Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

doi: 10.3791/54457 Published: September 9, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito presenta un método de moldeo por inyección para diseñar microvasos que recapitular las propiedades fisiológicas de endotelio. El proceso basado en microfluidos crea redes vasculares 3D patente con condiciones tailorable, tales como gradientes bioquímicos de flujo, composición celular, la geometría, y. Se describe el proceso de fabricación y los ejemplos de posibles aplicaciones.

Abstract

En plataformas in vitro para estudiar las células endoteliales y la biología vascular se limitan en gran medida a la cultura de células endoteliales 2D, el flujo cámaras con polímero o sustratos a base de vidrio, y ensayos de formación de tubo a base de hidrogel. Estos ensayos, mientras informativa, no se recapitulan la geometría del lumen, la matriz extracelular adecuada, y la proximidad multicelular, que juegan un papel clave en la modulación de la función vascular. Este manuscrito describe un método de moldeo por inyección para generar vasos diseñado con diámetros del orden de 100 micras. Los microvasos se fabrican mediante la siembra de células endoteliales en un canal microfluídico incrustado dentro de un tipo nativo I colágeno hidrogel. Mediante la incorporación de las células del parénquima dentro de la matriz de colágeno antes de la formación de canal, microambientes específicos de tejido pueden ser modeladas y estudiadas. modulaciones adicionales de propiedades y medios hidrodinámico composición permiten el control de la función vascular compleja dentro del microambiente deseada.Esta plataforma permite el estudio de la contratación perivascular de células, las interacciones sangre-endotelio, respuesta de flujo, y las interacciones de tejido microvascular. microvasos ingeniería ofrecen la posibilidad de aislar la influencia de los componentes individuales de un nicho vascular y precisamente controlan sus químicos, biológicos, mecánicos y propiedades para estudiar la biología vascular tanto en la salud y la enfermedad.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La microvasculatura en cada órgano ayuda a definir el microambiente del tejido, mantener la homeostasis del tejido y regulan la inflamación, la permeabilidad, la trombosis, y la fibrinólisis 1,2. Endotelio microvascular, en particular, es la interfaz entre el flujo sanguíneo y el tejido circundante y por lo tanto juega un papel crítico en la modulación de la función del órgano vascular y en respuesta a estímulos tales como las fuerzas hidrodinámicas y citoquinas circulantes y hormonas 3 - 5. La comprensión de las interacciones detalladas entre el endotelio, la sangre y el microambiente tejido circundante es importante para el estudio de la biología vascular y progresión de la enfermedad. Sin embargo, los avances en el estudio de estas interacciones se ha visto obstaculizado por limitada en herramientas in vitro que no recapitulan en la estructura microvascular vivo y la función 6,7. Como resultado, el campo y el avance terapéutico se ha basado en gran medida en costoso y tiempo-el consumo de modelos animales que a menudo no traducir del éxito en seres humanos 8 - 10. Mientras que los modelos in vivo son de gran valor en el estudio de mecanismos de la enfermedad y funciones vasculares, que son complejas y a menudo carecen de un control preciso del individuo celular, bioquímica, y las señales biofísicas.

Vasculatura en todo el cuerpo posee una estructura jerárquica madura en conjunción con lechos capilares expansivas, proporcionando la perfusión optimizado y el transporte de nutrientes al mismo tiempo 11. Inicialmente, las formas vasculatura como un plexo primitiva que reorganiza a una red jerárquica ramificada durante el desarrollo temprano 12,13. Aunque muchas de las señales implicadas en estos procesos se conocen bien 14 - 16, sigue siendo difícil de alcanzar, tales cómo el patrón vascular se determina 15. A su vez, la recapitulación de este proceso in vitro para diseñar redes vasculares organizados tiene abejan. Muchas plataformas difíciles existentes in vitro para modelar la vasculatura, por ejemplo, dos cultivos de células endoteliales dimensionales, carecen de características importantes tales como la proximidad multi-celular, tres geometría luminal dimensional, flujo, y de la matriz extracelular. Los ensayos de formación de tubos en 3D (hidrogeles de colágeno o fibrina) 17 - 19 o invasión ensayos de 20,21 se han utilizado para estudiar la función endotelial en 3D y sus interacciones con otras vasculares 17,22 celulares o tejidos tipos 23. Sin embargo, ensamblados lúmenes en estos ensayos carecen de interconectividad, el flujo hemodinámico, y la perfusión adecuada. Además, la propensión a la regresión vascular en estos ensayos de formación de tubo 24 impide que la cultura a largo plazo y la maduración que limita el grado de estudios funcionales que se pueden realizar. Por lo tanto, hay una necesidad creciente para diseñar plataformas in vitro de redes microvasculares que pueden modelar adecuadamente ESendotelial características y son capaces de cultivo a largo plazo.

Una variedad de técnicas de ingeniería vasculares han surgido en los últimos años para aplicaciones médicas para reemplazar o vasos de derivación afectada en pacientes con enfermedad vascular. Vasos de gran diámetro fabricados con materiales sintéticos tales como tereftalato de polietileno (PET), y politetrafluoroetileno (PTFE) han tenido un considerable éxito terapéutico con la permeabilidad a largo plazo (promedio 95% la permeabilidad de más de 5 años) 25. Aunque de pequeño diámetro injertos sintéticos (<6 mm) por lo general se enfrentan a complicaciones tales como hiperplasia de la íntima y trombopoyesis 26 - 28, ingeniería tisular injertos de pequeño diámetro hechos con material biológico han hecho progresos significativos 29,30. A pesar de los avances de este tipo, los vasos de ingeniería en la microescala han seguido siendo un reto. Para modelar adecuadamente la microvasculatura, es necesario para generar patrones de red complejas con sufciente resistencia mecánica para mantener la permeabilidad y con una composición de matriz que permite tanto la permeación de nutrientes para las células del parénquima y remodelación celular.

Este protocolo presenta una novedosa red de vasos artificiales perfusable que imita un nativo in vivo con un ajuste ajustable y controlable microambiente el 31 de - de 34. El método descrito genera microvasos Diseñado con diámetros del orden de 100 micras. microvasos ingeniería se fabrican mediante la perfusión de las células endoteliales a través de un canal de microfluidos que está incrustado dentro del tipo I colágeno suave hidrogel. Este sistema tiene la capacidad de generar redes modelados con estructura luminal abierta, replicar las interacciones multicelulares, modular la composición de la matriz extracelular, y aplicar fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. La microfabricación de modelado polidimetilsiloxano (PDMS) con el diseño de redes

  1. Fabricación de obleas para crear una plantilla negativo de la Red de Diseño
    1. Crear un modelo de red utilizando cualquier software de diseño (CAD) asistido por ordenador. Asegúrese de que la dimensión diagonal entre la entrada y la salida coincide con la distancia entre los depósitos de entrada y salida en los dispositivos de la vivienda en los pasos futuros (véase 2.1.1).
      Nota: El diseño del modelo en sí es en función a medida en los objetivos de investigación específicos del usuario (ver Figura 1, por ejemplo, patrones).
    2. Generar una máscara del patrón de red mediante la impresión de alta resolución o pedir una foto máscara de cromo de un proveedor comercial. Un protocolo más detallado del proceso de fotolitografía está disponible en otra parte 35.
    3. Limpiar una oblea de 8 "de silicio durante 5 min a 100 W con el tratamiento con plasma de oxígeno.
    4. Vierta suficiente fotoprotector negativo (SU-82.100 funciona bien) sobre la oblea de tal manera que la capa protectora forma una porción con diámetro de 2,5 cm. El uso de un revestidor de giro, girar la oblea a 500 rpm con 100 rpm / sec rampa y mantener durante 10 seg. Después volver a 1.600 rpm con 300 rpm / seg y mantener durante 30 segundos. Nota: La velocidad y la rampa deben optimizarse para cada condición de laboratorio para producir un espesor de 150 micras resistir.
    5. Soft-hornear la oblea a 65 ° C durante 7 minutos, la rampa de hasta 95 ° C a 360 ° C / h, y mantener durante 45 minutos. Enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente en el plato caliente. Imprimir el patrón de los vasos sobre la oblea recubierta por la exposición a la luz UV de 365 nm con una fotomáscara de cromo, con la exposición triple que la de la recomendación del fabricante (350 mJ / cm2 para un espesor de SU-8 de alrededor de 150 micras).
      Nota: Desde SU-8 es resistirse a una negativa, las regiones expuestas (todo excepto el patrón de diseño) se vuelven insolubles para el desarrollador en el paso 1.1.7.
    6. Hard-hornear la oblea expuesta a los 65 años° C durante 5 min y rampa de hasta 95 ° C a 360 ° C / hr y mantener durante 25 minutos, luego deje que se enfríe lentamente hasta la temperatura ambiente en el plato caliente.
    7. Sumergir la oblea en el SU-8 desarrollador durante 10 - 15 min para lavar no expuesta resistir, a continuación, limpie con alcohol isopropílico y se seca bajo un flujo de nitrógeno comprimido. Inspeccionar el patrón bajo un microscopio de luz para asegurar el SU-8 se resisten bien adheridos a la oblea (busque pelado y las burbujas no deseado).
    8. Medir el espesor de las características de patrón mediante un perfilómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante 36. Durante la adquisición de medición, evitar regiones de la estructura que son esenciales para la función de red (es decir, de entrada y conductos de salida) como un perfilómetro de contacto basado podría poner en peligro la integridad estructural de las características estampadas en la oblea. Alternativamente, utilizar un método sin contacto (es decir, perfilómetro óptico) para evitar este problema por completo.
  2. Generación de modelado y plana Moldes para Moldeo por colágeno
    Nota: Manejar silanos dentro de una campana de humos química.
    1. Colocar la oblea en un desecador con 100 l de tricloro (3,3,3-trifluoropropilo) silano durante 2 horas a silanizar la superficie.
    2. Transferir oblea silanizada en un 120 x 120 mm cuadrados placa de Petri. Verter agente de mezclado y de-gaseado elastómero PDMS y curado (10: 1 w / w ratio) sobre la oblea para lograr 4-6 mm de espesor. Verter PDMS adicionales en un cuadrado plato separado 120 x 120 mm de Petri para generar moldes planos y sin patrones. Curado a 65 ° C durante 2 horas.
    3. Retirar del horno y permitir que el PDMS se enfríen a temperatura ambiente. Con un bisturí cortar cuidadosamente un cuadrado alrededor del SU-8 y tire lentamente el molde de PDMS de la oblea. Recortar los bordes de 30 mm x 30 mm. Para moldes planos, corte curado PDMS sin un patrón impreso en piezas cuadradas de 40 mm x 40 mm.

2. Dispositivos de vivienda

  1. fabricatión de piezas superior e inferior de Vivienda
    1. Fabrique vivienda recipiente usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA). Para fabricar, ordenar las partes de una tienda de máquina estándar con capacidades de fresado de control numérico (CNC). Véase la Figura 1 para un esquema de las piezas superior e inferior.
    2. Diseño de la pieza de carcasa superior (Figura 1D) para incluir un 20 mm x 20 mm bien en la parte inferior del dispositivo con una profundidad de 1 mm, dos orificios de inyección de colágeno (diámetros 4 mm) en la parte superior del dispositivo situado en las esquinas de la plaza, así, dos depósitos de entrada y salida con 6 mm de diámetro, y cuatro orificios de los tornillos (3 mm de diámetro) en las cuatro esquinas del dispositivo.
      Nota: Los agujeros adicionales pueden ser perforados en la periferia de la pieza para propósitos de manipulación.
    3. Diseñar la pieza inferior de la carcasa (Figura 1E) para incluir un agujero cuadrado en el centro (dimensiones de 15 mm x 15 mm) con un entorno de 25 mm x 25 mmestante con una profundidad de 0,25 mm. Taladro 4 agujeros de los tornillos con rosca 4-40. Asegúrese de que los orificios de los tornillos en la parte inferior y superior piezas se alinean juntos durante futuros pasos de montaje.

