微小血管を安定化し、持続的な潅流39中の血管虚脱を防止します。
    3. 連続フローのセットアップのためのメディアを作成するには、最適な血管培養用の内皮増殖培地に3.5%のデキストラン(70 kDaの)を溶解。無菌技術を用いて、3.5%デキストランと内皮増殖培地で10ミリリットル注射器を埋めます。
    4. はんだごてを使用して、ペトリ皿の側壁に穴を溶融することにより、フローのための無菌培養皿を準備します。
    5. ルアーロックカップリング(メス、1月16日「ID)に12 "シリコンチューブ(1/32" ID)を取り付け、1 /もう一方の端にチューブのセグメント16」1との直管・ツー・チューブコネクタ」。セグメント「1の自由端に(針ハブから取り外さ)20Gブラント針」の1/4を挿入します。また、(ハウジング入口に嵌合する)。その後の工程では、より長いチューブが準備皿に通されると3に取り付けたチューブ対チューブ90°エルボコネクタージョイントに取り付けられたチューブの3」のセグメントを準備20 Gの針を介して、「セグメント。アウトレットチューブではなく、ルアーロックカップリングの自由端と、入口チューブを反映する必要があります。使用前にすべてのセグメントをオートクレーブ。
    6. スレッドは、準備された皿の中の穴を通って入口と出口チューブをオートクレーブ処理します。インナー20 Gの針に3」のセグメントを接続します。メディアフィルドシリンジにルアーロックカップリングを取り付け、高流量に設定し、シリンジポンプを使用して、チューブを介してメディアを灌流。チューブやコネクター内に気泡がないことを確認し、このような容器への流れを妨げるであろう。
    7. Cを挿入onnectorハウジング入口にジョイント。所望の流量にシリンジポンプを設定し、灌流を開始します。
      注:これは、容器の形状と、印加剪断応力の実験条件に応じて調整することができます。 100μmの直径のチャネルについて、3μL/分の流速をうまく働きます。
    8. 必要であれば、メディアの500μLを含む滅菌5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに挿入準備出口チューブと灌流液を収集します。
      注:メディアの少量の流れを遮断することができ、気泡の形成を防止するために、収集管に添加します。
    9. 流量に応じて、注射器は、24〜36時間後に再充填する必要があるかもしれません。これは、ハウジングの入口からコネクタを取り外し、シリンジを交換し、メディアは、いくつかの分の高流速で灌流させることによって行われます。このシーケンスは、気泡がチューブに導入されることはありません。 、培養のための所望の流量にポンプをリセットハウジング入口にコネクタを挿入し、インキュベーターに戻します。

4.デバイスの解析

  1. 透過性の分析
    1. その場で 、血管の透過性を可視化するために、40kDaのFITC-デキストランを使用してください。共焦点顕微鏡で血管ハウジングを置き、容器の面に焦点を合わせます。 、4倍の倍率で入口と画像に25ミリ秒の露光時間を5μM40kDaのFITC-デキストランを追加し、10分間、毎秒1フレームで。
    2. によって発表されたモデルに基づいて、コラーゲン(ミクロン/秒)に血管壁を横切ってデキストランの透過性を推定するために、解析コードの画像シリーズを分析します。アル 。31。
  2. 免疫染色&共焦点イメージング解析
    1. 血管を修正するには、PBSを3回(1回の洗浄あたり20分)を灌流することにより、20分および洗浄のための入口を通って3.7%ホルムアルデヒドで灌流。 2%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.5%トリトンX-100、PEとの結合をブロック非特異的抗体1時間、ネットワークを介してrfused。 4℃で一晩、一次抗体溶液を灌流し、PBSで3回洗浄します。 1ための二次抗体溶液を潅流 - 2時間、および同様にPBSで再び洗浄します。
    2. 1ミクロンのzステップと共焦点顕微鏡を用いてその場で微小血管の免疫蛍光画像を撮ります。画像4X、10X、または20Xの倍率で微小血管。
      注:10Xと20X拡大画像は、このような伸び、接合形成、などの細胞の詳細を提供する一方4Xの倍率は、グローバルネットワークの構成情報を提供します。
    3. Z投影(画像/スタック/ Z-プロジェクト)、断面(画像/スタック/直交ビュー)、および3D再構成(画像/スタック/ 3Dプロジェクト)でのImageJを用いて、画像スタックを分析します。
  3. 走査電子顕微鏡イメージング
    1. 電子顕微鏡分析のために、カルノフスキーのゾル半強度を灌流することによってその場で修正しますution(2%パラホルムアルデヒド/ 0.2 Mカコジル酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド)で一晩。容器を分解、慎重に2つに分解。縁をトリミングして、完全に数日間固定液に浸します。
    2. (各2分)を20分間25%グルタルアルデヒド中の容器の厚さの上部を浸し、PBSで3回すすいでください。 50%、70%、85%(2分毎)および100%エタノールで2回洗浄し(各5分)の連続エタノール洗浄で脱水。
    3. 製造業者のプロトコル40次の臨界点乾燥によってさらに脱水による分析のためのサンプルを準備します。金 - パラジウム(7 nm)を用いてコートに容器をスパッタし、5 kVで、スポットサイズ3の加速電圧と走査型電子顕微鏡で分析します。

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Representative Results

操作された容器プラットフォームは、私はマトリックスの天然型コラーゲンの中に埋め込 ​​まれた機能的な微小血管系を作成し、in vitroで 、細胞の生物物理学的および生化学的環境の厳密な制御を可能にします。操作された微小血管を作製するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、それらが特許ルーメンとコンフルエント内皮を形成する添付コラーゲン包埋マイクロ流体ネットワークを介して灌流します。 図1A-Cに示すように、容器の幾何学的形状は、具体的には、とりわけ、流量、ねじれ、および角度を分岐、に関する質問に答えるように設計することができます。微小血管を通る流量を調節することは、内皮細胞のせん断応力応答への洞察を提供します。以前に、製造の焦点は、主に100ミクロンのサイズ範囲の血管に、しかし500ミクロンまでの微小血管されているか、ある場合には、直径が50μmだけ小さくSUCCされていますessfully製培養しました。長期開存の例としては、重力駆動流( 図2A)と連続印加された流れ( 図2B)で培養微小血管の生存と同様に示されています。操作された微小血管のインビボ様性質は、いくつかの方法で証明することができます。様々な内皮機能がバリア機能( 図3A)、細胞-細胞相互作用およびシグナル伝達( 図3B)、および血管形成のリモデリング( 図3C)を含む、このプラットフォームを使用して測定することができます。これらの微小血管の重要な特徴は、生物学的に関連する方法で、炎症性刺激に応答する能力です。これは最高の非活性化内皮が静止である図4A-Cでの全血( 図4B)との相互作用を通じて実証されており、活性化内皮は、血栓形成( 図4C)を誘導します 。ジ内皮細胞を培養することによってこのプラットフォーム内起源ffering、異なる供給源からの内皮細胞間の機能的不均一性を理解することが可能である。 図5A-Cは、その培養された微小血管システムディスプレイにおける2つの異なるヒト幹細胞由来の内皮細胞タイプでこの不均一性の例を示しています大幅に異なる表現型41。流れプロファイル、細胞組成物、および培養条件を調整することにより、人工微小血管は、健康と病気の両方において内皮生物学および微小血管系を研究するためのインビトロのツール強力なを提供します。

図1
図1のネットワークの概略設計及び血管網の幾何学的形状は、特に、異なるフローパターンを生成するように設計することができる。マイクロチャネル製造プロトコルは A.例えば 、分枝状設計がFL減少しているであろう同じ容器31。B内の内皮上の様々なせん断応力の領域では、得られた中央付近の片道料金(3×3グリッド内の8倍の減少)。高度に分岐したグリッドは、以前のデザインとしてではなく、より大きな神経叢と同じ原理に従っています。千Paの圧力降下は、ネットワーク32を横切って印加されたときに、この設計では、10〜500秒の剪断速度の低下をもたらす流量の50倍の減少の効果は、-1に観察することができる。C.より複雑な設計がそのような鋭い角32と曲がりくねったネットワークとしてしばしば病理学的文脈で42を発生する層流の中断に対する内皮応答に関する質問に答えるために使用することができます。マイクロチャネルの製造中の3つの手順がありますが150μmD. - 。これらのパターンから作られた微小血管は100の直径を持つことになります。まず、住宅用治具の上部は、PDMの上に配置されます入口と出口とが整列されるようにパターン化ネットワーク型をS。コラーゲンIは、次いで、注入ポート(黒矢印)を介して密閉空間に注入されます。典型的には、0.75%のコラーゲンIの混合物を製造するために使用されます。成功した微小血管の製造0.6%のコラーゲンと低いで達成することができるが0.6%未満では、典型的に不十分な機械的強度及びチャネルの崩壊をもたらす。コラーゲンのE. A薄層がカバースリップの上に底部片に添加し、かつ平坦化されます37℃でゲル化した後、別のPDMSピース。F.と、カビが除去され、PDMSと上部と底部ハウジング治具には、ネットワークを囲むようにネジ止めされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
制御された流れプロファイルを用いて培養>図2.微小血管。 A. HUVECを、重力駆動流の下で培養微小血管に播種し、B.は 3μL/分の速度で連続的な流れを適用しました。この効果駆動正確なメカニズムは不明であるが、適用流下培養は最高の接合形成を増強するルーメン内の物理的圧力を加えることによって、マイクロ流体コラーゲンベースの微小血管を安定化させることが示されているメディアの3.5%デキストランの添加によって達成され、39 。微小血管内皮結合タンパク質CD31または分化31(赤)のクラスタに対して染色し、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)顆粒(緑)。A '、B'。両方の条件では、HUVECを細胞間結合およびVWFの内皮マーカーを発現させました顆粒。A」、Bは「。直交ビューは、特許や文化の中で6日後に丸みを帯びたルーメンを示しています。arge.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
内皮機能の研究のための図3.エンジニア微小血管。内皮バリア機能は、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)の灌流後に評価ネットワーク(上)およびバルクコラーゲン(下部)へのその拡散の後続の測定によってデキストラン抱合することができます。カスタムコードを使用して、灌流のビデオFITCデキストランの透過係数K(μM/秒)を決定するために経時的にフレーム内の関心領域上にピクセル強度をプロットするために分析することができます。ラボによる前の刊行物は、これらの操作された血管の透過性がex vivoで哺乳類の血管31,43のそれに匹敵することを明らかにした。B。 perivと内皮細胞の相互作用ascularまたは支持細胞がコラーゲンマトリックスの細胞組成を調節することによって、このプラットフォームで解析することができます。平滑筋細胞は、血管の周囲のコラーゲンの中に埋め込まれている場合、ここで、これらの細胞間相互作用の例を見ることができます。培養14日後、平滑筋細胞は、内皮と関連付ける(緑色α平滑筋アクチン(αSMA)について染色)と血管壁に沿ってプロセスを拡張して、正射影31に見られるような血管周囲細胞として作用します。パネルAおよびBに示されている画像は、以前の出版物31から複製されている。C。血管形成出芽及びリモデリングは、血管新生の刺激を含むように培地を改変することによって操作された微小血管で評価することができます。血管新生刺激がなければ、HUVECを(左)最小限の発芽を示します。血管新生刺激(1μMGSK-3の小分子阻害剤、20 ngの/ mlの血管内皮増殖因子、および20 ng / mlの塩基性線維芽細胞GROとトップダウン予測と直交ビュー(右)に見られるような要因WTH)、HUVECを容易にマトリックスに発芽します。芽の長さと数は、ImageJソフトウェア41と、容易に定量化可能である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4.血液内皮相互作用。操作された微小血管が静止していると炎症性刺激に適切に対応。A.アン入口付近に撮影改変されていない、HUVEC培養容器は強いCD31接合部染色(赤)とラウンド、オープンルーメン。A 'を示しいる直交内腔のビューが示されている。B.を CD41a標識血小板(緑)で全血をクエン酸すると、同様に静止容器に灌流され、最小限の広告内皮への血小板(緑)のhesionが観察されている。Cを 。メディアへのそのようなホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA、50 ngの/ mlの)などの炎症性刺激に曝露すると、チャネル内の大きな血栓の形成における全血結果の灌流(CD41a標識、緑)、血管壁31への白血球の接着(CD45 +はラベルされた、白)。ここに見られる画像は以前の出版物31から再生されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
ヒト幹細胞派生のEC。その他の内皮細胞の供給源で生成され、図5微小血管は、操作微小血管を生成するために使用することができます。今年初め、Palpant ら。らは、二つの異なるサブタイプOことを実証しましたFヒト胚性幹細胞由来の内皮細胞は、分化中のwnt /βカテニンシグナル伝達を操作することによって得ることができる:式によって部分的に特徴付けられる(HAND1の発現と高い造血電位によって特徴付けられる)造血内皮細胞及び心内膜のような内皮細胞( NFATC1とGATA4)41。Aの3D容器プラットフォームに播種し、培養は、造血のECは、いくつかの血管新生発芽を受けたとき。B.しかし 、心内膜のような電気部品は、おそらくに応じて、機能的な違いを示唆し、より多くの血管新生と回遊していますECの2つのサブタイプ間の流れ、(この作品は以前の出版物41に詳細に示されています)。両方の細胞型は、CD31接合タンパク質(赤色)およびいくつかのVWF(緑色)を発現します。両方の直交するビューは、特許管腔を示す。C.は、容器内の心内膜のようなECの走査型電子顕微鏡画像は、血管新生芽を示す見られるように腔側から。パネルAおよびBに提示される画像はPalpant から複製されています。アル。41。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

