Abstract
dış membran veziküller (OMV) programlamak için sentetik biyoloji teknikleri uygulayarak giderek artan ilgi, geleneksel nanopartiküller sentezlemek için çok zor kanıtlamaktadır OMV'ye için bazı çok ilginç ve benzersiz uygulamalara yol açmaktadır. Bugüne kadar, bütün Gram negatif bakterilerin küçük moleküller, peptitler, proteinler ve genetik malzemesi içeren kargo çeşitli OMV Gösteren ambalaj üretmek için gösterilmiştir. onların çeşitli yük göre OMV hücre-hücre iletişim gen transferi ve bakteri OMV üretiminde hangi bağlı olarak hastalık oluşturma faktörlerinin teslimat kadar birçok biyolojik süreçlere de karışırlar. Sadece son zamanlarda bakteriyel OMV kontrol etmek ve OMV içine rekombinant proteinlerin doğrudan ambalaj tekniklerinin geliştirilmesi yoluyla geniş bir uygulama yelpazesinde kullanım için erişilebilir hale gelmiştir. overa geliştirilmiş Bu protokol, üretimi, saflaştırılması için bir yöntem, ve enzim paketlenmiş OMV kullanımını temin tarifrekombinant enzim, artan vezikülasyon ve gelişmiş enzim stabilitesi ll üretimi. Bu protokolün başarılı kullanımı aynı zamanda, bir rekombinant protein üretimi ve yeniden birleştirici protein ve bir dış membran ankraj protein arasında sentetik bağlantı oluşturma yoluyla OMV kapsüllenmesi için yönlendiren bir bakteri suşunun oluşturulmasıyla sonuçlanır. ilaç ilaç dağıtım, tıbbi teşhis ve çevresel iyileştirme: Bu protokol ayrıca gibi diğer benzersiz uygulamalar için kullanılmak üzere bu protokolü adapte göz önünde bulundurulması gereken bakteri kültürlerinin yanı sıra uygun işleme teknikleri ve şeyler OMV izole etmek için yöntemler göstermektedir.
Introduction
Enzim yüklü bakteriyel dış membran veziküllerinin (OMV) tasarımı, üretim ve saflaştırma için bir yöntem olup burada sunulmuştur. OMV, 30-200 nm 1,2 büyüklükleri değişen proteoliposomes öncelikle tek katmanlı, küçük. Bugüne kadar incelenen tüm gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriler, yüzey 3,4 OMV veya hücre dışı vesiküller (EV), ya serbest göstermiştir. OMV üretildiği kesin mekanizma henüz tam olarak nedeni onları yanı sıra hizmet ettikleri farklı işlevleri salgılayan çeşitli bakteri nüfusa açıklanacaktır zorunda. OMV kompleksi arası iletimde, gen translokasyon çeşitli hizmet genetik malzemenin küçük moleküller, peptitler ve proteinler yükün geniş taşıma gösterilmiştir ve hastalık oluşturma 5,6 çalışır.
OMV biogenez kesin mekanizmaları iyi karakterize ve bakteriyel türler arasında farklılık göstermedi değildir. thi rağmens aslında, ilgi bir protein ve bakteriyel dış zar için son derece fazla protein endojen ve daha sonra OMV ile sentetik bir bağ oluşturarak OMV bir rekombinant proteinin ambalaj etkinliğinin arttırılması için bir yöntem geliştirdik. Sentetik bağlantı ya da yapay olarak dahil afinitesi yokluğunda, rekombinant şekilde sentezlenmiş protein ile OMV arasında gözlenen paketleme verimliliği 7 çok düşüktür. Bu sonuç, iyi anlaşılmış değildir mekanizmalar yoluyla bakteriyel yüzeye ya da yönlendirilmiş paketleme ile OMV formasyonunun kesin bir anda rastgele olasılık kapsülleme yoluyla gerçekleşir OMV içindeki proteinler dahil edilmesi gibi beklenebilir. inci kıyasla yüksek verimde ambalaj bazı proteinleri ile bağlı protein yüksek bir başarı rastgele olasılık kapsülleme ama etkili paket dayanır periplazmik boşluk içinde ekspresyonu üzerinde, sadece yoluyla proteinlerin paketleme gözlenmiştir olduğutüm 8-10'da paket yok. Ortak sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biz Escherichia coli (E.coli) aynı anda üretmek, paket ve kargo için bakteriler tarafından seçilir nasıl OMV oluşturulur ve nasıl ilgili güncel bilgi sınırlamaları ortadan OMV içine ilgi aktif bir enzim salgılaması için mühendis çalıştı ambalaj.
tercih edilen, sentetik bağlantı OMV içine yönsel ve paketlemeyi kolaylaştırmak için, bu başvurunun amaçları için, bir bölme proteini bioconjugation sistemi seçildi. Adından da anlaşılacağı gibi bölünmüş bir protein bioconjugation sistemi birbirleriyle etkileşim iki tamamlayıcı alt birim etki oluşur. Bu protokolün amacıyla seçilen bölünmüş protein domainleri Streptococcus pyogenes fibronektin bağlama proteini (FbaB) 11 elde edilir SpyCatcher (SC) SpyTag (ST) etki gibi ifade edilir. Bu bölme, protein sisteminin bu w sıradışıTavuk, iki alt birimi yakınlık içinde isopeptide bağ spontan bir kovalent bağ oluşturma asit ve lizin amino asit kalıntıları, aspartik proksimal arasında oluşturur. Isopeptide bağı oluşumu şaperon protein, katalitik enzimlerin veya kofaktörlerin eklenmesini gerektirmez ve kolayca, oda sıcaklığında (RT) ve fizyolojik olarak ilgili koşullar, 12, geniş bir aralıkta meydana gelebilir.
Kavramının bir kanıtı olarak, Brevundimonas diminuta gelen phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) OMV 13 türetilmiş E. coli 'içine paketlenmiş seçildi. PTE binükleer Zn / Zn etkin bir yeri içerir ve Dialkilfosfatlar ve aril alkolleri 14'e aryldialkylphosphates dönüştürme bir hidroliz reaksiyonu ile organofosfatlar ayrıştırma kabiliyeti yer alır. Organofosfatlar maruz kalma nöromüsküler kavşak makin de asetilkolinesteraz tarafından asetilkolin hidrolizini inhibe yoluyla uygun nörotransmitter fonksiyonu bozar15 derece tehlikeli g organofosfat türetilmiş bileşikler. Uzun süreli veya Organofosfatlar önemli maruziyet sık kontrol edilemeyen kasılmalar oluşur ve genellikle boğulma yoluyla ölüme neden olur. PTE paraokson doğru yüksek bir katalitik aktivite sergiler ise, çok güçlü bir insektisit, aynı zamanda diğer ilaç ve V / G tip kimyasal sinir ajanları 16 geniş bir hidrolize yeteneğine sahiptir. OMV ve paketlemeyi kolaylaştırmak için bir bakteriyel plazmid indüklenebilir bir promotör, bir periplazmik lokalizasyon sekansını ve SK gen dizisinin üst akışında bir kısa çoklu klonlama yerini içeren bir gen yapısı kodlayan tasarlanmıştır. OMV ambalaj periplazmik bölgeye PTE-SC füzyon proteinini hedefleyen genetik anahtarın oluşturulması için izin lideri ve SC sekansı arasındaki PTE geninin yerleştirilmesi. Burada tarif edilen çalışmalar PTE odaklanırken, enzim gen değiştirilebilir ve hali hazırda Fakültesi için diğer bir gen sekansı ile değiştirilebilirAlternatif bir enzim veya protein ilitate ambalaj.
Sentetik bağlantı ikinci bir parçası olarak bir çok dış zar proteini (OmpA) Abone terminali peptid dizisi sunmak tercih edilir. değişebilir bağlantı proteininin tercih protein, periplazmik boşluk içinde sunulur permisif alan adına sahip sitotoksisite neden olmadan bir füzyon yapısı tolere esastır iken rekombinant olduğunda, OMV mevcut olduğu bilinmektedir, ve toplam etmez üretilmiş. OmpA yüksek bakteriyel dış zar ve daha sonra OMV 17'de ifade edildiği bilinen bir 37.2 kDa transmembran Porin proteinidir. Küçük moleküllerin taşınması karıştığı, bakteri membranı 18 arasında, boyutu 2 nm <. Ana OmpA iki yapısal benzersiz etki, bir transmembran p varil motif ve peptidoglikan 19 ile etkileşim için bilinen periplasmically çözünebilir bir C-terminal bölümüne sahiptir. Mutant OmpA-ST füzyon designe olarakBuradaki D ompA C-terminal kısmı silinmiştir ve ST periplasmically bakan N- ya da C-ucu ile kaynaştırılır. OMPA periplazmik bölümünü silme dış membran ve hiper-vezikülasyon 7 giden membran istikrarsızlaştırma sonuçlanan peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısını azaltır. Genomik OmpA Brüt membran destabilizasyonuna azaltmak için, rekombinant şekilde eksprese OmpA-ST yapısına ek olarak muhafaza edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plazmidler hazırlanması 1.
- Bir (çapa-ST olarak bu protokolde anılacaktır) çiftdikgen bağlantı etki kaynaşmış plazmid (örneğin, pET22) çapa protein içeren (OmpA), epitop etiketi (örneğin saflaştırma ve tanımlama için 6xHis, myc veya BAYRAK etiketleri gibi) hazırlayın periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve seçilen bakteri suşunun 7 göre çoğaltma uygun kökeni.
- Üreticinin protokolü takip edilerek, bir ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin.
- Bir plasmid (ör pACYC184) (enzim-SC olarak protokolde adlandırılır) (PTE) bağlantı proteininin tamamlayıcı bioorthogonal bağlantı alanına birleştirilen OMV içinde paketlenmiş enzim / protein ihtiva eden hazırlama, epitop etiketi bağlantı proteini plazmid farklıdır periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve uygun origçoğaltma seçilen bakteri suşu 7 dayalı.
- Üreticinin protokolü 7 izlenerek ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin.
Bir OMV Ambalaj E.coli Kültür 2. Nesil
- Plazmid izolasyonu
- Enzim-SC oluşturmak ve bağlantı ST üreticinin protokolü 7'deki gibi ticari bir plazmid izolasyon kiti kullanılarak ayrı bakım hücre çizgilerinden oluşturur kodlayan plazmidler saflaştınlır. 260 nm ve 280 nm 'de absorbans ölçülerek DNA konsantrasyonu ve saflık belirler.
- Ko-transformasyon
- Protein ifadesi kolaylaştırılmış ticari olarak temin edilebilen bir E. coli suşu seçin.
