Abstract
Toenemende belang bij synthetische biologie technieken om buitenmembraan vesicles (OMV) programmeren leiden tot een aantal zeer interessante en unieke toepassingen voor OMV waarin traditionele nanodeeltjes te moeilijk te synthetiseren blijken. Tot op heden zijn alle Gram-negatieve bacteriën is aangetoond dat OMV demonstreren verpakken van diverse lading die kleine moleculen, peptiden, eiwitten en genetisch materiaal omvat te produceren. Op basis van hun verschillende lading worden OMV betrokken bij vele biologische processen gaande van cel-cel communicatie genoverdracht en levering van virulentiefactoren afhankelijk van welke bacteriën produceren het OMV. Pas onlangs zijn bacteriële OMV geworden toegankelijk zijn voor gebruik in een breed scala van toepassingen door de ontwikkeling van technieken voor de controle en de directe verpakking van recombinante eiwitten in OMV. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de productie, zuivering en gebruik enzym verpakte OMV wijze verbeterd overall productie van recombinant enzym, verhoogde vesiculatie en verbeterde enzymstabiliteit. Succesvolle gebruik van dit protocol zal resulteren in de creatie van een bacteriestam die tegelijkertijd produceert een recombinant eiwit en stuurt het voor OMV inkapseling door het creëren van een synthetische binding tussen het recombinante eiwit en een buitenste membraananker eiwit. Dit protocol Gegevens ook werkwijzen voor het isoleren van OMV uit bacteriële culturen evenals juiste behandeling technieken en dingen te overwegen bij de aanpassing van deze protocol voor gebruik voor andere unieke toepassingen zoals: farmaceutische afgifte van geneesmiddelen, medische diagnostiek, en het herstel van het milieu.
Introduction
Hier gepresenteerd is een methode voor het ontwerp, de productie en zuivering van enzym geladen bacteriële buitenste membraan blaasjes (OMV). OMV zijn klein, vooral unilamellaire, proteoliposomen die variëren in grootte 30-200 nm 1,2. Alle Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën die zijn tot nu toe onderzochte aangetoond loslaten van OMV of extracellulaire blaasjes (EV) vanaf hun oppervlak 3,4. Het precieze mechanisme waardoor OMV geproduceerd nog niet volledig opgehelderd door de diverse bacteriële populaties die hen evenals de variërende functies die zij dienen afscheiden. OMV is aangetoond dat een breed scala van vracht van kleine moleculen, peptiden en proteïnen genetisch materiaal waar een verscheidenheid aan complexe signaal, gen translocatie en virulentie functies 5,6.
De exacte mechanismen van OMV biogenese zijn niet goed gekarakteriseerd, en lijken te verschillen tussen bacteriesoorten. ondanks this feite hebben wij een werkwijze voor het verbeteren van de verpakkingsefficiëntie van een recombinant eiwit in OMV door een synthetische binding tussen een eiwit van interesse en een zeer overvloedige eiwit endogeen voor de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ontwikkeld. Aangezien een synthetische verbinding of kunstmatig opgenomen affiniteit tussen het recombinant tot expressie gebrachte eiwit en het OMV de waargenomen verpakkingsefficiëntie zeer laag 7. Dit resultaat is als incorporatie van de eiwitten in de OMV hetzij gebeurt door toeval inkapseling precies op het moment van OMV formatie op het bacteriële oppervlak of via gerichte verpakkingen met mechanismen die niet goed begrepen worden verwacht. Enig succes is waargenomen bij het verpakken eiwitten eenvoudig door overexpressie in de periplasmatische ruimte die berust op toeval inkapseling maar effectieve verpakking is sterk afhankelijk eiwit met sommige eiwitten verpakking hoog rendement in vergelijking met andere ebij niet verpakken helemaal 8-10. Door gebruik gemeenschappelijke synthetische biologische technieken zochten we Escherichia coli (E. coli) gelijktijdig produceren, verpakken en uitscheiden een actief enzym plaats in OMV dat beperkingen huidige kennis over hoe OMV gevormd en hoe lading wordt geselecteerd door de bacteriën omzeilt ingenieur verpakking.
Voor de toepassing van deze applicatie is een split-eiwit bioconjugatie systeem gekozen als de synthetische verbinding van de keuze om gerichte verpakkingen in het OMV vergemakkelijken. Zoals de naam suggereert een split eiwit bioconjugatie systeem bestaat uit twee complementaire domeinen subeenheid die interageren met elkaar. De splitsing eiwitdomeinen geselecteerd voor de toepassing van dit protocol worden aangeduid als de SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domein en zijn afgeleid van de Streptococcus pyogenes-fibronectine bindend eiwit (FbaB) 11. Deze splitsing proteïnesysteem is ongebruikelijk doordat wanneer de twee subeenheden in de nabijheid een isopeptidebinding spontaan vormt tussen het proximale asparaginezuur en lysine aminozuurresiduen waardoor een covalente binding. Vorming isopeptidebinding niet de toevoeging van chaperone eiwitten, katalytische enzymen of cofactoren, en kan gemakkelijk plaatsvinden bij kamertemperatuur (KT) en over een groot aantal fysiologisch relevante omstandigheden 12.
Als een proof of concept, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) van Brevundimonas diminuta werd geselecteerd om te worden verpakt in E. coli afkomstig OMV 13. PTE bevat een binucleair Zn / Zn actieve plaats en heeft de mogelijkheid organofosfaten afbreken door een hydrolysereactie omzetten aryldialkylphosphates in dialkylphosphates en arylalcoholen 14. Blootstelling aan organofosfaten schaadt juiste neurotransmitter functie door middel van het remmen van de hydrolyse van acetylcholine door acetylcholinesterase bij neuromusculaire verbindingen making organofosfaat afgeleide verbindingen uiterst gevaarlijk 15. Langdurige of significante blootstelling aan organofosfaten vaak resulteert in oncontroleerbare stuiptrekkingen en meestal de dood veroorzaakt via stikken. Hoewel PTE vertoont de hoogste katalytische activiteit ten opzichte paraoxon, een zeer krachtige insecticide, maar ook kan hydrolyseren van een hele reeks andere pesticiden en V / G soort chemische zenuwgassen 16. Om OMV verpakking te vergemakkelijken, werd een bacterieel plasmide geconstrueerd dat codeert voor een genconstruct dat een induceerbare promoter, een periplasmatische lokalisatiesequentie en een korte meervoudige kloneringsplaats stroomopwaarts van de SC gensequentie bevat. Insertie van het PTE-gen tussen de leider en SC-sequentie toegestaan voor de oprichting van een genetische schakelaar die de PTE-SC fusie-eiwit richt naar de periplasmatische ruimte voor OMV verpakking. Hoewel de hier beschreven inspannen PTE, het enzym gen uitwisselbaar en kan gemakkelijk worden vervangen door een ander gensequentie FACilitate verpakking van een alternatieve enzym of eiwit.
Het tweede deel van de synthetische verbinding, is een overvloedig buitenmembraan eiwit (OmpA) gekozen om de ST peptidesequentie presenteren. Terwijl de keuze van anker-eiwit kan variëren, is het essentieel dat het eiwit een permissieve domein dat weer in de periplasmatische ruimte, tolereert de fusieconstruct zonder induceren cytotoxiciteit, bekend aanwezig OMV te zijn, en niet aggregeert als het recombinant geproduceerd. OmpA- is een 37,2 kDa transmembraan porine-eiwit dat bekend is in hoge mate tot expressie gebracht in de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV 17. Het is betrokken bij het transport van kleine moleculen, <2 nm in grootte, in het bacteriële membraan 18. Inheemse OmpA- twee structureel unieke domeinen, een transmembraan motief beta vat en een periplasmically oplosbare C-terminale deel gekende bindingspartners met peptidoglycan 19. In de mutant OmpA-ST fusie designed hier het C-terminale gedeelte van OmpA werd verwijderd en de ST werd gefuseerd met de periplasmically gerichte N- of C-termini. De periplasmatische gedeelte van OmpA verwijderen vermindert het aantal interacties tussen het buitenste membraan en peptidoglycan waardoor membraan destabilisatie leiden tot hyper-blaasjes 7. Genomisch OmpA- werd gehandhaafd evenals de recombinant tot expressie gebrachte OmpA-ST construct grove membraan destabilisatie beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van plasmiden
- Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pET22) met het anker eiwit (OmpA) gefuseerd aan een biorthogonale koppeling domein (in dit protocol aangeduid als anchor-ST), epitooplabel (zoals 6xHis, myc of FLAG-tags voor zuivering en identificatie), periplasmatische localisatie tag, antibioticaresistentie en geschikte replicatieoorsprong basis van de geselecteerde bacteriestam 7.
- Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pACYC184) die het enzym / eiwit (PTE) te verpakken in de OMV gefuseerd met de complementaire bioorthogonal koppeling domein dat van het anker-eiwit (in dit protocol enzym-SC genoemd), epitooplabel, periplasmatische localisatie tag, antibiotische weerstand die verschilt van de ankereiwit plasmide en geschikte origin replicatie basis van de geselecteerde bacteriestam 7.
- Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant 7.
2. Genereren van een OMV Packaging E. coli Cultuur
- Plasmid Isolation
- Zuiver plasmiden dat codeert voor het enzym-SC bouwen en anchor-ST construeert uit afzonderlijke onderhoud cellijnen met behulp van een commercieel plasmide isolatie kit volgens protocol van de fabrikant 7. Bepaal DNA concentratie en zuiverheid meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nm.
- Cotransformatie
- Selecteer een E. coli stam die commercieel beschikbaar is voor eiwitexpressie te vergemakkelijken.
NOTE: BL21 (DE3) cellen werden hier gebruikt. De T7 lysogeen is vereist voor expressie van het anker-ST construct, dat berust op de T7 promoter en T7 RNA polymerase voor protein expressie. Het gebruik van andere bacteriestammen vereist hetzij de aanwezigheid van de T7 lysogeen gen of het gebruik van een andere dan pET22 7 plasmide. - Verdun gezuiverd plasmide-DNA bij gelijkwaardige molaire concentraties dan transformeren ze in competente bacteriecellen via ofwel heat shock transformatie of elektroporatie volgens het protocol van de fabrikant voor de bevoegde cellen gekozen.
- Plaat getransformeerde cellen op antibioticum-bevattende Luria-Bertani (LB) agarplaten met zowel ampicilline (pET22) en chlooramfenicol (pACYC184); zowel in eindconcentraties van 25 ug / ml.
- Plaats de kweekschaal bij 37 ° C gedurende de nacht alleen klonen die beide plasmiden te isoleren.
OPMERKING: Kolonies die antibiotische selectie overleven worden gebruikt voor alle toekomstige OMV preparaten. Antibiotica (ampicilline en chlooramfenicol) wordt toegevoegd aan alle vloeibare culturen selectieve druk te handhaven en om de aanwezigheid van beide plasmiden.
- Selecteer een E. coli stam die commercieel beschikbaar is voor eiwitexpressie te vergemakkelijken.
3. OMV Production
- Colony Expansion
- Inoculeer 5 ml van de cultuur media (meestal Terrific Broth (TB) of LB) met antibiotica bij de hiervoor genoemde concentraties (stap 2.2.3) met een enkele kolonie uit de in 2.2.4 beschreven selectie platen.
- Voer een 1: 100-voudige verdunning van de nachtelijke starter cultuur in de war gebracht cultuur kolven.
LET OP: Gebruik een volume van media tussen de 250-500 ml. - Handhaaf de kweek bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm opdat voldoende beluchting van de kweek wordt verkregen.
- Inductie van elk plasmide
- Laat de bacteriële kweek te groeien tot een OD600 van 0,6-0,8, ongeveer 3 uur na inoculatie van de groei van de primaire groei kolf.
- Om de uiteindelijke opbrengst van PTE-SC geladen blaasjes te verbeteren, centrifuge de hele cultuur bij 7.000 g gedurende 15 min. Resuspendeer de cel pellet in voorverwarmde, verse kweekmedium.
LET OP: Deze optional stap helpt om eventuele lege OMV, dat aanwezig is in het kweekmedium voorafgaand aan PTE-SC inductie zijn te verwijderen. - Maak een 20% voorraad oplossing van L-arabinose in water en steriel filter met behulp van een 0,22 pm filter. WINKEL L-arabinose oplossing bij 4 ° C gedurende 2-4 weken.
- Voeg de L-arabinose oplossing voor de kweekfles tot een uiteindelijke concentratie 0,2% tot inleiding PTE-SC productie.
LET OP: Dit helpt om de periplasmatische ruimte met PTE-SC preload voorafgaand aan de bevordering van meer blaasjes door middel van inductie van de mutant OmpA-ST. - Voeg een oplossing van 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in water en steriel filter met een 0,22 urn filter.
LET OP: IPTG moet onmiddellijk één keer gebruikt worden gehydrateerd. Hoeveelheden van IPTG kan ingevroren worden opgeslagen voor 3-6 maanden en kan onmiddellijk worden ontdooid voorafgaand aan gebruik. - Voeg IPTG na nog eens 3 uur incubatieperiode tot een eindconcentratie van 0,5 mM tot productie van het OmpA-ST initiëren.
- Laat de cultuur groeien gedurende nog 8-14 uur bij 37 ° C onder schudden.
4. OMV Zuivering
- Verwijdering van Intact Bacteriën
- Centrifugeer de bacteriële kweekmedia gedurende 15 minuten bij 7000 xg bij 4 ° C intacte bacteriën pelleteren.
- Decanteer en opslaan, de media van de bovenkant van de celpellet na centrifugatie daarbij goed op de celpellet niet storen.
- Herhaal stap 4.1.1 en 4.1.2 voor een extra centrifugeren cyclus te zorgen dat alle intact bacteriën uit het kweekmedium en zorg ervoor dat decanteren en opslaan van de media verwijderd.
- Verwijdering van Proteïneaggregaten
- Verder te zuiveren de bacteriële kweekmedia onder toepassing van een 0,45 urn membraanfilter om resterende bacteriën en ongewenst grote celmateriaal te verwijderen.
OPMERKING: Gebruik een biologisch compatibel membraanmateriaal hogere terugwinning en lagere eiwitadsorptie zoals celluloseacetaat (CA) en polyvinylideendifluoride (PVDF). Spuitfilter volumes minder dan 100 ml en vacuüm filter volumes groter dan 100 ml.- Om spuitfilter, trekken kweekmedium in steriele 10-50 ml spuit. Bevestig 0,45 pm filter om Luer einde van de spuit. Druk de zuiger en het verzamelen van doorstroming in een nieuw schip.
- Om filter stofzuigen, transfer kweekmedium een steriele filtratie apparaat. Bevestig de unit om de pomp te stofzuigen of de gootsteen aspirator om zuigkracht te genereren. Transfer gefilterd medium om nieuwe vaartuig.
- Verder te zuiveren de bacteriële kweekmedia onder toepassing van een 0,45 urn membraanfilter om resterende bacteriën en ongewenst grote celmateriaal te verwijderen.
- Isolatie van OMV via Ultracentrifugatie
- Voeg de gefilterde cultuur media in centrifugeren buisjes voorzichtig om tegengestelde buizen in evenwicht te brengen in de centrifuge.
- Pellet op ~ 150.000 xg gedurende 3 uur bij 4 ° C in een ultracentrifuge met de bijbehorende rotor overeenkomende zowel het instrument en pijpen worden gebruikt.
- Schenk de OMV uitgeputte cultuur media uit de OMV pellet, zorg dat u de OMV pellet niet te verstoren, meteen bij de voltooiing of centrifugering zoals OMV waardoor de pellet in de media blijven de pellet verminderen OMV herstel verweken.
LET OP: Deze pellet zal iets bruin en afhankelijk van het basisbedrag van de bacteriecultuur kan wel of niet zichtbaar zijn met het blote oog. Aanzuigen van de direct vanaf de bovenkant van de centrifugebuis is ook een optie in het achterhoofd dat de meer media uit de OMV pellet hoe zuiverder de uiteindelijke OMV monster zijn. - Sla de supernatant gecentrifugeerd voor later dynamische lichtverstrooiing (DLS) testen om te controleren of de OMV deeltjes waren volledig uitgeput van de media.
- Voeg 0,5-1 ml steriel gefiltreerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 of 100 mM N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (CHES) buffer bij pH 8,0 om de OMV pellet waardoor het incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de pellet niet uitdroogt.
OPMERKING: Extreme oplossing ionsterkte, pH en temperatuur kan tot verminderde OMV oplosbaarheid en bevorderen aggreking. - pipet voorzichtig de gezuiverde OMV oplossing uit de centrifugebuis, mengen langzaam aan de gehele pellet werd opgelost waarborgen.
5. OMV karakterisering
- Gebruik een in de handel verkrijgbare DLS of nanodeeltjes tracking software volgende protocollen de verstrekte fabrikant uniek voor elk instrument te bepalen OMV grootteverdeling en deeltjesconcentratie.
LET OP: Hier, OMV grootteverdeling en concentratie werd bepaald met behulp van NanoSight LM10 nanodeeltjes Tracking en NTA 2.3 Analysis-software.- Open de software.
- Schakel de microscoop en reinig alle oppervlakken op de microscoop en nanodeeltjes tracking unit.
- Voeg ~ 0,5 ml van OMV monster rechtstreeks aan het kijkvenster van het deeltje tracking device via de Luer fitting met een 1 ml steriele spuit en zorg ervoor dat het hele kijkvenster dekken zonder het injecteren van enige luchtbellen in het systeem.
- plaats tHij nanodeeltjes volgen eenheid op de microscoop podium en zet de laser.
- Klik op "Capture" in de software.
- Pas de microscoop focus en het podium om de deeltjes te visualiseren op het preview-scherm aanwezig is in de software-venster.
- Pas de "Camera Shutter" en "Camera Gain" tot lichte deeltjes duidelijk worden gevisualiseerd op een donkere achtergrond.
- Pas duur capture tot 60 sec.
- Klik op "Record".
- Wanneer u wordt gevraagd, het invoeren van de temperatuur van het monster / het apparaat, het etiket van de steekproef, en de video-gegevens op te slaan bij de voltooiing van de elke lopen in een gebruiker aangewezen map.
- Houd alle analyse parameters (Detection Threshold, Blur, Min Track lengte, Min Verwacht Particle Size) op automatisch detecteren mode en klik op "Proces Sequence."
OPMERKING: Raadpleeg de handleiding van hoe elke parameter afzonderlijk te fine-tunen analyseresultaten kan worden aangepast. - Neem deeltjesgrootteverdeling en deeltjes / ml concentratie zoals bepaald door de software.
LET OP: Een typische OMV hydrodynamische grootte ligt tussen 30-200 nm met een deeltjes / ml concentratie van ~ 10 x 10 8.
- Het bepalen van OMV eiwitgehalte
- Gebruik standaard SDS-PAGE en Western blot protocollen OMV zuiverheid, de productie van enzymen, en de SC-ST verknoping efficiency 7 te beoordelen.
LET OP: Het verknopen efficiëntie zal niet 100% 7.
- Gebruik standaard SDS-PAGE en Western blot protocollen OMV zuiverheid, de productie van enzymen, en de SC-ST verknoping efficiency 7 te beoordelen.
6. Keuring van Enzyme Packaging
- PTE Activity Assay
- Voer alle enzymatische assays in een geschikte buffer zoals 100 mM CHES-buffer (pH 8) bij 25 ° C in hetzij een cuvette of gemultiplext in een 96/384 putjes.
- Voeg 5 ul van een 1: 1000 verdunning van paraoxon in CHES buffer 90 pl CHES en 5 pl van gezuiverde OMV (~ 36-voudig geconcentreerd in vergelijking met de concentratie OMV aanwezig in het kweekmedium).
Let op: Paraoxon is een giftig bestrijdingsmiddelen moet per fabrikant en institutionele richtlijnen worden behandeld. - Neem absorptieaflezingen met regelmatige tussenpozen (elke 20 seconden voor ~ 2 uur totale reactietijd) en 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) en 348 nm (isosbestic punt ε = 5,4 mM -1 cm -1) aan toezien op de reactie verloop van de chromogene paraoxon afbraakproduct, p-nitrofenol.
LET OP: Bij pH-waarden boven 8 de dominante gedeprotoneerde vorm van p-nitrofenol is aanwezig waardoor voor nauwkeurige monitoring bij 405 nm. In alle andere complexe of lagere pH oplossingen moet de isosbestic punt van 348 nm te gebruiken als meerdere vormen van de p-nitrofenol aanwezig zijn. - Bereken initiële reactiesnelheden door bepaling van de helling van het lineaire gedeelte van de progressiekrommen uit stap 6.1.3 om de relatieve hoeveelheid PTE vergelijken elk monster, verpakkingsefficiëntie en PTE totale productie.
- Voer standaard enzymatischeassay protocollen om te bepalen K M, V max en k kat voor de OMV ingekapselde PTE.
OPMERKING: Lineweaver-Burk analyse kan worden gebruikt voor het bepalen van deze kinetische parameters waarbij de y-as = 1 / Vmax met helling = KM / Vmax 20.
- Transmembraan Substrate / Product Diffusion.
- Voer dezelfde kinetische assay als beschreven in stap 6.1 met gebruikmaking van toenemende concentraties van Triton X-100 in buffer CHES 0-3% vol.
OPMERKING: De toevoeging van Triton X-100 aan het opgeloste OMV functioneert om de lipide bilaag waardoor de inhoud van de OMV vrij toegankelijk zijn voor de reactieoplossing te verstoren. - Bereken en vergelijk de initiële snelheid bij elke Triton X-100 niveau transmembraan passage van het substraat / product aangeduid met minimale veranderingen van de enzymactiviteit (aanvangssnelheden) verifiëren vergelijking enzymactiviteit ianneer Triton X-100. Als een aanzienlijke toename van enzymactiviteit waargenomen in aanwezigheid van Triton X-100 is het waarschijnlijk dat het substraat niet vrij diffunderen in de OMV.
- Assay vrije enzymactiviteit (zoals hierboven beschreven in paragraaf 6.1) in aanwezigheid van Triton X-100 die enzymactiviteit verifiëren wordt niet geremd door de oppervlakteactieve stof zelf.
OPMERKING: Indien de activiteit sterk wordt beïnvloed door Triton X-100, andere toevoegsels, zoals saponinen of diverse polysorbaat / kunnen tween oppervlakteactieve geschikter zijn om de OMV membraan scheuren.
- Voer dezelfde kinetische assay als beschreven in stap 6.1 met gebruikmaking van toenemende concentraties van Triton X-100 in buffer CHES 0-3% vol.
7. OMV Storage
- Invriezen
- Plaats ~ 100 ul fracties van gezuiverde OMV direct in vloeibare stikstof te breken bevriezing van de monsters die zeker niet volledig onderdompelen de flesjes of contact opnemen met een vloeibare stikstof met het monster zelf.
OPMERKING: Gezuiverde OMV kunnen direct snel ingevroren in de buffer die werd geselecteerd voor oplossen van de pellet in de OMV zuiverinion proces zonder aanvullende cryoprotectants 7 nodig. - Bewaar de snap ingevroren monsters bij -80 ° C.
- Ontdooi ingevroren aliquots van stap 7.1.1 door ze bij kamertemperatuur wordt dat de monsters niet te verwarmen.
- Alvorens met alle monsters voor opslag op deze wijze uit te voeren het enzym assay stap 6,1 onze initiële snelheden voor en na het invriezen te verifiëren dat er geen significant verlies van enzymactiviteit na invriezen-ontdooien beschreven.
OPMERKING: WINKEL gezuiverde OMV bij 4 ° C indien een verlaging van de enzymactiviteit waargenomen door vorst.
- Plaats ~ 100 ul fracties van gezuiverde OMV direct in vloeibare stikstof te breken bevriezing van de monsters die zeker niet volledig onderdompelen de flesjes of contact opnemen met een vloeibare stikstof met het monster zelf.
- vriesdrogen
- Lyofiliseren de snap bevroren gezuiverde OMV fracties gebruik te maken van commercieel verkrijgbare vriesdrogen apparatuur 21.
- Opslag gelyofiliseerd fracties bij kamertemperatuur weken bij -80 ° C gedurende enkele maanden.
- Voeg dezelfde hoeveelheid gezuiverd water om het gevriesdroogde OMV als vóór lyofilisatie en laat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot t rehydraterenhij proeven. Meng voorzichtig wanneer dat nodig is dat zeker niet te vortex of ultrasone trillingen de OMV.
- Voeg gevriesdroogd OMV poeder direct naar point-of-care voor toepassingen waarbij voorafgaande verdunning / oplosbaar maken is niet nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gelijktijdige expressie van twee recombinante eiwitten, zoals is vereist voor de OMV verpakkingsstrategie die in dit protocol, kan worden bereikt door een aantal verschillende wegen. Hier werd een twee vectorsysteem gebruikt met compatibele oorsprongen van replicatie en een aparte induceerbare gencassettes. Voor de expressie van de PTE-SC construct commerciële plasmideskelet (pACY184) werd ontworpen om een arabinose induceerbare gencassette en een twin arginine periplasmatische localisatie leader sequentie, gevolgd door een reeks van unieke restrictieplaatsen klonering van het enzym-gen als vergemakkelijken fusie met een C-terminale Sc eiwit. Het plasmide construct dat codeert voor het membraananker buitenste eiwit het commerciële vector pET22 die de lac operon voor de controle van eiwitexpressie en de pelB periplasmatische lokalisatiesequentie gebruikt. De korte ST sequentie werd gekloneerd in de afgeknotte OmpA-eiwit vóór insertion in het expressieplasmide. In beide plasmiden werd het C-eindstandige hexahistidine sequentie behouden om voor gelijktijdige identificatie van de fusie-eiwitten OMV monsters. Constructie en karakterisatie van deze genconstructen, dat zowel de N- en C-eindstandige ST fusie constructen OmpA, worden volledig beschreven in Alves et al. 7. De genconstructen hierin beschreven niet bevorderlijk voor de verpakking van enzymen. In sommige gevallen kan het noodzakelijk zijn de periplasmatische lokalisatiesignaal, de regulerende elementen, of epitooplabels veranderen. Bovendien kunnen sommige eiwitten prohibitief grote en krijgt de binnenmembraan geheel dwars zijn. Enzymatische activiteit en OMV verpakkingsefficiëntie niet bepaald a priori en moet empirisch worden bepaald voor elke doeleiwit.
Hieronder staan de resultaten die men doorgaans zou verwachten na het succesvol uitvoeren out dit protocol. Inbegrepen is een schema van de twee ST / SC split eiwitdomeinen, OmpA-ST en PTE-SC fusieconstructen en een voorbeeld van isopeptide formatie op de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende inkapseling PTE-SC in een OMV (figuur 1) . Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten van het gezuiverde OMV morfologie via SEM en grootteverdeling en absolute concentratie OMV bepaald via particle tracking software (figuur 2). Verdere karakterisering van de OMV eiwitten en recombinante eiwitexpressie worden gezien via SDS-PAGE en Western blot (Figuur 3). Molecuulgewichten voor eiwitten van belang specifiek voor het protocol hier zijn als volgt: natief OmpA (37,2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Gezuiverde OMV moet een donkere band bij ongeveer 37 kDa dat indicatief is voor de zeer overvloedige natieve OmpA hebben. Afhankelijk van de gel resolutie kunnen er meerdere baNDS aanwezig in dit gebied van de gel als OmpA, OmpF en OmpC zijn relatief overvloedig en delen dezelfde molecuulgewicht. Een extra band die 2,2 kDa groter dan OmpA-ST kan ook worden waargenomen als gevolg van verkeerde klieving van de leader-sequentie als gevolg van overweldigend de E. coli expressie machines. Het is belangrijk op te merken dat een succesvol gezuiverde OMV monster niet veel andere sterk tot expressie gebrachte eiwitten hebben. Als er andere bands aanwezig zijn was ofwel de zuivering ten onrechte worden uitgevoerd of de bacteriestam wordt gebruikt kan worden het verpakken van andere eiwitten die niet in deze E. coli BL21 (DE3) stam waargenomen.
Bovendien zijn activiteit assays en vesicles scheuren experimenten voorzien om representatieve resultaten die zouden worden verwacht als de enzymatische substraat vrij de OMV kan binnenkomen via porin transmembraan eiwitten (Figuur 4) laten zien. Paraoxon relatief vrij komt in deOMV met endogene porine transmembraan proteïnen reageren met de verpakte PTE en het reactieproduct, p-nitrofenol, gaat ook relatief vrij door de OMV membraan. Dit fenomeen zal niet alomtegenwoordig onder alle product, substraat en enzym sets zijn en moet proefondervindelijk worden bepaald. Hoewel succesvolle OMV scheuren en enzymafgifte is waargenomen bij lage concentraties van wasmiddel en PTE (hierin Triton X-100) kunnen dergelijke toevoegingen de activiteit van andere enzymen beïnvloeden.
Plasmidekaarten zijn ook opgenomen aan het ontwerp van een twee plasmide verpakkingsstrategie gebruikmaking van de SC / ST (zie figuur 5) te tonen.
Figuur 1: Gerichte verpakking van eiwitten in OMV. Kristalstructuren van de eiwitten toegepast in de beschreven verpakking OMV strategy: OmpA, PTE, SpyTag (ST) en SpyCatcher (SC); VOB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, respectievelijk. Een schematische weergave van de OmpA-ST en PTE-SC fusieconstructen die een isopeptidebinding op de buitenmembraan van de bacteriën is weergegeven. Dit membraanfusie drijft incorporatie van de PTE binnen de vorming van OMV. Figuur weergegeven (aangepast) vanaf Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: OMV karakterisering. (A) SEM van ultracentrifuge gezuiverd OMV uit inheemse E. coli [BL21 (DE3)]. (B) Representatieve deeltje trac king size uitkeringen en (C) totaal blaasje concentratie gemiddeld over 90 sec monster leest voor Native OMV, PTE-SC in de afwezigheid van arabinose activering (PTE-No A), PTE-SC in de aanwezigheid van arabinose activering (PTE-A) N-terminale OmpA-ST co-getransformeerd met PTE-SC in aanwezigheid van arabinose en IPTG activatie (PTE / OMV-N) en de ultracentrifuge supernatant (UC supernatant). Een significante toename van OMV productie werd waargenomen in de PTE / OMV-N monster vergeleken met de natieve OMV en PTE-SC constructen alleen. OMV werden gekwantificeerd in de UC supernatant om een vrijwel volledig herstel van OMV in de UC pellet waardoor er weinig tot geen OMV in de bovenstaande bericht ultracentrifugatie demonstreren. Alle gegevens vertegenwoordigen gemiddelde (± SD) van drievoudige experimenten. Figuur weergegeven (aangepast) vanaf Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gezuiverd OMV eiwitgehalte vastberadenheid. (A) SDS-PAGE van het gezuiverde OMV UC pellet van de C-terminale OmpA-ST fusie tezamen tot expressie gebracht met PTE-SC (PTE / OMV) construct tonen representatieve overvloed OmpA-ST, inheemse OmpA, PTE-SC en OmpA- ST / PTE-SC isopeptide fusie. (B) Western blot analyse met behulp van de meegeleverde his-tag aanwezig in de OmpA en PTE construeert om visualisatie via een anti-6xhis antilichaam te vergemakkelijken. Het is belangrijk op te merken dat PTE bekend is dimeriseren, die aangegeven is op de blot door de aanwezigheid van grotere molecuulgewicht zijn gemerkte species. Ook al zijn er zeer hoge OmpA-ST expressie niveaus waargenomen is er geen volledige omzetting van gratisPTE-SC naar membraangebonden OmpA-ST / PTE-SC. Desondanks, de verhoging van de totale productie PTE en verbeterde verpakkingsefficiëntie suggereren dat terwijl covalente binding is niet overal de niet-covalente associatie van de ST en SC-domeinen is een belangrijke factor bij de gerichte verpakking in de OMV. Figuur weergegeven (aangepast) vanaf Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PTE activiteit en verpakking karakterisering. (A) Totale PTE expressie niveaus en OMV verpakking efficiency bepaald via beginsnelheid metingen met behulp van paraoxon als chromogeen substraat vergelijken PTE in de celpellets de UC supernatant en het gezuiverde OMV UC pellets. (B) Representatieve gegevens die het gebruik van Triton X-100 (0,5% T100) aan de OMV bilaag waardoor ongehinderde toegang van het substraat tot de OMV interieur verstoren. Vergelijking van deze gegevens aan testen uitgevoerd in afwezigheid van T100 maakt verificatie van translocatie substraat door de intacte OMV dubbellagen als enzymatische initiële snelheden ongewijzigd. Bij paraoxon was er weinig verschil waargenomen activiteit in aanwezigheid of afwezigheid van T100 aangeeft dat paraoxon loopt vrij door de poriën van de endogene OMV. (C) PTE-SC kinetische gegevens aanpassen aan standaard Michaelis-Menten enzymkinetiek vergelijking voor PTE / OMV-N en PTE-A. (D) A Lineweaver-Burk analyse voor het bepalen KM en kcat / KM (48, 4,4 x 10 7, 44 uM, 4,9 x10 7 sec -1 M-1 respectievelijk) tonen soortgelijke PTE literatuur kinetische parameters natieve enzym (90 uM, 2,7 x 10 7 sec -1 M -1) met R 2 ≥ 0,999 in alle gevallen. Alle gegevens vertegenwoordigen gemiddelde (± SD) van drievoudige experimenten. Figuur weergegeven (aangepast) vanaf Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve plasmideconstructen het voorbeeldsysteem beschreven. SpyCatcher gemodificeerd enzym-SC (PTE-SC) plasmide gericht voor inkapseling binnen de OMV (links). SpyTag modifIED membraananker-ST (OmpA-ST-N) plasmide (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocolfuncties een representatieve tonen gerichte verpakkingstechniek waarbij een enzym van interesse wordt geproduceerd en in OMV verpakt door E. coli. Zoals met vele complexe technieken er meerdere gebieden waarop het protocol kan worden aangepast om geschikt voor gebruik in verschillende unieke toepassingen, waarvan sommige hieronder. Hoewel het mechanisme van OMV verpakking en enzym inkapseling kan worden aangepast aan de specifieke behoeften er verschillende stappen in dit protocol dat cruciaal voor het succes zijn. De initiële verwijdering van intacte bacteriën en celresten is van groot belang en raakt alle stroomafwaartse pogingen tot kwantificering en monsteranalyse. Twee opeenvolgende centrifugatie stappen gevolgd door filtratie typisch voldoende om deze verontreinigingen te verwijderen. In alle gevallen voorzichtigheid geboden wanneer decanteren oplossing na centrifugatie om de overdracht van verontreinigingen te minimaliseren. Ook de laatste OMV pellet obtained na ultracentrifugatie vaak slechts losjes gehecht aan de bodem van de centrifugebuis. In de laatste fase, is voorzichtigheid geboden bij het verwijderen van het verbruikte kweekmedium zodat de pellet ongestoord blijft onderin het vat. In sommige geval kan het best zijn om het uiteindelijke kweekmedium te behouden tot na de analyse van het monster met behulp van DLS of nanodeeltjes tracking-apparaat naar de OMV pellet werd niet verloren in de laatste stappen van het protocol te waarborgen. Hieronder zijn een aantal extra problemen die kunnen ontstaan bij zowel dit protocol en anderen die zijn toegesneden op de specifieke behoeften van de onderzoekers.
Het gebruik van PTE in dit systeem zorgt voor een uitstekend model enzym inkapseling voor de milieusanering van organofosfaat besmette regio's met PTE zijn gemakkelijk te vervangen door een plaatsvervanger enzym of eiwit van belang. Zoals hier beschreven, de co-expressie van PTE-SC met OmpA-ST resulteerde in een grote toename van de totale PTE expressiop alsmede hogere blaasje productieniveaus meer PTE wordt verpakt binnen de blaasjes in vergelijking met PTE en PTE-SC alleen uitgedrukt. Door het aantal interacties tussen het buitenste membraan en peptidoglycan via de C-terminale deletie van OmpA hyper-blaasjes wordt bereikt. Dit biedt een eenvoudige route voor de bacteriën om de recombinante PTE die de toxische effecten die vaak in de overexpressie van uitheemse proteïnen waargenomen vermindert exporteren.
Hoewel PTE gemakkelijk kan worden vervangen in het modelsysteem is belangrijk op te merken dat niet alle enzymsubstraten vrij door de OMV bilaag passeert en dat het derhalve noodzakelijk dat elke unieke enzym en substraat paar testen van geval tot geval. Zelfs als een substraat niet door het membraan passeren deze techniek nog steeds kan worden gebruikt voor het produceren en verpakken een enzym in OMV en de toevoeging van Triton X-100, of geschikte alternatieve surfactant, worden toegevoegd in voldoende levels de vesicles voor gebruik scheuren.
Aangezien recombinante eiwitexpressie en verpakking kan dit protocol ook dienen als een basismethode voor OMV productie en zuivering van diverse bacteriële soorten. Alternatieve werkwijzen voor zuivering OMV, zoals dichtheidsgradiënt fractionering 22, membraanfiltratie 23 en ultrafiltratie 24, ook bestaan en kunnen meer geschikte technieken afhankelijk van de beoogde toepassing. Deze alternatieve zuiveringstechnieken kan gemakkelijk worden aangevuld in dit protocol in plaats van de ultracentrifugatie pelleteren van de OMV voor de gerichte verpakken van een eiwit in een OMV door het gebruik van een biorthogonale synthetische binding.
Andere modificaties kunnen worden aangebracht in de specifieke synthetische stangenstelsel gebruikt in dit protocol en de geselecteerde membraan tethering eiwit. Er zijn verschillende synthetische strategieën voor het koppelen van twee verschillende eiwittens binnen een biologisch systeem, waaronder: split-eiwitten 25, ook indien opgerold spoelen 26 en split inteins 27, om maar een paar te noemen. Andere gebonden membraan of transmembraan eiwitten zoals OmpF en OmpC zou waarschijnlijk zorgen voor geschikte ST modificatie sites en 28. In sommige gevallen kan het ook noodzakelijk zijn de ST en SC domeinen plaatsen van de SC op de verankering eiwit en de veel kleinere ST uitruilen het recombinante enzym / eiwit. Er zijn ook een aantal verschillende kloneringsstrategieën die hier kan worden toegepast, met inbegrip van het gebruik van meerdere plasmiden in dezelfde of verschillend inductiesystemen, een plasmide met meerdere eiwitten die gecodeerd worden, of zelfs gebruik homologe recombinatie technieken alle opgenomen of delen van de expressie systeem in het bacteriële genoom.
De micro-omgeving van de OMV helpt de verpakte enzym stabiliseren reducerende enzymatische inactivatie die gewoonlijk optreedt onder minder dan ideale storage voorwaarden, vries-dooi en vriesdrogen 29. Verwacht wordt ook dat de OMV sterk verbeterde weerstand tegen proteolytische splitsing zal verschaffen de OMV bilaag fungeert als een fysieke barrière tussen het actieve enzym en het in de extra-OMV ruimte eiwitten. Dit protocol kan verder worden uitgebreid met een aan de buitenkant gelegen klein molecuul, peptide, eiwit of label bevatten om doelgerichte aflevering van OMV ingekapselde eiwitten en affiniteitszuivering te faciliteren. Terwijl PTE werd geselecteerd voor deze unieke toepassing van de resultaten van deze studie, en de inhoud van dit protocol kan gemakkelijk worden gebruikt om analoge eiwitten verpakkingen strategieën voor het ontwerpen in diverse farmaceutische levering, medische diagnostiek, en herstel van het milieu-toepassingen 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