操作された微小血管は、管腔の幾何学、流体力学的な力、および多細胞相互作用などの生理的特徴が存在して調整可能でin vitroモデルです。プラットフォームのこのタイプは、それがモデル化し、in vitroでの培養条件は、問題の微小環境のそれに一致させることができる様々な状況下で内皮挙動を研究する能力を提供することで強力です。例えば、このような血管新生などの内皮のプロセスを、駆動機構は、異なる器官で、そのような健康と病気44など、さまざまな病理学的状態、で異なって発生することが知られています。このため、平面内皮細胞培養物は、一貫して6不十分であり、そのようなフィールドは、コストと時間がかかる動物モデルに大きく依存しているように。

動物モデルは、生物学的研究の進展のために有益で不可欠ながら、常に診療所にうまく変換されません。これは主に、特に9,45を刺激するそれらの応答について、マウスおよびヒトの生物学との間の差に起因しています。動物モデルから収集された情報を補完する追加のヒト特異的データを提供することができるインビトロモデルで構築することができることが不可欠である。 インビトロプラットフォームを調整する追加容量その環境に関心の微小環境を模倣する可能性があります。このようなシステムの主な特徴は、3次元構造と幾何学、細胞外マトリックス組成物(ECM)、実質細胞の近接性との相互作用、血流、および生化学的刺激を含める必要があります。操作された微小血管は、これらすべてのパラメータを組み込む能力を持っています。これは、すべての包括的なモデルを作成するために同時に行われ、または個々の応答との相互作用を分離するために段階的様式で添加することができます。

操作された微小血管の強力な側面はする能力であります制御フローと操作する流体力は、内皮細胞に作用します。一例として、デバイスは、重力駆動流条件下または連続灌流( 図2)を用いて培養することができます。血管壁のせん断応力の大きさは、流速および容器の幾何学的形状の変化によって、両方の条件に調節することができます。二つの条件の間の主な違いは、容器内のせん断応力の時間的な分布です。重力駆動流条件では、せん断応力は経時的に一定ではありません。入口リザーバが一杯になったときの流量及び剪断応力が直ちにメディアの変更後に最高です。メディア・ドレインと、せん断応力が減少します。これは、12時間かけてせん断応力の範囲につながります。流体力学的性質(例えば、内皮細胞上のせん断応力の影響を研究するために)を正確に制御する必要が実験は、連続流培養条件を使用する必要があります。

Engineered微小血管は、比較的容易に修正を加えた質問の広い範囲に答えるように調整することができます。異なる細胞タイプは、実質および内皮の両方が、異なる器官系をモデル化するために使用することができます。内皮細胞を播種して微小血管を作製することに加えて、上皮細胞ではなく腸のライニングに関連する研究、肺胞、腎臓尿細管などのためのチャネルを裏打ちするために使用することができます。微小環境は、細胞組成物によって定義されると、装置を灌流するために使用される栄養溶液( すなわち、培地、血液、成長因子、または他の生物学的に関連する体液)は、細胞シグナル伝達、静止、せん断応力に関する複雑な質問に答えるために変更することができます、栄養素、薬剤応答、およびより多くの。また、容器の形状は、特に剪断応力及び屈曲に内皮細胞応答を調査するために設計することができます。例えば、鄭からの最近の刊行物として。ら内皮細胞はincreasを有することを示しました高せん断応力と流れ加速と微小血管領域におけるED VWF分泌および繊維集合体。具体的には、VWFは、典型的には、ネットワーク内のコーナーや急カーブで形成されたバンドル。ネットワークジオメトリはまた多細胞細管を製造するように設計することができます。例えば、独自の入口と出口を有する2つの平行なチャネルをそれぞれ含んでいる設計は、濃度勾配を生成するために、又は隣接する細管環境(隣接する微小血管と、例えば、リンパ管)をモデル化するために使用することができます。 ( 図1A-Cに示されている)は、現在のネットワーク設計の格子状の構造体は、製造時に計算流体モデリングのためおよび構造的完全性のために有利で ​​あるが、体内の血管構造を示すものではありません。今後の研究では、このような階層分岐や角の丸いものなど、より生理的なネットワークパターンを使用する必要があります。

この手順に記載されているすべてのステップが重要ですが、成功した操作された微小血管の製造に必要とされるいくつかの重要なステップです。コラーゲンゲルは、均質な溶液を達成するために十分に混合しなければならない、この工程の間に気泡を導入しないことが不可欠です。これは、特に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を含む実験用の細胞の生存率および生理学的機能に必須です。コラーゲンの均一な混合物を得ることが困難である場合、それは中性であることを確認するために溶液のpHをチェックします。問題が解決しない場合、それはコラーゲンの株式を交換する必要があります可能性があります。もう一つの重要なステップは、上部と下部のハウジング部品の集合体である - このチャネルが崩壊する原因となりますので無理な力を使用しないことが必須です。いくつかの練習ラウンドはネジを回転させながら適用するために必要な力の量の感覚を得るために必要であり得ます。チャネルの崩壊やスマッシングで​​も練習後引き続き発生する場合は、PDMSネットワークが原因でabsorptに反っになっている可能です水分のイオン。新たに作製したPDMSの型で起動すると、この問題を解決するのに役立ちます。下のデバイスで不適切にネジ穴は、チャネルの崩壊を引き起こす可能性があります。ネジは組立時に滑らかに回転することができない場合は、余分な力は、多くの場合、構造的な障害の原因となる適用されなければなりません。強調されるべきである最後の重要なステップは頻繁に送り、通常、12時間ごとの重要性です。これは、内皮細胞を維持し、乾燥からデバイスを防ぐために必須です。内皮細胞は不健康現れたり、コラーゲン壁の内皮の健康を連続流を適用するために、シリンジポンプを使用して、より頻繁に容器を供給し、またはそれを保証するために、コラーゲンゲルのpHをチェックするためにされた改善する潜在的な方法を切り離し播種した場合に生理的なレベルです。

現在、このプラットフォームは、組み立て時にチャネルの構造的完全性を維持するために適切な剛性の細胞外マトリックスと製造に限定されます。密な共同でllagen以上より6 mg / mlでは十分であるが、コラーゲン未満6 mg / mlで、そのような全体の器官から脱細胞化マトリックスのような他の行列が弱すぎます。これは、当該マトリックスとコラーゲンの混合物を使用することによって克服することができます。操作された微小血管はまた、それらのサイズスケールによって制限されています。容器は約100μmの下限に製造することができるが、実質的な修飾は、より小さなスケールを達成するために適用される必要があるであろう。操作された微小血管の三次元内腔を作成するが、ネットワーク自体が平坦です。真の三次元の血管叢を作成するために、追加の改変には、複数の操作された容器を積み重ねることによって、多層ネットワークを作成するように適用される必要があります。

この方法で提示される代表的な結果は、バリア機能、細胞間シグナル伝達(周皮細胞の動員および血管の安定化)、新脈管形成、および血栓症を評価するために使用することができる方法を操作さ微小血管を示しています。 Highliこれらの研究のghtsは、以前の刊行物31,32で、より詳細なプレゼンテーションとここに提示されています。これらの研究は、血小板が活性化内皮31に付着し、周皮細胞が操作された微小血管31の内皮を移行し、コート方法を示し、および流体せん断応力は、内皮活性化とVWF分泌およびアセンブリ32を調節します 。操作された微小血管はさらに、腎臓33又は心臓34などの血管新生組織およびモデル器官特異システムを構築するために使用することができます。せん断応力、ジオメトリ、ECM、および細胞組成に関して、これらの生理学的な血液内皮相互作用およびチューニング微小環境を複製する能力は、血管疾患の将来の研究を可能にします。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、幹細胞および再生医学だけでなく、ワシントン大学のワシントンナノファブリケーション施設のための研究所のリンとマイク・ガーベイイメージング研究所を承認したいと思います。彼らはまた、国立衛生研究所の財政支援は、(YZへ)DP2DK102258を付与し、訓練助成金(SSKとMARへ)T32EB001650とT32HL007312(MAR)は認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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