Not: BL21 (DE3) hücreleri burada kullanılmıştır. T7 lizojenin prot için T7 destekleyici ve T7 RNA polimeraz dayanır çapa ST yapının ekspresyonu için gerekli olanein ifadesi. Diğer bakteri suşlarının kullanımı T7 lizojenin geninin varlığını ya pET22 7 dışında bir plazmidin kullanılması istenmektedir. - daha sonra seçilen hücreler için imalatçının protokolü izlenerek ısı şoku transformasyonu ya da elektroporasyon ya ile kompetan bakteriyel hücreler içine transforme eş molar konsantrasyonlara saflaştırılmış plazmid DNA ile seyreltilir.
- , Üzerine antibiyotik içeren iki ampisilin (pET22) ve kloramfenikol (pACYC184) ile agar plakaları Luria-Bertani (LB) Levha dönüştürülmüş hücreler her ikisi de 25 ug / ml nihai konsantrasyonlarda mevcut.
- Her iki plazmit ihtiva eden tek klonları izole etmek için gece boyunca 37 ° C 'de kültür tabağına yerleştirin.
NOT: Antibiyotik seçimi hayatta koloniler gelecekteki tüm OMV hazırlıkları için kullanılacaktır. Antibiyotikler (ampisilin ve kloramfenikol) selektif basıncı korumak ve her iki plazmidlerin varlığını sağlamak için tüm sıvı kültürlere ilave edilecektir.
- Protein ifadesi kolaylaştırılmış ticari olarak temin edilebilen bir E. coli suşu seçin.
3. OMV Üretimi
- koloni Genişleme
- 2.2.4 anlatılan seçme plakaları tek bir koloni ile yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda antibiyotik içeren bir kültür ortamı (tipik olarak Terrific Broth (TB) ve LB) (aşama 2.2.3) 5 ml inoküle.
- şaşkın kültürü şişeler içine bir gecede starter kültür 100 kat seyreltme: 1 gerçekleştirin.
NOT: 250-500 ml arasında medya hacmi kullanın. - kültür yeterli havalandırma elde sağlamak için 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de kültür muhafaza edin.
- Her plazma indüksiyonu
- Bakteri kültürü birincil büyüme balonun aşılamadan sonra, bir OD 0.6-0.8 arasında 600 büyüme yaklaşık 3 saat büyümeye olanak sağlar.
- PTE-SC yüklü veziküllerin son verimini artırmak için, 15 dakika boyunca 7.000 xg'de tüm kültür santrifüj. önceden ısıtılmış taze kültür ortamı hücre pelletini.
NOT: Bu optuğratarak aşama PTE-SC indüksiyonu öncesinde kültür ortamı içinde mevcut olan herhangi bir boş OMV giderilmesine yardımcı olur. - 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre L-arabinoz% 20 stok solüsyonu olun. 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın, L-arabinoz çözeltisi.
- PTE-SC üretiminin başlatılması için bir son% 0.2 konsantrasyonuna kültür şişesine, L-arabinoz solüsyonu ekleyin.
NOT: Bu önceki mutant OmpA-ST indüksiyon yoluyla artan vezikülasyon teşvik PTE-SC ile periplazmik boşluk önceden yüklemek için yardımcı olur. - 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre içinde 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözeltisi olun.
Not: IPTG kez hemen kullanılmıştır hidrate olması gerekir. IPTG alikotları 3-6 ay donmuş olarak saklanabilir ve kullanımdan önce, hemen çözülmüş olabilir. - OmpA-ST üretimini başlatmak için 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar ilave 3 saat inkübasyon döneminden sonra IPTG ekleyin.
- cul izinçalkalayarak 37 ° C 'de ilave bir 8-14 saat boyunca büyümeye Ture.
4. OMV Arıtma
- Bozulmamış Bakterilerin uzaklaştırılması
- sağlam bakteri pelet 4 ° C'de 7,000 x g'de 15 dakika süre ile bakteriyel kültür ortamı santrifüjleyin.
- Hücre pelet rahatsız değil Durusu ve dikkatli olmak hücre topağı sonrası santrifüj üst kapalı, medya kaydedin.
- bir ek santrifüj döngüsü tüm bozulmamış bakteri süzün ve medyayı kaydetmek için emin olmak kültür ortamından kaldırılır sağlamak için tekrarlayın 4.1.1 ve 4.1.2 adımları.
- Protein Agregaların çıkarılması
- Bundan başka kalıntı bakteri ve kötü büyük hücre malzemenin çıkarılması için 0.45 um zar filtre kullanılarak bakteriyel kültür ortamı saflaştırılması.
Not: (örneğin, selüloz asetat (CA) veya poliviniliden diflorür daha yüksek geri kazanımlar ve düşük protein adsorpsiyonu için biyolojik açıdan uyumlu bir membran malzemesi kullanmaPVDF). 100 ml ve 100 ml daha fazla vakum filtre hacimleri daha az şırınga filtresi birimleri.- şırınga filtresi için steril 10-50 ml şırınganın içine kültür ortamı çizin. şırınga Luer sonuna kadar 0.45 mikron filtre takın. pistonu basınız ve akış yoluyla yeni bir kap içinde toplamak.
- Filtreyi vakum steril filtrasyon aparatına kültür ortamı aktarmak için. Pompayı vakum veya emme oluşturmak için aspiratör batmaya birimi takın. Yeni geminin filtrelenmiş orta aktarın.
- Bundan başka kalıntı bakteri ve kötü büyük hücre malzemenin çıkarılması için 0.45 um zar filtre kullanılarak bakteriyel kültür ortamı saflaştırılması.
- Ultrasantrifügasyon üzerinden OMV İzolasyonu
- santrifüj karşıt tüpleri dengelemek için dikkatli olmak santrifüj tüplerine süzülmüş kültür ortamı ekleyin.
- alet ve tüpler her iki eşleştirme mukabil rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C sıcaklıkta 3 saat ~ 150.000 x g'de topak kullanılmaktadır.
- hemen tamamlama o da OMV pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, OMV pelet OMV tükenmiş kültür ortamı DurusuOMV kurtarma azaltarak pelet yumuşatır medyada kalmasını OMV pelet izin olarak f santrifüj.
NOT: Bu pelet hafif kahverengi bakteri kültürü başlangıç miktarına bağlı olarak ya da gözü tarafından görülemeyen olabilir olacaktır. santrifüj tüpünün üst doğrudan medya aspire da OMV kaldırıldı fazla medya son OMV örnek olacak daha saf pelet akılda tutmak bir seçenektir. - OMV parçacıklar tamamen medyadan tükenmiş olduğunu doğrulamak için, daha sonra dinamik ışık saçılımı (DLS) test için santrifüj süpernatant kaydedin.
- Ekle, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin OMV topak, pH 8.0, steril filtre edildi fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ve 100 mM N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES), tampon 0.5-1 mi. pelet kuru değil emin olun.
NOT: Çözelti iyonik kuvvet, pH ve sıcaklığın aşırı düşük OMV çözünürlük neden olabilir ve Birikmesi arttırabilirNavigasyon. - Dikkatle çözünür hale olmuştur tüm pelet sağlamak için hafifçe karıştırarak, santrifüj tüpüne saflaştırılmış OMV çözümünü pipetlemeyin.
5. OMV Karakterizasyonu
- OMV boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu belirlemek için her enstrümanın özgü sağlanan üreticinin protokolleri takip piyasada mevcut DLS veya nanopartikül izleme yazılımı kullanın.
NOT: Burada, OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon NanoSight LM10 Nanopartikül İzleme ve NTA 2.3 Analiz yazılımı kullanılarak tespit edildi.- yazılımını açın.
- mikroskop açın ve mikroskop ve nanoparçacık izleme ünitesi üzerindeki tüm yüzeyleri temizleyin.
- ~ Bir hava enjekte olmadan tüm görüntüleme penceresi kapak emin olarak 1 ml steril bir şırınga ile montaj Luer aracılığıyla parçacık izleme cihazının bakma penceresi ile doğrudan OMV numune 0.5 mi sisteme kabarcıklar ekleyin.
- Yeri to mikroskop sahnede birimi, izleme ve lazeri açın nanoparçacık.
- Yazılımda "yakalama" tıklayın.
- mikroskop odağı ayarlayın ve yazılım penceresindeki önizleme ekranı şimdiki parçacıkları görselleştirmek için sahne.
- parlak parçacıklar açıkça karanlık bir arka plan görsel kadar "Kamera Shutter" ve "Kamera Gain" ayarlayın.
- 60 sn yakalama süresini ayarlayın.
- "Kaydet" i tıklayın.
- , Giriş numune / cihaz sıcaklığı istendiğinde, örnek etiket ve bir kullanıcı belirlenen klasöre çalıştırmak her tamamlanmasından video verileri kaydetmek.
- (Algılama Eşiği, Blur, Min Parça Uzunluğu Min Beklenen Partikül Boyutu) oto modunu algılamak ve tıklayın tüm analiz parametrelerini tutmak "Süreç Sırası."
NOT: Her bir parametre ince ayar analiz sonuçlarına bağımsız olarak ayarlanabilir nasıl kılavuzuna başvurun. - Telaffuz parçacık boyutu dağılımı ve parçacık / myazılım tarafından tespit edildiği üzere l konsantrasyonu.
Not: Tipik bir OMV hidrodinamik boyutu aralığı ~ 10 x 10 8 bir parçacık / ml konsantrasyonu ile 30-200 nm arasındadır.
- OMV Protein İçeriği belirlenmesi
- OMV saflık, enzim üretimi, ve SK-ST çapraz bağlama verimliliği 7 değerlendirmek için standart SDS-PAGE ve Batı benek protokolleri kullanarak.
Not: çapraz bağlama verimliliği% 100 7 olmayacaktır.
- OMV saflık, enzim üretimi, ve SK-ST çapraz bağlama verimliliği 7 değerlendirmek için standart SDS-PAGE ve Batı benek protokolleri kullanarak.
Enzim Ambalaj 6. Doğrulama
- PTE Aktivite Deneyi
- ya da bir küvet içinde, 25 ° C'de, uygun bir tampon maddesi, örneğin 100 mM CHES tamponu (pH 8) 'de, tüm enzimatik testleri gerçekleştirmek veya 96/384 oyuklu bir plaka içerisinde multiplekslenmektedir.
- 1 5 ul ekleyin: Ches 90 ul ve saflaştırılmış OMV 5 ul CHES tamponunda paraoksonun 1000 seyreltme (~ 36 kat kültür ortamında bulunan OMV konsantrasyonuna göre konsantre).
Dikkat: Paraokson bir toksik pestisit olduğunuve üretici ve kurumsal kurallarımıza göre ele alınması gerekir. - 405 nm'de düzenli aralıklarla absorbans okumaları (~ 2 saat, toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 sn) alın (ε = 18.1 mM -1 cm-1) ve 348 nm (isosbestic nokta s = 5.4 mM -1 cm-1) en kromojenik paraokson arıza ürün, p-nitrofenolu reaksiyon ilerlemesini izlemek.
Not: pH değeri 8 den P-nitrofenolu baskın protonu giderilmiş formu 405 nm'de doğru izlenmesi için izin mevcuttur. Tüm diğer karmaşık ya da daha düşük pH değerli solüsyonlarda p-nitrofenolu birden formları, mevcut olacak şekilde 348 nm isosbestic noktasını kullanmak gerekmektedir. - Her bir örnek, paket verimliliği, toplam PTE üretiminde PTE nispi miktarı karşılaştırma aşamasında 6.1.3 İlerleme eğrileri doğrusal kısmının eğimi belirleyerek başlangıç reaksiyon hızları hesaplanır.
- Standart enzimatik gerçekleştirinTahlil protokolleri K M, V max belirlemek ve OMV k kedi PTE kapsüllü.
NOT: Lineweaver-Burk analizi bu kinetik parametrelerin belirlenmesi için kullanılabilir nerede y kesişim = 1 / V maks ve eğim = K M / V max 20.
- Transmembran Yüzey / Ürün Difüzyon.
- hacimce Aşama 0-3 ile% CHES tamponu, Triton X-100'ün artan konsantrasyonları kullanılarak 6.1 de tarif edildiği gibi aynı kinetik deney analizi yapın.
Not: çözündürülmüş OMV fonksiyonlarına Triton X-100 eklenmesi OMV içeriği, reaksiyon çözeltisine serbestçe erişilebilir olduğu için izin lipid çift bozabilir. - Hesaplamak ve aktivitesi enzim göre enzim aktivitesinde çok az bir değişiklik (başlangıç hızı) ile gösterilen alt-tabaka / ürün transmembran geçişini kontrol etmek için her bir Triton X-100 seviyesinde İlk hızlar, karşılaştırmaN Triton X-100 bulunmaması. enzim aktivitesinde bir artış, Triton X-100'ün varlığında görülürse alt-tabaka serbest OMV nüfuz etmez olasıdır.
- enzim aktivitesi doğrulamak için Triton X-100'ün varlığında deneyi serbest enzim aktivitesi (Bölüm 6.1'de yukarıda anlatıldığı gibi) yüzey aktif maddeler ile inhibe değildir.
NOT: aktivitesi büyük ölçüde Triton X-100 gibi saponinler veya çeşitli polisorbat gibi alternatif katkı etkilenirse / ara yüzey aktif OMV membran rüptürü için daha uygun olabilir.
- hacimce Aşama 0-3 ile% CHES tamponu, Triton X-100'ün artan konsantrasyonları kullanılarak 6.1 de tarif edildiği gibi aynı kinetik deney analizi yapın.
7. OMV Depolama
- Dondurucu
- doğrudan sıvı azot içine saflaştırılmış OMV Yeri ~ 100 ul alikotları ek emin tam şişeleri batığın veya numune kendisi ile herhangi bir sıvı azot temas olmaması alikotları dondurma.
NOT: Arıtılmış OMV tampon doğrudan donduruldu olabilir purificat sırasında OMV pelet çözülmesi için seçildi7 Gerekirse ek dondurarak saklama koruyucuları ile iyon süreci. - -80 ° C'de ek dondurulmuş alikotları saklayın.
- RT emin örnekleri ısıtmak için değil varlık onları yerleştirerek adım 7.1.1 dondurulmuş alikotları çözülme.
- Bu şekilde depolama için tüm örnekler hazırlamak önce aşamasından önce başlangıç hızları karşılaştırarak 6.1 ve enzim aktivitesi sonrası dondurularak çözülme önemli bir kayıp olmadığını doğrulamak için dondurulduktan sonra tarif edilen enzim tahlili gerçekleştirmek.
Not: enzim aktivitesinde bir azalma dondurma nedeniyle gözlenmesi halinde saklayın 4 ° C'de OMV arıtıldı.
- doğrudan sıvı azot içine saflaştırılmış OMV Yeri ~ 100 ul alikotları ek emin tam şişeleri batığın veya numune kendisi ile herhangi bir sıvı azot temas olmaması alikotları dondurma.
- liyofilizasyon
- Piyasada mevcut liyofilizasyon donanımları 21 kullanılarak anında dondurulmuş saflaştırılmış OMV alikotları liyofilize.
- Mağaza hafta veya aylarca, -80 ° C'de, oda sıcaklığında alikotları liyofilize edildi.
- Liyofılizasyon öncesinde şekilde liyofilize OMV saf suyun aynı hacimde ekleyin ve t rehidrate, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştirO örnek. Gerekli emin olunca girdap ya da OMV ses dalgalarına maruz değil hafifçe karıştırın.
- önce seyreltme / çözündürme gerekli olmadığı yerlerde işaret-bakım uygulamaları için doğrudan liyofilize OMV tozu ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol ayrıntılı OMV ambalaj stratejisi için gerekli olduğu gibi, iki yeniden birleştirici proteinin aynı anda sentezlenmesi, farklı yollar bir numara ile gerçekleştirilebilir. Burada, bir iki vektör sistemi çoğaltma ve ayrı olarak uyarılabilir gen kasetlerinin uyumlu kökeni ile kullanılmıştır. PTE-SC sentezlenmesi için bir arabinoz, indüklenebilir gen kaseti ve bir enzim geninin klonlanmasını kolaylaştırmak için benzersiz sınırlama sitelerinin bir dizi ardından periplazmik lokalizasyon lider dizisine arginin bir çift içermek üzere tasarlanmış olan bir ticari bir plazmid omurgasını (pACY184) oluşturmak bir C-terminal SC proteinine füzyon. Dış zar bağlantı proteinini kodlayan plazmid yapısı, protein ekspresyonunun kontrol ve pelB periplazmik lokalizasyon dizisi için lac operon kullanan ticari vektör pET22 olup. Kısa ST dizisi INSE önce kesik OmpA protein klonlanmıştırifade plazması içine rtion. her iki plazmid olarak, C-terminal hekzahistidin sekansı OMV örneklerinde füzyon proteinlerinin aynı anda tespiti için izin vermek için muhafaza edilmiştir. OmpA N- ve C-terminali ST füzyon konstruktları, her iki dahil olmak üzere, bu gen yapılarının inşası ve karakterizasyonu, tam Alves diğ tarif edilmiştir. 7. Burada tarif edilen gen yapıları, enzimlerin paket için elverişli olmayabilir. Bazı durumlarda, periplazmik lokalizasyon sinyali, düzenleyici elemanlar, ya da epitop etiketleri değiştirmek için gerekli olabilir. Ayrıca, bazı proteinler engelleyici büyük ve tamamen iç zarı enine mümkün olabilir. Enzim aktivitesi ve OMV paketleme verimliliği priori tespit edilemez ve ampirik her hedef protein için tespit edilmesi gerekir.
Aşağıda başarıyla taşıyan o ardına genellikle beklediğiniz sonuçlarıBu protokolü ut. Bir OMV içinde iki ST / SC bölünmüş protein alanları şematik, OmpA-ST ve PTE-SC füzyon yapıları olarak bakteriyel dış membran isopeptide oluşumu Örnek ve PTE-SC daha sonra kapsülleme dahildir (Şekil 1) . Ayrıca temsili SEM aracılığıyla saflaştırılmış OMV morfoloji sonuçları yanı sıra boyut dağılımı ve mutlak OMV konsantrasyon parçacık izleme yazılımı ile belirlenen (Şekil 2) dahildir. OMV protein içeriği ve rekombinant protein ekspresyonu ileri karakterizasyonu SDS-PAGE ve Western Blot (Şekil 3) ile görülür. aşağıdaki gibi burada sağlanan protokole özgü ilgi proteinlerin için molekül ağırlıkları şunlardır: Yerli OMPA (37.2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Saflaştırılmış OMV yüksek miktardaki nativ OmpA göstergesidir koyu bant yaklaşık 37 kDa olmalıdır. Jel çözünürlüğüne bağlı olarak birden fazla ba olabilirOmpA, OMPF ve OMPC olarak jel bu bölgedeki nds mevcut tüm nispeten bol ve benzer moleküler ağırlığı paylaşın. OmpA-ST nedeniyle de, E. coli sentezleme makineleri ezici sonucu lider sekansın uygun olmayan bölünmeye gözlenebilir 2,2 kDa daha büyük olan bir ilave bant. Başarıyla saflaştırılmış OMV örnek diğer birçok yüksek ifade proteinleri olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Diğer gruplar varsa da saflaştırma hatalı gerçekleştirildiği veya bakterilerin, E. coli BL21 (DE3) soyu gözlenmemiştir diğer proteinleri ambalaj olabilir kullanılmaktadır süzün.
Ayrıca, etkinlik analizleri ve vezikül kopma deneyleri enzimatik substrat serbestçe transmembran porin proteinleri (Şekil 4) ile OMV girebilirsiniz eğer beklenen temsilcisi sonuçları göstermek için sağlanmıştır. Paraokson, nispeten serbest bir şekilde girerEndojen transmembran Porin proteinleri ile OMV OMV zardan görece serbestçe geçer, paketlenmiş PTE ve reaksiyon ürününün, s-nitrofenolu tepkimeye bırakılır. Bu olgu, tüm ürün, alt-tabaka ve enzim kümeleri arasındaki yerde olmayacak ve deneysel olarak tespit edilmelidir. Başarılı bir OMV yırtılma ve enzim salma deterjan ve PTE (burada Triton X-100), düşük konsantrasyonları ile görülmüş olsa da, bu tür ilave için diğer enzimlerin aktivitesini etkileyebilir.
Plazmid haritalar da SC / ST sistemini (Şekil 5) kullanan iki plazmid ambalaj stratejisi tasarımı göstermek için dahil edilmiştir.
Şekil 1: OMV içine proteinlerin Yönetmen ambalaj. tarif OMV ambalaj strat kullanılan proteinler için kristal yapılarıEGY: OmpA, PTE, SpyTag (SS) ve SpyCatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA sırasıyla 4MLI, 4MLI. bakterilerin dış zar bir isopeptide bağı oluşturmak OmpA-ST ve PTE-SC kaynaşma şematik bir temsili gösterilmektedir. Bu membran füzyon oluşturan OMV olan PTE dahil edilmesini tahrik eder. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: OMV karakterizasyonu. Ultra santrifüj işlemi (A) SEM yerel E. coli OMV saflaştırılmıştır [BL21 (DE3)]. (B) Temsilcisi parçacık trac kral dağılımları ve (C) toplam vezikül konsantrasyonu örnek Yerli OMV, arabinoz aktivasyonu (PTE-Hayır A) arabinoz aktivasyon varlığında, PTE-SC yokluğunda PTE-SC için okur 90 sn boyunca ortalama (PTE-A) N-terminal OmpA-ST birlikte dönüştürülmüş arabinoz ve IPTG aktivasyonu (PTE / OMV-H) varlığında, PTE-SC ve ultra santrifüj süpernatan (UC süpernatant) mevcuttur. OMV üretimde önemli bir artış Yerli OMV ve PTE-SC yalnız yapıları ile karşılaştırıldığında PTE / OMV-N numunesinde gözlendi. OMV süpernatant sonrası Ultrasantrifügasyon hiçbir OMV küçük bırakarak UC pelet OMV neredeyse tam iyileşme göstermek için UC süpernatant ölçüldü. Tüm veriler, üçlü deney (± SD) bir mekanizma sağlamaktadır. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Saf OMV protein içeriği belirlenmesi. PTE-SC ile birlikte eksprese C-terminal OmpA-ST füzyon saflaştırılmış OMV UC pelet (A) SDS-PAGE (PTE / OMV) OmpA-ST, Yerli OMPA, PTE-SC ve OmpA- temsilcisi bolluğu gösteren inşa ST / PTE-SC isopeptide füzyon. (B) OMPA ve PTE mevcut dahil onun-etiketi kullanan Western Blot analizi bir anti-6xHis antikor aracılığıyla görselleştirme kolaylaştırmak için oluşturur. Daha büyük bir moleküler ağırlığa his-etiketli türlerin varlığı ile lekesi üzerinde kanıtlandığı gibi PTE, dimerize bilinmektedir dikkat etmek önemlidir. Çok yüksek OmpA-ST ifade seviyeleri gözlenen olsa serbest tam bir dönüşüm yokturzara PTE-SC OmpA-ST / PTE-SC bağlı. Buna karşın, genel olarak PTE üretimi ve gelişmiş paketleme verim artışı kovalent bağ oluşumu her yerde olmasa da ST ve SK etki kovalent olmayan ilişki OMV içinde yönlendirilmiş ambalajın önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: PTE aktivitesi ve paketleme karakterizasyonu. (A) Genel PTE ekspresyon seviyeleri ve OMV paketleme verimliliği bıraktı kullanan ilk hız ölçümleri ile tespitOxon hücre topakları, UC süpernatan içinde PTE mevcut karşılaştıran bir kromojenik substrat ve saflaştırılmış UC OMV peletler olarak anlaşılacaktır. (B) OMV iç alt-tabaka engelsiz erişim sağlayan OMV iki tabakalı bozmaya Triton X-100 (% 0.5 T100) kullanımını gösteren Örnek verileri. enzimatik İlk hızlar, aynı kalırsa T100 yokluğunda gerçekleştirilebilir deneyleri için bu verileri karşılaştırmak sağlam OMV ikili tabakalar arasında alt-tabaka translokasyonu doğrulama kolaylaştırır. paraokson halinde varlığında veya paraokson OMV ile endojen gözenekler boyunca serbestçe geçer gösteren T100 yokluğunda gözlemlenen çok az aktivite fark yoktu. (C) PTE / OMV-N ve PTE-A için standart Michaelis-Menten enzim kinetiği denklemi PTE-SC kinetik veri uyum. (D) K M ve k cat / K M (48 belirlemek için kullanılan bir Lineweaver-Burk analizi, 4.4 x 10 7, 44 uM, 4.9 x10 7 saniye -1 sırasıyla M -1) doğal enzim gibi benzer PTE edebiyat kinetik parametreleri gösteren (90 uM, 2.7 x 10 7 saniye -1 M -1) tüm durumlarda R 2 ≥ 0,999 ile. Tüm veriler, üçlü deney (± SD) bir mekanizma sağlamaktadır. Alves ve ark gelen Şekil çoğaltılamaz (uyarlanmış). ACS İçi Mat arabirimleri (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Telif hakkı 2015 American Chemical Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Burada anlatılan örnek sistem için Temsilcisi plazmid yapıları. SpyCatcher modifiye enzim-SC (PTE-SC) plazmid OMV (solda) içinde kapsülleme için hedeflenen. SpyTag modified membran çapa-ST (OmpA-ST-N) plazmid (sağda). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Temsilcisi göstermek için bu protokol işlevleri, ilgili bir enzim üretimi ve E. coli OMV içine paketlenmiş olan bir paketleme tekniği yöneliktir. birçok karmaşık tekniklerle de protokol aşağıda ayrıntılı olarak bazıları, farklı özel uygulamalarda, kullanım için uyum için değiştirilebilir olan birden çok alan vardır. OMV paketleme ve enzim kapsülleme mekanizması özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir olsa da başarısı için kritik olan bu protokol kapsamında birkaç adım vardır. sağlam bir bakteri ve hücresel enkaz ilk çıkarılması büyük önem taşımaktadır ve kantitatif veya numune analizinde tüm alt girişimleri etkileyecektir. filtrasyon ve ardından iki ardışık santrifüj adımları bu kirleri çıkarmak için genellikle yeterli olmaktadır. boşaltılarak çözeltiler Santrifüj işleminden sonra kirletici aktarımını en aza indirmek için, ancak, tüm örnekler bakım alınmalıdır. Benzer şekilde, son OMV pelet obtained Aşağıdaki ultrasantrifügasyon genellikle sadece gevşek bir santrifüj tüpünün tabanına yapıştırılır. Pelet kabın altındaki bozulmamış kalmasını sağlamak için harcanan kültür ortamı çıkarılırken son aşamalarında, dikkat edilmelidir. Bazı durumda bu protokolün son adımda kayıp değildi OMV pelet sağlamak için DLS veya nanopartikül izleme cihazı kullanarak örnek analizi sonrasına kadar nihai kültür ortamı korumak için iyi olabilir. Aşağıda araştırmacıların özel ihtiyaçlarına göre uyarlanmış bu özel protokol ve diğerleri hem ortaya çıkabilecek bazı ek endişeleri vardır.
Bu sistemde PTE kullanımı PTE alternatif bir enzim veya söz konusu proteinin ile kolayca değiştirilebilir olması ile organofosfat kontamine bölgelerin çevresel iyileştirme için mükemmel bir model enzimi kapsülleme sağlar. burada açıklandığı gibi OmpA-ST ile PTE-SC Koekspresyon genel PTE expressi büyük bir artışa neden olduhem de daha fazla PTE yüksek vezikül üretim seviyeleri PTE ve tek başına ifade PTE-SC göre veziküller içinde paketlenir. OmpA hiper vezikülasyon C-terminal silme yoluyla, dış membran ve peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısının azaltılması ile elde edilir. Bu bakteriler genellikle yerli olmayan proteinlerin aşın gözlenen toksik etkileri azaltır rekombinant PTE ihracat için kolay bir yol sağlar.
PTE kolayca bu model sistemde değiştirilebilir iken tüm enzim substratları özgürce OMV bilayeri geçeceği dikkat etmek önemlidir ve her benzersiz enzim ve substrat çifti vaka bazında bir durumda test edilmesi bu nedenle zorunludur. zarından Bu teknik geçmez bir alt tabaka de üretim ve OMV olarak bir enzim ve Triton X-100 ilave ya da uygun başka bir yüzey aktif madde paketlemek için kullanılabilir olsa bile, yeterli le eklenebilirVELS kullanmadan önce kesecikler rüptüre.
rekombinant protein ekspresyonu ve paketleme yokluğunda bu protokol, aynı zamanda, çeşitli bakteri türleri OMV üretimi ve saflaştırılması için temel bir yöntem olarak hizmet edebilir. Bu yoğunluk gradyan fraksiyonasyon 22 membran filtrasyonu 23 ve ultra-süzme 24 olarak OMV saflaştırma için alternatif yöntemler de vardır ve amaçlanan uygulamaya bağlı olarak daha uygun teknikler olabilir. Bu alternatif saflaştırma teknikleri de hali hazırda bir çiftdikgen sentetik bağlantı aracılığıyla bir OMV bir proteinin yönelik ambalaj OMV ultrasantrifügasyon taneleme yerine bu protokolde desteklenebilir.
Diğer değişiklikler bu protokol yanı sıra seçilen membran bağlama proteini kullanılan özel sentetik bağlantı sistemi yapılabilir. Eşleştirme, iki farklı protein için çeşitli sentetik stratejiler vardıriçeren bir biyolojik sistem içinde s: Bölünmüş proteinleri 25, sarmal bobinler 26, ve split inteins 27, sadece birkaç listelemek için. Böyle OMPF ve OMPC gibi diğer membrana bağlı veya transmembran proteinleri olasılıkla uygun ST modifikasyon siteleri de 28 için sağlayacaktır. Bazı durumlarda, aynı zamanda yeniden birleştirici enzim / protein ST ve ankraj protein SC yerleştirilmesi SC etki alanları ve daha küçük ST değiş tokuş etmek için gerekli olabilir. aynı ya da farklı indüksiyon sistemlerinde birden plasmidlerin kullanımı dahil olmak üzere, burada uygulanabilir, farklı klonlama stratejileri da vardır, birden fazla protein tek bir plazmid kodlanmış ya da ifade homolog rekombinasyon, bütün dahil teknikleri veya parçaları kullanılarak bakteriyel genoma sistemi.
OMV mikroçevresinin yaygın İdeal st daha az altında oluşur enzimatik inaktivasyonu azaltarak paketlenmiş enzim stabilize etmek için yardımcı olurOraj koşullar, donma-çözülme ve liyofilizasyon 29. Ayrıca, OMV iki tabakalı aktif enzim ve ekstra OMV alanı içinde mevcut protein arasındaki fiziksel bir engel olarak işlev gibi OMV proteolitik bölünmeye büyük ölçüde geliştirilmiş direnç sağlayacağı tahmin edilmektedir. Bu protokol ayrıca OMV kapsüllü proteinler ve afinite saflaştırma hedeflenen teslim kolaylaştırmak için bir dış bakan küçük molekül, peptid veya protein etiketi içerecek şekilde genişletilebilir. PTE Bu bir uygulama için seçilen birlikte bu protokolün, bu çalışmanın sonuçları, içeriği kolaylıkla çeşitli farmasötik teslimat kullanım için benzer bir proteini ambalaj stratejiler tasarlamak için kullanılabilir, Kullanılan Tıbbi Tanı ve çevresel iyileştirme uygulamaları 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
