Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning och montering av 3D mikrokärl

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript presenterar en formsprutnings metod för att konstruera mikrokärl som rekapitulera fysiologiska egenskaper endotel. Den mikroflödesbaserad process skapar patent 3D vaskulära nätverk med tailorable förhållanden, såsom flöde, cellulära sammansättning, geometri, och biokemiska gradienter. Tillverkningsprocessen och exempel på möjliga tillämpningar beskrivs.

Abstract

In vitro plattformar för att studera endotelceller och kärlbiologi är i stort sett begränsade till 2D endotelceller kultur, flödeskammare med polymer eller glasbaserade substrat, och hydrogel-baserade rör bildningsanalyser. Dessa analyser, medan informativ, inte rekapitulera lumen geometri, ordentlig extracellulära matrisen och flercelliga närhet, som spelar nyckelroller i att modulera vaskulär funktion. Detta manuskript beskriver en formsprutningsmetod för att generera Engineered fartyg med diametrar av storleksordningen 100 ^ m. Mikrokärl tillverkas genom ympning endotelceller i en mikroflödessystem kanal inbäddad i en infödd typ I-kollagen hydrogel. Genom att införliva parenkymceller i kollagenmatrisen före kanalbildning, kan specifika vävnadsmikromiljöer modelleras och studeras. Ytterligare moduleringar av hydrodynamiska egenskaper och media sammansättning möjliggör styrning av komplexa kärlfunktionen inom det önskade mikromiljö.Denna plattform gör det möjligt för studier av perivaskulär cell rekrytering, blod endotel interaktioner, flöde svar och vävnads mikrovaskulära interaktioner. Engineered mikrokärl erbjuder möjligheten att isolera påverkan från enskilda komponenter i en kärl nisch och exakt kontrollera kemiska, mekaniska och biologiska egenskaper för att studera vaskulär biologi i både hälsa och sjukdom.

Introduction

Mikrovaskulaturen i varje organ hjälper till att definiera den vävnadsmikromiljö, underhålla vävnadshomeostas och reglera inflammation, permeabilitet, trombos och fibrinolys 1,2. Mikrokärlendotel, i synnerhet, är gränssnittet mellan blodflödet och den omgivande vävnaden och spelar därför en viktig roll i att modulera vaskulär och organfunktion som svar på stimuli såsom hydrodynamiska krafter och cirkulerande cytokiner och hormoner 3 - 5. Att förstå de detaljerade interaktioner mellan endotelet, blod, och den omgivande vävnaden mikro är viktig för att studera vaskulär biologi och sjukdomsprogression. Däremot har framsteg i att studera dessa interaktioner hindrats av begränsade in vitro verktyg som inte rekapitulera in vivo mikrovaskulära struktur och funktion 6,7. Som ett resultat har området och terapeutisk avancemang relied tungt på kostsamma och tids-krävande djurmodeller som ofta misslyckas med att översätta till framgång i människor 8 - 10. Medan in vivo-modeller är ovärderliga för studier av sjukdomsmekanismer och vaskulära funktioner, de är komplexa och ofta saknar exakt kontroll av enskilda cellulära, biokemiska och biofysiska signaler.

Kärl hela kroppen har en mogen hierarkisk struktur i samband med expansiva kapillärbäddar, vilket ger optimerad perfusion och näringstransport samtidigt 11. Inledningsvis kärlformer som en primitiv plexus som omorganiserar till ett hierarkiskt förgrenad nätverk under tidig utveckling 12,13. Även om många av de som är inblandade i dessa processer signaler väl förstått 14-16, är det fortfarande svårfångade hur en sådan vaskulär mönstring bestäms 15. I sin tur, rekapitulera denna process in vitro för att konstruera organiserade vaskulära nätverk har been svåra. Många befintliga in vitro-plattformar för att modellera vaskulatur, såsom tvådimensionella endoteliala cellkulturer, saknar viktiga egenskaper såsom flercelliga närhet, tredimensionellt luminal geometri, flöde, och extracellulära matrisen. Tube bildningsanalyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 - 19 eller invasionsanalyser 20,21 har använts för att studera endotelfunktion i 3D och deras interaktioner med andra vaskulära 17,22 eller vävnadscelltyper 23. Men monterade lumen i dessa analyser saknar sammankoppling, hemodynamiska flöde och lämpliga perfusion. Vidare benägenheten för vaskulär regression i dessa rörbildning analyser 24 förhindrar långtidsodling och mognad vilket begränsar graden av funktionella studier som kan utföras. Det finns således en växande behov av att konstruera in vitro plattformar mikrovaskulära nätverk som på lämpligt sätt kan modellera svdothelial egenskaper och är i stånd att långtidsodling.

En mängd av vaskulära modifieringstekniker har vuxit fram under årens lopp för medicinska tillämpningar för att ersätta eller bypass påverkas fartyg hos patienter med kärlsjukdom. Fartyg med stor diameter tillverkade av syntetiska material såsom polyetylentereftalat (PET), och polytetrafluoretylen (ePTFE) har haft betydande terapeutisk framgång med långtidsöppenhet (genomsnitt 95% öppenhet över 5 år) 25. Även liten diameter syntetiska transplantat (<6 mm) vanligtvis möter komplikationer såsom intimal hyperplasi och thrombopoiesis 26-28, vävnadstekniska transplantat med liten diameter som gjorts med biologiskt material har gjort betydande framsteg 29,30. Trots framsteg av detta slag har konstruerade fartyg på mikro förblev en utmaning. Att adekvat modellera mikrovaskulaturen, är det nödvändigt att generera komplexa nätverksmönster med suflig mekanisk styrka för att bibehålla öppenhet och med en matriskomposition som gör det möjligt för både närings permeation för parenkymala celler och cellulära ombyggnad.

Detta protokoll presenterar en ny konstgjord perfusable fartyg nätverk som härmar en infödd in vivo miljö med en avstämbar och kontrollerbar mikro 31-34. Den beskrivna metoden genererar Engineered mikrokärl med diametrar i storleksordningen 100 nm. Engineered mikrokärl tillverkas genom perfusion endotelceller genom en mikroflödessystem kanal som är inbäddad i mjuk typ I-kollagen hydrogel. Detta system har kapacitet att generera mönstrade nätverk med öppen luminal struktur, replikera flera cellulära interaktioner, modulera extracellulär matriskomposition, och tillämpa fysiologiskt relevanta hemodynamiska krafter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikro av Mönstrad Polydimetylsiloxan (PDMS) med nätverksdesign

  1. Wafer Fabrication att skapa en negativ mall för nätverksdesign
    1. Skapa ett nätverk mönster med någon datorstödd konstruktion (CAD) programvara. Säkerställa att den diagonala dimensionen mellan inloppet och utloppet är anpassat till avståndet mellan inlopps- och utloppsreservoarerna på bostadsenheter i framtida steg (se 2.1.1).
      Obs: Utformningen av mönstret i sig är anpassad beroende på de specifika forsknings målen för användaren (se figur 1 till exempel mönster).
    2. Generera en mask av nätverksmönster med högupplösta utskrifter eller beställa en krom fotomasker från en kommersiell leverantör. En mer detaljerad protokoll för fotolitografi process finns på annat håll 35.
    3. Rengör en 8 "kiselskiva under 5 minuter vid 100 W med syre plasmabehandling.
    4. Häll tillräckligt negativ fotoresist (SU-82.100 fungerar bra) på skivan så att motstå bildar en klick med en diameter på 2,5 cm. Med hjälp av en spinnbeläggare, snurra skivan vid 500 rpm med 100 varv / sek ramp och bibehålla under 10 sekunder. ramp sedan upp till 1600 varv per minut med 300 rpm / s och underhålla under 30 sek. Obs: Den hastighet och ramp måste optimeras för varje laboratorium tillstånd för att ge ett resist tjocklek av 150 | im.
    5. Mjuk-baka rånet vid 65 ° C under 7 min, ramp upp till 95 ° C med 360 ° C / h, och bibehålla under 45 min. Långsamt svalna till rumstemperatur på den varma plattan. Imprint fartyget mönster på den belagda skivan genom exponering för 365 nm UV-ljus under en krom fotomasker, med exponering trippel som tillverkarens rekommendation (350 mJ / cm2 för en SU-8 tjocklek på cirka 150 pm).
      Obs: Eftersom SU-8 är en negativ motstå, kommer de exponerade områdena (allt utom mönsterdesign) blir olöslig till utvecklaren i steg 1.1.7.
    6. Hård baka den exponerade rånet vid 65° C under 5 min och ramp upp till 95 ° C med 360 ° C / h och bibehålla under 25 min, sedan låta det långsamt svalna till RT på den varma plattan.
    7. Doppa skivan i SU-8 utvecklare under 10 - 15 min för att tvätta bort oexponerad resist och sedan rena med isopropylalkohol och torka under en komprimerad kväveflöde. Inspektera mönstret under ett ljusmikroskop för att säkerställa att SU-8 resisten väl bundna till skivan (leta efter oönskad peeling och bubblor).
    8. Mäta tjockleken på mönster funktioner med hjälp av en profilometer enligt tillverkarens anvisningar 36. Vid mätningen förvärvet undvika områden av strukturen som är väsentliga för nätverksfunktion (dvs inlopps- och utloppsledningar) som en kontakt baserad profilometer kan äventyra den strukturella integriteten hos de mönstrade funktioner på skivan. Alternativt kan du använda en icke-kontaktmetod (dvs optisk profilometer) för att undvika det här problemet helt och hållet.
  2. Geersättningar av mönstrade och platt formar för Collagen Molding
    Obs: Hantera silaner inom ett dragskåp.
    1. Placera skivan i en torkapparat med 100 pl av trikloro (3,3,3-trifluoropropyl) silan i 2 h för att silaniseras ytan.
    2. Överför silaniserad skivan i en 120 x 120 mm i kvadrat petriskål. Pour blandades och avgasad PDMS elastomer och härdare (10: 1 vikt / vikt-förhållande) över skivan för att åstadkomma 4-6 mm tjocklek. Häll ytterligare PDMS i en separat 120 x 120 mm i kvadrat petriskål för att generera platta formar utan mönster. Härda vid 65 ° C under 2 h.
    3. Ta bort från ugnen och låt PDMS svalna till rumstemperatur. Med hjälp av en skalpell skära noggrant en fyrkant runt SU-8 och sakta dra av PDMS mögel från skivan. Trimma kanterna till 30 mm x 30 mm. För platta formar, skära härdade PDMS utan tryckt mönster i fyrkantiga bitar om 40 mm x 40 mm.

2. Bostads Devices

  1. fabricatjon Top och nederdelen Pieces
    1. Fabricera kärlet som inrymmer användning av poly (metylmetakrylat) (PMMA). Att tillverka, beställa delar från en vanlig mekanisk verkstad med dator numeriskt styrda (CNC) fräsfunktioner. Se figur 1 för en schematisk bild av de övre och nedre delar.
    2. Utforma övre huset stycket (figur 1D) att inkludera en 20 mm x 20 mm och på undersidan av enheten med ett djup av 1 mm, två kollageninsprutningsportar (4 mm diameter) på enhetens ovansida ligger i hörnen av kvadraten väl, två inlopps- och utloppsreservoarerna med 6 mm diameter, och fyra skruvhål (3 mm diameter) vid de fyra hörnen hos anordningen.
      Obs: Ytterligare hål kan borras i utkanten av pjäsen för hanteringsändamål.
    3. Utforma den undre höljesdelen (figur 1E) för att inkludera ett fyrkantigt hål i mitten (dimensionerna 15 mm x 15 mm) med en omgivande 25 mm x 25 mmhylla med ett djup av 0,25 mm. Borra 4 skruvhålen med 4-40 tråd. Se till att skruvhålen i botten och toppstyckena kommer att anpassa samman under kommande monteringssteg.

3. mikrokärls Device Fabrication

  1. Framställning av material
    1. Tvätta och autoklavera två uppsättningar av pincett, en spatel av rostfritt stål, en liten platt skruvmejsel skruvar av rostfritt stål, och flera av rostfritt stål styrstift. För tillverkning av fartygen, även autoklav micropatterned PDMS formar, PDMS plana kvadrater, glastäck (22 x 22 mm), och bomullsbitar.
    2. Sterilisera PMMA bostads bitar i blekmedel i minst en timme, skölj sedan med autoklaverat vatten i vävnadsodling huven två gånger, och låt lufttorka i steril vävnadsodlingsskålar (150 mm x 25 mm).
  2. Steril Polyetylenimin-glutaraldehyd (PEI - GA) Beläggning
    1. Behandla inre brunnar i steriliserade torra PMMA bitarmed plasma under ca 1 min. Tillsätt 1% Polyetylenimin (PEI) på de inre brunnarna (20 mm i kvadrat och på toppen och 25 mm i fyrkant hylla på undersidan) av PMMA stycken för 10 minuter. Skölj med sterilt H2O och låt torka i vävnadsodling huven.
      Obs: Den tid som behövs för plasmabehandling varierar beroende på vilken enhet som används - PEI bör sprids lätt indikerar en hydrofil yta. Om inte, kan ytterligare plasmabehandling vara nödvändig.
    2. Applicera 0,1% glutaraldehyd (GA) på PEI behandlade ytorna av PMMA stycken för 30 min. Skölj två gånger med sterilt vatten och låt torka.
      Obs: I kommande steg kommer kollagen följa den belagda ytan genom kollagen glutaraldehyd tvärbindning. Detta hjälper till att säkra gelén på plats inuti anordningen under framtida monteringssteg och att hela enheten odlingsperioden.
  3. Collagen Gel Förberedelser
    1. Tillverka fartyg som använder 0,6% - 1% kollagenlösningar. För att göra 0,75% kollagen för fartygstillverkning, blanda typ I kollagen stamlösning (1,5% - isolerad från råtta tails 37) med natriumhydroxid (NaOH), 10x Media Supplement (M199), och cellkulturmedier. Håll alla lösningar på is.
    2. Bestämma volymen av kollagen genom följande ekvation, där V ƒinal är den slutliga volymen av gelén som krävs (typiskt, 1 ml kollagen per enhet är tillräcklig), V är lager kollagen volymen av lager kollagen som behövs, är Ci lager kollagen koncentrationen av beståndet kollagen, är och C ƒinal kollagen den önskade koncentrationen av kollagenet i kärlet.
      ekvation 1
    3. Använd en 1 ml spruta för att överföra den lämpliga volymen av lager kollagen till en ny 30 ml koniska rör. Bestäm volymerna av neutraliserande NaOH (V NaOH), M199 10x media tillägg(V 10 X), och cellkulturmedier (V 1 X) enligt följande och blanda sig i en 15 ml koniskt rör:
      ekvation 2
    4. Tillsätt blandningen av neutraliserande reagens (V 10 X, V NaOH, V 1 X) till den alikvoteras kollagen, och använda en liten spatel för att försiktigt blanda lösningen tills en homogen gel erhålles. Undvika att införa bubblor genom att röra långsamt och försiktigt.
    5. Infoga celler i matrisen vid den önskade koncentrationen (t.ex. 0,5 - 20 miljoner celler / ml), tillsätt cellerna till kollagenlösningen efter att den blandas med de neutraliserande reagens, och fortsätt att röra om tills cellerna är homogent fördelade.
    6. När cellerna tillsätts, justera volymen på cellodlingsmedia för att rymma ytterligare volym, som bestäms med följande ekvation, där V celler </ sub> är den erforderliga volymen av cellsuspensionen, är C ƒinal celldensitet den önskade densiteten av celler i kärlet, är C suspension celldensitet densiteten av celler i stamlösning.
      ekvation 3
  4. Kollagen injektion - Top Piece
    1. Placera micropatterned PDMS mögel i en 100 mm x 20 mm skål. Plasma rengöra PDMS formen under en minut.
    2. Rikta den övre PMMA stycket ovanpå PDMS formen så att de kvadratiska reservoarer på formen är direkt under inlopps- och utloppsreservoarerna (se Figur 1D - streckade linjer). Placera rostfritt stål styrpinnarna in i inlopp och utlopp reservoar hål på toppen PMMA stycket att upprätthålla tydlig åtkomst från reservoarerna till mönstret.
    3. Använd en 1 ml spruta för att extrahera ~ 0,5-0,6 ml kollagen. Se till att inga bubblor kvar i sprutan.
    4. Tryck ned lightly med pincett på övre huset för att säkerställa spola kontakt mellan toppstycket och PDMS mögel. Injicera kollagen långsamt genom en injektionsport ovanpå PMMA stycket. Kontrollera att kollagen fyller i 20 mm x 20 mm domän över mönstret och inte läcker ut.
    5. Stänga skålen utan att knuffas tapparna och tillåta att gela i en 37 ° C inkubator i 30 min.
  5. Kollagen Injektion - bottenstycket
    1. Placera en 22 x 22 mm glastäckglas i centrum av bottenstycket. Använd en 1 ml spruta för att fördela ~ 0,25 ml kollagen jämnt på objektglaset. sänka försiktigt PDMS plan kvadrat över kollagen, se till att PDMS är platt mot PMMA och det finns inga fångade bubblor. Tillåt att gela vid 37 ° C under 30 min.
  6. anordning Assembly
    1. Efter gelning, tillsätt tillräckligt PBS runt den plana PDMS stycket på bottenstycket för att omge PDMS (ca 1 ml). Använd pincett för att ta bort alla eXcess kollagen runt kanterna, och sakta dra av PDMS pjäs. Tillsätt mer PBS på toppen av kollagen för att upprätthålla hydrering.
    2. För att förbereda den övre delen, använder pincett för att plocka upp den övre PMMA stycket och vänd på den så att PDMS formen är på topp. Tillsätt några droppar av PBS till gränssnittet, sedan snabbt och stadigt bort PDMS mögel från toppen PMMA stycket.
    3. Försiktigt bort rostfritt stål styrpinnar från den andra sidan av PMMA huset med ett annat par av pincett. Tillsätt flera fler droppar av PBS på micropatterned kollagen. Vänd PMMA överstycket över så att kollagenet är vänd nedåt och placera 4 skruvar i hörnhålen.
    4. Försiktigt lägga toppstycket på toppen av bottenstycket och rikta in skruvarna med hörnhålen på bottenstycket. Tillåter inte de två delarna att glida mot varandra. Använd en skruvmejsel för att dra åt skruvarna med en lätt beröring. Inte för hårt.
    5. Aspirera PBS omger PMMA ytor och placera en liten piece av bomull i ena kanten av enheten. Med hjälp av en pipett, ta bort eventuella PBS från reservoarerna och ersätta med cellodlingsmedia. Låta enheten gela tillsammans i en 37 ° C inkubator i åtminstone 1 timme.
  7. cell Seeding
    1. Kultur humana navelvenendotelceller (HUVEC) i endotel tillväxtmedier vid 37 ° C (CO2, O2) till konfluens 38. Använd om möjligt mellan kanalerna 4 och 7.
    2. Trypsinize endotelceller genom tvättning av odlingskolven med 6 ml PBS och sedan tillsätta 2 ml av 0,05% trypsin vid 37 ° C för att dissociera cellerna. Låt cellerna i trypsin tills det mesta av de viktigaste sammanväxningar har lossnat och cellerna avrundas uppåt (detta tar normalt cirka 2-3 minuter). Stoppa trypsin reaktionen genom tillsats av 4 ml av endotelceller tillväxtmedium innehållande fetalt bovint serum (FBS). Skölj kolven med flera gånger i media för att säkerställa att cellerna är fristående från kolven och samlai ett koniskt rör.
    3. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och återsuspendera dem vid en densitet av 10 miljoner celler per ml. Avlägsna all cellodlingsmedia från inlopps- och utloppsreservoarerna. Med användning av en 200 | j, l gel loading spets, tillsätt 10 | il av cellsuspensionen in i centrum av inloppsreservoaren. Cellerna skall börja flöda in i nätverket omedelbart och belägga nätverket.
    4. Tillsätt 200 | il media lika för båda reservoarer och låta cellerna fästa och sprids inom nätverket för att åtminstone en timme.
  8. anordning Kultur
    1. Kultur anordningen med gravitationen drivet flöde genom nätverket genom att tillsätta 200 | il av cellodlingsmedia till inloppsreservoaren och 50 | j, l till utloppsbehållaren. Med denna metod för odling, byt media varje 12 timmar för att upprätthålla endotel lönsamhet.
      Obs: Om kontinuerlig flödesodlingsbetingelser är önskvärda (för att upprätthålla konstant skjuvspänning, samla media vid utloppet, etc.) en syringe pump kan användas i stället för gravitationsdriven kultur.
    2. Tillåta de ympade endotelceller minst 24 h för att fästa och stabilisera före applicering kontinuerligt flöde. Före kontinuerlig inställning flöde, behålla enheter med gravitationsdriven flödesförhållanden.
      OBS! Medie villkor för tillämpad flöde skiljer sig från tyngdkraften driven kultur. Tillsatsen av en plasmaexpander, såsom dextran, till media stabiliserar de konstruerade mikrokärl och förhindrar vaskulär kollaps under ihållande perfusion 39.
    3. För att göra media för kontinuerlig inställning flöde, upplösa 3,5% dextran (70 kd) i endotel tillväxtmedier för optimal fartyg kultur. Med hjälp av steril teknik, fylla 10 ml sprutor med endothelial growth media med 3,5% dextran.
    4. Bered en steril odlingsskål för flöde genom att smälta hål i sidoväggen hos en petriskål med hjälp av en lödkolv.
    5. Fäst 12 "kisel slang (1/32" ID) till en Luer lås koppling (Kvinna, 1/16 "ID), och en 1 /16 "rakt rör-till-rör-anslutning med en 1" -segmentet i slangen på den andra änden. Infoga en 1/4 "20G trubbig nål (villa från nålnavet) till den fria änden av en" segment. förbereder också en 3 "segment av slang kopplad till ett rör-till-rör 90 ° vinklad koppling leden (som monteras i huset inlopp). I efterföljande steg kommer längre slangen träs genom den beredda skålen och fäst till tre "segment via 20 G nål. Utloppsslangen bör spegla inloppsslang, med en fri ände i stället för ett Luer-lås koppling. Autoklav alla segment före användning.
    6. Gänga autoklaveras inlopps- och utloppsslangen genom hål i den beredda skålen. Fäst 3 "segment till inre 20 G nålar. Fäst Luer lås koppling till sprut media fyllda och BEGJUTA media genom slangen med hjälp av sprutpumpen inställd på en hög flödeshastighet. Se till att det inte finns några bubblor i slangar eller kopplingar, eftersom dessa kommer att hindra flödet till kärlet.
    7. Sätt i connector gemensamt i huset inlopp. Ställ sprutpumpen till den önskade flödeshastigheten och börja perfusion.
      OBS: Detta kan justeras beroende på fartygets geometri och experimentella betingelser yrkes skjuvspänningar. För en kanal 100 ^ m diameter, en flödeshastighet av 3 ul / min fungerar bra.
    8. Om så önskas, samla perfusatet med beredd utloppsröret in i en steril 5 ml polystyren rundbottnad rör innehållande 500 ul av media.
      Notera: En liten mängd medium tillsätts till uppsamlingsröret för att förhindra bubbelbildning som kan blockera flödet.
    9. Beroende på flödeshastigheten, kan sprutan behöva återfyllas efter 24 till 36 timmar. Detta görs genom att ta bort kontakten från husinloppet, som ersätter sprutan, och låta media att BEGJUTA vid en hög flödeshastighet för flera minuter. Denna sekvens garanterar att bubblorna inte introduceras till slangen. Återställ pumpen till den önskade flödeshastigheten för kultur, in kontakten i höljet inlopp ochåtergå till inkubatorn.

Analys 4. Enhet

  1. permeabilitet Analys
    1. Använd 40 kDa FITC-dextran för att visualisera permeabilitet fartyget in situ. Placera kärlet som inrymmer på ett konfokalt mikroskop och fokus vid kärlets planet. Tillsätt 5 | iM 40 kDa FITC-dextran till inloppet och bild vid 4X förstoring, 25 ms exponeringstid, och vid en bild per sekund under 10 min.
    2. Analysera bilden serie med analys kod för att uppskatta permeabiliteten för Dextran tvärs över kärlväggen in i kollagen (^ m / sek) på grundval av en modell publicerad av Zheng et. al. 31.
  2. Immunfärgning & Confocal avbildning Analys
    1. För att fixa fartyg, BEGJUTA med 3,7% formaldehyd genom inloppet i 20 minuter och tvätta genom perfusion PBS tre gånger (20 min per tvätt). Blockera ospecifik antikroppsbindning med 2% bovinserumalbumin (BSA) och 0,5% Triton X-100 perfused genom nätverket under 1 timme. BEGJUTA primära antikroppslösningar över natten vid 4 ° C och tvätta tre gånger med PBS. BEGJUTA sekundära antikroppslösningar för 1-2 h, och tvätta igen med PBS på samma sätt.
    2. Ta immunofluorescens bilder av mikrokärl i situ med användning av ett konfokalt mikroskop med ett z-steg av ett im. Avbilda mikrokärl vid en förstoring av 4X, 10X eller 20X.
      Notera: Förstoring av 4X kommer att ge globalt nätverk strukturinformation, medan 10X och 20X förstorade bilder kommer att ge cellulära detaljer såsom töjning, korsning bildning, etc.
    3. Analysera bildstaplar med ImageJ med Z prognoser (Bild / Stacks / Z-projektet), tvärsnitt (Bild / Stacks / ortogonal vy) och 3D rekonstruktioner (Bild / Stacks / 3D Project).
  3. Svepelektronmikroskopi Imaging
    1. För elektronmikroskopi analys, fixa in situ genom perfusion halv styrka Karnovsky s solution (2% paraformaldehyd / 2,5% glutaraldehyd i 0,2 M kakodylatbuffert) över natten. Isär kärlet och försiktigt separera de två delarna. Trimma kanterna och fullt fördjupa sig i det fixativlösning i flera dagar.
    2. Sänk den tjocka övre delen av kärlet i 25% glutaraldehyd i 20 minuter och skölj tre gånger med PBS (2 min vardera). Dehydratisera i seriella etanoltvättningar av 50%, 70%, 85% (2 min vardera) och två tvättningar i 100% etanol (5 min vardera).
    3. Förbered provet för analys med ytterligare uttorkning av kritisk punkt torkning följa tillverkarens protokoll 40. Sputter coat kärlet med guld-palladium (7 nm) och analysera under ett svepelektronmikroskop med en accelererande spänning av 5 kV, fläckstorlek 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den konstruerade fartyg plattform skapar funktionell mikrocirkulation inbäddad i en naturlig kollagen typ I matris och möjliggör strikt kontroll av den cellulära, biofysiska och biokemiska miljö in vitro. Att tillverka modifierade mikrokärl, de mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) perfusion genom kollagen inbäddade mikroflödes nätverk där de fäster för att bilda en patent lumen och sammanflytande endotel. Såsom illustreras i figur 1A-C, kan kärlets geometri utformas särskilt för att svara på frågor om flödeshastigheten, slingrighet, och förgrening vinklar, bland andra. Modulera flödet genom mikrokärl ger en inblick i den skjuvspänning-svaret av endotelceller. Tidigare har tillverkning fokus legat främst på fartyg i 100 pm storleksområdet, men mikrokärl upp till 500 pm eller, i vissa fall, så liten som 50 mikrometer i diameter har varit successfully gjord och odlas. Exempel på långtidsöppenhet visas liksom överlevnaden av mikrokärl som odlats under gravitationsdrivet flöde (Figur 2A) och kontinuerlig tillämpad flöde (Figur 2B). De in vivo-liknande egenskaper modifierade mikrokärl kan visas på flera sätt. Olika endotelceller funktioner kan mätas med hjälp av denna plattform, inklusive barriärfunktionen (figur 3A), cell-cell-interaktioner och signalering (figur 3B), och angiogen ombyggnad (Figur 3C). En kritisk egenskap hos dessa mikrokärl är deras förmåga att reagera på inflammatoriska stimuli i en biologiskt relevant sätt. Detta visas bäst genom deras interaktion med helblod i figur 4A-C, där icke-aktiverat endotel är vilande (figur 4B) och aktiverat endotel inducerar trombosbildning (Figur 4C). Genom odling av endotelceller i differing ursprung inom denna plattform, är det möjligt att förstå den funktionella heterogeniteten mellan endotelceller från olika källor. Figur 5A-C illustrerar ett exempel på denna heterogenitet med två olika humana stamcellshärledda endoteliala celltyper som när de odlas i mikrokärlssystemet display drastiskt annorlunda fenotyper 41. Genom att ställa flödesprofiler, cellkomposition, och odlingsbetingelser, modifierade mikrokärl ger ett kraftfullt verktyg vitro i att studera endotel biologi och mikrovaskulaturen i både hälsa och sjukdom.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av nätverkslösningar och Microchannel Fabrication protokoll. Den vaskulära nätverket geometri kan vara specifikt utformade för att generera olika flödesmönster. A. Till exempel, en grenad design kommer att ha minskat flow närheten av centrum (en minskning 8 gånger i en 3 av 3 rutnät) resulterar i regioner med varierande skjuvspänning på endotel i samma kärl 31. B. En i hög grad grenad galler följer samma princip som den tidigare designen men med större plexus. Med denna design, effekterna av en minskning 50 gånger i flödeshastighet, vilket resulterar i en reduktion skjuvhastighet från 10 till 500 sek -1 kan observeras när ett tryckfall av 1000 Pa appliceras över nätverket 32. C. Mer komplexa konstruktioner såsom en slingrig nätverk med skarpa hörn 32 kan användas för att besvara frågor om endotel svar på avbrott i laminärt flöde, som ofta förekommer i patologiska sammanhang 42. Mikrokärl tillverkade av dessa mönster kommer att ha en diameter på 100 -. Um D. 150 Det finns tre viktiga steg under mikrotillverkning. För det första är den övre delen av huset jiggen placeras ovanpå PDMS mönstrad nätverks mögel, så att inloppet och utloppet är i linje. Kollagen I sprutas sedan in det inneslutna utrymmet genom injektionsöppningarna (svart pil). Normalt är en 0,75% kollagen I blandningen som används för tillverkning. Framgångsrik mikrokärls tillverkning kan uppnås med så lite som 0,6% kollagen, emellertid mindre än 0,6% resulterar typiskt i otillräcklig mekanisk hållfasthet och kanal kollaps. E. Ett tunt lager av kollagen sätts till bottenstycket ovanpå täckglas, och tillplattade med en annan PDMS pjäs. F. Efter gelning vid 37 ° C, är PDMS formarna bort och de övre och nedre bostads jiggar skruvas ihop för att innesluta nätverket. klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
> Figur 2. mikrokärl Odlade med kontrollerat flöde profiler. A. HUVEC såddes i mikrokärl som odlats under gravitationsdrivet flöde och B. appliceras kontinuerligt flöde vid en hastighet av 3 ul / min. Kultur under tillämpad flöde uppnås bäst med tillsats av 3,5% dextran till media som har visat att stabilisera mikroflödeskollagenbaserade mikrokärl genom att utöva fysiska påfrestningar inom lumen som förbättrar korsning bildning, även om den exakta mekanismen driver denna effekt är oklar 39 . Mikrokärl färgades för endothelial korsning protein CD31 eller kluster av differentiering 31 (röd) och von Willebrands faktor (vWF) granulat (grön). A ', B ". I båda villkor, HUVEC uttryckte endotelceller markörer för cellcellkontakter och VWF granulat. A ", B". ortogonala visar patent och rundade lumen efter 6 dagars odling.arge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Engineered mikrokärl för studier av endotelfunktion. A. Endothelial barriärfunktion kan bedömas efter perfusion av FITC (fluorescein isotiocyanat) -konjugerad Dextran genom lokala nät (överst) och efterföljande mätning av dess diffusion in i bulkkollagen (botten). Med användning av anpassad kod, kan videor av perfusionen analyseras för att plotta pixelintensiteten över en region av intresse inuti ramen över tiden för att bestämma permeabilitetskoefficienten K (^ m / sek) av FITC-dextran. Tidigare publikationer av labbet har visat att genomsläppligheten av dessa konstruerade fartyg är jämförbar med ex vivo däggdjurs fartyg 31,43. B. Endoteliala cellinteraktioner med perivascular eller stödceller kan analyseras i denna plattform genom att modulera den cellulära sammansättningen av kollagenmatrisen. Här, kan ett exempel på dessa cell-cell interaktioner ses när glatta muskelceller är inbäddade i kollagen runt fartygen. Efter 14 dagar i kultur, glatta muskelceller (färgas för alfa glatt muskulatur aktin (αSMA) i grönt) förknippar med endotelet och utvidga processer längs kärlväggen och fungera som perivaskulära celler som ses i de rätvinkliga projektionerna 31. Bilder som visas i panel A och B är reproduktioner från en tidigare publikation 31. C. Angiogena groning och ombyggnad kan utvärderas i manipulerade mikrokärl genom att ändra odlingsmediet att inkludera angiogena stimuli. Utan angiogena stimuli, HUVEC visar minimal groning (till vänster); med angiogena stimuli (1 | iM lågmolekylär hämmare av GSK-3, 20 ng / ml vaskulär endotelial tillväxtfaktor, och 20 ng / ml basisk fibroblast growth faktor), HUVEC lätt gro in i matrisen såsom visas i toppen och nedåt utskjutande delar och ortogonala vyer (höger). Gro längd och antal är lätta att kvantifiera med ImageJ programvara 41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Bild 4. Blod endotel interaktioner. Engineered mikrokärl är vilande och reagera på lämpligt sätt på inflammatoriska stimuli. A. En omodifierad, HUVEC odlade fartyg fotograferas nära inloppet uppvisar stark CD31 Junktional färgning (röd) och en rund, öppen lumen. A ". Ortogonal utsikt över lumen visas. B. När citratbehandlat helblod med CD41a-märkta trombocyter (grön) perfuseras genom en liknande vilande kärl, minimal annonsvidhäft- av trombocyter (grön) till endotel observeras. C. Med exponering för inflammatoriska stimuli såsom forbol-12-myristat-13-acetat (PMA, 50 ng / ml) till medierna, perfusion av helblod resulterar i bildning av stora tromber (CD41a-märkt, grön) inuti kanalen och adhesion av leukocyter (CD45 + märkt, vit) till kärlväggen 31. Bilder ses här återges från en tidigare publikation 31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. mikrokärl Genererade med mänskliga stamceller Derived-EC. Ytterligare endotelceller cellkällor kan användas för att generera modifierade mikrokärl. Tidigare i år, Palpant et. al. visade att två distinkta subtyper of humana embryonala stamcellshärledda endotelceller kan erhållas genom att manipulera wnt / β-catenin signalering under differentiering: hemogenic endotelceller (som kännetecknas av uttryck av HAND1 och en hög hemogenic potential) och endokardiala liknande endotelceller (som kännetecknas delvis av expression av NFATC1 och GATA4) 41. A. När seedade och odlas i 3D kärlet plattform, hemogenic EC genomgå någon angiogen groning. B. Men den endokardiala liknande EC är mycket mer angiogena och flyttande, vilket tyder på funktionella skillnader, kanske som svar på flöde mellan de två subtyper av EC (detta arbete presenteras mer i detalj i en tidigare publikation 41). Båda celltyper uttrycker CD31 Junktional proteiner (röd) och några VWF (grön). Ortogonala vyer av båda visar patent lumen. C. Ett svepelektronmikroskopbild av den endokardiala liknande EC inuti kärlet visar en angiogen grodd som settfrån den luminala sidan. Bilder som presenteras i paneler A och B är reproduktioner från Palpant et. al. 41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Engineered mikrokärl är ett in vitro-modell där fysiologiska egenskaper såsom luminal geometri, hydrodynamiska krafter, och multi-cellulära interaktioner är närvarande och avstämbar. Denna typ av plattform är kraftfull i att det ger möjlighet att modellera och studera endothelial beteende i en mängd olika sammanhang där in vitro odlingsbetingelser i kan matchas med den för mikro i fråga. Till exempel, de mekanismer som driver endotelceller processer, såsom angiogenes, är kända för att förekomma på olika sätt i olika organ och olika patologiska tillstånd, såsom hälsa och sjukdom 44. Av denna anledning, är plant endotelial cellkultur gående otillräcklig 6 och som sådan i fältet har förlitat sig tungt på kostsamma och tidskrävande djurmodeller.

Djurmodeller, medan informativ och väsentliga för utvecklingen av biologisk forskning, inte alltid översätta väl till kliniken.Detta har till stor del bero på skillnader mellan mus och människa biologi, särskilt när det gäller deras svar på stimuli 9,45. Det är därför viktigt att kunna bygga in vitro-modeller som kan ge ytterligare personalspecifika data för att komplettera informationen som samlats in från djurmodeller. In vitro-plattformar har potential att efterlikna mikro av intresse med den extra kapacitet att ställa denna miljö. Viktiga egenskaper hos ett sådant system bör innefatta tredimensionell struktur och geometri, extracellulär matriskomposition (ECM), parenkymalcellen närhet och interaktion, blodflöde, och biokemiska stimuli. Engineered mikrokärl har kapacitet att införliva alla dessa parametrar. Detta kan göras samtidigt för att skapa en allomfattande modellen, eller tillsättas i ett steg vist sätt för att isolera enskilda svar och interaktioner.

En kraftfull aspekt av tekniska mikrokärl är förmågan attflödesreglering och manipulera de hydrodynamiska krafter som utövas på endotelet. Som ett exempel kan anordningen odlas under gravitationsdriven flödesförhållanden eller med kontinuerlig perfusion (figur 2). Storleken av skjuvspänning på kärlväggen kan moduleras i båda tillstånden genom förändringar i flödeshastigheten och kärlet geometri. Den huvudsakliga skillnaden mellan de två villkor är den tidsmässiga fördelningen av skjuvspänningen i kärlet. I gravitationsdriven flödesförhållanden, är skjuvspänningen inte konstant över tiden. Flödeshastigheten och skjuvspänning är högst omedelbart efter en mediaändring när inloppsbehållaren är full. Som media avlopp kommer skjuvspänningen minska. Detta leder till en rad skjuvspänning under loppet av 12 timmar. Experiment som kräver exakt kontroll över de hydrodynamiska egenskaperna (till exempel för att studera effekterna av skjuvspänning på endotelet) bör använda kontinuerliga flödesodlingsbetingelser.

Engineered mikrokärl kan ställas in för att svara på ett brett spektrum av frågor med relativt enkla ändringar. Olika celltyper, både parenkymal och endotel, kan användas för att modellera olika organsystem. Förutom att tillverka mikrokärl med endotelceller sådd, kan epitelceller i stället användas för att rada kanalen för studier rörande tarm foder, lung alveolerna, njure tubuli, osv. När väl mikromiljö definieras av cellkomposition, näringslösningen (dvs., media, blod, tillväxtfaktorer eller andra biologiskt relevant vätska) som används för att perfundera anordningen kan ändras för att svara på komplexa frågor om cellsignalering, quiescence, skjuvspänning , näringsämnen, läkemedelssvar, och mycket mer. Vidare kan geometrin hos kärlet vara specifikt utformade för att undersöka endotelial svar på skjuvspänning och slingrighet. Som ett exempel, en nyligen publicerad från Zheng et. al. visade att endotelceller har increasEd VWF sekretion och fiberenhet i mikrokärls regioner med hög skjuvspänning och flödes acceleration. Specifikt buntar VWF typiskt bildas vid hörn och skarpa svängar inom nätverket. Nätverket geometri kan också utformade för tillverkning av flercelliga tubuli. Till exempel kan en konstruktion som innehåller två parallella kanaler var och en med sitt eget inlopp och utlopp användas för att generera en koncentrationsgradient eller för att modellera en intilliggande tubulus miljö (t.ex., lymfatiska kärl med intilliggande mikrokärls). De gallerliknande strukturer av aktuella nätverks motiv (som visas i figur 1 A-C) är fördelaktiga för computational fluid modellering och för strukturell integritet under tillverkning, men är inte en indikation på vaskulär struktur i kroppen. I framtida studier bör mer fysiologiska nätverks mönster som de med hierarkisk förgrening och rundade hörn användas.

Även om alla steg som beskrivs i detta förfarande är viktiga, därfinns flera viktiga steg som krävs för en framgångsrik konstruerad mikrokärlstillverkning. Kollagengelen måste blandas noggrant för att uppnå en homogen lösning, och det är viktigt att inte införa bubblor under detta steg. Detta är nödvändigt för cellviabilitet och fysiologisk funktion, särskilt för experiment som inkluderar parenkymala celler i kollagenmatrisen. Om en enhetlig blandning av kollagenet är svårt att erhålla, kontrollera pH-värdet hos lösningen så att den är neutral. Om problemet kvarstår, är det möjligt kollagen lager bör bytas ut. En annan avgörande steg är monteringen av de övre och nedre bostäder stycken - det är viktigt att inte använda onödigt våld eftersom detta kan orsaka kanalerna att kollapsa. Flera övningsrundor kan behövas för att få en känsla av den kraft som krävs för att tillämpa under rotation skruvar. Om kanal kollaps eller krossande fortsätter att inträffa även efter praktiken är det möjligt PDMS nätverket har blivit skev på grund av absorption av fukt. Från och med nygräddade PDMS formar kommer hjälpa till att lösa detta problem. Felaktigt gängade hålen i bottenanordningen kan också orsaka kanal kollaps. Om skruvarna inte kan rotera jämnt under montering, måste extra kraften anbringas ofta resulterar i konstruktionsbrott. Det sista kritiska steget som bör betonas är vikten av frekvent utfodring, typiskt varje 12 h. Detta är nödvändigt för att hålla endotelet och förhindra anordningen från att torka ut. I händelse av att ympas endotelceller verkar ohälsosamma eller lossna från kollagen väggen potentiella sätt att förbättra endotel hälsa att mata fartyg oftare använder en sprutpump för att tillämpa kontinuerligt flöde, eller kontrollera pH-värdet i kollagengel för att säkerställa att den är vid ett fysiologiskt nivå.

För närvarande är denna plattform begränsad till tillverkning med extracellulär matris av lämplig styvhet för att upprätthålla den strukturella integriteten av kanalen under montering. tät collagen vid eller större än 6 mg / ml är tillräcklig, men kollagen mindre än 6 mg / ml och andra matriser såsom decellulariserade matris från hela organ är för svaga. Detta kan övervinnas genom användning av en blandning av kollagen med matrisen i fråga. Manipulerade mikrokärl är också begränsad av deras storlek skala. Fartyg kan framställas till en lägre gräns av ca 100 pm, men betydande ändringar skulle behöva tillämpas för att åstadkomma en mindre skala. Även om modifierade mikrokärl skapar en tredimensionell lumen, är själva nätverket plana. Att skapa en verkligt tredimensionell kärl plexus, skulle ytterligare ändringar behöver tillämpas som att skapa en flerskiktad nätverk genom att stapla flera manipulerade fartyg.

De representativa resultat som presenteras i denna metod visa hur Engineered mikrokärl kan användas för att bedöma barriärfunktion, cell-cellsignalering (pericyte rekrytering och vaskulär stabilisering), angiogenes, och trombos. unghts av dessa studier presenteras här med mer detaljerade presentationer i tidigare publikationer 31,32. Dessa studier visar hur pericyter migrera och belägga endotel av konstruerade mikrokärl 31, trombocyter följa aktiverat endotel 31 och vätska skjuvspänning modulerar endotel aktivering och VWF utsöndring och montering 32. Engineered mikrokärl kan vidare användas för att bygga vaskulariserade vävnader och modellorganspecifika system, såsom njuren 33 eller hjärtat 34. Förmågan att replikera dessa fysiologiska blod endotel interaktioner och ställa in mikro med avseende på skjuvspänning, geometri, ECM, och cellulära sammansättning kommer att möjliggöra framtida studier av vaskulära sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för det Lynn och Mike Garvey Imaging Laboratory vid Institutet för Stem Cell och regenerativ medicin samt Washington Nanoteknik Facility vid University of Washington. De erkänner också ekonomiskt stöd från National Institute of Health ger DP2DK102258 (till YZ) och utbildningsbidrag T32EB001650 (till SSK och MAR) och T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Bioteknik tissue engineering mikrovaskulaturen endotelceller vaskulära teknik 3D-cellodling micropatterning
Micropatterning och montering av 3D mikrokärl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter