Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Abstract

Nitro platformlarda, endotel hücreleri, vasküler biyolojisi ölçüde 2B endotelyal hücre kültürü ile sınırlıdır çalışma polimer veya cam bazlı substratlar ve hidrojel-bazlı tüp oluşumu testleri ile odaları akar. Bu testlerin, bilgilendirici olurken, vasküler fonksiyonun düzenlenmesinde önemli rol oynarlar lümen geometri, uygun hücre dışı matriks ve çok hücreli yakınlığı, recapitulate yok. Bu yazıda 100 um mertebesinde çapları ile mühendislik damarları üretmek için bir enjeksiyon kalıplama yöntemi tarif etmektedir. Mikrodamarlar Ben hidrojel kollajen yerel türü içinde gömülü bir mikroakışkan kanal endotel hücrelerin ekim tarafından üretilmektedir. oluşumu kanal önce kollajen matris içinde parankimal hücreler dahil olarak, belirli bir doku microenvironments modellenmiştir incelenebilir. hidrodinamik özellikleri ve medya kompozisyon ek modülasyon istenen mikroçevresinin içinde karmaşık vasküler fonksiyon kontrolü için izin verir.Bu platform, perivasküler hücre alımı, kan endotel etkileşimlerini akış cevap ve doku-mikrovasküler etkileşimleri çalışma sağlar. Engineered mikrodamarlar bir damar niş bireysel bileşenlerinden etkisini izole etmek olanağı sunmak ve hassas sağlık ve hastalık hem de vasküler biyoloji okumak için kimyasal, mekanik ve biyolojik özelliklerini kontrol eder.

Introduction

Her organ mikrovasküler, doku mikro tanımlamak doku homeostazını korumak ve inflamasyon, geçirgenlik, tromboz ve fibrinoliz 1,2 düzenlenmesine yardımcı olur. 5 - mikrovasküler endotel, özellikle, bu nedenle, kan akışı ve çevreleyen doku arasında bir arayüz, hidrodinamik kuvvetler ve dolaşımdaki sitokinler ve hormonlar 3 gibi bir uyarıcıya tepki olarak vasküler ve organ fonksiyonu modüle önemli bir rol oynar. endotel, kan arasındaki ayrıntılı etkileşimleri anlamak ve çevredeki doku mikro-damar biyoloji ve hastalığın ilerlemesi çalışma için önemlidir. In vivo mikrovasküler yapısında özetlemek ve 6,7 çalışmayan in vitro araçları sınırlı tarafından Ancak, bu etkileşimlerin incelenmesinde ilerleme engellemiştir edilmiştir. Sonuç olarak, saha ve tedavi ilerleme masraflı ve zaman-ağır güvendi10 - genellikle insanlarda 8 başarının çevirmek için başarısız hayvan modelleri tüketen. In vivo modeller hastalık mekanizmaları ve vasküler fonksiyonları çalışmada değerli olmakla birlikte, karmaşık ve çoğu kez bireysel hücresel, biyokimyasal hassas kontrolü ve biyofizik ipuçlarını yoksundur.

Vücutta damar sistemi optimize perfüzyon ve besin taşıma eş zamanlı olarak 11 sağlayarak, geniş kılcal yatak ile birlikte olgun hiyerarşik bir yapıya sahiptir. Başlangıçta, erken gelişme 12,13 sırasında hiyerarşik dallı bir ağa yeniden düzenleyen bir ilkel pleksus olarak damar formları. Bu süreçlerde yer alan sinyallerin çok iyi 14 anlaşılmış olmasına rağmen - 16, vasküler desenlendirme 15 nasıl belirlendiğini böyle zor kalır. Buna karşılık, organize damar ağları mühendisi in vitro bu süreci yansıtan arı vardırn zordur. Birçok mevcut in vitro platformları, iki boyutlu bir endotel hücre kültürleri olarak, bu tür çok hücreli yakınlığı, üç boyutlu bir lümen geometri, akış ve hücre-dışı matris olarak önemli özelliklerinin eksikliği, damar model. 3D hidrojeller tüp oluşumu deneyleri (kollajen veya fibrin) 17 - 19 veya istila deneyleri 20,21 diğer vasküler 17,22 veya doku hücre tipleri 23 ile 3D ve onların etkileşimleri endotel fonksiyonunu incelemek için kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, bu deneylerde lümen birleştiricisi, hemodinamik akışı ve uygun perfüzyon eksikliği toplandı. Bundan başka, bu tüp oluşumu deneylerinde 24 vasküler gerileme eğilimi gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar derecesini sınırlar süren uzun süreli kültürleri ve olgunlaşmasını önler. Böylece, uygun model olabilir mikrovasküler ağlarının en in vitro platformları mühendisi gelişen ihtiyaç vardırözelliklerini dothelial ve uzun süreli kültür yeteneğine sahiptirler.

vasküler mühendislik teknikleri çeşitli damar hastalığı olan hastalarda değiştirmek için medikal uygulamalar veya bypass etkilenen gemiler için yılda ortaya çıkmıştır. Polietilen tereftalat (PET) ve politetrafloroetilen (ePTFE) gibi sentetik malzemelerden yapılmış geniş çaplı damarları uzun dönem açıklık (ortalama% 95 açıklığının 5 yıldan fazla) 25 ile önemli bir terapötik başarı oldu. Küçük çaplı sentetik greft (<6 mm) tipik olarak intimal hiperplazi ve trombopoezde 26 gibi komplikasyonların karşı karşıya olmasına rağmen - doku biyolojik malzeme ile yapılmış küçük çaplı greft mühendislik 28, önemli ilerlemeler 29,30 yaptık. Bu tür ilerlemelere rağmen, böylece mikro üzerine tasarlanmış kaplar bir sorun kalmıştır. yeterli mikrovaskuleterini modellemek için, Suf karmaşık bir ağ desenleri oluşturmak için gerekli olanficient mekanik dayanım açıklığını ve parankimal hücreleri ve hücre yenileme için hem besin nüfuz sağlayan bir matris kompozisyonu ile korumak için.

34 - Bu protokol ayarlanabilir ve kontrol edilebilir mikroçevresinin 31 ayar in vivo bir yerli taklit eden bir roman yapay perfusable damar ağı sunuyor. tarif edilen yöntem, 100 um mertebesinde çapları ile mühendislik mikrodamarlar oluşturur. Engineered mikrodamarlar Ben hidrojel kollajen yumuşak türü içinde gömülü olduğu bir mikroakışkan kanal aracılığıyla endotel hücreleri perfüze tarafından üretilmektedir. Bu sistem, açık lümen yapı ile desenli ağlar oluşturmak çoklu hücresel etkileşimleri çoğaltmak, hücre dışı matris bileşimi modüle eden ve fizyolojik olarak uygun hemodinamik kuvvetleri uygulamak için kapasiteye sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ağ Tasarımı Desenli polidimetilsiloksan (PDMS) 1. Mikro ve

  1. Gofret Üretim Ağı Tasarım Negatif Şablon oluşturma
    1. Herhangi bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak bir ağ deseni oluşturun. girişi ile çıkışı arasındaki diyagonal boyut gelecek adımlar (2.1.1 bakınız) konut cihazlarda giriş ve çıkış rezervuarlar arasındaki mesafeyi maç emin olun.
      Not: kendisi özel kullanıcının özel araştırma hedeflerine bağlıdır desen tasarımı (örneğin kalıpları için bakınız Şekil 1).
    2. yüksek çözünürlüklü baskı kullanarak ağ modelinin bir maske oluşturmak veya ticari bir tedarikçiden bir krom photomask sipariş. Fotolitografi işlem daha ayrıntılı bir protokoldür başka 35 mevcuttur.
    3. oksijen plazma tedavi ile 100 W 5 dakika boyunca 8 "silikon gofret temizleyin.
    4. Yeterince negatif ışığa dökün (SU-82.5 cm çapında formları bir topak karşı öyle ki gofret üzerine 2100 iyi çalışır). bir eğirme kaplayıcı kullanılarak, 100 devir / sn rampa 500 rpm'de gofret spin ve 10 saniye boyunca muhafaza edilir. Daha sonra, 300 devir / sn 1600 rpm'ye kadar rampa ve 30 saniye boyunca muhafaza edilir. Not: Hız ve 150 um karşı kalınlığı elde etmek için her laboratuar durum için optimize edilmesi gerekir rampası.
    5. Yumuşak fırında, 7 dakika boyunca 65 ° C 'de gofret, 360 ° C / saat ile 95 ° C' ye kadar rampa ve 45 dakika boyunca muhafaza edilir. Yavaş yavaş sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına kadar soğumasını. Pozlama ile, bir krom photomask altında 365 nm UV ışığına maruz bırakılarak, üreticinin tavsiyesine (350 mJ / yaklaşık 150 um SU-8 kalınlığı cm 2) Üçlü o kaplı gofret üzerine gemi modeli basar.
      Not: SU-8 negatif karşı olduğundan, maruz bölgeler (desen tasarımı dışında her şey) adım 1.1.7 yılında geliştirici çözünmez hale gelecektir.
    6. Sabit fırında 65 ° C'de maruz gofret°, 5 dakika C ve yavaş yavaş sıcak plaka üzerine oda sıcaklığına soğumaya bırakın, sonra 360 ° C / saat ile 95 ° C 'ye kadar rampa ve 25 dakika boyunca muhafaza edilir.
    7. 15 dk maruz kalmayan bir sıkıştırılmış azot akışı altında daha sonra izopropil alkol ile temiz ve kuru, karşı yıkayacak - 10 SU-8 geliştirici gofret daldırın. (Istenmeyen soyma ve kabarcıkları arayın) SU-8 de gofret bağlandığı karşı olmak için bir ışık mikroskobu altında deseni kontrol edin.
    8. Üreticinin talimatlarına 36 göre bir profilometre kullanılarak desen özellikleri kalınlığını ölçün. Ölçüm Satın alma sırasında, gofret desenli özelliklerin yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilecek bir kişi bazlı profilometre gibi ağ fonksiyonu (yani, giriş ve çıkış boruları) için gerekli olan yapı bölgeleri kaçının. Alternatif olarak, tamamen bu sorunu önlemek için bir temassız yöntemi (yani, optik profilometre) kullanın.
  2. geKollajen Kalıp için Desenli ve Düz Kalıpları lendirme
    Not: Kimyasal bir davlumbaz içinde silanlar taşıyınız.
    1. yüzey Silanize 2 saat trikloro (3,3,3-trifloropropil) silan 100 ul bir kurutucuda gofret yerleştirin.
    2. 120 x 120 mm kare Petri kabı içine Silanlanmış gofret aktarın. 6 mm kalınlığında - 4 elde etmek için gofret zarfında karıştırılır ve gazı alınmış PDMS elastomer ve sertleştirme ajan (1 oranında 10 ağırlık / ağırlık) dökün. desen olmadan düz kalıp üretmek için ayrı bir 120 x 120 mm kare Petri kabı içine ilave PDMS dökün. 2 saat boyunca 65 ° C'de tedavi.
    3. Fırından çıkarın ve PDMS, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Bir neşter kullanılarak özenle SU-8 etrafında bir kare kesilmiş ve yavaş yavaş gofret PDMS kalıp soyulabilir. x 30 mm 30 mm kenarları kırpın. Düz kalıplar için, kesim x 40 mm 40 mm hakkında kare parçalar halinde bir baskılı desen olmadan PDMS tedavi.

2. Konut Cihazları

  1. fabricatTop iyon ve Alt Konut Adet
    1. poli (metil metakrilat) ile kabı yuvası (PMMA) imal. , Imal bilgisayar nümerik kontrollü (CNC) freze yetenekleri ile standart makine dükkandan parçaları sipariş etmek. Üst ve alt parçalardan oluşan bir şematik için bakınız Şekil 1..
    2. Köşelerinde bulunan cihazın üzerine 1 mm bir derinlik ile cihazın alt iki kollajen enjeksiyon noktaları (4 mm çap) üzerine de, 20 mm x 20 mm dahil üst muhafaza parçası (Şekil 1D) Tasarım kare de, 6 mm çapında iki giriş ve çıkış rezervuarlar ve cihazın dört köşesinde dört vida delikleri (3 mm çapında).
      Not: Ek delikler işleme amacıyla parçanın çevresi üzerinde açılmış olabilir.
    3. Bir çevreleyen 25 mm x 25 mm ortasında bir kare delik içerecek şekilde alt gövde parçası (Şekil 1E) Tasarım (boyutlar 15 mm x 15 mm)0.25 mm derinliğe sahip raf. Matkap 4-40 iplik ile 4 vida delikleri. alt vida deliklerini sağlamak ve üst parçalar gelecek montaj adımları sırasında birlikte uyumlu hale getirecektir.

3. Mikrodamar Cihaz İmalatı

  1. Malzemelerinin Hazırlanması
    1. Yıkayın ve cımbız iki takım, paslanmaz çelik spatula, küçük düz tornavida, paslanmaz çelik vida ve çeşitli paslanmaz çelik dübel pimleri otoklav. gemilerin yapımı için, aynı zamanda micropatterned PDMS kalıp otoklav, düz kareler, cam lamelleri (22 x 22 mm) ve pamuk parçaları PDMS.
    2. Daha sonra iki kez doku kültürü kaputu otoklavlanmış su ile yıkayın, en az 1 saat boyunca çamaşır suyu PMMA gövde parçaları sterilize ve steril doku kültürü çanakları içinde kuru hava (150 mm x 25 mm) izin verir.
  2. Steril polietilenimin-glutaraldehit (PEI - GA) Kaplama
    1. sterilize kuru PMMA adet iç kuyu davranınyaklaşık olarak 1 dakika boyunca plazma. İç kuyular 10 dakika PMMA adet (20 mm kare kuyu üzerinde üstünde ve altında 25 mm kare raf) üzerine% 1 polietilenimin (PEI) ekleyin. Steril H 2 O ile durulayın ve doku kültürü kaputu kurumasını bekleyin.
      Not: Plazma tedavisi için gereken süre kullanılan cihaza bağlı olarak değişkendir - AST kolayca hidrofil yüzey belirten yaymak gerekir. Değilse, ek plazma tedavisi gerekebilir.
    2. PEI 30 dakika boyunca PMMA adet yüzeyleri tedavi üzerine% 0.1 glutaraldehit (GA) uygulayın. steril su ile iki kez durulayın ve kurumaya bırakın.
      Not: Gelecekteki adımda, kolajen kollajen glutaraldehit çapraz bağlanma yoluyla kaplanmış yüzeye yapışır. Bu sonraki montaj adımları sırasında ve cihaz kültürü süresi boyunca cihazın içinde yerine jel güvenliğinin sağlanmasına yardımcı olur.
  3. Kollajen jel hazırlanması
    1. % 1 kolajen -% 0,6 ile damarları Üretiyorçözümleri. Sodyum hidroksit (NaOH), 10x ortam ilavesi (M199) ve hücre kültür ortamı ile - (sıçan izole edilmiş 37 kuyrukları% 1.5 i) stok çözeltisi kolajen tip karışımı, kap imalatı için% 0.75 kolajen yapmak. buz üzerinde tüm çözümler tutun.
    2. V ƒinal gerekli jel son hacmi aşağıdaki denklem ile kolajen miktarını (genellikle, cihaz başına kollajen 1 ml yeterlidir), V stok kollajen gerekli stok kollajen hacmi, C stok kollajen konsantrasyonu Hazır kollajen ve c ƒinal kollajen kabı içinde kollajen arzu edilen konsantrasyondur.
      denklem 1
    3. yeni bir 30 ml konik tüp hazır kollajen uygun hacimde transfer etmek için 1 ml'lik şırınga kullanın. Nötralize NaOH (V NaOH) hacimleri belirleyin, M199 10x medya takviyesi(V x 10), ve hücre kültür ortamı (V 1 kez) takip etmekte ve 15 ml konik bir tüp içinde ayrı karışımı edilmiştir:
      denklem 2
    4. Nötralize reaktifleri aliquoted kolajen (V 1 X V 10 X, V NaOH) karışımı ekleyin ve homojen bir jel elde edilinceye kadar hafifçe çözüm karıştırmak için küçük bir spatula kullanın. yavaş ve nazikçe karıştırarak kabarcıkları tanıtan kaçının.
    5. , - (20.000.000 hücre / ml, örneğin 0.5) nötrleştirici reaktiflerle karıştırıldıktan sonra kolajen çözeltisi hücreleri ekleyin ve hücreler, homojen bir şekilde dağıtılmaktadır kadar karıştırmaya devam edin istenilen konsantrasyonda matrisine hücreleri dahil etmek.
    6. Hücreler eklendiğinde, aşağıdaki denklem, V-hücreleri tarafından tespit edildiği üzere, ilave hacim karşılamak için hücre kültürü ortamı seviyesini ayarlamak </ Alt> hücre süspansiyonu gerekli hacmi, Cı ƒinal hücre yoğunluğu kabın istenen hücreler yoğunluğu, Cı süspansiyon hücre yoğunluğu stok çözeltisi hücre yoğunluğudur.
      denklem 3
  4. Kollajen Enjeksiyon - En Adet
    1. 100 mm x 20 mm çanak micropatterned PDMS kalıp yerleştirin. 1 dakika boyunca PDMS kalıp temizlemek plazma.
    2. Kalıp kare rezervuarlar giriş ve çıkış rezervuar altında doğrudan olduğunu (- kesikli çizgiler Şekil 1D bakınız) böylece PDMS kalıp üstündeki üst PMMA parça aynı hizaya getirin. girişine paslanmaz çelik dübel işaretçilerine yerleştirin ve deseni rezervuar net erişimini sağlamak için üst PMMA parçası üzerinde rezervuar delikler çıkış.
    3. 0.6 ml kolajen - ~ 0.5 elde etmek için 1 ml şırınga kullanın. hiçbir kabarcıklar şırınga kalır emin olun.
    4. l aşağı basınightly üst konut cımbız ile üst parça ve PDMS kalıp arasındaki hizada temas sağlamak için. Üst PMMA parçası üzerinde bir enjeksiyon portu üzerinden yavaşça kolajen enjekte edilir. Bu kolajen desen üzerinde 20 mm x 20 mm etki doldurur ve dışarı akmaması edin.
    5. Pimler jostling olmayan çanak kapatın ve 30 dakika süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde jel sağlar.
  5. Kollajen Enjeksiyon - Alt Parça
    1. taban parçasının ortasında bir 22 x 22 mm cam lamel. cam slayt üzerine eşit bir şekilde 0.25 mi kolajen dağıtmak için 1 ml şırınga kullanın. Yavaşça PDMS PMMA karşı düz ve hiçbir tuzak kabarcıkları vardır sağlanması, kollajen PDMS düz kare indirin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de jel izin verin.
  6. Cihaz montaj
    1. jelleşme sonra PDMS (yaklaşık 1 ml) çevreleyen alt parça üzerinde düz PDMS parçası etrafında yeterli PBS ekleyin. herhangi bir e çıkarmak için cımbız kullanınXcess kenarlarında kollajen ve yavaş yavaş PDMS parçasını soyulabilir. hidrasyon korumak için kollajen üstüne daha fazla PBS ekleyin.
    2. üst parça hazırlamak için, üst PMMA parça almak ve PDMS kalıp üstünde olacak şekilde ters çevirmek için cımbız kullanın. Daha sonra hızlı bir şekilde arayüzüne PBS birkaç damla ekleyin ve sıkıca üst PMMA parçasından PDMS kalıp çıkarmak.
    3. Yavaşça cımbız başka çifti kullanılarak PMMA konut diğer taraftan paslanmaz çelik dübel işaretçilerine kaldırın. micropatterned kollajen üzerine PBS fazla birkaç damla ekleyin. kolajen aşağı bakacak şekilde PMMA üst parça ters çevirin ve köşe deliklerinin içine 4 vidayı yerleştirin.
    4. Yavaşça alt parçası üzerinde köşe delikleri ile vida hizalayarak alt parçasının üstünde üst parça yatıyordu. İki adet birbirine karşı kaymasına izin vermeyin. yumuşak bir dokunuş kullanarak vidayı sıkmak için bir tornavida kullanın. Aşırı sıkmayın.
    5. PBS PMMA yüzeyleri çevreleyen aspire ve küçük bir pi koyuncihazın bir kenarına göre pamuk ece. Bir pipet kullanarak, rezervuarlar herhangi PBS kaldırmak ve hücre kültür ortamı ile değiştirin. Aygıt, en az 1 saat süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir araya jel izin verin.
  7. hücre Yayımlama
    1. 37 ° C 'de endotelyal büyüme ortamında Kültürü İnsan göbeğine yakın damar endotelial hücreler (HUVECs) (CO2, O2) konfluansa 38. Mümkün olduğunda, pasajlar 4 ile 7 arasında kullanın.
    2. PBS 6 ml kültür şişesi yıkanması ve daha sonra hücreleri ayırmak 37 ° C de, 2 ml% 0.05 tripsin eklenerek endotel hücrelerini tripsinize edin. fokal yapışıklıklar en müstakil ve hücreler yuvarlanır kadar (- 3 dakika bu genellikle yaklaşık 2 sürer) tripsin hücreleri bırakın. fetal sığır serumu (FBS) içeren, endotelyal büyüme ortamı 4 ml ekleyerek tripsin reaksiyonu durdurun. Hücreler şişeden ayrılır sağlamak ve toplamak için medya birkaç defa şişeyi yıkayınkonik bir tüp içinde.
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve ml başına 10.000.000 hücre yoğunluğunda onları yeniden süspanse edin. giriş ve çıkış kapları tüm hücre kültür ortamını çıkarın. 200 ul jel yükleme ucu kullanarak, giriş haznenin merkezine hücre süspansiyonu 10 ul ekle. hücreler hemen ağ ve kat ağı içine akmaya başlayacaktır.
    4. Her iki rezervuarlar eşit 200 ul medya ekleyin ve izin hücreler eklemek ve en az 1 saat süreyle ağ içinde yayıldı.
  8. cihaz Kültür
    1. Kültür giriş haznesine hücre kültür ortamının 200 ul ve çıkış haznesine 50 ul eklenmesi ile ağ üzerinden yer çekimi kontrolünde akış cihaz. Bu kültür yöntemi ile, endotel canlılığını muhafaza etmek için her 12 saat ortam değiştirin.
      Not: Sürekli akış kültür koşulları arzu varsa (sürekli kayma gerilmesi korumak çıkışında, vb de medya toplamak için) bir SYRInge pompası yerine yer çekimi kontrolünde kültür kullanılabilir.
    2. en az 24 saat numaralı seribaşı endotel hücreleri sürekli akış uygulamadan önce takmak ve stabilize etmek için izin verin. Sürekli akış kurulumu öncesinde, yerçekimi tahrik akış koşulları cihazları korumak.
      NOT: Uygulanan akışı için medya koşullar yerçekimi tahrik kültürden farklıdır. Ortama örneğin dekstran gibi plazma genişletici, eklenmesi tasarlanmış mikrodamarlar stabilize eder ve sürekli perfüzyon 39 sırasında vasküler çökmesini önler.
    3. Sürekli akış kurulumu için medyayı yapmak en uygun damar kültürü için endotelyal büyüme ortamında% 3.5 Dextran (70 kDa) çözmek için. Steril teknik kullanılarak,% 3.5 dekstran ile endotelyal büyüme ortamı ile 10 mi şırınga doldurun.
    4. lehim kullanarak bir petri kabının yan duvarındaki delik eritilerek akışı için bir steril kültür çanağı hazırlayın.
    5. Luer kilit kavrama (Kadın, 1/16 "ID) 12" silikon tüp (1/32 "ID) takın ve 1 /diğer ucunda boru segmentinde 16 "1 düz tüp için tüp bağlantısı". segmentinde 1/4 "1 serbest ucuna (iğne hub ayrılmış) 20G künt iğne" takın. Ayrıca (gövde girişine monte edilecek). Daha sonraki adımlarda, daha uzun boru hazırlanan yemeğin boyunca geçirilmesini ve 3 bağlı bir boru için tüp 90 ° dirsek bağlantısı ortak bağlı bir boru 3 "segmentini hazırlanması 20 G iğne aracılığıyla "segmenti. Outlet boru serbest ucunda yerine bir Luer kilit kavrama ile giriş tüp yansıtmalıdır. Kullanmadan önce tüm kesimlerini otoklavlayın.
    6. Hazırlanan yemek deliklerden otoklava giriş ve çıkış boruları geçirin. . İç 20 G iğne 3 "segmentleri takın medya dolu şırıngaya Luer kilit bağlantıyı takın ve yüksek akış hızında ayarlanmış şırınga pompası kullanılarak tüp aracılığıyla medyayı serpmek. Tüp veya konnektörleri hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun, bu şekilde gemiye akışını engelleyecektir.
    7. c takınonnector konut girişine ortak. İstenilen debiye şırınga pompası ayarlayın ve perfüzyon başlar.
      Not: damar geometrisi ve uygulanan kesme gerilimlerinin deneysel koşullara bağlı olarak, bu ayarlanabilir. 100 mikron çapında bir kanal için, 3 ul / dakika akış hızı iyi çalışır.
    8. İstenirse, medya 500 ul içeren steril 5 ml'lik polistiren yuvarlak dipli tüp yerleştirilir hazırlanmış çıkış boru ile perfüzat toplamak.
      Not: ortam küçük bir miktar akışını engelleyebilir kabarcık oluşmasmı önlemek üzere toplama tüpüne ilave edilir.
    9. Akış hızına bağlı olarak, bir şırınga 24 ile 36 saat sonra yeniden dolmasını gerekebilir. Bu, gövde girişine konnektörünü kaldırma şırınga değiştirilmesi ve ortam birkaç dakika boyunca yüksek bir akış oranında perfüze edilmesi için izin vererek yapılır. Bu dizi kabarcıklar boru tanıtıldı değildir olmasını sağlar. Kültür için istenen akış hızına pompayı sıfırlayın konut girişine konnektörü takın veinkübatör dönmek.

4. Cihaz Analizi

  1. geçirgenlik Analizi
    1. In situ olarak kabın geçirgenliği görselleştirmek için 40 kDa FITC-dekstran kullanın. konfokal mikroskop damar konut yerleştirin ve damar düzlemindeki odaklanır. 4X büyütme, 25 msn maruz kalma süresinde, giriş ve görüntü 5 uM 40 kDa FITC-dekstran ekleyin ve 10 dakika için saniyede 1 frame.
    2. Zheng ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir modeline dayalı kollajen (mm / sn) içine damar duvarı boyunca Dextran'ın geçirgenliğini tahmin etmek analiz koduyla görüntü serisi analiz edin. ark. 31.
  2. Immün & Konfokal Görüntüleme Analizi
    1. damarları düzeltmek için PBS üç kez (yıkama başına 20 dk) perfüze ile 20 dakika ve yıkama için giriş boyunca% 3,7 formaldehit ile serpmek. % 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100, PE bağlanmasını bloke spesifik olmayan antikor1 saat için ağ üzerinden rfused. gece boyunca 4 ° C 'de primer antikor çözeltileri serpmek ve üç kez PBS ile yıkayın. 1 için ikincil antikor çözeltileri serpmek - 2 saat, ve aynı şekilde, PBS ile tekrar yıkanır.
    2. 1 mikron z-adım bir konfokal mikroskop kullanılarak yerinde mikrodamarlar immünofloresan görüntüleri çekmek. Resim 4X, 10X, 20X ve büyütülerek mikrodamar.
      Not: 10X ve 20X büyütülmüş görüntüler vb uzama, kavşak oluşumu, hücresel ayrıntıları ise 4X Büyütme, küresel ağ yapısı bilgi verecektir.
    3. Z projeksiyonlar (Resim / Yığınları / Z-proje), kesitler (Resim / Yığınları / Dik görünümü) ve 3D rekonstrüksiyon (Resim / Yığınları / 3D Projesi) ile ImageJ kullanarak görüntü yığınlarını analiz edin.
  3. Taramalı Elektron Mikroskobu Görüntüleme
    1. Elektron mikroskobu analizi için, Karnovsky en sol yarım gücünü perfüze in situ düzeltmekKatkı gece boyunca (0.2 M kakodilat tampon içinde% 2 paraformaldehit /% 2,5 glutaraldehit). gemi sökün ve dikkatlice iki adet ayrı. kenarlarını kırpın ve tamamen birkaç gün fiksatif çözüm batırın.
    2. (2 dk) 20 dakika boyunca% 25 glutaraldehid kabın kalın üst kısmı daldırın ve üç kez PBS ile yıkayın. % 50,% 70,% 85 (2 dk) ve% 100 etanol (her biri 5 dakika) 'de iki yıkama seri etanol yıkamalarda kurutmak.
    3. Üreticinin protokolü 40 aşağıdaki kritik nokta kurutma ile daha dehidratasyon ile analiz için örnek hazırlayın. altın paladyum (7 nm) ile kaplamaz gemi sputter ve 5 kV, spot boyutu 3 hızlanan gerilimine sahip bir tarayıcı elektron mikroskobu altında analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mühendislik gemi platformu I matris doğal kollajen tip içinde gömülü fonksiyonel mikrovaskuleterini oluşturur ve in vitro, hücresel biyofizik ve biyokimyasal ortamın sıkı kontrol sağlar. işlenmiş mikrodamarlar imal etmek için, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir lümen ve birleşik endoteli oluşturmak için ekleme kolajen gömülü mikroakışkan ağ üzerinden perfüze edilir. Şekil 1A-C'de gösterildiği gibi, kap geometrisi akış hızı, eğrilik ile ilgili sorulara cevap için tasarlanmış olabilir, ve diğerleri arasında, açılar dallanma. mikrodamarlar aracılığıyla akış hızını modüle endotel hücrelerinin kayma gerilmesi-tepki fikir verir. Daha önce, imalat odak çapı 50 um kadar küçük, ancak bazı durumlarda, 500 um kadar, mikrokapların veya esas olarak 100 um boyut aralığında damarları üzerinde olmuştur succ olmuşturessfully yaptı ve kültürlendi. Uzun dönem açıklık örnekleri yerçekimi tahrik akış (Şekil 2A) ve sürekli uygulanan akış (Şekil 2B) altında kültür mikrodamarlar hayatta yanı sıra gösterilmiştir. Işlenmiş mikro damarların in vivo benzeri özellikleri çeşitli yollarla gösterilebilir. Çeşitli Endotelial işlevler bariyer fonksiyonu (Şekil 3A), hücre-hücre etkileşimleri ve sinyal (Şekil 3B) ve anjiyojenik yeniden (Şekil 3C) da dahil olmak üzere, bu platformu kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu mikrodamarlar kritik bir özelliği biyolojik ilgili bir şekilde inflamatuar uyaranlara yanıt yeteneğidir. Bu en iyi aktif olmayan endotel hareketsiz olan Şekil 4A-C, tam kan (Şekil 4B) ile etkileşim yoluyla gösterilmiştir ve aktive edilmiş endotel trombüs oluşumunu (Şekil 4C) neden olur. di endotelyal hücrelerin kültürlenmesi ileBu platform içinde kaynağını ffering, farklı kaynaklardan gelen endotel hücreleri arasında fonksiyonel heterojenliği anlamak mümkündür. Şekil 5A-C, iki farklı insan kök hücresi türevli endotel hücre tipleri bu heterojenite bir örneğini göstermektedir olduğu kültürlendiğinde mikrodamar sistemi ekranında büyük ölçüde farklı fenotipleri 41. Akış profilleri, hücre kompozisyon ve kültür koşullarını ayarlayarak, mühendislik mikrodamarlar sağlık ve hastalık hem de endotel biyoloji ve mikrovaskuleterini incelemek için in vitro aracında güçlü sağlamaktadır.

Şekil 1
Şekil 1. Network şematik Tasarımları ve vasküler ağ geometrisi, özellikle farklı akış desenleri oluşturmak için tasarlanmış olabilir. Microchannel Fabrikasyon Protokolü. A. Örneğin, bir dallı bir tasarım fl azalmış olacaktıraynı kap 31. B içinde endotel üzerinde çeşitli kesme stresi olan bölgelerde ortaya çıkan merkezi akış oranları (3 3 ile ızgara 8 misli azalma). Bir çok dallı ızgara önceki tasarım olarak fakat daha büyük bir pleksus ile aynı prensibi izler. 1000 Pa bir basınç düşüşü ağ üzerinden uygulandığında Bu tasarım sayesinde, 500 sn, 10 bir kesme hızı azalması elde edilen akış hızında 50 kat azalma etkisi -1 gözlenebilir 32. C. Daha karmaşık tasarım böyle keskin köşeli bir dolambaçlı bir ağ olarak 32 sıklıkla patolojik bağlamlarda 42 meydana laminer akışı kesintileri, endotel tepki ilgili soruları cevaplamak için kullanılabilir. Mikrokanal imalat sırasında üç ana adım vardır 150 mikron D. -. Bu desenleri yapılan mikrodamarlar 100 bir çapa sahip olacaktır. İlk olarak, gövde jig üst kısmı PDM üstüne yerleştirilirS giriş ve çıkış hizalı olacağı biçimde, desenli bir ağ kalıp. Kolajen sonra enjeksiyon portu üzerinden kapalı alanı (siyah ok) enjekte edilir. Tipik olarak,% 0.75 kolajen I kanşımı imalatı için kullanılır. Başarılı mikrodamar üretim kollajen E. ince bir tabaka lamel üzerine alt parça ilave edilir. Ancak az% 0.6, tipik olarak yetersiz mekanik mukavemet ve kanal çökmesi ile sonuçlanır, düşük 0.6% 'si olarak kolajen ile elde ve düzleştirilmektedir 37 ° C'de jelleşme sonra başka bir PDMS parça. F ile, kalıplar çıkarılır PDMS alt ve üst gövde jig ağı içine birlikte vidalanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
> Kontrollü Akış Profilleri ile Kültür Şekil 2. Mikrodamarlar. C. HUVECler yer çekimi kontrolünde akış altında kültüre Mikro damarların içinde tohumlandı ve B. 3 ul / dakikalık bir oranda sürekli bir akış uygulandı. Bu etkiyi tahrik mekanizması tam olarak açık olmamakla birlikte uygulanan akışı altında kültür iyi birleşme oluşumunu arttırmak lümen içinde fiziksel basınçları uygulayarak mikroakışkan kollajen bazlı mikrodamarlar stabilize gösterilmiştir ortama% 3.5 Dextran eklenmesi ile elde edilir 39 . Mikrodamarlar endotel kavşak protein CD31 veya farklılaşma 31 (kırmızı) ve von Willebrand faktör küme için boyandı (VWF) granüller (yeşil). A ', B'. Her iki durumda da, HUVECler hücre-hücre kavşaklarda ve VWF endotel belirteçleri ifade granüller. bir "B". Dik görünümleri patent ve kültürde 6 gün sonra yuvarlak lümen göstermektedir.arge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil Endotel Fonksiyonu Araştırmaları 3. Engineered Mikrodamarlar. Bir. Endotel bariyer fonksiyonu FITC (floresein izotiyosiyanat) perfüzyon sonra değerlendirilen ağlar (üstte) ve toplu kollajen (alt) içine difüzyon sonraki ölçümü ile Dextran konjüge edilmiş olabilir. Özel kod kullanarak, perfüzyon videoları FITC Dextran'ın geçirgenlik katsayısı K (mm / sn) belirlemek için zamanla çerçevesinde ilgi bölge üzerinde piksel yoğunluğu arsa için analiz edilebilir. Laboratuarı tarafından Önceki yayınlar, bu işlenmiş damar geçirgenliği ex vivo olarak, memeli gemi 31,43. B ile kıyaslanabilir olduğunu göstermiştir. periv ile endotel hücre etkileşimleriascular veya destek hücreleri, kollajen matrisinin hücre bileşiminin modüle edilmesi Bu platformda analiz edilebilir. düz kas hücreleri, damarların Çevre kolajen içinde gömülü olduğunda Burada, bu hücre-hücre etkileşimleri örnek görülmektedir. Kültür içinde 14 gün sonra, düz kas hücreleri, endotel ile ilişkilendirmek (yeşil, alfa düz kas aktin (αSMA) lekeli) ve damar duvarı boyunca işlemleri uzanmakta ve dik çıkıntılar 31 görüldüğü gibi perivasküler hücreleri hareket ederler. Panel A ve B gösterilen görüntüler önceki bir yayında 31. C den tekrarıdırlar. Anjiyogenik filizlenme ve biçimlenme anjiyogenik uyaranlara içerecek şekilde kültür ortamı değiştirerek mühendislik mikrodamarlar değerlendirilebilir. anjiyojenik uyaran olmadan, HUVECler az filizlenmeyi (solda) göstermektedir; anjiyojenik uyaranlara (GSK-3, 20 ng / ml, vasküler endotelyal büyüme faktörü, 1 uM küçük molekül inhibitörü, ve 20 ng / ml temel fibroblast Gro sahipyukarıdan aşağıya projeksiyonlar ve ortogonal görünümler (sağda) de görüldüğü gibi faktör wth), HUVECler kolayca matriks içine filiz. Filiz uzunluğu ve sayısı ImageJ yazılım 41 ile kolayca ölçülebilir olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Kan endotele Etkileşimleri. Engineered mikrodamarlar hareketsiz ve inflamatuar uyaranlara uygun bir şekilde yanıt. A. bir değiştirilmemiş, girişinin yakınına fotoğraflandı HUVEC kültürlü damar güçlü CD31 junctional boyama (kırmızı) ve yuvarlak, açık lümen göstermektedir. A '. Ortogonal lümenin bir görünümü gösterilmiştir. B. CD41a-işaretlenmiş trombositlerin (yeşil), tam kanın sitratlı zaman benzer bir durağan damar yoluyla perfüze minimal reklamendotelyuma trombosit (yeşil) hezyon görülmektedir. C. Bu ortam, forbol-12-miristat-13-asetat (PMA, 50 ng / ml), geniş trombus oluşumu ile tam kan sonuçlarının perfüzyon gibi iltihabı etkiler maruz kalma ile kanal içinde (yeşil CD41a etiketli) ve damar duvarı 31 lökositlerin (etiketli CD45 +, beyaz) yapışır. Burada görülen Görüntüler önceki bir yayında 31 den yeniden üretilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
İnsan Kök hücre derive-EC. Ek endotel hücre kaynakları ile oluşturulan Şekil 5. Mikrodamarlar işlenmiş mikrodamarlar oluşturmak için de kullanılabilir. Bu yılın başlarında, Palpant et. ark., iki farklı alt O gösterdif insan embriyonik kök hücre türevli endotel hücreleri farklılaşması sırasında Wnt / β-katenin işleyerek elde edilebilir: hemogenic endotelyal hücrelerin ve endokard gibi endotel hücreleri (HAND1 ve yüksek hemogenic potansiyeli ekspresyonu ile karakterize edilir) (ifade kısmen, özelliği NFATC1 ve GATA4) 41. A. 3B, kap platformunun tohumlanmış ve kültürlendi, hemogenic EC bir anjiyojenik filizlenme uğradığında. B. Ancak, endokardiyal gibi Ecs belki de yanıt olarak, işlevsel bir fark gösteren, daha anjiyojenik ve göçmen (Bu eser bir önceki yayında 41 daha detaylı olarak sunulmuştur) EC iki alt tipleri arasında, akış. Her iki hücre tipi, CD31 bileşke proteinlerini (kırmızı) ve bazı VWF (yeşil) ifade etmektedir. Hem Dik görüşleri patent lümen göstermektedir. C. geminin içinde endokardiyal gibi EC A taramalı elektron mikroskobu görüntüsü bir anjiyojenik filiz gösterir görüldüğü gibiluminal taraftan. Paneller A ve B sunulan Görüntüler Palpant et gelen çoğaltım bulunmaktadır. ark. 41. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Engineered mikrodamarlar gibi lümen geometri, hidrodinamik kuvvetler ve çok hücreli etkileşimler gibi fizyolojik özellikleri mevcut ve ayarlanabilir olduğu bir in vitro model vardır. Platformun bu tip ve model in vitro kültür koşulları, söz konusu mikro-o eşleştirilebilir çeşitli bağlamlarda endotel davranışını incelemek olanağı sunar ki güçlüdür. Örneğin, damar endotel işlemleri, sürücü mekanizmaları, farklı organlarda ve sağlık ve hastalık 44 gibi farklı patolojik durumlarda, farklı oluştuğu bilinmektedir. Bu nedenle, düzlemsel endotel hücre kültürü sürekli 6 yetersizdir ve bu alan masraflı ve zaman alıcı hayvan modellerinde dayanmıştır gibi.

Hayvan modelleri, bilgilendirici ve biyolojik araştırmaların ilerlemesi için gerekli süre, her zaman kliniğe iyi tercüme etmeyin.Bu büyük ölçüde, özellikle 9,45 uyaranlara tepkilerini ilişkin, fare ve insan biyolojisi arasındaki farklar sanılıyor. Hayvan modellerinde toplanan bilgileri tamamlamak için ek insana özgü veri sağlayabilir in vitro modellerinde inşa edebilmek için elzemdir. In vitro platformlar ayarlamak için ek kapasite o ortam ile çıkar mikro taklit potansiyeline sahiptir. Bu tür bir sistemin temel özellikleri, üç boyutlu yapısı ve geometrisi, hücre dışı matris bileşimi (ECM) parankimal hücre yakınlık ve etkileşimi, kan akımı, ve biyokimyasal uyaranlara içermelidir. Engineered mikrodamarlar tüm bu parametreleri dahil kapasitesine sahiptir. Bu her şeyi kapsayan bir model oluşturmak için eş zamanlı olarak yapılan, ya da bireysel tepkiler ve etkileşimleri izole etmek için bir adım akıllıca bir şekilde eklenebilir.

mühendislik mikrodamarlar güçlü yönü yeteneğiKontrol akışı ve manipüle hidrodinamik kuvvetler endotel üzerinde uygulanan. Bir örnek olarak, cihaz, yer çekimi kontrolünde akış koşulları altında ya da sürekli perfüzyon (Şekil 2) ile kültürlenebilir. damar duvarında kesme geriliminin büyüklüğü akış oranı ve damar geometrisindeki değişikliklerle her iki durumda da modüle edilebilir. İki durum arasındaki temel fark kap içindeki kayma gerilmesi zamansal dağılımı. yer çekimi kontrolünde akış koşullarında, kayma gerilimi zaman sabit değildir. giriş haznesi dolduğunda debisi ve kayma gerilmesi bir medya değişiminden sonra en yüksek hemen vardır. medya drene olarak, kayma gerilimi azaltacaktır. Bu, 12 saat boyunca kesme stresinin bir dizi yol açar. (Endotel üzerindeki makaslama stresin etkilerini incelemek için, örneğin) hidrodinamik özellikleri üzerinde hassas kontrol gerektiren deneyler sürekli akış kültür koşulları kullanmalısınız.

Engineered mikrodamarlar nispeten kolay değişiklikler ile sorular geniş bir yelpazede cevap ayarlanmış olabilir. Farklı hücre tipleri, parankimal ve endotel hem farklı organ sistemlerini modellemek için kullanılabilir. Endotel hücre tohumlama ile mikrodamarlar imal ek olarak, epitel hücreleri yerine gibi bağırsak iç yüzeyi, akciğer alveollerinin, böbrek tübül, ilgili çalışmalar için kanal için kullanılabilir. Mikro-hücreli bileşim, besleyici çözelti ile tanımlanır sonra (yani, ortam, kan, büyüme faktörleri, ya da diğer biyolojik olarak uygun sıvı) aygıtı perfüze edilmesi için kullanılmış olan hücre sinyal iletimi, sükunet, kesme stresi ile ilgili kompleks sorulara cevap değiştirilebilir , besin, ilaç yanıtı ve daha fazlası. Bundan başka, kabın geometrisi stres veya bükülmeleri kesme endotel yanıt araştırmak için tasarlanabilir. Örneğin, Zheng et bir son yayın olarak. ark., endotel hücreleri, yükselmektedir olduğunu göstermiştiryüksek kesme stresi ve akış hızlandırma ile mikrovasküler bölgelerde Ed VWF sekresyon ve fiber düzeneği. Özellikle, VWF genellikle ağ içindeki köşeleri ve keskin dönüşler oluşan demetleri. Ağ geometrisi de çok hücreli tübülleri imal etmek için tasarlanabilir. Örneğin, kendi giriş ve çıkış, iki paralel kanal, her içeren bir tasarım bir konsantrasyon gradyenti üretmek için veya bitişik bir borucuk ortamı (bitişik mikro damarın örn, lenf damarı) modellemek için de kullanılabilir. (Şekil 1A-C gösterilmektedir) mevcut ağ tasarımları ızgara benzeri yapılar hesaplamalı akışkanlar modelleme ve üretim sırasında yapısal bütünlüğü için avantajlıdır, ancak vücutta damar yapısının göstergesi değildir. Bundan sonraki çalışmalarda, bu hiyerarşik dallanma ve köşeleri yuvarlatılmış olanlar daha fazla fizyolojik bir ağ desen kullanılmalıdır.

Tüm adımlar bu prosedürde belirtilen süre orada, önemliBaşarılı mühendislik mikrovasküler imalatı için gerekli olan birçok kritik adımlar vardır. kollajen jel homojen bir çözelti elde etmek için iyice karıştırılır gerekir ve aşama sırasında kabarcıkları tanıtmak için gereklidir. Bu durum, özellikle, kollajen matris parankimal hücreler bulunmaktadır deneyler için, hücre canlılığı ve fizyolojik fonksiyon için gereklidir. kollajen düzenli bir karışım elde etmek zordur, bu nötr sağlamak için çözeltinin pH değeri kontrol edilir. Sorun devam ederse, kollajen stok değiştirilmesi gerekir mümkündür. Diğer önemli adım üst ve alt gövde parçalarının montajı - bu kanalların çökmeye neden olabilir olarak aşırı güç kullanmak değil esastır. Birçok uygulama mermi vida dönerken uygulamak için gerekli olan kuvvet miktarı bir duygu elde etmek için gerekli olabilir. Kanal çöküşü ya da parçalanması bile uygulama sonrası oluşmaya devam ederse, PDMS ağı nedeniyle absorpt için çarpık hale gelmiştir mümkündürnem iyonu. taze yapılmış PDMS kalıplar ile başlayan bu sorunu çözmeye yardımcı olacaktır. Alt cihazda yanlış dizilmiş delikler kanal çökmesine neden olabilir. vidalar montaj sırasında sorunsuz döndürmek mümkün değilse, ekstra kuvvet genellikle yapısal başarısızlıkla sonuçlanan uygulanmalıdır. vurgulanması gereken son kritik adım sık beslenme, genellikle her 12 saat önemidir. Bu endotele korumak ve kurutmadan aygıtı önlemek için gereklidir. endotel hücreleri sağlıksız görünen ya da kolajen duvardan endotel sağlığı sürekli akış uygulamak için bir şırınga pompası kullanmak, daha sık damarları beslemek ya da sağlamak için kollajen jel pH kontrol etmek iyileştirmek için potansiyel yollarını ayırmak seribaşı halinde fizyolojik düzeydedir.

Şu anda, bu platform, birleştirme sırasında kanalın yapısal bütünlüğünün muhafaza edilmesi için uygun olan sertliği, hücre dışı matris ile üretim sınırlıdır. yoğun işbirliğien llagen veya daha fazla 6 mg / ml, yeterli olmakla birlikte, kolajen az 6 mg / ml, örneğin bütün organların hücresizleştirilmiş matris olarak diğer matrisler çok zayıf. Bu, söz konusu matris ile kollajen karışımı kullanılarak aşılabilir. Engineered mikrodamarlar ayrıca büyüklük ölçeği ile sınırlıdır. Kaplar, yaklaşık 100 um'lik bir alt sınırına imal edilebilir, ama önemli değişiklikler daha küçük bir ölçekte elde etmek için uygulanması gereken olacaktır. işlenmiş mikrodamarlar üç boyutlu bir lümen oluşturma rağmen şebekede düzlemseldir. gerçekten üç boyutlu damar pleksus oluşturmak için, ek modifikasyonlar birden mühendislik damarları istifleme çok katmanlı ağ oluşturma gibi uygulanacak gerekir.

Bu yöntem sunulmuştur Örnek sonuçlar bariyer fonksiyonu, hücreler arası iletimde (perisit alımları ve vasküler stabilizasyonu), anjiyogenez ve tromboz değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini projelendirilmiş mikrodamar göstermektedir. IşıklıBu çalışmaların ghts önceki yayınlarda 31,32 daha detaylı sunumlar ile burada sunulmuştur. Bu çalışmalar mühendislik mikrodamarlar 31 endotel, trombositler aktive endotele 31 uymak ve sıvı kayma gerilmesi endotel aktivasyonu ve VWF salgılanmasını ve montajı 32 modüle nasıl perisitler göç ve ceket göstermektedir. Engineered mikrodamarlar ayrıca, böbrek 33 veya kalp 34 olarak vaskülarize dokuların ve model organa özgü sistemler oluşturmak için kullanılabilir. saygı ile bu fizyolojik kan endotel etkileşimlerini ve ayar mikro çoğaltma yeteneği stres, geometri, ECM kesme ve hücresel kompozisyon damar hastalıkları gelecekteki çalışmaları sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp yanı sıra Washington Üniversitesi Washington Nanofabrikasyona Tesisi Enstitüsü Lynn ve Mike Garvey Görüntüleme Laboratuvarı kabul etmek istiyorum. Onlar da Ulusal Sağlık Enstitüsü maddi destek kabul (YZ) DP2DK102258 verir, eğitim ve (MAR) T32HL007312 (SSK ve MAR) T32EB001650 verir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).

Tags

Biyomühendislik Sayı 115 doku mühendisliği mikrovasküler endotel hücreleri vasküler mühendislik 3D hücre kültürü micropatterning
Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter