Abstract
Un creciente interés en la aplicación de técnicas de biología sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) están dando lugar a algunas aplicaciones muy interesantes y únicos para los OMV en nanopartículas tradicionales están resultando demasiado difícil de sintetizar. Hasta la fecha, todas las bacterias Gram-negativas se han demostrado para producir envases que demuestra OMV de una variedad de carga que incluye moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y material genético. Sobre la base de su diversa carga, OMV están implicados en muchos procesos biológicos que van desde la comunicación célula-célula para la transferencia de genes y la entrega de factores de virulencia, dependiendo de que las bacterias están produciendo la OMV. Sólo recientemente se han vuelto accesibles para su uso en una amplia gama de aplicaciones a través del desarrollo de técnicas para controlar y envasado directa de proteínas recombinantes en bacterias OMV OMV. Este protocolo describe un método para la producción, purificación, y el uso de la enzima de envasados OMV proporcionar para mejorar la overall producción de la enzima recombinante, el aumento de vesiculación, y la estabilidad de la enzima mejorada. la utilización con éxito de este protocolo dará lugar a la creación de una cepa bacteriana que a la vez produce una proteína recombinante y la dirige para OMV de encapsulación a través de la creación de una unión sintética entre la proteína recombinante y una proteína de anclaje a la membrana externa. Este protocolo también se detallan los métodos para el aislamiento de OMV a partir de cultivos bacterianos, así como las técnicas apropiadas de manipulación y cosas para considerar cuando la adaptación de este protocolo para su uso en otras aplicaciones únicas, tales como: entrega de medicamentos, el diagnóstico médico, y la remediación ambiental.
Introduction
Se presenta aquí un método para el diseño, la producción y purificación de vesículas de enzimas cargadas bacterianas de membrana externa (OMV). OMV son pequeños, principalmente unilamelar, proteoliposomas que varían en tamaño desde 30 hasta 200 nm de 1,2. Todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas que han sido estudiados hasta la fecha han demostrado la liberación de cualquiera de las OMV o vesículas extracelulares (EV) de su superficie de 3,4. El mecanismo exacto por el cual se producen OMV aún no se han aclarado por completo debido a las diversas poblaciones bacterianas que ellos, así como las diferentes funciones que sirven secretan. OMV se ha demostrado que el transporte de una amplia gama de carga a partir de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas al material genético que sirve una variedad de complejo de señalización, la translocación de genes, y la virulencia funciones 5,6.
Los mecanismos exactos de la biogénesis OMV no están bien caracterizadas, y parecen diferir entre especies bacterianas. A pesar de this hecho, hemos desarrollado un método para mejorar la eficacia de empaquetamiento de una proteína recombinante en OMV mediante la creación de una unión sintética entre una proteína de interés y una proteína muy abundante endógena a la membrana externa bacteriana y la posterior OMV. En ausencia de un enlace sintético, o afinidad constituida artificialmente, entre la proteína expresada de forma recombinante y la OMV la eficacia de empaquetamiento observada es muy bajo 7. Este resultado es de esperar que la incorporación de las proteínas dentro de la OMV se produce ya sea a través de la encapsulación azar en el preciso momento de la formación de OMV en la superficie bacteriana o por medio de envasado dirigido por mecanismos que no se comprenden bien. Algunos éxito se ha observado en el envasado de proteínas simplemente a través de más de expresión dentro del espacio periplásmico que se basa en la encapsulación azar pero el envase eficaz es altamente dependiente de la proteína con algunas proteínas de envasado a alta eficiencia en comparación con otros tha no empaquetar en absoluto 8-10. Mediante la utilización de técnicas de biología sintética comunes hemos tratado de diseñar Escherichia coli (E. coli) para producir al mismo tiempo, el paquete y segregan una enzima activa de interés en OMV que elude las limitaciones del conocimiento actual acerca de cómo se forman y cómo OMV de carga es seleccionada por las bacterias para embalaje.
Para los fines de esta solicitud se seleccionó un sistema de bioconjugación proteína de división como la unión sintética de elección para facilitar el embalaje direccional en la OMV. Como el nombre sugiere un sistema bioconjugation proteína de división se compone de dos dominios de subunidades complementarios que interactúan entre sí. Los dominios de la proteína de división seleccionados para los fines de este protocolo se conocen como la SpyCatcher (SC) y SpyTag dominio (ST) y se derivan de la proteína de unión a fibronectina pyogenes Streptococcus-(FbaB) 11. Este sistema de la proteína de división es inusual en que wuando las dos subunidades están dentro de la proximidad de un enlace isopeptide forma espontáneamente entre los extremos proximal aspártico residuos de ácido de ácidos y aminoácidos lisina que crean una unión covalente. Formación de enlaces isopeptídicos no requiere la adición de proteínas chaperonas, enzimas catalíticas, o cofactores y puede ocurrir fácilmente a temperatura ambiente (RT) y en un amplio rango de condiciones fisiológicamente relevantes 12.
Como prueba de concepto, se seleccionó fosfotriesterasa (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta para ser envasados en E. coli derivado OMV 13. PTE contiene un sitio activo Zn / Zn binuclear y tiene la capacidad de descomponer los fosfatos orgánicos a través de una reacción de hidrólisis convertir aryldialkylphosphates en dialquilfosfatos y alcoholes de arilo 14. La exposición a los organofosfatos afecta la función del neurotransmisor adecuada a través de la inhibición de la hidrólisis de la acetilcolina por la acetilcolinesterasa en las uniones neuromusculares Makincompuestos derivados organofosforados g extremadamente peligrosas 15. La exposición prolongada o significativa a organofosforados habitualmente da lugar a convulsiones incontrolables y por lo general causa la muerte a través de la asfixia. Mientras PTE exhibe la actividad catalítica más alta hacia paraoxón, un muy potente insecticida, también es capaz de hidrolizar una amplia gama de otros pesticidas y agentes nerviosos química V / G de tipo 16. Para facilitar el empaquetamiento OMV, un plásmido bacteriano fue diseñado que codifica una construcción génica que contiene un promotor inducible, una secuencia de localización periplásmica, y un corto sitio de clonación múltiple aguas arriba de la secuencia del gen SC. La inserción del gen PTE entre el líder y la secuencia SC permitido para la creación de un interruptor genético que se dirige a la proteína de fusión PTE-SC al espacio periplásmico para el envasado de OMV. Si bien los esfuerzos descritos aquí se centran en PTE, el gen de la enzima es intercambiable y fácilmente podría ser reemplazada con otra secuencia de gen a FACilitate envasado de una enzima o proteína alternativa.
A medida que la segunda parte de la ligamiento sintético, se elige una proteína de membrana externa abundante (OmpA) para presentar la secuencia del péptido ST. Si bien la elección de la proteína de anclaje puede variar, es esencial que la proteína tiene un dominio permisivo que presenta dentro del espacio periplásmico, tolera la construcción de fusión sin inducir citotoxicidad, se sabe que está presente en OMV, y no agregar cuando es recombinante producida. OmpA es una proteína transmembrana kDa porin 37.2 que se sabe que está altamente expresado en la membrana externa bacteriana y la posterior OMV 17. Se está implicada en el transporte de moléculas pequeñas, <2 nm de tamaño, a través de la membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tiene dos dominios estructuralmente únicos, un motivo de barril beta transmembrana y una porción C-terminal periplasmically soluble conocido para interactuar con el peptidoglicano 19. En el designe de fusión OmpA-ST mutanted aquí se ha eliminado la porción C-terminal de OmpA y el ST se fusionó a la N- frente periplasmically o C-terminales. La eliminación de la porción periplásmico de OmpA disminuye el número de interacciones entre la membrana exterior y el peptidoglicano que resulta en la desestabilización de la membrana que conduce a la hiper-7 vesiculación. Genomic OmpA se mantuvo además de la construcción de OmpA-ST expresado de forma recombinante para mitigar la desestabilización de membrana bruta.
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Protocol
1. Preparación de los plásmidos
- Preparar un plásmido (por ejemplo, pET22) que contiene la proteína de anclaje (OmpA) fusionado a un dominio de ligamiento biorthogonal (denominado en el presente Protocolo como ancla-ST), etiqueta de epítopo (por ejemplo, 6xHis, etiquetas myc o FLAG para la purificación e identificación), periplásmico etiqueta de localización, resistencia a los antibióticos, y de origen adecuada de la replicación basada en la cepa bacteriana seleccionada 7.
- Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante.
- Preparar un plásmido (por ejemplo, pACYC184) que contiene la enzima / proteína (PTE) para ser empaquetados dentro de la OMV fusionado con el dominio de ligamiento bioorthogonal complementaria a la de la proteína de anclaje (denominado en el presente protocolo como enzima-SC), etiqueta de epítopo, etiqueta periplasmic localización, resistencia a los antibióticos que es diferente que el plásmido proteína de anclaje, y orig apropiadoen la replicación basado en la cepa bacteriana seleccionada 7.
- Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo 7 del fabricante.
2. Generación de una OMV Packaging E. coli Cultura
- aislamiento del plásmido
- Purificar plásmidos que codifican la enzima-SC construir y anclaje-ST construye a partir de líneas celulares de mantenimiento separadas utilizando un kit de aislamiento de plásmido comercial según el protocolo del fabricante 7. Determinar la concentración de ADN y la pureza mediante la medición de la absorbancia a 260 nm y 280 nm.
- Co-transformación
- Seleccione una cepa de E. coli que está disponible comercialmente para facilitar la expresión de proteínas.
NOTA: BL21 células se utilizaron aquí (DE3). Se requiere que el lisógeno T7 para expresión de la construcción de anclaje-ST, que se basa en el promotor T7 y la ARN polimerasa T7 para protein expresión. El uso de otras cepas bacterianas requiere o bien la presencia del gen lisógeno T7 o el uso de un plásmido que no sea pET22 7. - Diluir plásmido de ADN purificado a concentraciones molares equivalentes luego transformarlas en células bacterianas competentes a través de ya sea el calor de transformación de choque o la electroporación siguiendo el protocolo del fabricante para las células competentes elegidos.
- células de la placa transformada Onto Luria-Bertani (LB) placas de agar con ampicilina (pET22) y cloranfenicol (pACYC184) que contiene los antibióticos; ambos presentes a concentraciones finales de 25 mg / ml.
- Coloque la placa de cultivo a 37 ° C durante la noche para aislar sólo los clones que contienen ambos plásmidos.
NOTA: Las colonias que sobreviven a la selección de antibióticos se utilizan para todas las futuras preparaciones de OMV. Antibióticos (ampicilina y cloranfenicol) se añadirán a todos los cultivos líquidos para mantener la presión selectiva y asegurar la presencia de ambos plásmidos.
- Seleccione una cepa de E. coli que está disponible comercialmente para facilitar la expresión de proteínas.
3. Producción de OMV
- expansión de la colonia
- Inocular 5 ml de medio de cultivo (típicamente Caldo Terrific (TB) o LB) que contenía antibióticos a las concentraciones mencionadas anteriormente (etapa 2.2.3) con una sola colonia de las placas de selección descritos en 2.2.4.
- Realizar una dilución 1: 100 veces del cultivo iniciador durante la noche en frascos de cultivo con deflectores.
NOTA: Utilice un volumen de medios de comunicación entre 250-500 ml. - Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación a 250 rpm para asegurar que la aireación suficiente de la cultura se alcanza.
- La inducción de cada plásmido
- Deje que el cultivo de bacterias para crecer hasta una DO600 de 0,6-0,8, aproximadamente 3 horas después de la inoculación del crecimiento del matraz crecimiento primario.
- Para mejorar el rendimiento final de vesículas cargadas PTE-SC, centrifugar todo el cultivo a 7.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento celular en la pre-calentado, medios de cultivo fresco.
NOTA: Este optional paso ayuda a eliminar cualquier OMV vacío que están presentes en el medio de cultivo antes de la inducción PTE-SC. - Hacer una solución madre 20% de L-arabinosa en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar la solución de L-arabinosa a 4 ° C durante 2-4 semanas.
- Añadir la solución de L-arabinosa al matraz de cultivo a una concentración final 0,2% para iniciar la producción PTE-SC.
NOTA: Esto ayuda a cargar previamente el espacio periplásmico con PTE-SC antes de la promoción de una mayor formación de vesículas través de la inducción de la mutante OmpA-ST. - Hacer una solución 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras.
NOTA: IPTG debe ser utilizado inmediatamente una vez hidratado. Alícuotas de IPTG se pueden almacenar congeladas durante 3-6 meses y se pueden descongelar inmediatamente antes de su uso. - Añadir IPTG después de un período de incubación de 3 horas adicionales a una concentración final de 0,5 mM para iniciar la producción de la OmpA-ST.
- Permitir que el cultura de crecer para un 8-14 h adicionales a 37 ° C con agitación.
4. Purificación OMV
- La eliminación de bacterias intactas
- Centrifugar los medios de cultivo bacteriano durante 15 minutos a 7000 xga 4 ° C para sedimentar las bacterias intactas.
- Se decanta, y guardar, los medios de comunicación fuera de la parte superior del poste centrifugación sedimento celular con cuidado de no perturbar el sedimento celular.
- Repetir los pasos 4.1.1 y 4.1.2 para un ciclo de centrifugación adicional para asegurar que todas las bacterias intactas se retiran de los medios de cultivo asegurándose de decantar y guardar los medios de comunicación.
- La eliminación de agregados de proteínas
- purificar adicionalmente el medio de cultivo bacteriano utilizando un filtro de 0,45 micras de membrana para eliminar las bacterias residuales y el material celular grande no deseado.
NOTA: Utilice un material de membrana biológicamente compatible para mayores recuperaciones y menor absorción de proteínas, tales como acetato de celulosa (CA) o difluoruro de polivinilideno (PVDF). volúmenes filtro de jeringa de menos de 100 ml y los volúmenes de filtro de vacío de más de 100 ml.- Para filtro de jeringa, extraer el medio de cultivo en jeringa estéril de 10-50 ml. Adjuntar 0,45 micras filtro a extremo Luer de la jeringa. Presionando el émbolo y recoger de flujo continuo en un buque nuevo.
- Para aspirar filtro, transferir medio de cultivo a un aparato de filtración estéril. Coloque la unidad de la bomba de vacío o se hundirá aspirador para generar succión. Transferir medio filtrado a la nueva embarcación.
- purificar adicionalmente el medio de cultivo bacteriano utilizando un filtro de 0,45 micras de membrana para eliminar las bacterias residuales y el material celular grande no deseado.
- Aislamiento de OMV a través de ultracentrifugación
- Añadir los medios de cultivo filtrado en tubos de centrifugación teniendo cuidado de equilibrar tubos opuestas en la centrífuga.
- Pellet a ~ 150.000 xg durante 3 horas a 4 ° C en una ultracentrífuga mediante el rotor correspondiente a juego tanto el instrumento y tubos que se utilizan.
- Se decanta el medio de cultivo agotado OMV a partir del sedimento OMV, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de OMV, inmediatamente a la terminación of centrifugación como permitir que el sedimento OMV a permanecer en los medios de comunicación se ablandará el sedimento de la reducción de la recuperación de OMV.
NOTA: Este pellet será ligeramente marrón y dependiendo de la cantidad de partida de cultivo bacteriano puede o no ser visible a simple vista. De aspiración de los medios de comunicación directamente desde la parte superior del tubo de centrifugación es también una opción teniendo en cuenta que los medios de comunicación más retiradas de la OMV sedimentar las más pura será la muestra final OMV. - Guardar el sobrenadante se centrifuga para las pruebas más adelante dispersión dinámica de luz (DLS) para verificar que las partículas de OMV estaban completamente agotados de los medios de comunicación.
- Añadir 0,5 a 1 ml de pH 7,4 o mM N 100 tampón estéril filtrada Phosphate Buffered Saline (PBS) ciclohexil-2-aminoetanosulfónico ácido (CHES) a pH 8,0 al sedimento OMV lo que le permite incubar durante 30 min a TA. Asegúrese de que la pastilla no se seque.
NOTA: Los extremos en la concentración de la solución iónica, el pH y la temperatura puede dar lugar a una solubilidad reducida OMV y promover agregación. - pipetear cuidadosamente la solución OMV purifica a partir del tubo de centrífuga, mezclando suavemente para asegurar la totalidad de la pastilla ha sido solubilizado.
5. Caracterización de OMV
- Utilizar cualquier software DLS o el seguimiento de nanopartículas disponibles comercialmente siguiendo los protocolos del fabricante proporcionado únicos para cada instrumento para determinar la distribución del tamaño de partícula y la concentración de OMV.
NOTA: En este caso, se determinó la distribución del tamaño de OMV y la concentración de la utilización de nanopartículas NanoSight LM10 de seguimiento y software de análisis NTA 2.3.- Abra el software.
- Encienda el microscopio y limpiar todas las superficies de la unidad de microscopio y el seguimiento de las nanopartículas.
- Añadir ~ 0,5 ml de muestra de OMV directamente a la ventana de visualización del dispositivo de rastreo de partículas a través del adaptador Luer con una jeringa estéril de 1 ml asegurándose de cubrir toda la ventana de visualización sin inyectar burbujas de aire en el sistema.
- lugar tque nanopartícula unidad de seguimiento sobre la platina del microscopio y encender el láser.
- Haga clic en "Capture" en el software.
- Ajuste el enfoque del microscopio y la etapa de visualizar las partículas en la pantalla de vista previa presente en la ventana del software.
- Ajuste el "obturador de la cámara" y "ganancia de la cámara" hasta que las partículas brillantes se visualizan claramente en un fondo oscuro.
- Ajustar la duración de la captura hasta 60 seg.
- Haga clic en "Grabar".
- Cuando se le solicite, introduzca la temperatura / dispositivo de muestra, etiquetar la muestra, y guardar los datos de vídeo al final de la cada funcionar en una carpeta designada por el usuario.
- Mantenga todos los parámetros de análisis (detección de umbral, la falta de definición, Pista longitud mínima, que se espera Min Tamaño de Partículas) en Modo de detección automática y haga clic en "secuencia del proceso."
NOTA: Consulte el manual de cómo cada parámetro se puede ajustar de forma independiente a los resultados de análisis de sintonía fina. - Registro de partícula y distribución de tamaño de partículas / mconcentración de L como se determina por el software.
NOTA: Un rango de tamaño hidrodinámico OMV típico es entre 30-200 nm con una concentración de partículas / ml de ~ 10 x 10 8.
- Determinar el contenido de proteína OMV
- Utilice estándar SDS-PAGE y los protocolos de transferencia de Western para evaluar la pureza OMV, la producción de la enzima, y la eficacia de reticulación SC-ST 7.
NOTA: La reticulación eficiencia no será 100% 7.
- Utilice estándar SDS-PAGE y los protocolos de transferencia de Western para evaluar la pureza OMV, la producción de la enzima, y la eficacia de reticulación SC-ST 7.
6. Verificación de enzima Packaging
- Ensayo de la actividad PTE
- Realizar todos los ensayos enzimáticos en un tampón adecuado, tal como 100 mM de tampón CHES (pH 8) a 25 ° C, ya sea en una cubeta o multiplexados en una placa de 96/384 también.
- Añadir 5 l de una dilución 1: 1000 de paraoxón en tampón CHES 90 l de CHES y 5 l de OMV purificado (~ 36 veces concentrado en comparación con la concentración de OMV presente en el medio de cultivo).
Precaución: paraoxón es un pesticida tóxicoy debe ser manejado por el fabricante y las directrices institucionales. - Tomar las lecturas de absorbancia a intervalos regulares (cada 20 segundos durante ~ 2 horas de tiempo de reacción total) a 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) y 348 nm (ε punto isosbéstico = 5,4 mM -1 cm -1) a controlar la progresión de reacción del producto de la descomposición paraoxón cromogénico, p-nitrofenol.
NOTA: A valores de pH por encima de 8 está presente la forma desprotonada dominante de p-nitrofenol lo que permite un seguimiento preciso a 405 nm. En todas las demás soluciones de pH complejo o inferior, es necesario utilizar el punto de 348 nm isosbéstico como múltiples formas de la p-nitrofenol estarán presentes. - Calcular las velocidades iniciales de reacción mediante la determinación de la pendiente de la porción lineal de las curvas de progreso de la etapa 6.1.3 para comparar la cantidad relativa de PTE en cada muestra, la eficiencia de embalaje, y la producción total de PTE.
- Realizar enzimática estándarprotocolos de ensayo para determinar la K M, V max y kcat para el OMV encapsulados PTE.
NOTA: Un análisis de Lineweaver-Burk puede ser utilizado para la determinación de estos parámetros cinéticos en la intersección y = 1 / V máx y la pendiente max = 20 K M / V.
- Transmembrana Substrato / difusión del producto.
- Realizar el mismo análisis ensayo cinético descrito en el paso 6.1 utilizando concentraciones crecientes de Triton X-100 en tampón CHES de 0-3% en volumen.
NOTA: La adición de Triton X-100 a las funciones de OMV solubilizados para interrumpir la bicapa lipídica permitiendo de los contenidos de la OMV a ser libremente accesible a la solución de reacción. - Calcular y comparar las velocidades iniciales en cada nivel de Triton X-100 para verificar el paso transmembrana del sustrato / producto indicado por el cambio mínimo en la actividad de la enzima (velocidades iniciales) en comparación con la actividad enzimática in la ausencia de Triton X-100. Si se observa un aumento sustancial de la actividad enzimática en presencia de Triton X-100, es probable que el sustrato no se difunde libremente en la OMV.
- actividad de la enzima libre de ensayo (como se describe anteriormente en la sección 6.1) en presencia de Triton X-100 para verificar que la actividad de la enzima no es inhibida por el propio agente tensioactivo.
NOTA: Si la actividad se ve afectada en gran medida por Triton X-100, aditivos alternativos, tales como saponinas o varios polisorbato / tensioactivos de interpolación pueden ser más adecuados para romper la membrana OMV.
- Realizar el mismo análisis ensayo cinético descrito en el paso 6.1 utilizando concentraciones crecientes de Triton X-100 en tampón CHES de 0-3% en volumen.
7. Almacenamiento OMV
- Congelación
- alícuotas lugar ~ 100 l de OMV purificada directamente en nitrógeno líquido para congelar las alícuotas complemento asegurándose de no sumergir totalmente los viales o ponerse en contacto con cualquier nitrógeno líquido con la propia muestra.
NOTA: Purified OMV puede congeló directamente en la memoria intermedia que fue seleccionado para solubilizar el precipitado OMV durante el purificatproceso de ion sin crioprotectores adicionales necesarios 7. - Almacenar las alícuotas se congelaron rápidamente a -80 ° C.
- Descongelar alícuotas congeladas procedentes de la etapa 7.1.1 colocándolos a temperatura ambiente asegurándose de no calentar las muestras.
- Antes de preparar todas las muestras para el almacenamiento de esta manera realizar el ensayo enzimático descrito en la etapa 6.1 la comparación de velocidades iniciales antes y después de la congelación para verificar que no hay pérdida significativa en la actividad de la enzima poste de congelación-descongelación.
NOTA: tienda purificó OMV a 4 ° C si se observa una reducción en la actividad enzimática debido a la congelación.
- alícuotas lugar ~ 100 l de OMV purificada directamente en nitrógeno líquido para congelar las alícuotas complemento asegurándose de no sumergir totalmente los viales o ponerse en contacto con cualquier nitrógeno líquido con la propia muestra.
- La liofilización
- Liofilizar las alícuotas se congelaron rápidamente VME purificadas utilizando equipos de liofilización disponible en el mercado 21.
- Tienda liofilizado alícuotas a temperatura ambiente durante semanas o a -80 ° C durante muchos meses.
- Añadir el mismo volumen de agua purificada a la OMV liofilizado como antes de la liofilización y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min para rehidratar tse muestra. Mezclar suavemente cuando sea necesario asegurarse de no Vortex o sonicar la OMV.
- Agregue el polvo liofilizado OMV directamente al punto de atención para aplicaciones donde antes de dilución / solubilización no es necesario.
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Representative Results
La expresión simultánea de dos proteínas recombinantes, como se requiere para la estrategia de embalaje OMV se detalla en este protocolo, se puede lograr a través de un número de diferentes vías. Aquí, un sistema de dos vector se utilizó con orígenes de replicación compatibles y casetes de genes inducibles por separado. Para la expresión de la PTE-SC construir un plásmido comercial columna vertebral (pACY184) fue diseñado para incluir un casete de gen inducible de arabinosa y un doble arginina secuencia líder localización periplásmica seguido de una serie de sitios de restricción únicos para facilitar la clonación del gen de la enzima como una fusión a una proteína SC C-terminal. La construcción de plásmido que codifica la proteína de anclaje de la membrana externa es la pET22 vector comercial que utiliza el operón lac por el control de expresión de la proteína y la secuencia de localización periplásmica pelB. La secuencia ST corto se clonó en la proteína OmpA truncado antes de inseRTion en el plásmido de expresión. En ambos plásmidos, la secuencia de hexahistidina C-terminal se mantuvo para permitir la identificación simultánea de las proteínas de fusión en las muestras de OMV. Construcción y caracterización de estas construcciones de genes, incluyendo tanto las construcciones de fusión N- y C-terminal ST a OmpA, se describen completamente en Alves et al. 7. Las construcciones génicas descritas en este documento pueden no ser propicio para el envasado de todas las enzimas. En algunos casos, puede ser necesario cambiar la señal periplásmica localización, los elementos reguladores, o las etiquetas de epítopo. Además, algunas proteínas pueden ser prohibitivamente grande y no puede atravesar la membrana interna por completo. La actividad enzimática y la eficacia de envasado OMV no pueden determinarse a priori y tendrá que ser determinado empíricamente para cada proteína diana.
A continuación se presentan los resultados que cabría esperar por lo general después de la realización con éxito out este protocolo. Se incluye un esquema de los dos dominios de la proteína / SC Autonum, OmpA-ST y la fusión PTE-SC construcciones, así como un ejemplo de la formación isopeptide en la membrana externa de la bacteria y la posterior encapsulación de PTE-SC dentro de un OMV (Figura 1) . También se incluyen los resultados representativos de la morfología OMV depuradas a través de SEM, así como la distribución del tamaño y concentración de OMV absoluta determinada a través del software de rastreo de partículas (Figura 2). Además de la caracterización del contenido de proteína OMV y expresión de proteínas recombinantes se ve a través de SDS-PAGE y Western blot (Figura 3). Los pesos moleculares de las proteínas de interés específico para el protocolo proporcionado aquí son los siguientes: OmpA nativo (37,2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Purificada OMV debe tener una banda oscura a aproximadamente 37 kDa que es indicativo de la altamente abundante OmpA nativo. Dependiendo de la resolución de gel, pueden existir varias bands presente en esta región del gel como OmpA, OmpF y OmpC son todos relativamente abundante y comparten un peso molecular similar. Una banda adicional que es de 2,2 kDa más grande que OmpA-ST también se puede observar debido a la escisión incorrecta de la secuencia líder como resultado de sobrecargar la maquinaria de expresión de E. coli. Es importante tener en cuenta que una muestra OMV purificado con éxito no tendrá muchas otras proteínas altamente expresadas. Si otras bandas están presentes ya sea la purificación se llevó a cabo de forma incorrecta o las bacterias tensión que se utiliza puede ser envasado de otras proteínas que no se observan en esta cepa de E. coli BL21 (DE3).
Por otra parte, se han proporcionado ensayos de actividad y experimentos de ruptura de la vesícula para demostrar resultados representativos que se esperaría si el sustrato enzimático puede entrar libremente en el OMV a través de proteínas transmembrana porinas (Figura 4). Paraxón relativamente libremente entra en laOMV a través de proteínas transmembrana porin endógenos para reaccionar con la PTE empaquetado y el producto de reacción, p-nitrofenol, también pasa con relativa libertad a través de la membrana de OMV. Este fenómeno no será ubicua entre todos los productos, el sustrato, y los conjuntos de enzimas y debe ser determinado experimentalmente. Aunque exitoso ruptura OMV y la liberación de enzimas se ha visto con bajas concentraciones de detergente y PTE (en el presente documento Triton X-100), tales adiciones pueden afectar a la actividad de otras enzimas.
Mapas plasmídicos también se han incluido para demostrar el diseño de una estrategia de embalaje de dos plásmidos utilizando el sistema de SC / ST (Figura 5).
Figura 1: Los envases Dirigida de las proteínas en OMV. Las estructuras cristalinas de las proteínas utilizadas en el envasado strat OMV descritoEGY: OmpA, PTE, SpyTag (ST) y SpyCatcher (SC); AP: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, respectivamente. Se muestra una representación esquemática de las construcciones de fusión OmpA-ST y PTE-SC forman un enlace isopeptídico en la membrana externa de las bacterias. Esta fusión de la membrana conduce incorporación de la PTE dentro de la OMV de conformación. Figura reproducida (adaptado) a partir de Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Derechos de autor 2015 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de OMV. (A) SEM de ultracentrífuga purificó OMV a partir de E. coli nativa [BL21 (DE3)]. (B) trac partículas Representante rey distribuciones de tamaño y (C) concentración total de vesículas promedio de más de 90 segundos muestra lee por Native OMV, PTE-SC en ausencia de la activación de arabinosa (PTE-No A), PTE-SC en presencia de activación arabinosa (PTE-A) , N-terminal OmpA-ST co-transformada con PTE-SC en presencia de arabinosa y la activación IPTG (PTE / OMV-N), y el sobrenadante ultracentrífuga (UC sobrenadante). Se observó un aumento significativo en la producción de OMV en la muestra PTE / OMV-N en comparación con el nativo OMV y PTE-SC construye solo. OMV fueron cuantificados en el sobrenadante de la UC para demostrar una recuperación casi completa de OMV en el sedimento UC dejando poco o ningún OMV en el puesto sobrenadante ultracentrifugación. Todos los datos representan medias (± DE) de tres experimentos. Figura reproducida (adaptado) a partir de Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Derechos de autor 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación del contenido de proteína purificada OMV. (A) SDS-PAGE de la pastilla purificada OMV UC de la fusión OmpA-ST C-terminal coexpressed con PTE-SC (PTE / OMV) construir lo que demuestra la abundancia representante de OmpA-ST, nativo OmpA, PTE-SC y el OmpA- ST / PTE-SC fusión isopeptide. (B) Análisis de transferencia Western utilizando el incluido su etiqueta presente en la OmpA y PTE construye para facilitar la visualización a través de un anticuerpo anti-6xHis. Es importante señalar que PTE se conoce para dimerizar, como se evidencia en la transferencia por la presencia de mayor peso molecular marcado con his especies. A pesar de que son muy altos niveles de expresión OmpA-ST observadas no hay una conversión completa del librePTE-SC a la membrana obligado OmpA-ST / PTE-SC. A pesar de este hecho, el aumento de la producción PTE general y mejorar la eficiencia de envasado sugieren que mientras que la formación del enlace covalente no es ubicuo la asociación no covalente de la ST y dominios SC es un factor importante en el empaquetado dirigido dentro de la OMV. Figura reproducida (adaptado) a partir de Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Derechos de autor 2015 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Actividad de PTE y caracterización de envasado. (A) En general PTE niveles de expresión y eficacia de empaquetamiento OMV determinaron a través de mediciones de velocidad iniciales utilizan paraoxon como sustrato cromogénico comparando PTE presente en los gránulos de células, el sobrenadante UC, y los gránulos purificados UC OMV. (B) Los datos representativos que demuestran la utilización de Triton X-100 (0,5% T100) para interrumpir el bicapa OMV que permite el acceso sin trabas de sustrato al interior OMV. La comparación de estos datos para los ensayos realizados en ausencia de T100 facilite la verificación de la translocación de sustrato a través de las bicapas de OMV intactas si velocidades iniciales enzimáticos son sin cambios. En el caso de paraoxón había muy poca diferencia actividad observada en presencia o ausencia de T100 que indica que paraoxón pasa libremente a través de los poros endógenos en la OMV. (C) PTE-SC datos de cinética en condiciones de Michaelis-Menten cinética enzimática ecuación estándar de TEP / OMV-N y PTE-A. (D) Un análisis de Lineweaver-Burk utilizado para la determinación de K M y k cat / K M (48, 4,4 x 10 7; 44 M, 4,9 x10 7 seg -1 M -1, respectivamente), demostrando parámetros cinéticos literatura PTE similares a los de la enzima nativa (90 M, 2,7 x 10 7 seg -1 M -1) con R 2 ≥ 0,999 en todos los casos. Todos los datos representan medias (± DE) de tres experimentos. Figura reproducida (adaptado) a partir de Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Derechos de autor 2015 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: construcciones de plásmidos representativos para el sistema de ejemplo descrito aquí. SpyCatcher modificado enzima-SC (PTE-SC) plásmido dirigido para la encapsulación dentro de la OMV (izquierda). SpyTag modifIED membrana de anclaje-ST (OmpA-ST-N) plásmido (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este funciones de protocolo para demostrar un representante dirigidas técnica de embalaje en el que se produce y se empaqueta en OMV por E. coli una enzima de interés. Al igual que con muchas técnicas complejas hay varias áreas en las que el protocolo puede ser modificado para adaptarse a su uso en diferentes aplicaciones únicas, algunas de las cuales se detallan a continuación. Si bien el mecanismo de envases OMV y la encapsulación de la enzima se puede adaptar a las necesidades específicas hay varios pasos dentro de este protocolo que son críticos para su éxito. La eliminación inicial de bacteria intacta y restos celulares es de importancia significativa y afectará a todos los intentos de aguas abajo en la cuantificación o análisis de la muestra. Dos pasos de centrifugación sucesivos seguido de filtración es típicamente suficiente para eliminar estos contaminantes. Sin embargo, en todos los casos el cuidado debe ser tomado cuando las soluciones de decantación después de la centrifugación para reducir al mínimo la transferencia de contaminantes. Del mismo modo, la final de pellets o OMVbtained siguiente ultracentrifugación a menudo es sólo ligeramente adheridas a la parte inferior del tubo de centrífuga. En las etapas finales, se debe tener cuidado al retirar el medio de cultivo gastado para asegurar que el gránulo permanece inalterado en la parte inferior del recipiente. En algún caso puede ser mejor para retener el medio de cultivo final hasta después de los análisis de muestras usando DLS o el seguimiento de nanopartículas dispositivo para garantizar la pastilla OMV no se perdió en los pasos finales del protocolo. A continuación se presentan algunas preocupaciones adicionales que puedan surgir tanto con este protocolo particular y otros que se adapta a las necesidades específicas de los investigadores.
El uso de PTE en este sistema proporciona una excelente encapsulación enzima modelo para la remediación ambiental de las regiones organofosforados contaminado con PTE ser fácilmente reemplazable por una enzima alternativa o proteína de interés. Como se describe aquí, la co-expresión de TEP-SC con OmpA-ST dio lugar a un gran aumento en expressi general PTEen, así como los niveles de producción más altos de vesículas con más PTE de ser empaquetados dentro de las vesículas en comparación con TEP y TEP-SC expresa por sí sola. Al reducir el número de interacciones entre la membrana exterior y el peptidoglicano a través de la deleción C-terminal de OmpA hiper-vesiculación se alcanza. Esto proporciona una ruta fácil para las bacterias para exportar el PTE recombinante que mitiga los efectos tóxicos que se observan a menudo en la sobreexpresión de las proteínas no nativas.
Mientras PTE puede ser fácilmente reemplazado en este modelo de sistema que es importante tener en cuenta que no todos los sustratos de enzimas van a pasar libremente a través de la bicapa OMV y por lo tanto es imperativo que cada enzima única y un par de sustrato a ensayo en una base de caso por caso. Incluso si un sustrato no pasa a través de la membrana de esta técnica todavía se puede utilizar para producir y empaquetar una enzima en OMV y la adición de Triton X-100, o un tensioactivo alternativa adecuada, se pueden añadir en suficiente levels para romper las vesículas antes de su uso.
En ausencia de expresión de la proteína recombinante y el embalaje de este protocolo también puede servir como un método básico para la producción de OMV y purificación a partir de diversas especies bacterianas. Los métodos alternativos para la purificación de OMV, tales como fraccionamiento en gradiente de densidad 22, filtración de membrana 23, y ultra-filtración 24, también existen y pueden ser las técnicas más adecuadas, dependiendo de la aplicación prevista. Estas técnicas de purificación alternativos también pueden complementarse fácilmente en este protocolo en lugar de la granulación de la ultracentrifugación OMV para el envasado dirigido de una proteína en una OMV a través del uso de un enlace sintético biortogonal.
Otros se pueden hacer modificaciones al sistema de vinculación sintética específica utilizada en este protocolo, así como la proteína de anclaje de membrana seleccionado. Hay varias estrategias sintéticas para el emparejamiento de dos proteínas diferentess dentro de un sistema biológico que incluyen: proteínas de división 25, en espiral de bobinas 26 y 27 fracción inteins, por mencionar algunos. Otros unidas a la membrana o transmembrana proteínas tales como OmpF y OmpC probable que proporcionarían a los sitios adecuados ST modificación así 28. En algunos casos, también puede ser necesario cambiar la ST y dominios SC colocando el SC en la proteína de anclaje y la mucho menor ST sobre la enzima / proteína recombinante. También hay un número de diferentes estrategias de clonación que pueden ser implementadas aquí, incluyendo el uso de múltiples plásmidos en las mismas o diferentes sistemas de inducción, un único plásmido con múltiples proteínas codificadas, o incluso la utilización de técnicas de recombinación homóloga para incorporar todas o partes de la expresión sistema en el genoma bacteriano.
El microambiente de la OMV ayuda a estabilizar la enzima empaquetado reducir la inactivación enzimática que comúnmente se produce en menos de st idealescondiciones orage, congelación-descongelación, liofilización y 29. También se anticipa que la OMV proporcionará en gran medida la mejora de la resistencia a la escisión proteolítica como la bicapa OMV funcionará como una barrera física entre la enzima activa y las proteínas presentes en el espacio extra-OMV. Este protocolo adicional se puede ampliar para incluir una molécula pequeña, un péptido, o una etiqueta de proteína frente a exterior para facilitar la administración dirigida de proteínas OMV encapsulados y purificación por afinidad. Mientras PTE fue seleccionado para esta aplicación única de los resultados de este estudio, y los contenidos de este protocolo, fácilmente se pueden utilizar para diseñar estrategias de empaque proteína análogos para uso en diversa de administración farmacéutica, médicos de diagnóstico y remediación ambiental aplicaciones 30.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
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