3. microvasos la fabricación del dispositivo

  1. Preparación de Materiales
    1. Lavar y esterilizar en autoclave dos juegos de pinzas, una espátula de acero inoxidable, un destornillador plano pequeño, tornillos de acero inoxidable, y varios pasadores de acero inoxidable. Para la fabricación de los vasos, también autoclave moldes de PDMS micropatterned, PDMS cuadrados planos, cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm), y piezas de algodón.
    2. Esterilizar las piezas de cubierta de PMMA en lejía durante al menos 1 hora, luego enjuague con agua esterilizada en autoclave en la campana de cultivo de tejidos en dos ocasiones, y dejar secar al aire en placas de cultivo de tejido estéril (150 mm x 25 mm).
  2. Estéril polietilenimina-glutaraldehído (PEI - GA) Recubrimiento
    1. Tratar pocillos interiores de piezas de PMMA secos esterilizadoscon plasma durante aproximadamente 1 min. Añadir 1% polietilenimina (PEI) en los pozos interiores (los 20 mm de lado así en la parte superior y la plataforma cuadrada de 25 mm en la parte inferior) de las piezas de PMMA durante 10 minutos. Enjuague con estéril H 2 O y dejar secar en la campana de cultivo de tejidos.
      Nota: El tiempo necesario para el tratamiento con plasma es variable dependiendo del dispositivo que se utiliza - la PEI debe propagarse fácilmente que indica una superficie hidrófila. Si no, puede ser necesario el tratamiento con plasma adicional.
    2. Aplicar 0,1% de glutaraldehído (GA) en PEI tratada superficies de las piezas de PMMA para 30 min. Enjuague dos veces con agua estéril y dejar secar.
      Nota: En los pasos futuros, el colágeno se adherirá a la superficie recubierta a través de la reticulación de colágeno-glutaraldehído. Esto ayuda a asegurar el gel en su lugar dentro del dispositivo durante futuros pasos de montaje y durante todo el periodo de cultivo dispositivo.
  3. Preparación del gel del colágeno
    1. Fabricar barcos que utilicen el 0,6% - 1% de colágenosoluciones. Para producir colágeno 0,75% para la fabricación de recipientes, tipo de la mezcla I colágeno solución madre (1,5% - aislado de rata colas 37) con hidróxido de sodio (NaOH), 10x Medios Suplemento (M199), y medios de cultivo celular. Mantenga todas las soluciones en hielo.
    2. Determinar el volumen de colágeno mediante la siguiente ecuación, donde V ƒinal es el volumen final de gel requerido (por lo general, 1 ml de colágeno por dispositivo es suficiente), V colágeno de valores es el volumen de colágeno de stock necesario, colágeno de C es la concentración del colágeno de valores, colágeno y C ƒinal es la concentración deseada del colágeno en el recipiente.
      Ecuación 1
    3. Usar una jeringa de 1 ml para transferir el volumen apropiado de colágeno de stock a un nuevo tubo cónico de 30 ml. Determinar los volúmenes de la NaOH neutralizante (V NaOH), M199 10x suplemento medios(V 10 X), y medios de cultivo celular (V 1 X) como sigue y mezclar por separado en un tubo cónico de 15 ml:
      Ecuación 2
    4. Añadir la mezcla de reactivos neutralizantes (V 10 X, NaOH V, V 1 X) al colágeno alícuota, y el uso de una pequeña espátula para mezclar suavemente la solución hasta que se obtiene un gel homogéneo. Evitar la introducción de burbujas de agitación lenta y suavemente.
    5. Para incorporar las células en la matriz a la concentración deseada (por ejemplo, 0,5 - 20 millones de células / ml), añadir a las células a la solución de colágeno después de que se mezcla con los reactivos de neutralización, y se continúa agitando hasta que las células se distribuyen homogéneamente.
    6. Cuando se añaden las células, ajustar el volumen de medios de cultivo celular para acomodar el volumen adicional, tal como se determina por la siguiente ecuación, donde las células V </ sub> es el volumen requerido de la suspensión de células, C densidad celular ƒinal es la densidad deseada de las células en el recipiente, la densidad de células en suspensión C es la densidad de las células en la solución madre.
      Ecuación 3
  4. La inyección de colágeno - Parte superior del
    1. Coloque el molde de PDMS micropatterned en un 100 mm x 20 mm plato. Plasma limpiar el molde de PDMS durante 1 min.
    2. Alinear la pieza de PMMA parte superior en la parte superior del molde de PDMS de manera que los depósitos de cuadrados en el molde están directamente debajo de los depósitos de entrada y de salida (véase la Figura 1D - líneas de trazos). Coloque los pasadores de acero inoxidable en la entrada y salida agujeros de depósito en la pieza de PMMA parte superior para mantener el acceso claro a partir de los depósitos en el patrón.
    3. Utilice una jeringa de 1 ml para extraer ~ 0.5 - 0,6 ml de colágeno. Asegúrese de que no queden burbujas permanecen en la jeringa.
    4. Presione hacia abajo lightly con pinzas en la parte superior de la carcasa para asegurar el contacto al ras entre la pieza superior y el molde de PDMS. Inyectar colágeno lentamente a través de un puerto de inyección sobre la pieza de PMMA superior. Compruebe que el colágeno se llena en el dominio de 20 mm x 20 mm por encima del patrón y no se escape.
    5. Cierre el plato sin empujones los pasadores y dejar cuajar en una incubadora a 37ºC durante 30 min.
  5. La inyección de colágeno - pieza inferior
    1. Colocar un cubreobjetos de vidrio 22 x 22 mm en el centro de la pieza inferior. Utilice una jeringa de 1 ml para dispensar ~ 0,25 ml de colágeno de manera uniforme sobre el portaobjetos de vidrio. Con cuidado baje el PDMS cuadrado plano sobre el colágeno, lo que garantiza el PDMS es plana contra el PMMA y no hay burbujas atrapadas. Permitir a gel a 37 ° C durante 30 min.
  6. conjunto de dispositivo
    1. Después de la gelificación, añadir una cantidad suficiente PBS alrededor de la pieza PDMS plana sobre la pieza inferior para rodear el PDMS (alrededor de 1 ml). Utilizar pinzas para quitar cualquier correoxcess colágeno alrededor de los bordes, y poco a poco se despegan la pieza PDMS. Añadir más de PBS en la parte superior del colágeno para mantener la hidratación.
    2. Para preparar la pieza superior, utilizar pinzas para recoger la pieza de PMMA superior y darle la vuelta para que el molde de PDMS es en la parte superior. Añadir unas gotas de PBS a la interfaz, a continuación, de forma rápida y firmemente quitar el molde de PDMS de la pieza de PMMA superior.
    3. Retire con cuidado pasadores de acero inoxidable desde el otro lado de la carcasa PMMA utilizando otro par de pinzas. Añadir unas gotas más de PBS sobre el colágeno micropatterned. Voltear la pieza superior de PMMA de manera que el colágeno está orientada hacia abajo y coloque 4 tornillos en los orificios de esquina.
    4. Coloque con cuidado la pieza superior en la parte superior de la pieza inferior, alineando los tornillos con los agujeros de las esquinas de la pieza inferior. No permitir que las dos piezas se deslicen uno contra el otro. Utilice un destornillador para apretar los tornillos con un toque suave. No apriete en exceso.
    5. Aspirar el PBS que rodea las superficies de PMMA y colocar una pequeña piECE de algodón debajo de un borde del dispositivo. Con una pipeta, eliminar cualquier PBS a partir de los embalses y reemplazar con medio de cultivo celular. Deje que el dispositivo gel juntos en una incubadora a 37 ° durante al menos 1 hr.
  7. La siembra de células
    1. Cultivar las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en medio de crecimiento endotelial a 37 ° C (CO2, O2) a una confluencia del 38. Siempre que sea posible, utilice los pasajes entre 4 y 7.
    2. Tripsinizar las células endoteliales mediante el lavado del frasco de cultivo con 6 ml de PBS y añadiendo después 2 ml de tripsina al 0,05% a 37 ° C para disociar las células. Dejar las pilas tripsina hasta que la mayoría de las adhesiones focales han desprendido y las células se redondean hacia arriba (esto suele durar alrededor de 2 - 3 minutos). Detener la reacción de tripsina mediante la adición de 4 ml de medio de crecimiento endotelial que contenía suero bovino fetal (FBS). Lavar el matraz con los medios de comunicación varias veces para asegurar que las células se separaron del matraz y recogeren un tubo cónico.
    3. Contar las células usando un hemocitómetro y resuspender ellos a una densidad de 10 millones de células por ml. Retire todos los medios de cultivo celular a partir de los depósitos de entrada y salida. Utilizando una punta de carga de gel 200 l, añadir 10 l de suspensión de células en el centro de la depósito de entrada. Las células deben comenzar a fluir en la red inmediatamente y la capa de la red.
    4. Añadir 200 l medios de comunicación por igual a ambos depósitos y dejar que las células se unen y se extienden dentro de la red durante al menos 1 hora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Cultura del dispositivo con el flujo por gravedad a través de la red mediante la adición de 200 l de medio de cultivo celular al depósito de entrada y de 50 l para el depósito de salida. Con este método de cultivo, sustitución de los medios cada 12 horas para mantener la viabilidad endotelial.
      Nota: Si las condiciones de cultivo de flujo continuo son deseables (para mantener la tensión de corte constante, recoger los medios de comunicación en la salida, etc.) a SYRbomba Inge puede utilizarse en lugar de la cultura por gravedad.
    2. Permitir que las células endoteliales sembradas al menos 24 hr para sujetar y estabilizar antes de la aplicación de flujo continuo. Antes del establecimiento de flujo continuo, mantener los dispositivos con condiciones de flujo por gravedad.
      NOTA: Las condiciones de medios de flujo aplicada difieren de la cultura por gravedad. La adición de un expansor de plasma, tal como dextrano, a los medios estabiliza los microvasos de ingeniería y previene el colapso vascular durante la perfusión sostenida 39.
    3. Para hacer que los medios de comunicación para la configuración de flujo continuo, se disuelven 3,5% de dextrano (70 kDa) en medio de crecimiento endotelial para el cultivo óptimo buque. Utilizando una técnica estéril, llenar jeringas de 10 ml con medio de crecimiento endotelial con 3,5% de dextrano.
    4. Preparar una placa de cultivo estéril para el flujo por fusión de agujeros en la pared lateral de una placa de Petri utilizando un soldador.
    5. Adjuntar 12 "tubo de silicona (1/32" DI) a un acoplamiento de bloqueo Luer (Mujer, 1/16 "ID), y un 1 /16 "conector recto de tubo a tubo con un 1" segmento de tubo en el otro extremo. Introduzca un "aguja roma 20G (individual desde el cubo de la aguja) para el extremo libre de la 1" 1/4 segmento. También hay que preparar un segmento de 3 "de tubo unido a una 90 ° conjunto conector de codo de tubo a tubo (para montarse en la entrada de la caja). En los pasos subsiguientes, el tubo ya se rosca a través del plato preparado y unido a la 3 "segmento a través de la aguja 20 G. tubo de salida debería reflejar tubo de entrada, con un extremo libre en lugar de un acoplamiento de bloqueo Luer. Autoclave todos los segmentos antes de su uso.
    6. Rosca de entrada en autoclave y el tubo de salida a través de agujeros en el plato preparado. Adjuntar 3 segmentos "a internos 20 agujas G. Una el acoplamiento de bloqueo Luer de la jeringa medios llenas y la perfusión de los medios de comunicación a través de la tubería usando la bomba de jeringa fijada en un alto caudal. Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo o conectores, ya que éstos impedir el flujo al recipiente.
    7. Insertar el connector conjunta en la entrada de la vivienda. Establecer la bomba de jeringa a la velocidad de flujo deseada y comenzar la perfusión.
      NOTA: Este puede ser ajustado en función de la geometría del vaso y las condiciones experimentales de tensiones tangenciales aplicadas. Para un canal de 100 m de diámetro, con un caudal de 3 l / min funciona bien.
    8. Si se desea, recoger perfundido con tubo de salida dispuesto insertado en un estéril 5 ml de poliestireno tubo de fondo redondo que contiene 500 l de medios de comunicación.
      Nota: Se añade una pequeña cantidad de medios de comunicación para el tubo de recogida para evitar la formación de burbujas que puede bloquear el flujo.
    9. Dependiendo de velocidad de flujo, puede necesitar ser rellenados después de 24 a 36 h de la jeringa. Esto se hace mediante la eliminación del conector de la entrada de la caja, en sustitución de la jeringa, y permitiendo que los medios para perfundir a un alto caudal durante varios minutos. Esta secuencia asegura que las burbujas no se introducen en el tubo. Restablecer la bomba a la velocidad de flujo deseada para la cultura, insertar el conector en la entrada de la caja, yvolver a la incubadora.

Análisis 4. Dispositivo

  1. Análisis de la permeabilidad
    1. Utilice 40 kDa FITC-dextrano para visualizar la permeabilidad del vaso in situ. Coloque la carcasa buque en un microscopio confocal y se centran en el plano del vaso. Añadir 5 M 40 kDa FITC-dextrano para la entrada y la imagen a la magnificación de 4x, 25 mseg tiempo de exposición, y en 1 cuadro por seg para 10 min.
    2. Analizar la serie de imágenes con el código de análisis para estimar la permeabilidad de dextrano a través de la pared del vaso en colágeno (m / seg), basado en un modelo publicado por Zheng et. al. 31.
  2. Análisis y inmunotinción Imagen confocal
    1. Para solucionar los vasos, perfundir con un 3,7% de formaldehído través de la entrada durante 20 minutos y lavar por perfusión de PBS tres veces (20 min por lavado). Bloquear la unión con la albúmina 2% de suero bovino (BSA) y 0,5% de Triton X-100 pe anticuerpo no específicarfused través de la red para 1 hr. Perfundir soluciones de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C y lavar tres veces con PBS. Perfundir soluciones anticuerpo secundario durante 1 - 2 horas, y lavar de nuevo con PBS de la misma manera.
    2. Tomar imágenes de inmunofluorescencia de microvasos in situ utilizando un microscopio confocal con una z paso de 1 m. La imagen de los microvasos a un aumento de 4X, 10X, 20X o.
      Nota: Ampliación de 4X proporcionará información global de la estructura de la red, mientras 10X y 20X imágenes ampliadas proporcionarán detalles celulares, tales como la elongación, la formación de salida, etc.
    3. Analizar las pilas de imágenes utilizando ImageJ con proyecciones Z (Imagen / / Z-proyecto Pilas), secciones transversales (Imagen / view Pilas / ortogonal), y reconstrucciones en 3D (imagen / Pilas / Proyecto 3D).
  3. Microscopía Electrónica de Barrido Imaging
    1. Para el análisis de microscopía electrónica, corregir in situ mediante la perfusión de fuerza media de Karnovsky solution (2% de glutaraldehído paraformaldehído / 2,5% en tampón cacodilato 0,2 M) durante la noche. Desmontar el recipiente y se separe con cuidado las dos piezas. Recortar los bordes y sumergirse plenamente en la solución fijadora durante varios días.
    2. Sumergir la parte superior de espesor de la embarcación en el 25% de glutaraldehído durante 20 minutos y enjuagar tres veces con PBS (2 min cada uno). Deshidratar en lavados de etanol en serie de 50%, 70%, 85% (2 min cada uno) y de dos lavados en etanol al 100% (5 min cada uno).
    3. Preparar la muestra para el análisis con una mayor deshidratación mediante secado por punto crítico tras el protocolo del fabricante 40. Por pulverización catódica recubrir el recipiente con oro-paladio (7 nm) y analizar bajo el microscopio electrónico de barrido con una tensión de aceleración de 5 kV, tamaño del punto 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La plataforma recipiente ingeniería crea microvasculatura funcional incrustado dentro de un tipo natural de colágeno I de la matriz y permite el control ajustado del medio ambiente celular, biofísicas y bioquímicas in vitro. Para fabricar los microvasos de ingeniería, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) se sometieron a perfusión a través de la red de microfluidos colágeno embebido en donde se unen para formar un lumen de patentes y el endotelio confluente. Como se ilustra en la Figura 1A-C, la geometría del vaso puede ser diseñado específicamente para responder a las preguntas con respecto a velocidad de flujo, tortuosidad, y la ramificación ángulos, entre otros. La modulación de la velocidad de flujo a través de los microvasos da una idea de la cizalla estrés-respuesta de las células endoteliales. Anteriormente, el enfoque de fabricación ha sido principalmente en los buques en el rango de 100 micras de tamaño, sin embargo microvasos hasta 500 micras o, en algunos casos, tan pequeño como 50 micras de diámetro han sido successfully hecho y cultivadas. Ejemplos de permeabilidad a largo plazo se muestran, así como la supervivencia de los microvasos cultivadas bajo flujo por gravedad (Figura 2A) y el flujo continua aplicada (Figura 2B). Las propiedades in vivo -como de microvasos de ingeniería se pueden demostrar de varias maneras. Varias funciones endoteliales pueden medirse utilizando esta plataforma, incluyendo la función de barrera (figura 3A), las interacciones célula-célula y de señalización (Figura 3B), y la remodelación angiogénico (Figura 3C). Una característica crítica de estos microvasos es su capacidad para responder a estímulos inflamatorios de una manera biológicamente relevante. Esto se demuestra mejor a través de su interacción con sangre entera en la Figura 4A-C, donde el endotelio no activado está en reposo (Figura 4B) y el endotelio activado induce la formación de trombos (Figura 4C). Mediante el cultivo de células endoteliales de didistinga orígenes dentro de esta plataforma, es posible comprender la heterogeneidad funcional entre las células endoteliales de diferentes fuentes. Figura 5A-C ilustra un ejemplo de esta heterogeneidad con dos tipos diferentes de células madre humanas derivadas de células endoteliales que cuando se cultivan en la pantalla del sistema de microvasos drásticamente diferentes fenotipos 41. Sintonizando los perfiles de flujo, composición de las células y condiciones de cultivo, microvasos ingeniería proporcionan una poderosa herramienta en vitro para estudiar la biología endotelial y la microvasculatura, tanto en la salud y la enfermedad.

Figura 1
Figura 1. Esquema de la Red de Protocolo de diseños y Microchannel fabricación. La geometría de la red vascular puede ser diseñado específicamente para generar diferentes patrones de flujo. A. Por ejemplo, un diseño ramificado habrá disminuido flvelocidades de flujo cerca del centro (una reducción de 8 veces en una cuadrícula de 3 por 3) resultantes en regiones de tensión de cizallamiento variada sobre el endotelio dentro del mismo recipiente 31. B. Una red muy ramificada sigue el mismo principio que el diseño anterior, pero con un plexo más grandes. Con este diseño, los efectos de una reducción de 50 veces en la velocidad de flujo, lo que resulta en una reducción de la velocidad de cizalla de 10 a 500 seg -1 se pueden observar cuando se aplica una caída de presión de 1000 Pa a través de la red 32. C. diseños más complejos tal como una red tortuosa con las puntas 32 ​​se puede utilizar para responder a las preguntas con respecto a la respuesta endotelial a interrupciones en el flujo laminar, que a menudo se producen en contextos patológicos 42. Microvasos a partir de estos patrones tendrán un diámetro de 100 -. 150 micras D. Hay tres pasos principales durante la fabricación de microcanales. En primer lugar, la parte superior de la plantilla de carcasa se coloca en la parte superior de la PDMS modelado molde de red de tal manera que la entrada y la salida están alineados. El colágeno I se inyecta entonces en el espacio cerrado a través de los puertos de inyección (flecha negro). Típicamente, una mezcla de 0,75% de colágeno I se usa para la fabricación. Fabricación de microvasos con éxito se puede lograr con colágeno precio tan bajo como 0,6%, sin embargo menos de 0,6% da lugar típicamente a una resistencia mecánica insuficiente y el colapso del canal. Se añade E. Una fina capa de colágeno para la pieza inferior en la parte superior del cubreobjetos, y se aplana con otra pieza de PDMS. F. Después de la gelificación a 37 ° C, el PDMS se retiran los moldes y las plantillas de cubierta superior e inferior están atornilladas entre sí para encerrar la red. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
> Figura 2. Microvasos cultivadas con perfiles de flujo controlado. A. HUVECs sembradas en microvasos cultivadas bajo flujo impulsado por gravedad y B. aplica flujo continuo a una velocidad de 3 l / min. Cultura bajo flujo aplicado se consigue mejor con la adición de 3,5% de dextrano a los medios de comunicación que se ha demostrado para estabilizar microvasos a base de colágeno de microfluidos ejerciendo presiones físicas dentro del lumen que mejoran la formación de salida, aunque el mecanismo exacto la conducción de este efecto no es claro 39 . Microvasos se tiñeron para el CD31 proteína de unión endotelial o grupo de diferenciación 31 (rojo) y el factor de von Willebrand (VWF) gránulos (verde). A ', B'. En ambas condiciones, las HUVEC expresan marcadores endoteliales de uniones célula-célula y VWF gránulos. A ", B". vistas ortogonales muestran patentes y lúmenes redondeadas después de 6 días de cultivo.arge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Microvasos diseñadas especialmente para el estudio de la función endotelial. Una función de barrera endotelial. Puede evaluarse después de la perfusión del FITC (isotiocianato de fluoresceína) y conjugado con dextrano a través de las redes (arriba) y la posterior medición de su difusión en el colágeno mayor (parte inferior). El uso de código personalizado, videos de la perfusión pueden ser analizados para trazar intensidad de los píxeles sobre una región de interés dentro de la trama a través del tiempo para determinar el coeficiente de permeabilidad K (m / seg) de la FITC-dextrano. Publicaciones anteriores por el laboratorio han demostrado que la permeabilidad de estos recipientes de ingeniería es comparable a la de la ex vivo de mamíferos vasos 31,43. B. las interacciones de células endoteliales con perivcélulas ascular o de apoyo pueden ser analizados en esta plataforma mediante la modulación de la composición celular de la matriz de colágeno. Aquí, un ejemplo de estas interacciones célula-célula puede observarse cuando las células del músculo liso están incrustados dentro del colágeno que rodea los vasos. Después de 14 días en cultivo, las células del músculo liso (tiñeron para la actina alfa del músculo liso (αSMA) en verde) asociado con el endotelio y se extienden a lo largo de los procesos de la pared del vaso y actúan como células perivasculares como se ve en las proyecciones ortogonales 31. Las imágenes mostradas en el panel A y B son reproducciones de una publicación anterior 31. C. brote angiogénico y la remodelación se pueden evaluar en microvasos de ingeniería mediante la modificación de los medios de cultivo para incluir estímulos angiogénicos. Sin estímulos angiogénicos, HUVECs muestran germinación mínima (izquierda); con estímulos angiogénicos (1 mM inhibidor de molécula pequeña de GSK-3, 20 ng / factor de crecimiento endotelial vascular ml, y 20 ng / ml de fibroblastos básicos growth de los factores), HUVEC brotar fácilmente en la matriz como se ve en la parte superior hacia abajo y proyecciones ortogonales (derecha). La longitud de brotes y el número es fácilmente cuantificable con el software ImageJ 41. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Interacciones de sangre-endotelio. Diseñado microvasos son quiescentes y responden apropiadamente a los estímulos inflamatorios. A. Un sin modificar, HUVEC cultivadas recipiente fotografiado cerca de la entrada de muestra fuerte tinción CD31 de unión (rojo) y una ronda, lumen abierto. A '. Ortogonal se muestra la vista de la luz. B. Cuando citrada de sangre entera con plaquetas marcadas con CD41a (verde) se perfunde a través de un recipiente de manera similar de reposo, ad mínimoSe observa HESION de las plaquetas (verde) al endotelio. C. Con la exposición a estímulos inflamatorios, como forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, 50 ng / ml) a los medios de comunicación, la perfusión de los resultados de sangre entera en la formación de grandes trombos (CD41a marcado con, verde) dentro del canal y adhesión de los leucocitos (CD45 + etiquetados, blanco) a la pared del vaso 31. Imágenes que se ven aquí se reproducen a partir de una publicación anterior 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. microvasos generados con el vástago humano celulares derivadas de ECs. Fuentes de células endoteliales adicionales pueden ser usados ​​para generar los microvasos de ingeniería. A principios de este año, Palpant et. al. demostró que dos subtipos distintos océlulas derivadas de células madre embrionarias humanas f endoteliales se pueden obtener mediante la manipulación de la señalización Wnt / β-catenina durante la diferenciación: células endoteliales hemogenic (caracterizado por la expresión de HAND1 y un alto potencial hemogenic) y las células endoteliales endocárdicos-como (caracterizan en parte por la expresión NFATc1 y GATA4) 41. A. Cuando siembran y cultivan en el buque plataforma 3D, EC hemogenic sufren algunos brote angiogénico. B. Sin embargo, la EC-endocárdica similares son mucho más angiogénico y migratoria, lo que sugiere diferencias funcionales, tal vez en respuesta a fluir, entre los dos subtipos de ECs (este trabajo se presenta con más detalle en una publicación anterior 41). Ambos tipos de células expresan proteínas de unión de CD31 (rojo) y algunos FVW (verde). Vistas ortogonales de ambos muestran lúmenes de patentes. C. Una imagen de microscopio electrónico de barrido de la EC-endocárdica como dentro del vaso muestra un brote angiogénico como se vedesde el lado luminal. Las imágenes presentadas en los paneles A y B son reproducciones de Palpant et. al., 41. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Microvasos de ingeniería son un modelo in vitro, donde están presentes y sintonizable características fisiológicas, tales como la geometría luminal, las fuerzas hidrodinámicas, y las interacciones multicelulares. Este tipo de plataforma es de gran alcance, ya que ofrece la posibilidad de modelar y estudiar el comportamiento del endotelio en una variedad de contextos en los que las condiciones de cultivo in vitro en puede ser igualada a la del microambiente en cuestión. Por ejemplo, los mecanismos que impulsan los procesos endoteliales, tales como la angiogénesis, se sabe que se producen de manera diferente en diferentes órganos y en diferentes estados patológicos, como la salud y la enfermedad 44. Por esta razón, cultivo de células endoteliales planar es consistentemente inadecuada 6 y, como tal, el campo se ha basado en gran medida en modelos animales costosos y lentos.

Los modelos animales, mientras que informativo y esencial para el progreso de la investigación biológica, no siempre se traducen bien a la clínica.Esto se ha atribuido en gran medida a las diferencias entre murino y la biología humana, en particular con respecto a su respuesta a estímulos 9,45. Por tanto, es esencial para poder construir modelos in vitro que pueden proporcionar datos específicos de humanos adicionales para complementar la información obtenida de modelos animales. Plataformas in vitro tienen el potencial para imitar el microambiente de interés con la capacidad adicional para sintonizar ese entorno. Las características clave de un sistema de este tipo debe incluir la estructura tridimensional y la geometría, composición de la matriz extracelular (ECM), la proximidad de células del parénquima y la interacción, el flujo de sangre, y los estímulos bioquímicos. microvasos de ingeniería tienen la capacidad de incorporar todos estos parámetros. Esto se puede hacer simultáneamente para crear un modelo que lo abarca todo, o se añade de manera sabia paso para aislar las respuestas e interacciones individuales.

Un aspecto de gran alcance de microvasos de ingeniería es la capacidad deflujo de control y manipular las fuerzas hidrodinámicas ejercidas sobre el endotelio. A modo de ejemplo, el dispositivo puede ser cultivado bajo condiciones de flujo por gravedad o con perfusión continua (Figura 2). La magnitud de la tensión de cizallamiento en la pared del vaso puede ser modulada en ambas condiciones a través de cambios en la tasa de flujo y la geometría del recipiente. La principal diferencia entre las dos condiciones es la distribución temporal de la tensión de cizallamiento dentro del recipiente. En condiciones de flujo por gravedad, la tensión de corte no es constante en el tiempo. La tasa de flujo y la tensión de corte son más altos inmediatamente después de un cambio de medio, cuando el depósito de entrada está llena. A medida que los drenajes de los medios, el esfuerzo de corte se reducirá. Esto conduce a una gama de tensión de corte a lo largo de 12 hr. Los experimentos que requieren un control preciso sobre las propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, para estudiar los efectos de la tensión de cizallamiento en el endotelio) deben utilizar condiciones de cultivo de flujo continuo.

mimicrovasos ngineered pueden ajustarse para responder a una amplia gama de preguntas con relativamente fáciles modificaciones. Diferentes tipos de células, tanto del parénquima y endotelial, se pueden utilizar para modelar diferentes sistemas de órganos. Además de la fabricación de microvasos con la siembra de células endoteliales, células epiteliales en lugar podrían utilizarse para alinear el canal para los estudios relativos a la mucosa intestinal, alvéolos pulmonares, túbulo renal, etc. Una vez que el microambiente se define por la composición celular, la solución de nutrientes (es decir, los medios de comunicación, la sangre, factores de crecimiento, u otro fluido biológicamente relevante) que se utiliza para perfundir el dispositivo se puede cambiar para responder a preguntas complejas sobre la señalización celular, la quietud, la tensión de cizallamiento , nutrientes, la respuesta al fármaco, y más. Además, la geometría del recipiente puede ser diseñado específicamente para investigar la respuesta endotelial a esfuerzo cortante y tortuosidad. Como un ejemplo, una publicación reciente de Zheng et. al. mostraron que las células endoteliales tienen Increassecreción ed VWF y conjunto de fibras en las regiones de microvasos con alta tensión de corte y la aceleración de flujo. Específicamente, VWF haces de forma típicamente en las esquinas y curvas cerradas dentro de la red. La geometría de la red también puede ser diseñado para fabricar túbulos multicelulares. Por ejemplo, un diseño que contiene dos canales paralelos, cada uno con su propia entrada y la salida podría utilizarse para generar un gradiente de concentración o para modelar un entorno túbulo adyacente (por ejemplo, vaso linfático con los microvasos adyacentes). Las estructuras en forma de rejilla de los diseños actuales de la red (como se muestra en la Figura 1A-C) son ventajosas para el modelado de fluidos computacional y para la integridad estructural durante la fabricación, pero no son indicativos de la estructura vascular en el cuerpo. En estudios futuros, se deben utilizar patrones de red más fisiológicas, tales como los que tienen ramificación jerárquica y esquinas redondeadas.

Si bien todos los pasos descritos en este procedimiento son importantes, hayvarios pasos críticos que se requieren para el éxito de la fabricación de los microvasos de ingeniería. El gel de colágeno se debe mezclar a fondo para lograr una solución homogénea, y es esencial para no introducir burbujas durante este paso. Esto es esencial para la viabilidad celular y la función fisiológica, particularmente para experimentos que incluyen las células del parénquima en la matriz de colágeno. Si una mezcla uniforme del colágeno es difícil de obtener, comprobar el pH de la solución para asegurar que es neutral. Si el problema persiste, es posible que la población de colágeno debe ser reemplazado. Otro paso importante es el montaje de las piezas del chasis superior e inferior - es esencial no utilizar la fuerza excesiva ya que esto puede causar el colapso de los canales. Varias rondas de práctica pueden ser necesarios para obtener una idea de la cantidad de fuerza necesaria para aplicar la vez que gira tornillos. Si el colapso o aplastamiento canal sigue ocurrir incluso después de la práctica, es posible que la red se ha convertido en PDMS deformado debido a absorption de humedad. A partir de moldes de PDMS recién hechos ayudará a resolver este problema. agujeros roscados en forma incorrecta el dispositivo inferior también pueden causar el colapso del canal. Si los tornillos no son capaces de girar suavemente durante el montaje, la fuerza adicional se debe aplicar a menudo dando lugar a fallo estructural. El último paso crítico que hay que resaltar es la importancia de la alimentación frecuente, normalmente cada 12 horas. Esto es esencial para mantener el endotelio y la prevención de que el dispositivo se seque. En el caso de que sembraron células endoteliales parecen poco saludable o se desprendan de la pared de colágeno, las posibles formas de mejorar la salud del endotelio son para alimentar a los vasos más a menudo, utilizar una bomba de jeringa para aplicar flujo continuo, o comprobar el pH del gel de colágeno para asegurarse de que está en un nivel fisiológico.

Actualmente, esta plataforma se limita a la fabricación de la matriz extracelular de la rigidez adecuada para mantener la integridad estructural de la canal durante el montaje. co densallagen a o mayor que 6 mg / ml es suficiente, pero el colágeno de menos de 6 mg / ml y otras matrices, como matriz descelularizado de órganos enteros son demasiado débiles. Esto se puede superar mediante el uso de una mezcla de colágeno con la matriz en cuestión. microvasos de ingeniería también están limitados por su escala de tamaño. Los buques se pueden fabricar a un límite inferior de aproximadamente 100 micras, pero tendrían que ser aplicada para conseguir una escala más pequeña modificaciones sustanciales. Aunque microvasos ingeniería crear un lumen tres dimensiones, la propia red es plana. Para crear un plexo vascular verdaderamente tridimensional, tendrían que ser aplicada como la creación de una red de múltiples capas apilando varios vasos de ingeniería modificaciones adicionales.

Los resultados representativos se presentan en este método demuestran cómo microvasos ingeniería se puede utilizar para evaluar la función de barrera, la señalización célula-célula (reclutamiento de pericitos y estabilización vascular), la angiogénesis y la trombosis. Highlipeleas de estos estudios se presentan aquí con presentaciones más detalladas en las publicaciones anteriores 31,32. Estos estudios muestran cómo los pericitos migrar y recubrir el endotelio de los microvasos de ingeniería 31, las plaquetas se adhieren al endotelio activado 31, y el esfuerzo cortante del fluido modula la activación endotelial y la secreción de FVW y montaje 32. Microvasos de ingeniería se pueden usar además para construir los tejidos vascularizados y sistemas de órganos específicos de modelo, como el riñón o el corazón 33 34. La capacidad de replicar estas interacciones sangre-endotelio fisiológicos y sintonizar el microambiente con respecto al esfuerzo cortante, la geometría, ECM, y la composición celular permitirá a los futuros estudios de enfermedades vasculares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer la Lynn y Mike Garvey Laboratorio de Imagen en el Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa, así como el Fondo de Washington nanofabricación de la Universidad de Washington. También reconocen el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud otorga DP2DK102258 (a YZ), y la formación otorga T32EB001650 (a SSK y MAR) y T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95, (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107, (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21, (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7, (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12, (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238, (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23, (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25, (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312, (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152, (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11, (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19, (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17, (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284, (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366, (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2, (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100, (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142, (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532, (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter