Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning og montering av 3D microvessels

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskriptet presenterer en injeksjon metode for å konstruere microvessels at rekapitulere fysiologiske egenskapene til endotelet. Den mikrofluidbasert prosess skaper patent 3D-vaskulære nettverk med tailorable tilstander, slik som flyt, cellesammensetning, geometri, og biokjemiske gradienter. Fremstillingsprosessen og eksempler på potensielle anvendelser beskrives.

Abstract

In vitro-plattformer for å studere endotelceller og vaskulær biologi er i stor grad begrenset til 2D endotelial cellekultur, strømningskamre med polymer- eller glassbaserte substrater, og hydrogel-baserte rør formasjons analyser. Disse analysene, mens informativ, ikke rekapitulere lumen geometri, riktig ekstracellulære matrise, og multi-cellular nærhet, som spiller sentrale roller i moduler vaskulær funksjon. Dette manuskriptet beskriver en sprøytestøpemetode for å generere konstruerte fartøyer med diameter i størrelsesorden 100 mikrometer. Microvessels er fabrikkert ved såing av endotelceller i et mikrofluidkanal integrert i en naturlig type I kollagen hydrogel. Ved å innlemme parenkymceller i kollagenmatriksen før kanaldannelse kan spesifikke vev microenvironments modelleres og undersøkt. Ytterligere modulasjoner av hydrodynamiske egenskaper og media sammensetning gir mulighet for styring av komplekse vaskulær funksjon innenfor den ønskede mikromiljøet.Denne plattformen gjør det mulig for studiet av perivaskulær celle rekruttering, blod-endotel interaksjoner, strømrespons, og vev-mikrovaskulær interaksjoner. Konstruert microvessels tilbyr muligheten til å isolere påvirkningen fra enkelte komponentene i en vaskulær nisje og presist kontrollere dens kjemiske, mekaniske og biologiske egenskaper til å studere vaskulær biologi i både helse og sykdom.

Introduction

Microvasculature i hvert organ bidrar til å definere vevet mikromiljøet, vedlikeholde vev homeostase og regulerer betennelse, permeabilitet, trombose, og fibrinolyse 1,2. Mikrovaskulær endotel, i særdeleshet, er grensesnittet mellom blodstrømmen og det omgivende vev, og derfor spiller en avgjørende rolle i modulering av vaskulær og organfunksjon som reaksjon på stimuli slik som hydrodynamiske krefter og sirkulerende cytokiner og hormoner 3 - 5. Å forstå den detaljerte vekselvirkninger mellom endotelet, blod, og det omkringliggende vevet mikro er viktig for studiet av vaskulær biologi og sykdomsprogresjon. Men fremgang i å studere disse interaksjoner har blitt hindret av begrenset in vitro-verktøy som ikke rekapitulere in vivo mikrovaskulær struktur og funksjon 6,7. Som et resultat, har feltet og terapeutiske fremskritt støttet seg tungt på kostbare og tidskonsumere dyremodeller som ofte ikke klarer å oversette til suksess i mennesker 8 - 10. Selv om in vivo-modeller er uvurderlig i studiet av sykdomsmekanismer og vaskulære funksjoner, de er komplekse og ofte mangler nøyaktig kontroll av individuelle celle, biokjemiske og biofysiske signaler.

Blodkar i hele kroppen besitter en moden hierarkisk struktur i forbindelse med ekspansive kapillære senger, gir optimal perfusjon og næringstransport samtidig 11. I utgangspunktet blodkar former som en primitiv plexus som reorganiserer til en hierarkisk forgrenet nettverk under tidlig utvikling 12,13. Selv om mange av de som er involvert i disse prosessene signalene blir godt forstått 14-16, gjenstår det unnvikende hvordan en slik vaskulær mønstring bestemmes 15. I sin tur, rekapitulere denne prosessen in vitro til ingeniør organiserte vaskulære nettverk har been vanskelig. Mange eksisterende in vitro-plattformer for å modellere blodkar, for eksempel todimensjonale endoteliale cellekulturer, mangler viktige egenskaper som multi-cellulær nærhet, tre-dimensjonal geometri luminal, strømning, og ekstracellulær matriks. Tube formasjons analyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 - 19 eller invasjon analyser 20,21 har blitt brukt til å studere endotelfunksjon i 3D og deres samhandling med andre vaskulære 17,22 eller vev celletyper 23. Men samlet lumen i disse analysene mangler tilkoblinger, hemodynamisk flyt, og passende perfusjon. Videre er det tilbøyelighet for vaskulær regresjon i disse rør formasjons assays 24 hindrer at langtidskultur og modning som begrenser graden av funksjonelle studier som kan utføres. Dermed er det en gryende behov for å konstruere in vitro plattformer av mikrovaskulære nettverk som kan hensiktsmessig modellere nodothelial egenskaper og er i stand til langvarig kultur.

En rekke vaskulære engineering teknikker har dukket opp gjennom årene for medisinsk bruk for å erstatte eller bypass påvirket fartøy hos pasienter med vaskulær sykdom. Stor diameter fartøy laget av syntetiske materialer slik som polyetylentereftalat (PET), og polytetrafluoretylen (ePTFE) har hatt betydelig terapeutisk suksess med langvarig åpenhet (gjennomsnittlig 95% åpenhets over 5 år) 25. Selv små diameter syntetiske transplantater (<6 mm) typisk møte komplikasjoner som intimal hyperplasi og trombopoiese 26-28, vev konstruert liten diameter grafts laget med biologisk materiale har gjort betydelige fremskritt 29,30. Til tross for fremskritt av denne typen, har utviklet fartøy på mikro forble en utfordring. Å tilstrekkelig modellere mikrovaskulaturen, er det nødvendig å generere komplekse nettverksmønster med sufkelig mekanisk styrke til å opprettholde åpenhet og med en matriseblanding som gjør det mulig for både næringsgjennomtrengning for parenchymale celler og cellulære remodeling.

Denne protokollen presenterer en ny kunstig perfusable fartøy nettverk som etterligner en innfødt in vivo setting med en fleksibel og kontrollerbar mikromiljøet 31-34. Den beskrevne metoden genererer konstruerte microvessels med diameter i størrelsesorden 100 mikrometer. Konstruert microvessels er fabrikkert av perfusert endotelceller gjennom et mikrofluidkanal som er innleiret i myk type I kollagen hydrogel. Dette systemet har kapasitet til å generere mønstrede nettverk med åpen luminal struktur, replikere flercellede interaksjoner, modulere ekstracellulære matrise sammensetning, og anvende fysiologisk relevante hemodynamiske krefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfabrication av Mønstret Polydimethylsiloxane (PDMS) med Network Design

  1. Wafer Fabrication å skape en negativ mal av Network Design
    1. Opprett et nettverk mønster ved hjelp av en dataassistert konstruksjon (DAK) programvare. Sørg for at den diagonale dimensjonen mellom innløp og utløp matche avstanden mellom innløps- og utløps reservoarer på huset enheter i fremtidige trinn (se 2.1.1).
      Merk: Utformingen av mønsteret i seg selv er tilpasset avhengig av de konkrete forskningsmål av brukeren (se figur 1 for eksempel mønstre).
    2. Generere en maske av nettverket mønster med høyoppløselig utskrift eller bestille en krom fotomaske fra en kommersiell leverandør. En mer detaljert protokoll for fotolitografisk prosess er tilgjengelig andre steder 35.
    3. Rengjør en 8 "silisium wafer i 5 min ved 100 W med oksygen plasma behandling.
    4. Hell nok negativ fotoresist (SU-82100 fungerer bra) på skiven slik at den motstår danner en klatt med diameter på 2,5 cm. Ved hjelp av en spinne-belegger, spinn skiven ved 500 opm med 100 rpm / sek rampe og vedlikeholde i 10 sek. Deretter rampen opp til 1600 rpm med 300 rpm / sek og vedlikeholde i 30 sek. Merk: hastighet og rampe må være optimalisert for hvert laboratorium betingelse for å gi en motstå tykkelse på 150 mikrometer.
    5. Soft-bake skiven ved 65 ° C i 7 min, gradient opp til 95 ° C med 360 ° C / time, og vedlikeholde i 45 minutter. Langsomt avkjøles til romtemperatur på den varme platen. Påføre fartøyet mønsteret på den belagte wafer ved å utsettes for 365 nm UV-lys under en krom fotomaske, med eksponering trippel som produsentens anbefaling (350 mJ / cm 2 for et SU-8 tykkelse på rundt 150 um).
      Merk: Siden SU-8 er en negativ motstå, vil de utsatte områdene (alt unntatt mønster design) blir uløselig til utbygger i trinn 1.1.7.
    6. Hard-bake den eksponerte wafer ved 65° C i 5 minutter og rampe opp til 95 ° C med 360 ° C / t og vedlikeholde i 25 minutter, og deretter la den langsomt avkjøles til romtemperatur på den varme platen.
    7. Senk wafer i SU-8 utbygger for 10 - 15 min å vaske bort ueksponert motstå, så rent med isopropylalkohol og tørr under en komprimert nitrogen flyt. Inspisere mønsteret under et lysmikroskop for å sikre SU-8 motstå er godt festet til skiven (se for uønsket avskalling og bobler).
    8. Måle tykkelsen på mønster funksjoner ved hjelp av et profilometer i henhold til produsentens instruksjoner 36. Under måling anskaffelse, unngår regioner av den struktur som er avgjørende for nettverksfunksjon (dvs. innløps- og utløpsledninger) som et kontakt basert profilometer kan svekke den strukturelle integriteten til de mønstrede funksjonene på skiven. Alternativt kan du bruke en ikke-kontakt metode (dvs. optisk profilometer) for å unngå dette problemet helt.
  2. Gerelse av Mønstret og Flat Former for Kollagen Molding
    Merk: Handle silaner innenfor et avtrekksskap.
    1. Plasser platen i en eksikator med 100 ul triklor (3,3,3-trifluorpropyl) silan i 2 timer for å silanize overflaten.
    2. Overfør silanert wafer inn i en 120 x 120 mm firkantet petriskål. Hell blandet og de-gasset PDMS elastomer og herdemiddel (10: 1 vekt / vekt-forhold) over skiven for å oppnå 4. - 6. mm tykkelse. Hell ekstra PDMS inn i en egen 120 x 120 mm firkantet petriskål til å generere flate former uten mønster. Herding ved 65 ° C i 2 timer.
    3. Fjern fra ovnen og la PDMS for å avkjøles til romtemperatur. Ved hjelp av en skalpell må du kutte en firkant rundt SU-8 og sakte skrelle av PDMS mold fra wafer. Trimme kantene til 30 mm x 30 mm. For flate former, kutt herdet PDMS uten en trykt mønster i firkantede biter ca 40 mm x 40 mm.

2. Boliger Devices

  1. fabrication av Topp og bunn Housing Pieces
    1. Dikte fartøy huset ved hjelp av poly (metylmetakrylat) (PMMA). Å dikte, bestille deler fra en standard maskinverksted med datamaskinen numerisk styrt (CNC) fresing evner. Se figur 1 for en skjematisk av topp- og bunnstykkene.
    2. Utforme den øvre del av huset stykket (figur 1D) for å inkludere en 20 mm x 20 mm godt på undersiden av enheten med en dybde på 1 mm, to kollagen injeksjonsporter (4 mm diameter) på toppen av enheten som befinner seg ved hjørnene av plassen brønnen, to innløps- og utløps reservoarer med diameter 6 mm, og fire skruehull (3 mm diameter) ved de fire hjørnene av enheten.
      MERK: Ytterligere hull kan bores på periferien av stykket for håndteringsformål.
    3. Utforme bunnhus stykket (figur 1E) til å omfatte et firkantet hull i midten (dimensjoner 15 mm x 15 mm) med et omkringliggende 25 mm x 25 mmhylle med en dybde på 0,25 mm. Bor 4 skruehull med 4-40 gjenger. Sørg for at skruehullene i den nederste og øverste brikkene vil justere sammen under fremtidige monteringstrinnene.

3. microvessel Device Fabrication

  1. Utarbeidelse av materialer
    1. Vask og autoklav to sett med pinsett, rustfritt stål slikkepott, en liten flat skrutrekker rustfrie skruer, og flere rustfritt stål styrepinner. For fabrikasjon av skipene, også autoklav micropatterned PDMS muggsopp, PDMS flate firkanter, dekkglass (22 x 22 mm), og bomull stykker.
    2. Sterilisere PMMA bolig brikker i blekemiddel i minst en time, og skyll med Autoclaved vann i vevskultur panseret to ganger, og la det lufttørke i sterilt vev kultur retter (150 mm x 25 mm).
  2. Steril Polyethyleneimine-glutaraldehyd (PEI - GA) Coating
    1. Unn indre brønner av steriliserte tørre PMMA stykkermed plasma i ca. 1 min. Tilsett 1% Polyethyleneimine (PEI) på de indre brønner (20 mm firkantet vel på toppen og 25 mm firkantet hylle på bunnen) av PMMA stykker for 10 min. Skyll med sterilt H 2 O og la tørke i vevskultur panseret.
      Merk: Den tiden som trengs for plasma behandling er variabel avhengig av hvilken enhet som brukes - PEI bør spres lett indikerer en hydrofil overflate. Hvis ikke, kan ytterligere plasma behandling være nødvendig.
    2. Anvende 0,1% glutaraldehyd (GA) på PEI behandlede overflater av PMMA stykker i 30 min. Skyll to ganger med sterilt vann og la tørke.
      Merk: I fremtidige trinn, vil kollagen følge den belagte overflaten gjennom kollagen-glutaraldehyd kryssbinding. Dette bidrar til å sikre at gelen på plass inne i anordningen under fremtidige monteringstrinn, og over hele enheten dyrkningsperioden.
  3. Collagen Gel Forberedelse
    1. Dikte fartøy som bruker 0,6% - 1% kollagenløsninger. For å gjøre 0,75% kollagen for fartøy fabrikasjon, bland type I kollagen stamløsning (1,5% - isolert fra rotte tails 37) med natriumhydroksid (NaOH), 10x Media Supplement (M199), og cellekulturmedier. Hold alle løsninger på is.
    2. Bestemme volumet av kollagen ved den følgende ligning, hvor V ƒinal er det endelige volum av gel som kreves (typisk, 1 ml av kollagen per enhet er tilstrekkelig), er V lager kollagen volumet av lager kollagen nødvendig, er C lager kollagen konsentrasjonen av bestanden kollagen, er og C ƒinal kollagen den ønskede konsentrasjon av kollagen i fartøyet.
      ligning 1
    3. Bruke en 1 ml sprøyte for å overføre passende volum av lager kollagen i et nytt 30 ml konisk rør. Bestemme volumene av den nøytraliserende NaOH (V NaOH), M199 10x media supplement(V 10 X), og cellekulturmedier (V 1 X) som følger, og blandes separat i en 15 ml konisk rør:
      ligning 2
    4. Tilsett blandingen av nøytraliserende reagenser (V 10 X, V NaOH, V 1 X) til den alikvotert kollagen, og bruke en liten spatel til forsiktig blande løsningen inntil en homogen gel er oppnådd. Unngå å innføre bobler ved å røre sakte og forsiktig.
    5. For å innlemme celler i matriksen ved den ønskede konsentrasjon (for eksempel 0,5 - 20 millioner celler / ml), tilsett cellene til kollagen oppløsningen etter at den er blandet med den nøytraliserende reagenser, og fortsett å røre inntil cellene er homogent fordelt.
    6. Når cellene er lagt til, justere volumet av cellekulturmedier for å imøtekomme den ekstra volum, som bestemmes av følgende ligning, hvor V celler </ sub> er det nødvendige volum av cellesuspensjonen, er C ƒinal celletetthet den ønskede densitet av cellene i beholderen, er C suspensjon celletetthet tettheten av celler i stamløsningen.
      ligning 3
  4. Kollagen Injection - Topp Piece
    1. Plasser micropatterned PDMS mold i en 100 mm x 20 mm parabolen. Plasma rengjøre PDMS mold i 1 min.
    2. Rett inn toppen PMMA stykke på toppen av PDMS mold slik at de firkantede reservoarene på formen er direkte under innløps- og utløps reservoarer (se figur 1D - stiplede linjer). Plasser rustfritt stål styrepinnene inn i innløp og utløp reservoar hull på toppen PMMA stykke å opprettholde fri tilgang fra reservoarene til mønsteret.
    3. Bruk en 1 ml sprøyte til å trekke ut ~ 0,5 til 0,6 ml kollagen. Pass på at ingen bobler er igjen i sprøyten.
    4. Trykk ned lightly med pinsett på toppdekslet for å sikre flush kontakt mellom toppstykket og PDMS mold. Injisere kollagen sakte gjennom en injeksjonsåpning på toppen PMMA stykke. Kontroller at kollagen fyller ut 20 mm domene x 20 mm over mønsteret og ikke lekker ut.
    5. Lukk parabolen uten brå bevegelser de styrepinnene og la gel i en 37 ° C inkubator i 30 min.
  5. Kollagen Injection - Bottom Piece
    1. Plassere et 22 x 22 mm glass dekkglass i sentrum av bunnstykket. Bruk en 1 ml sprøyte for å dispensere ~ 0,25 ml kollagen jevnt på glass-slide. Senk forsiktig PDMS flat firkant over kollagen, sikre PDMS er flatt mot PMMA og det er ingen fanget bobler. Tillat å gel ved 37 ° C i 30 minutter.
  6. Enhets Assembly
    1. Etter gelering, tilsett nok PBS rundt flat PDMS stykket på bunnstykket for å omgi PDMS (ca 1 ml). Bruk pinsett til å fjerne eXcess kollagen rundt kantene, og sakte skrelle av PDMS stykke. Tilsett mer PBS på toppen av kollagen for å opprettholde hydrering.
    2. For å forberede den øverste stykket, bruker pinsett til å plukke opp den øverste PMMA stykke og snu det slik at PDMS formen er på topp. Tilsett noen dråper av PBS til grenseflaten, og deretter hurtig og sikkert fjernes PDMS formen fra toppen PMMA stykke.
    3. Fjern forsiktig rustfritt stål styrepinner fra den andre siden av PMMA bolig med en annen pinsett. Legg flere mer dråper av PBS på micropatterned kollagen. Vend PMMA toppen stykke over slik at collagen vender ned og plassere 4 skruene i hjørnehullene.
    4. Forsiktig lå den øverste stykke på toppen av bunnstykket, og juster skruer med hjørnehullene på bunnstykket. Ikke la de to delene til å gli mot hverandre. Bruk en skrutrekker til å stramme skruene med en svak berøring. Ikke stram for hardt.
    5. Aspirer PBS omgir PMMA overflater og plassere en liten piece av bomull under én kant av enheten. Ved hjelp av en pipette, fjerne PBS fra reservoarene og erstatte med cellekulturmedier. La enheten gelé sammen i en 37 ° C inkubator i minst en time.
  7. Cell Seeding
    1. Kultur humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) i endotelial vekstmedier ved 37 ° C (CO 2, O 2) til sammenflytning 38. Når det er mulig, bruker mellom passasjene 4 og 7.
    2. Trypsineres endotelceller ved vasking av kulturflaske med 6 ml PBS og deretter tilsetning av 2 ml av 0,05% trypsin ved 37 ° C for å skille cellene. La cellene i trypsin inntil det meste av de fokale adhesjon er frittliggende, og cellene er avrundet opp (dette tar typisk ca. 2 - 3 min). Stoppe trypsin reaksjonen ved å tilsette 4 ml av endotelial vekstmedier inneholdende bovint serum (FBS) føtalt. Vask kolbe med medie flere ganger for å sikre at cellene blir løsnet fra kolben og samlei et konisk rør.
    3. Tell cellene ved bruk av et hemocytometer og resuspender dem med en tetthet på 10 millioner celler pr ml. Fjern alle cellekultur medier fra inn- og utløps reservoarer. Ved hjelp av en 200 ul gel lasting spiss, tilsett 10 ul av cellesuspensjonen i midten av innløpet reservoaret. Cellene bør begynne å strømme inn i nettverket umiddelbart og belegge nettverket.
    4. Legg til 200 mL media like mye til begge reservoarer og la cellene feste og spre innenfor nettverket i minst en time.
  8. enhet Kultur
    1. Kultur anordningen med tyngdekraften drives strømning gjennom nettverket ved å tilsette 200 pl cellekulturmedium til innløpsreservoaret og 50 ul til utløpet reservoaret. Med denne metoden for kultur, erstatte media hver 12 time for å opprettholde endothelial levedyktighet.
      Merk: Hvis dyrkningsforhold kontinuerlig flyt er ønskelig (for å opprettholde konstant skjærspenning, samle media ved utløpet, etc.) en syringe pumpe kan brukes i stedet for tyngdekraften drevne kultur.
    2. Tillat seeded endotelceller minst 24 hr å feste og stabilisere før du søker kontinuerlig flyt. Før kontinuerlig flyt oppsett, opprettholde enheter med tyngdekraften drevet strømningsforhold.
      MERK: Mediene vilkår for anvendt flyt avvike fra tyngdekraften drevet kultur. Tilsetningen av en plasma ekspander, slik som dekstran, til mediet stabiliserer konstruert mikrokar og forhindrer vaskulær kollaps under vedvarende perfusjon 39.
    3. For å gjøre media for kontinuerlig flyt oppsett, oppløse 3,5% dekstran (70 kDa) i endotelial vekstmedier for optimal fartøy kultur. Bruk steril teknikk, fyller 10 ml sprøyter med endotelial vekstmedier med 3,5% dekstran.
    4. Fremstille et sterilt kulturskål for strømningen ved å smelte hull i sideveggen av en petriskål ved hjelp av en loddebolt.
    5. Fest 12 "silisium tubing (1/32" ID) til en Luer lock kobling (Kvinne, 1/16 "ID), og en 1 /16 "rett rør-i-rør-kontakt med en 1" segment av slangen i den andre enden. Sette inn en 1/4 "20G butt nål (løsrevet fra nål-muffen) til den frie ende av en" segmentet. Også fremstille et 3 "segment av produksjonsrøret er festet til en rør-i-rør 90 ° albuekobling ledd (som skal monteres i huset innløpet). I etterfølgende trinn, vil den lengre slangen tres gjennom den tilberedte fatet og festet til tre "segmentet via 20 G nål. Outlet slangen bør speile innløpsslangen, med en fri ende i stedet for et Luer lock kobling. Autoklav alle segmenter før bruk.
    6. Træ autoklavert innløps- og utløpsslangen gjennom hull i den tilberedte retten. Fest 3 "segmenter til indre 20 g nåler. Fest Luer lock kobling til mediet fylt sprøyte og perfuse media gjennom røret ved hjelp av sprøytepumpe innstilt ved en høy strømningshastighet. Kontroller at det ikke er noen bobler i slangen eller kontakter, da disse vil hindre strømning til fartøyet.
    7. Sett connector felles inn i husets innløp. Angi at sprøytepumpe til den ønskede strømningshastighet og begynne perfusjon.
      MERK: Dette kan justeres avhengig av fartøy geometri og eksperimentelle forhold i anvendt skjærspenninger. For en 100 um diameter kanal, en strømningshastighet på 3 mL / min fungerer godt.
    8. Dersom det er ønskelig, samle perfusate med forberedt utløp rør settes inn i en steril 5 ml polystyren rund bunn rør som inneholder 500 mL av media.
      Merk: En liten mengde av mediet ble tilsatt til oppsamlingsrøret for å forhindre blæredannelse som kan blokkere strømning.
    9. Avhengig av strømningshastighet, kan sprøyten må etterfylling etter 24 til 36 timer. Dette gjøres ved å fjerne kontakten fra husets innløp, og erstatte sprøyten, og slik at media til perfuse ved en høy strømningshastighet i flere minutter. Denne sekvens sikrer at boblene ikke blir introdusert til slangen. Tilbake pumpen til ønsket strømningshastighet for kultur, sett kontakten inn i huset innløp, ogtilbake til inkubatoren.

4. Enhet Analysis

  1. permeabilitet Analysis
    1. Bruk 40 kDa FITC-dekstran for å visualisere permeabiliteten av fartøyet in situ. Plasser fartøyet boliger på et konfokal mikroskop og fokus på fartøyet planet. Tilsett 5 uM 40 kDa FITC-dekstran til innløpet og bilde ved 4X forstørrelse, 25 msek eksponeringstid, og ved en ramme per sekund i 10 minutter.
    2. Analysere bildet serie med analyse-kode for å estimere permeabiliteten av Dextran på tvers av beholderveggen inn i kollagen (pm / sek), basert på en modell publisert av Zheng et. al. 31.
  2. Farging og Confocal Imaging Analysis
    1. For å fikse fartøy, perfuse med 3,7% formaldehyd gjennom innløpet i 20 min og vask av perfusert PBS tre ganger (20 min per vask). Blokk ikke-spesifikk antistoff-binding med 2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Triton X-100 perfused gjennom nettverket i 1 time. Perfuse primære antistoffløsninger over natten ved 4 ° C og vask tre ganger med PBS. Perfuse sekundære antistoffløsninger til 1 - 2 timer, og vaskes igjen med PBS på samme måte.
    2. Ta immunofluorescence bilder av microvessels in situ ved hjelp av en konfokal mikroskop med en z-trinn i en mikrometer. Bilde microvessels på en forstørrelse på 4X, 10X eller 20X.
      Merk: Forstørrelse av 4X vil gi globalt nettverk strukturere informasjon, mens 10X og 20X forstørrede bilder vil gi mobil detaljer som forlengelse, krysset formasjon, osv.
    3. Analyser bildestakker bruker ImageJ med Z anslag (Bilde / Stacks / Z-prosjektet), tverrsnitt (Bilde / Stacks / Orthogonal visning), og 3D-rekonstruksjoner (Bilde / Søyler / 3D-prosjektet).
  3. Scanning elektronmikroskopi Imaging
    1. For elektronmikroskopi analyse, fikse in situ ved perfusert halv styrke Karnovsky sin solution (2% paraformaldehyd / 2,5% glutaraldehyd i 0,2 M kakodylatbuffer) over natten. Demontere beholderen og forsiktig skille de to deler. Trim kantene og fordype i fiksativ løsning i flere dager.
    2. Dyppe den tykke øvre parti av beholderen i 25% glutaraldehyd i 20 minutter og skylles tre ganger med PBS (2 min hver). Dehydrere i serieetanolvaskinger på 50%, 70%, 85% (2 minutter hver) og to vaskinger i 100% etanol (5 min hver).
    3. Forbered prøven for analyse med ytterligere dehydrering ved kritisk punkt tørking etter produsentens protokoll 40. Frese frakk fartøyet med gull-palladium (7 nm) og analysere under et scanning elektronmikroskop med en akselererende spenning på 5 kV, spot størrelse 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den konstruerte fartøy plattformen skaper funksjonelle microvasculature integrert i en naturlig kollagen type I matrise og gir stram kontroll over mobilnettet, biofysiske og biokjemiske miljø in vitro. Å dikte konstruert microvessels er menneskenavlevene endotelceller (HUVECs) perfusert gjennom kollagen-embedded microfluidic nettverk hvor de skal festes for å danne et patent lumen og sammenflytende endotelet. Som illustrert i figur 1A-C, kan fartøyet geometri være spesielt utformet for å svare på spørsmål om strømningshastighet, tortuosity, og forgrening vinkler, blant andre. Å modulere strømningshastigheten gjennom microvessels gir innsikt i skjærspenning-responsen av endotelceller. Tidligere har fremstillingen fokusert primært på fartøyene i 100 um størrelsesområdet, men microvessels opp til 500 um, eller, i noen tilfeller, så små som 50 pm i diameter har vært successfully gjort og kultivert. Eksempler på lang sikt åpenhet er vist, så vel som overlevelsen av mikrokar dyrket under gravitasjonsdrevet strømning (figur 2A) og kontinuerlig påført strømning (figur 2B). De in vivo-lignende egenskaper konstruerte microvessels kan påvises på flere måter. Forskjellige endoteliale funksjon kan måles ved hjelp av denne plattform, herunder barrierefunksjon (figur 3A), celle-celle interaksjoner og signalering (figur 3B), og angiogene remodellering (figur 3C). Et kritisk trekk ved disse microvessels er deres evne til å svare på inflammatoriske stimuli i en biologisk relevant måte. Dette er best demonstrert gjennom deres interaksjon med fullblod i figur 4A-C der ikke-aktivert endotel er hvilende (figur 4B) og aktivert endotel induserer trombedannelse (Figur 4C). Ved dyrking av endotelceller differing opprinnelse innenfor denne plattformen, er det mulig å forstå funksjonell heterogenitet mellom endotelceller fra forskjellige kilder. Figur 5A-C viser et eksempel på denne heterogeniteten med to forskjellige humane stamcelleavledet endotelcelle-typer som når de dyrkes i microvessel systemdisplayet drastisk forskjellig fenotyper 41. Ved å justere strømningsprofiler, cellesammensetning og kulturforhold, konstruerte microvessels gi en kraftig in vitro verktøy for å studere endothelial biologi og microvasculature i både helse og sykdom.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av nettverk og Mikro Fabrication Protocol. Det vaskulære nettverket geometri kan være spesielt utviklet for å generere ulike strømningsmønstre. A. For eksempel, en forgrenet design vil ha redusert flow priser nær sentrum (en 8 fold reduksjon i et tre ved tre rutenett) som resulterer i regionene varierte skjærspenning på endotelet innenfor samme fartøy 31. B. Et sterkt forgrenet gitter følger det samme prinsipp som den foregående konstruksjon, men med en større plexus. Med denne utforming, virkningene av en 50 gangers reduksjon i strømningshastighet, noe som resulterte i en skjærhastighet reduksjon fra 10 til 500 sek -1 kan observeres når et trykkfall på 1000 Pa tilføres over nettverket 32. C. Mer komplekse konstruksjoner slik som en buktet nettverk med skarpe hjørner 32 kan brukes til å svare på spørsmål om endotelial som reaksjon på avbrudd i laminær strømning, noe som ofte forekommer i patologiske kontekster 42. Microvessels laget av disse mønstrene vil ha en diameter på 100 -. 150 mikrometer D. Det er tre store skritt i løpet av microchannel fabrikasjon. Først blir det øvre parti av huset jiggen plassert på toppen av PDMS mønstret nettverk formen slik at innløp og utløp er i flukt. Collagen I blir så injisert inn i det lukkede rom gjennom injeksjonsportene (sort pil). Vanligvis er en 0,75% kollagen I blandingen som brukes for fabrikasjon. Vellykket microvessel fabrikasjon kan oppnås med så lite som 0,6% kollagen, men mindre enn 0,6% vanligvis resulterer i utilstrekkelig mekanisk styrke og kanal sammenbrudd. E. Et tynt lag av kollagen tilsettes til bunnstykket på toppen av dekkglass, og flatet med en annen PDMS stykke. F. Etter gele ved 37 ° C, er PDMS muggsopp fjernes og de ​​øverste og nederste bolig jigs skrudd sammen for å vedlegge nettverket. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
> Figur 2. microvessels dyrket med Kontrollerte strømningsprofiler. A. HUVECs sådd i mikrokar dyrket under gravitasjonsdrevet strømning og B. påføres kontinuerlig strømning i en hastighet på 3 mL / min. Kultur i henhold påført strømning oppnås best ved tilsetning av 3,5% Dextran til de media som har vist seg å stabilisere microfluidic kollagenbasert microvessels ved å utøve fysikalske trykk inne i hulrommet at forbedre knutepunkt dannelse, selv om den eksakte mekanisme for å drive denne effekten er uklar 39 . Microvessels ble farget for endothelial krysset protein CD31 eller klynge av differensiering 31 (rød) og von Willebrand faktor (VWF) granulater (grønn). A ', B'. I begge forholdene, HUVECs uttrykt endotelceller markører for celle-celle veikryss og VWF granulat. A ", B". Ortogonale utsikt vise patent og avrundede lumen etter 6 dager i kultur.arge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Engineered microvessels for studier av endotelfunksjon. A. Endotelial barrierefunksjonen kan bli vurdert etter perfusjon med FITC (fluoresceinisotiocyanat) -konjugert Dextran gjennom nettverkene (øverst) og etterfølgende måling av dens diffusjon inn i bulk kollagen (nederst). Ved hjelp av tilpasset kode, kan videoer av perfusjon bli analysert for å plotte pikselintensiteten over en region av interesse innenfor rammen over tid for å bestemme permeabiliteten koeffisienten K (pm / sek) av FITC-dekstran. Tidligere publikasjoner av laboratoriet har vist at permeabiliteten av disse konstruerte fartøyer er sammenlignbar med den for ex vivo pattedyr fartøyer 31,43. B. Endotelcelle interaksjoner med perivascular eller støttelegemer kan analyseres på denne plattformen ved å modulere den cellulære sammensetning av kollagenmatriksen. Her kan et eksempel på slike celle-celle-interaksjoner ses når glatte muskelceller blir integrert i kollagenet som omgir karene. Etter 14 dager i kultur, de glatte muskelceller (farget for alfa glatt muskel aktin (αSMA) i grønt) assosierer med endotelet og strekker prosesser langs karveggen og fungere som perivaskulære celler som ses i de ortogonale projeksjoner 31. Bildene i panel A og B er reproduksjoner fra en tidligere publikasjon 31. C. Angiogen spirende og ombygging kan evalueres i konstruerte microvessels ved å endre dyrkingsmedier å inkludere angiogene stimuli. Uten angiogene stimuli, HUVECs viser minimal spirende (til venstre); med angiogene stimuli (1 uM lite molekyl inhibitor av GSK-3, 20 ng / ml vaskulær endotelial vekstfaktor, og 20 ng / ml basisk fibroblast growth faktor), HUVECs lett spire i matrisen som sett i top down projeksjoner og ortogonale visninger (til høyre). Den spire lengde og antall er lett kvantifiserbare med ImageJ programvare 41. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Blod-endotelet Interactions. Konstruert microvessels er stillestående og svare riktig på inflammatoriske stimuli. A. En umodifisert, HUVEC kultivert fartøy fotografert nær innløpet viser sterk CD31 junctional farging (rød) og en rund, åpen lumen. A '. Orthogonal riss av lumen er vist B.. Når citrat helt blod med CD41a-merkede blodplater (grønn) perfundert gjennom en tilsvarende stillestående kar, minimal annonsehesion av blodplater (grønne) til endotelet er observert. C. Med eksponering til inflammatoriske stimuli så som forbol-12-myristat-13-acetat (PMA, 50 ng / ml) til mediet, perfusjon av fullblod resulterer i dannelse av store tromber (CD41a-merket, grønt) i kanalen og adhesjon av leukocytter (CD45 + merket, white) til beholderveggen 31. Bildene sett her er gjengitt fra en tidligere publikasjon 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. microvessels generert med Menneskelig Stem Cell Avledet-egenkapitalbevis. Andre endotelcelle kilder kan brukes til å generere konstruert microvessels. Tidligere i år Palpant et. al. viste at to forskjellige subtyper of humane embryonale stamceller avledet endotelceller kan oppnås ved å manipulere Wnt / β-catenin signalering i løpet av differensiering: hemogenic endotelceller (karakterisert ved ekspresjon av HAND1 og en høy hemogenic potensial) og endokardiale lignende endotelceller (karakterisert delvis ved ekspresjon av NFATC1 og GATA4) 41. A. Når seeded og dyrket i 3D fartøy plattformen, hemogenic egenkapitalbevis gjennomgå noen angiogen spirende. B. Men endokardial-lignende egenkapitalbevis er mye mer angiogen og vandrende, noe som tyder funksjonelle forskjeller, kanskje som svar på flyt, mellom de to subtyper av ECS (dette arbeidet er presentert i mer detalj i en tidligere publikasjon 41). Begge celletyper uttrykker CD31 synaptiske proteiner (rød) og noen VWF (grønn). Ortogonale riss av begge viser patent lumen. C. En scanning elektronmikroskopbilde av den endokardiale lignende ECS i beholderen viser en angiogen spire som settfra den luminale side. Bildene som presenteres i paneler A og B er reproduksjoner fra Palpant et. al. 41. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konstruert microvessels er en in vitro modell der fysiologiske egenskaper som luminal geometri, hydrodynamiske krefter, og flercellede interaksjoner er til stede og fleksibel. Denne type plattform er kraftig ved at den gir mulighet til å modellere og studere endothelial atferd i en rekke sammenhenger der vitro dyrkningsforholdene i kan matches til at av mikromiljøet i spørsmålet. For eksempel, de mekanismer som driver endoteliale prosesser, slik som angiogenese, er kjent for å forekomme på en annen måte i forskjellige organer og i forskjellige patologiske tilstander, som helse og sykdom 44. Av denne grunn er plan endotelial cellekultur gående utilstrekkelig 6 og som sådan feltet har støttet seg tungt på kostbare og tidkrevende dyremodeller.

Dyremodeller, mens informativ og viktig for utviklingen av biologisk forskning, ikke alltid oversette godt til klinikken.Dette er i stor grad tilskrives forskjeller mellom mus og human biologi, særlig om deres reaksjon på stimuli 9,45. Det er derfor viktig å være i stand til å bygge in vitro modeller som kan gi flere mennesker spesifikke data for å utfylle informasjon hentet fra dyremodeller. In vitro-plattformer har potensial til å etterligne mikromiljøet av interesse med ekstra kapasitet til å tune det miljøet. Viktige egenskaper ved et slikt system bør omfatte tredimensjonal struktur og geometri, ekstracellulær matrise-blandingen (ECM), parenchymal celle nærhet og interaksjon, blodgjennomstrømning, og biokjemiske stimuli. Konstruert microvessels har kapasitet til å inkorporere alle disse parametrene. Dette kan gjøres samtidig å skape en altomfattende modell, eller lagt i en trinnvis måte å isolere individuelle svar og interaksjoner.

En kraftig aspekt av konstruerte microvessels er evnen til åkontrollflyt og manipulere de hydrodynamiske krefter som utøves på endotelet. Som et eksempel, kan anordningen bli dyrket under tyngdekraftdrevet strømningsbetingelser eller med kontinuerlig perfusjon (figur 2). Størrelsen av den skjærspenning på beholderveggen kan moduleres i begge tilstander gjennom endringer i strømningshastighet og fartøyet geometri. Hovedforskjellen mellom de to forhold er den tidsmessige fordeling av skjærspenning i beholderen. I gravitasjonsdrevet strømningsforhold, er skjærspenningen ikke konstant over tid. Strømningshastigheten og skjærspenningen er størst umiddelbart etter en endring av medium når innløpsbeholderen er full. Som medie avløp, vil skjærspenningen reduseres. Dette fører til en rekke skjærspenning i løpet av 12 timer. Eksperimenter som krever nøyaktig kontroll over de hydrodynamiske egenskaper (for eksempel, for å studere effektene av skjærbelastning på endotelet) bør bruke kontinuerlige strømningsdyrkningsbetingelser.

Engineered microvessels kan være innstilt til å svare på et bredt spekter av spørsmål med relativt enkle modifikasjoner. Forskjellige celletyper, både parenkymal og endotel, kan brukes til å modellere forskjellige organsystemer. I tillegg til å fabrikere microvessels med endotelceller såing, kan epitelceller i stedet benyttes for å fore kanalen for studier relatert til tarmslimhinnen, lunge alveolene, nyre tubuli, etc. Når mikromiljøet er definert av celle sammensetning, næringsoppløsning (dvs. media, blod, vekstfaktorer, eller annet biologisk relevant fluid) som brukes til å perfuse anordningen kan endres for å svare på komplekse spørsmål om cellesignalisering, quiescence, skjærbelastning , næringsstoffer, narkotika respons, og mer. Videre kan geometrien av fartøyet være spesielt utformet for å undersøke endotelial reaksjon mot skjærspenninger og tortuosity. Som et eksempel, en fersk publikasjon fra Zheng et. al. viste at endotelceller har increased VWF sekresjon og fibersammenstillingen i microvessel regioner med høy skjærspenning og flyt akselerasjon. Nærmere bestemt, VWF bunter typisk dannet ved hjørner og skarpe svinger i nettverket. Nettverket geometri kan også være utformet for å fremstille flercellede tubuli. For eksempel kan en utforming som inneholder to parallelle kanaler som hver med sitt eget innløp og utløp kan brukes til å generere en konsentrasjonsgradient eller for å modellere et tilstøtende tubuli miljø (f.eks, lymfatiske kar med tilstøtende microvessel). De gitterlignende strukturer av nåværende nettverks motiver (vist i Figur 1 A-C) er fordelaktige for beregnings fluid modellering og for strukturell integritet under fabrikasjon, men er ikke resultatet av vaskulær struktur i kroppen. I fremtidige studier bør mer fysiologiske nettverks mønstre som de med hierarkisk forgrening og avrundede hjørner benyttes.

Mens alle trinnene i denne fremgangsmåten er viktig, deter flere viktige skritt som er nødvendige for vellykket konstruert microvessel fabrikasjon. Kollagen Gelen må blandes grundig for å oppnå en homogen løsning, og det er viktig ikke å innføre bobler under dette trinnet. Dette er viktig for cellenes levedyktighet og fysiologisk funksjon, særlig for eksperimenter som omfatter parenkymceller i kollagenmatriksen. Dersom en ensartet blanding av kollagen er vanskelig å få tak i, kontrollerer pH-verdien av løsningen for å sikre at den er nøytral. Hvis problemet vedvarer, er det mulig kollagen lager bør byttes ut. Et annet kritisk punkt er forsamlingen av de øverste og nederste bolig stykker - det er viktig å ikke bruke unødig makt, da dette kan føre til at kanaler for å kollapse. Flere runder praksis kan være nødvendig for å oppnå en følelse av hvor mye kraft som er nødvendig for å søke mens roterende skruer. Hvis kanal kollaps eller knusende vedvarer selv etter trening, er det mulig PDMS-nettverket er blitt vridd på grunn av absorption av fuktighet. Fra og med nystekte PDMS muggsopp vil bidra til å løse dette problemet. Feilaktig gjengede hull i bunnen enheten kan også forårsake kanal kollaps. Hvis skruene ikke er i stand til å rotere jevnt under montering, må ekstra kraft brukes ofte resulterer i strukturell svikt. Den siste avgjørende skritt som bør vektlegges er betydningen av hyppig fôring, vanligvis hver 12 time. Dette er viktig for å opprettholde endotelet og hindre enheten fra å tørke ut. I det tilfelle at sådd endotelceller ser ut usunn eller løsne fra kollagen veggen, mulige måter å forbedre endotelial helse er å mate fartøyene oftere, bruke en sprøytepumpe for å anvende kontinuerlig strøm, eller kontrollerer pH-verdien av kollagen gel for å sikre at den er ved et fysiologisk nivå.

For tiden er denne plattformen begrenset til fabrikasjon med ekstracellulær matriks av passende stivhet til å opprettholde strukturell integritet av kanalen under monteringen. tett samarbeidllagen ved eller større enn 6 mg / ml er tilstrekkelig, men kollagen mindre enn 6 mg / ml og andre matrikser slik som decellularized matriks fra hele organer er for svake. Dette kan overvinnes ved anvendelse av en blanding av kollagen med matrisen i spørsmålet. Konstruert microvessels er også begrenset av sin størrelse skala. Fartøyer kan fremstilles til en nedre grense på omtrent 100 um, men betydelige modifikasjoner ville trenge å bli brukt for å oppnå en mindre skala. Selv om konstruert microvessels skape et tredimensjonalt lumen, er selve nettverket plane. For å opprette en virkelig tredimensjonalt vaskulær plexus, ville ytterligere endringer må brukes slik som å skape et flerlags nettverk ved å stable flere konstruerte fartøy.

De representative resultater som presenteres i denne fremgangsmåten demonstrere hvordan Engineered microvessels kan brukes til å vurdere barrierefunksjon, celle-celle-signalisering (pericyte rekruttering og vaskulær stabilisering), angiogenese, og trombose. highlights av disse studiene er presentert her med mer detaljerte presentasjoner i tidligere publikasjoner 31,32. Disse studiene viser hvordan pericytes migrere og frakk endotelet av konstruerte microvessels 31, blodplater holde aktivert endotel 31, og væske skjærspenning modulerer endothelial aktivering og VWF sekresjon og montering 32. Konstruerte microvessels kan videre brukes til å bygge vaskulariserte vev og modellorganspesifikke systemer, slik som nyre 33 eller 34 hjertet. Evnen til å replikere disse fysiologiske blod-endotel interaksjoner og justere mikromiljøet i forhold til skjærspenning, geometri, ECM, og cellulære sammensetning vil muliggjøre fremtidige studier av vaskulære sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institutt for Stem Cell og regenerativ medisin samt Washington Nanofabrication Facility ved University of Washington. De erkjenner også økonomisk støtte fra National Institute of Health gir DP2DK102258 (til YZ), og trening gir T32EB001650 (til SSK og MAR) og T32HL007312 (til MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Bioteknologi tissue engineering microvasculature endotelceller vaskulær engineering 3D cellekultur micropatterning
Micropatterning og montering av 3D microvessels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter