Abstract
Eine zunehmende Interesse der synthetischen Biologie-Techniken bei der Anwendung der äußeren Membran Vesikel (OMV) zu programmieren, führen zu einigen sehr interessanten und einzigartigen Anwendungen für die OMV, wo traditionelle Nanopartikel zu schwierig erweisen zu synthetisieren. Bis heute sind alle gramnegativen Bakterien wurde gezeigt, OMV Demonstrieren Verpackung einer Vielzahl von Ladung zu erzeugen, die kleine Moleküle, Peptide, Proteine und genetische Material enthält. Auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Ladung, sind OMV in vielen biologischen Prozessen beteiligt im Bereich von Zell-Zell-Kommunikation zu Gentransfer und Lieferung von Virulenzfaktoren abhängig davon, welche Bakterien die OMV produzieren. Erst vor kurzem haben bakterielle OMV für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen durch die Entwicklung von Techniken zugänglich zu steuern und direkte Verpackung von rekombinanten Proteinen in die OMV. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Verwendung von Enzym verpackt OMV zur Bereitstellung verbesserter Marktpreisefürll Herstellung von rekombinanten Enzyms erhöht Vesikulation und verbesserte Enzymstabilität. Erfolgreiche Nutzung dieses Protokolls wird in der Schaffung einer Bakterienstamm führen, die gleichzeitig ein rekombinantes Protein produziert und leitet sie für OMV Verkapselung durch eine synthetische Bindung zwischen dem rekombinanten Protein zu schaffen, und eine äußere Membran-Ankerproteins. Dieses Protokoll beschreibt auch Verfahren zur Isolierung von OMV aus Bakterienkulturen sowie für eine angemessene Handhabung Techniken und Dinge zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll für den Einsatz für andere einzigartige Anwendungen wie Anpassung: pharmazeutische Drug Delivery, medizinische Diagnostik und Umweltsanierung.
Introduction
Dargestellt ist hier ein Verfahren für die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von Enzym-beladenen bakterielle äußere Membranvesikel (OMV). OMV sind klein, vor allem unilamellare, Proteo , die von 30 bis 200 nm 1,2 in einem Größenbereich. Alle Gram-negative und Gram-positive Bakterien , die bisher untersucht wurden , haben gezeigt , Freisetzung von entweder OMV oder extrazelluläre Vesikel (EV) von ihrer Oberfläche 3,4. Der genaue Mechanismus, durch den OMV produziert haben noch voll auf Grund der unterschiedlichen Bakterienpopulationen aufgeklärt werden, dass sie so gut wie die unterschiedlichen Funktionen ausscheiden, die sie dienen. OMV wurden , um eine breite Palette von Fracht aus kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen an genetischem Material dazu dient , eine Vielzahl von komplexen Signal, Gen - Translokation zu transportieren gezeigt, und Virulenzfunktionen 5,6.
Die genauen Mechanismen der OMV Biogenese sind nicht gut charakterisiert, und scheinen zwischen Bakterienarten zu unterscheiden. Trotz this der Tat haben wir ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz eines rekombinanten Proteins in OMV entwickelt durch eine synthetische Bindung zwischen einem Protein von Interesse und eine hoch reichlich Protein endogen der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV entsteht. In Abwesenheit eines synthetischen Bindung oder künstlich eingearbeitet Affinität zwischen dem rekombinant exprimierten Protein und der OMV die beobachtete Verpackungseffizienz sehr niedrig 7. Dieses Ergebnis ist in dem Augenblick der OMV Bildung an der Bakterienoberfläche oder durch gerichtete Verpackung durch Mechanismen, die nicht gut verstanden sind innerhalb der OMV erfolgt entweder durch Zufall Verkapselung als Einbau der Proteine zu erwarten. Ein gewisser Erfolg wurde in Verpackungsproteine einfach durch Überexpression in den periplasmatischen Raum beobachtet worden, die auf zufällige Chance Verkapselung, aber effektive Verpackung setzt eine hohe Proteinabhängig mit einigen Proteinen mit hohem Wirkungsgrad Verpackung im Vergleich zu anderen tham Do Paket nicht mehr 8-10. Durch die Verwendung von gemeinsamen synthetischen Biologie - Techniken haben wir versucht , Escherichia coli (E. coli) zu konstruieren , ein aktives Enzym von Interesse in OMV gleichzeitig produzieren, verpacken und ausscheiden, die derzeitigen Kenntnissen Beschränkungen hinsichtlich umgeht , wie OMV gebildet werden und wie Ladung durch die Bakterien ausgewählt ist für Verpackung.
Für die Zwecke dieser Anmeldung ein Split-Protein Biokonjugation System wurde als der synthetische Verknüpfung der Wahl ausgewählt Richtungs Verpackung in das OMV erleichtern. Wie der Name schon ein Split-Protein Biokonjugation System schlägt besteht aus zwei komplementären Untereinheit Domänen, die miteinander interagieren. Die geteilten Proteindomänen für die Zwecke dieses Protokoll ausgewählt werden als die SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) Domäne und aus dem Streptococcus pyogenes Fibronektin-bindenden Protein (FbaB) 11 abgeleitet werden. Diese Spaltung Proteinsystem ist ungewöhnlich, dass when die beiden Untereinheiten innerhalb der Nähe sind eine Isopeptidbindung bildet sich spontan zwischen dem proximalen Asparaginsäure und Lysin Aminoreste Säure eine kovalente Bindung zu schaffen. Isopeptidbindung Bildung erfordert nicht die Zugabe von Chaperon - Proteinen, katalytische Enzyme oder Cofaktoren und kann bei Raumtemperatur (RT) und über einen weiten Bereich von physiologisch relevanten Bedingungen 12 leicht auftreten.
Als Beweis des Konzeptes wurde Phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) aus Brevundimonas diminuta ausgewählt in E. coli 13 OMV abgeleitet verpackt werden. PTE enthält einen zweikernigen Zn / Zn aktiven Stelle und hat die Fähigkeit , Organophosphate durch eine Hydrolysereaktion zu brechen aryldialkylphosphates in Dialkylphosphate und arylalkohole Umwandlung 14. Die Exposition gegenüber Organophosphaten beeinträchtigt richtige Neurotransmitterfunktion durch die Hydrolyse von Acetylcholin durch Acetylcholinesterase bei neuromuskulären Verbindungen Hemmung Making Organophosphat abgeleiteten Verbindungen extrem gefährlich 15. Längerer oder signifikante Exposition gegenüber Organophosphaten führt häufig zu unkontrollierbaren Zuckungen und in der Regel zum Tode führt über Erstickung. Während PTE die höchste katalytische Aktivität gegenüber paraoxon zeigt, ein sehr wirksames Insektizid, ist es auch in der Lage 16 eine breite Palette von anderen Pestiziden und V / G - Typ chemischen Nervenmittel zur Hydrolyse. Zur Erleichterung wurde OMV Verpackung, ein bakterielles Plasmid ausgelegt, dass ein Genkonstrukt kodiert, das einen induzierbaren Promotor, einen periplasmatischen Lokalisierungssequenz und eine kurze multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von der SC-Gensequenz. Einsetzen des PTE Gens zwischen dem Leiter und SC Sequenz zur Erstellung eines genetischen Schalter erlaubt, die die PTE-SC-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum für OMV Verpackung ausgerichtet ist. Während die hier beschriebenen Bemühungen auf PTE konzentrieren, ist das Enzym-Gen untereinander austauschbar und leicht mit einem anderen Gen-Sequenz ersetzt werden könnte, um facilitate Verpackung eines alternativen Enzym oder Protein.
Was den zweiten Teil des synthetischen Bindung, eine reichliche outer membrane protein (OmpA) wird gewählt, um die ST-Peptidsequenz zu präsentieren. Während die Wahl des Ankerproteins variieren kann, ist es wesentlich, dass das Protein eine permissive Domäne besitzt, die in den periplasmatischen Raum präsentiert, toleriert das Fusionskonstrukt ohne Zytotoxizität zu induzieren, ist bekannt, in OMV anwesend zu sein, und nicht aggregiert, wenn er rekombinant ist hergestellt. OmpA ist ein 37,2 kDa Transmembran - Porin - Protein , das 17 in der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV stark exprimiert wird bekannt sein. Es liegt im Transport von kleinen Molekülen verwickelt <2 nm in der Größe, in der Bakterienmembran 18. Einheimische OmpA hat zwei strukturell unterschiedliche Domains, ein Trans Beta Barrel - Motiv und ein periplasmatisch löslichen C-terminalen Teil bekannt mit dem Peptidoglycan 19 zu interagieren. In der Mutante OmpA-ST Fusion designed hier der C-terminalen Teil von OmpA wurde gelöscht und die ST wurde dem periplasmatisch zugewandt N- oder C-Terminus fusioniert. Löschen des periplasmatischen Teil OmpA verringert die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und der Peptidoglykan in Membrandestabilisierung resultierende was zu hyper-vesiculation 7. Genomic OmpA wurde zusätzlich zu dem rekombinant exprimierten OmpA-ST-Konstrukt zu mildern Brutto Membrandestabilisierung gehalten.
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Protocol
1. Herstellung der Plasmide
- Bereiten Sie ein Plasmid (zB pET22) mit dem Ankerprotein (OmpA) zu einer biorthogonales Verknüpfung Domäne fusioniert (bezeichnet in diesem Protokoll als Anker-ST), Epitop - Tag (wie 6xHis, myc oder FLAG - Tags für die Reinigung und Identifizierung), periplasmatischen Lokalisation tag, Antibiotikaresistenz, und geeignete Replikationsursprung auf der Basis der ausgewählten Bakterienstamm 7.
- Extrahieren Plasmid-DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA-Extraktions-Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers.
- Bereiten Sie ein Plasmid (zB pACYC184) mit dem Enzym / Protein (PTE) innerhalb der OMV an die komplementäre bioorthogonale Verknüpfung Domäne des Ankerproteins zu dem fusionierten verpackt werden ( im Sinne dieses Protokoll als Enzym-SC), Epitop - Tag, periplasmatische Lokalisierung Tag, Antibiotika-Resistenz, die als Ankerprotein-Plasmid unterschiedlich ist, und geeignete origin der Replikation auf dem ausgewählten Bakterienstamm 7 basiert.
- Extrahieren Plasmid - DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA - Extraktions - Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers 7.
2. Erzeugung eines OMV Verpackung E. coli Kultur
- Plasmidisolierung
- Reinige Plasmide kodieren , das Enzym-SC konstruieren und Anker-ST - Konstrukte aus getrennten Leitungen Wartungszelle Kommerzielle Plasmidisolation Kit gemäß Herstellerprotokoll 7 verwenden. Bestimmen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen wird.
- Co-Transformation
- Wählen Sie ein E. coli - Stamm, der kommerziell erhältlich ist , die Proteinexpression zu erleichtern.
HINWEIS: BL21 (DE3) -Zellen wurden hier verwendet. Die T7-Lysogen wird für die Expression des anker ST Konstrukts erforderlich, die für prot auf dem T7-Promotor und T7-RNA-Polymerase beruhtein Ausdruck. Verwendung anderer Bakterienstämme erfordert entweder die Anwesenheit des T7 - Lysogen - Gens oder die Verwendung eines Plasmids , ausgenommen pET22 7. - Verdünnen gereinigte Plasmid-DNA zu äquivalenten molaren Konzentrationen dann wandeln sie in kompetente Bakterienzellen entweder über Hitzeschock-Transformation oder Elektroporation gemäß dem Protokoll des Herstellers für die kompetenten Zellen ausgewählt.
- Platte transformierten Zellen auf antibiotikahaltigen Luria-Bertani (LB) Agarplatten sowohl mit Ampicillin (pET22) und Chloramphenicol (pACYC184); beide in Endkonzentrationen von 25 ug / ml.
- Legen Sie die Kulturschale bei 37 ° C über Nacht nur Klone zu isolieren beide Plasmide enthalten.
HINWEIS: Kolonien, die Antibiotika-Selektion überleben wird für alle zukünftigen OMV Präparate verwendet werden. Antibiotika (Ampicillin und Chloramphenicol) wird für alle flüssigen Kulturen zugegeben werden Selektionsdruck aufrecht zu erhalten und um die Anwesenheit beider Plasmide gewährleistet.
- Wählen Sie ein E. coli - Stamm, der kommerziell erhältlich ist , die Proteinexpression zu erleichtern.
3. OMV Produktion
- Colony Expansion
- Beimpfen von 5 ml Kulturmedium (typischerweise Terrific Broth (TB) oder LB) Antibiotika bei den genannten Konzentrationen (Schritt 2.2.3) mit einer einzelnen Kolonie aus den Selektionsplatten beschrieben in 2.2.4 enthält.
- Führen Sie eine 1: 100-fache Verdünnung der über Nacht Starterkultur in verwirrte Kulturflaschen.
HINWEIS: ein Volumen von Medien zwischen 250-500 ml verwenden. - Halten die Kultur bei 37 ° C bei 250 Upm Schütteln, dass eine ausreichende Belüftung der Kultur gewährleistet ist, erreicht.
- Induktion von jedem Plasmid
- Erlauben die Bakterienkultur bis zu einer OD 600 von 0,6-0,8, etwa 3 h Wachstum nach Beimpfung des Hauptwachstumskolben wachsen.
- Um die endgültige Ausbeute von PTE-SC beladenen Vesikel zu verbessern, Zentrifuge die gesamte Kultur bei 7000 × g für 15 min. Zellpellet in vorgewärmte, frische Kulturmedien.
HINWEIS: Diese Optional Schritt hilft eine leere OMV zu entfernen, die die Induktion PTE-SC vor in den Kulturmedien vorhanden sind. - Machen Sie eine 20% ige Stammlösung von L-Arabinose in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 & mgr; m-Filter. Store L-Arabinose-Lösung bei 4 ° C für 2-4 Wochen.
- Fügen Sie den L-Arabinose-Lösung der Kulturflasche bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,2% PTE-SC Produktion zu initiieren.
HINWEIS: Dies hilft, den periplasmatischen Raum mit PTE-SC vor der Förderung der verstärkten Vesikulation durch Induktion des mutierten OmpA-ST vorab zu laden. - Machen Sie eine 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Lösung in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 & mgr; m-Filter.
HINWEIS: IPTG muss sofort einmal mit Feuchtigkeit versorgt werden. Aliquots von IPTG kann für 3-6 Monate eingefroren werden gespeichert und können unmittelbar vor auftauen zu verwenden. - Hinzufügen IPTG nach weiteren 3 Stunden Inkubationszeit bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM Herstellung des OmpA-ST zu initiieren.
- Lassen Sie die cultur für eine weitere 8-14 h bei 37 ° C wachsen unter Schütteln.
4. OMV Reinigung
- Entfernung von intakten Bakterien
- Zentrifugieren der Bakterienkulturmedium für 15 min bei 7000 xg bei 4ºC intakten Bakterien zu pelletieren.
- Dekantieren und zu speichern, die Medien von der Spitze der Post Zentrifugation Zellpellet wird vorsichtig, um nicht das Zellpellet stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 für einen zusätzlichen Zentrifugationszyklus alle intakten Bakterien aus dem Kulturmedium ist sicher entfernt werden, um sicherzustellen, dekantieren und die Medien speichern.
- Entfernung von Proteinaggregaten
- Reinigung weiter die Bakterienkulturmedien ein 0,45 um Membranfilter verwendet, um restliche unerwünschte Bakterien und große Zellmaterial zu entfernen.
HINWEIS: Verwenden Sie eine biologisch kompatiblen Membranmaterial für höhere Gewinnungsraten und niedriger Proteinadsorption wie Celluloseacetat (CA) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF). Spritzenfilter Volumen weniger als 100 ml und Vakuumfiltervolumen größer als 100 ml.- Um Spritzenfilter, Kulturmedium in sterile 10-50 ml Spritze ziehen. Bringen 0,45 um Filter zu Luer Ende Spritze. Drücken Sie Kolben und sammeln Durchfluss in ein neues Gefäß.
- Vakuumfilter Kulturmedium auf eine sterile Filtrationsvorrichtung übertragen. Bringen Einheit zur Vakuumpumpe oder Absauger versenken Sog zu erzeugen. Übertragen gefilterten Mediums zu neuen Schiff.
- Reinigung weiter die Bakterienkulturmedien ein 0,45 um Membranfilter verwendet, um restliche unerwünschte Bakterien und große Zellmaterial zu entfernen.
- Die Isolierung von OMV über Ultrazentrifugation
- Fügen Sie die gefilterten Kulturmedien in Zentrifugenröhrchen vorsichtig gegenüberliegende Rohre in der Zentrifuge zu balancieren.
- Pellet bei ~ 150.000 xg für 3 h bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge des entsprechenden Rotors unter Verwendung sowohl des Instruments passend und -röhren verwendet wird.
- Dekantiert die OMV abgereichertem Kulturmedien von der OMV Pellet, darauf achten, daß die OMV Pellet zu stören, sofort bei der Fertigstellung of Zentrifugieren als Pellet ermöglicht die OMV in den Medien zu bleiben wird das Pellet reduzieren OMV Erholung erweichen.
HINWEIS: Dieses Pellet leicht braun werden und in Abhängigkeit von der Ausgangsbetrag der Bakterienkultur kann oder mit dem Auge nicht sichtbar sein. direkt von der Spitze des Zentrifugationsröhrchens die Medien Ansaugrauchmelder ist auch eine Option, wenn man bedenkt, dass die mehr Medien aus dem OMV entfernt Pellet die reineren die endgültige OMV Probe sein wird. - Speichern Sie die zentrifugiert Überstand für eine spätere dynamische Lichtstreuung (DLS) Tests, um sicherzustellen, dass die OMV Partikel von den Medien völlig erschöpft waren.
- Hinzufügen 0,5-1 ml sterilfiltriert Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4 oder 100 mM N - Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES) Puffer bei pH 8,0 auf das OMV Pellet ermöglicht es für 30 min bei RT inkubiert. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht trocknet.
HINWEIS: Extremes in Ionenstärke der Lösung, pH-Wert und Temperatur kann in reduzierter OMV Löslichkeit führen und fördern aggresuchung. - Pipettieren vorsichtig die gereinigte OMV Lösung aus dem Zentrifugenröhrchen, das Mischen sanft das gesamte Pellet, um sicherzustellen, wurde in Lösung gebracht worden.
5. OMV Charakterisierung
- Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen DLS oder Nanopartikel-Tracking-Software nach den Protokollen des Herstellers zur Verfügung gestellt einzigartig für jedes Instrument OMV Größenverteilung und Partikelkonzentration zu bestimmen.
HINWEIS: Hier OMV Größenverteilung und Konzentration bestimmt wurde Nanosight LM10 Nanoparticle-Tracking und NTA 2.3 Analyse-Software verwendet wird.- Öffnen Sie die Software.
- Schalten Sie Mikroskop und reinigen alle Oberflächen auf dem Mikroskop und Nanopartikel-Tracking-Einheit.
- In ~ 0,5 ml OMV Probe direkt auf das Sichtfenster der Partikel-Tracking-Gerät durch den Luer mit einer sterilen 1-ml-Spritze Montage sicher zu sein, das gesamte Sichtfenster abdecken, ohne dass Luft in das System Blasen zu injizieren.
- Platz ter Nanopartikel-Tracking-Einheit auf dem Mikroskoptisch, und schalten Sie den Laser.
- Klicken Sie auf "Aufnahme" in der Software.
- Stellen Sie das Mikroskop Fokus und inszenieren die Partikel auf dem Vorschaubildschirm in der Software-Fenster zu visualisieren.
- Stellen Sie die "Kamera-Shutter" und "Camera Gain" bis helle Partikel eindeutig auf einem dunklen Hintergrund sichtbar gemacht werden.
- Stellen Sie erfassen Dauer auf 60 Sekunden.
- Klicken Sie auf "Record".
- Wenn Sie gefragt werden, geben Sie die Probe / Gerätetemperatur, die Probe beschriften und in einen Benutzer festgelegten Ordner laufen bei der Fertigstellung der jeweils die Videodaten speichern.
- Halten Sie alle Analyseparameter (Nachweisgrenze, Blur, Min Streckenlänge, Min Erwartete Partikelgröße) auf automatische Erkennung Modus und klicken Sie auf "Prozessablauf."
HINWEIS: Das Handbuch für wie kann jeder Parameter unabhängig für die Feinabstimmung Analyseergebnisse angepasst werden. - Nehmen Sie Partikelgrößenverteilung und Partikel / ml Konzentration, wie durch die Software bestimmt wird.
HINWEIS: Eine typische OMV hydrodynamischen Größenbereich zwischen 30 bis 200 nm mit einer Partikel / ml - Konzentration von ~ 10 x 10 8.
- Die Bestimmung OMV Proteingehalt
- Verwenden Sie Standard - SDS-PAGE und Western - Blot - Protokolle OMV Reinheit, Enzymproduktion, und die SC-ST Vernetzungseffizienz 7 zu bewerten.
HINWEIS: Vernetzungseffizienz wird nicht zu 100% 7 sein.
- Verwenden Sie Standard - SDS-PAGE und Western - Blot - Protokolle OMV Reinheit, Enzymproduktion, und die SC-ST Vernetzungseffizienz 7 zu bewerten.
6. Überprüfung der Enzym Verpackung
- PTE-Aktivitätstest
- Führen alle enzymatischen Assays in einem geeigneten Puffer, wie 100 mM CHES-Puffer (pH 8) bei 25 ° C entweder in einer Küvette oder in einer Well-Platte 96/384 gemultiplext.
- Werden 5 ul einer 1: 1.000-Verdünnung von Paraoxon in CHES-Puffer und 90 & mgr; l CHES und 5 & mgr; l gereinigter OMV (~ 36-fach konzentriert, im Vergleich zu der OMV-Konzentration im Kulturmedium).
Achtung: Paraoxon ist eine giftige Pestizidund muss pro Hersteller und institutionellen Richtlinien behandelt werden. - Nehmen Sie Extinktionsablesungen in regelmäßigen Abständen (alle 20 sec für ~ 2 Stunden Gesamtreaktionszeit) bei 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) und bei 348 nm (isosbestischer Punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) zu Überwachung der Reaktionsverlauf des chromogenen paraoxon Abbauprodukt, p - Nitrophenol.
HINWEIS: Bei pH - Werten über 8 die dominante deprotonierten Form p - Nitrophenol vorhanden ist , bei 405 nm für eine genaue Überwachung zu ermöglichen. In allen anderen komplexen oder niedrigerer pH - Lösungen ist es notwendig , den isosbestischen Punkt von 348 nm , wie mehrere Formen der p - Nitrophenol zu nutzen , wird anwesend sein. - Berechnen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten durch die Steigung des linearen Teils der Verlaufskurven aus Schritt 6.1.3 Bestimmung der relativen Menge des PTE in jeder Probe, Verpackungseffizienz und Gesamt PTE Produktion zu vergleichen.
- Führen Standard enzymatischeTestprotokolle K M, V max und k cat für die OMV verkapselt PTE zu bestimmen.
ANMERKUNG: Eine Analyse Lineweaver-Burk kann zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet werden , wenn der y-Intercept = 1 / V max und Steigung = K M / V max 20.
- Transmembran-Substrat / Produkt Diffusion.
- Führen die gleiche Analyse kinetischer Assay, wie in Schritt 6.1 unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Triton X-100 in Puffer CHES von 0-3 Vol% beschrieben.
HINWEIS: Die Zugabe von Triton X-100 zu den solubilisierten Funktionen OMV so dass die Lipid-Doppelschicht zu stören, für die der Inhalt der OMV zur Reaktionslösung frei zugänglich zu sein. - Berechnen und vergleichen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten an jedem Triton X-100 Ebene Trans Passage des Substrats / Produkt durch minimale Änderung der Enzymaktivität (Anfangsgeschwindigkeiten) angegeben, um zu überprüfen, verglichen zur Enzymaktivität in die Abwesenheit von Triton X-100. Wenn eine wesentliche Erhöhung der Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100 beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, daß das Substrat frei diffundieren nicht in das OMV.
- Assay freie Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100, der Enzymaktivität (wie in Abschnitt 6.1 oben beschrieben), um zu überprüfen, wird nicht durch das Tensid selbst gehemmt.
HINWEIS: Wenn Aktivität stark von Triton X-100, alternative Additive wie Saponine oder verschiedene Polysorbat / Tween-Tenside können besser geeignet sein Bersten der OMV Membran beeinflusst.
- Führen die gleiche Analyse kinetischer Assay, wie in Schritt 6.1 unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Triton X-100 in Puffer CHES von 0-3 Vol% beschrieben.
7. OMV über Speicher,
- Einfrieren
- Platz ~ 100 & mgr; l-Aliquots von gereinigtem OMV direkt in flüssigem Stickstoff zu schnappen die Aliquots einfrieren sicher nicht vollständig zu sein, um die Fläschchen in Wasser getaucht oder Kontakt mit einem flüssigen Stickstoff mit der Probe selbst.
HINWEIS: Gereinigte OMV direkt im Puffer werden einschnappen können eingefroren, die zum Lösen der OMV Pellet während des purificat ausgewählt wurdeIonen - Prozess ohne zusätzliche Gefrierschutzmittel notwendig 7. - Lagern Sie die schockgefroren Aliquots bei -80 ° C.
- Tauen gefrorenen Aliquots aus Schritt 7.1.1, indem sie bei RT sicher zu sein, nicht zu erwärmen, die Proben platzieren.
- Vor allen Proben für die Speicherung auf diese Weise vorbereitet führen den Enzymtest in Schritt 6.1 Vergleich Anfangsgeschwindigkeiten beschrieben vor und nach dem Einfrieren zu verifizieren, dass es keinen signifikanten Verlust der Enzymaktivität Beitrag Gefrier-Auftau.
HINWEIS: Shop gereinigt OMV bei 4 ° C, wenn eine Verringerung der Enzymaktivität aufgrund von Gefrieren beobachtet wird.
- Platz ~ 100 & mgr; l-Aliquots von gereinigtem OMV direkt in flüssigem Stickstoff zu schnappen die Aliquots einfrieren sicher nicht vollständig zu sein, um die Fläschchen in Wasser getaucht oder Kontakt mit einem flüssigen Stickstoff mit der Probe selbst.
- Die Gefriertrocknung
- Lyophilisieren die schockgefroren gereinigte OMV Aliquots im Handel erhältliche Lyophilisation Ausrüstung verwendet 21.
- Die lyophilisierte Aliquots bei RT für Wochen oder bei -80 ° C für viele Monate.
- Das gleiche Volumen von gereinigtem Wasser auf das gefriergetrocknete OMV als vor der Lyophilisation und lassen Sie sich für 30 min bei RT stehen t rehydrierener probieren. Vorsichtig mischen, wenn notwendig, sicher zu sein, nicht zu verwirbeln oder die OMV beschallen.
- In lyophilisierten OMV Pulver direkt auf Point-of-Care für Anwendungen, in denen eine vorherige Verdünnung / Solubilisierung nicht notwendig ist.
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Representative Results
Gleichzeitige Expression von zwei rekombinanten Proteinen, wie für die OMV Verpackungsstrategie in diesem Protokoll detailliert erforderlich ist, kann durch eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Hier wird ein Zwei-Vektor-System wurde mit kompatiblen Replikationsursprünge und separaten induzierbaren Genkassetten verwendet. Für die Expression des PTE-SC konstruieren Kommerzielle Plasmidrückgrat (pACY184) konstruiert wurde eine Arabinose induzierbare Gen-Kassette und ein Doppel Arginin periplasmatische Lokalisation Leadersequenz durch eine Reihe von einzigartigen Restriktionsstellen, gefolgt umfassen die Klonierung des Enzymgens als zu erleichtern Fusion mit einem C-terminalen SC Protein. Das Plasmid - Konstrukt kodierend für das äußere Membrananker - Protein ist das kommerzielle Vektor pET22 die zur Kontrolle der Proteinexpression und die pelB periplasmatischen Lokalisierungssequenz des lac - Operons nutzt. Die kurze ST-Sequenz wurde in das abgeschnittene OmpA Protein geklont vor insertion in das Expressionsplasmid. In beiden Plasmiden wurde der C-terminalen Hexahistidin-Sequenz zur gleichzeitigen Identifikation der Fusionsproteine in OMV Proben zu ermöglichen, gehalten. Konstruktion und Charakterisierung dieser Genkonstrukte, die sowohl den N- und C - terminalen ST - Fusionskonstrukte zu OmpA, sind vollständig in Alves et al. 7. Die Genkonstrukte hierin beschriebenen nicht förderlich sein, um die Verpackung aller Enzyme. In einigen Fällen kann es notwendig sein, das periplasmatische Lokalisierungssignal zu ändern, die regulatorischen Elemente, oder die Epitop-Tags. Darüber hinaus werden einige Proteine können untragbar groß und nicht in der Lage, die innere Membran gänzlich quer. Enzymatische Aktivität und OMV Verpackungseffizienz nicht a priori bestimmt werden und müssen empirisch für jedes Zielprotein bestimmt werden.
Im Folgenden sind die Ergebnisse, die man in der Regel nach der erfolgreichen Durchführung o erwartenut dieses Protokoll. Eingeschlossen ist eine schematische Darstellung der beiden ST / SC Spaltproteindomänen, OmpA-ST und PTE-SC - Fusion sowie ein Beispiel für Isopeptid Bildung Konstrukte an der bakteriellen äußeren Membran und anschließender Verkapselung von PTE-SC innerhalb einer OMV (Figur 1) . Ebenfalls enthalten sind repräsentative Ergebnisse der gereinigten OMV Morphologie über SEM sowie Größenverteilung und absolute OMV - Konzentration bestimmt über Partikel - Tracking - Software (Abbildung 2). Die weitere Charakterisierung des OMV Proteingehalt und rekombinante Proteinexpression werden über SDS-PAGE und Western - Blot (Figur 3) zu sehen. Die Molekulargewichte für Proteine von Interesse spezifisch für das Protokoll hier zur Verfügung gestellten sind wie folgt: nativen OmpA (37,2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Gereinigtes OMV sollte ein dunkles Band haben bei etwa 37 kDa, die der hoch reichlich einheimische OmpA anzeigt. In Abhängigkeit von der Gel-Auflösung kann es mehrere ba seinnds in dieser Region des Gels, wie OmpA, OmpF und OmpC sind alle relativ reichlich vorhanden und ein ähnliches Molekulargewicht teilen. Eine weitere Band , die 2,2 kDa größer als OmpA-ST ist auch durch unsachgemäße Spaltung der Leader - Sequenz als Folge beobachtet werden, um den E. coli - Expressionsmaschinerie überwältigend. Es ist wichtig, dass eine erfolgreich gereinigt OMV Probe wird nicht viele andere stark exprimierte Proteine zu beachten. Wenn andere Bands vorhanden sind , entweder wurde die Reinigung nicht ordnungsgemäß durchgeführt oder die Bakterien verwendet - Stamm, um andere Proteine Verpackung werden nicht in diesem E. coli BL21 (DE3) -Stamm beobachtet.
Darüber hinaus haben Aktivitätstests und Vesikel Bruch Experimente zur Verfügung gestellt worden , repräsentative Ergebnisse zu zeigen , dass , wenn die enzymatische Substrat frei zu erwarten wäre , kann die OMV durch Trans Porin - Proteine (Abbildung 4) eingeben. Paraoxon relativ tritt frei dieOMV durch endogene Proteine Trans Porin mit dem verpackten PTE und das Reaktionsprodukt, p - Nitrophenol, auch verläuft relativ frei durch die OMV - Membran zu reagieren. Dieses Phänomen wird unter allen Produkt, Substrat und Enzymmengen nicht allgegenwärtig und experimentell bestimmt werden müssen. Obwohl erfolgreiche OMV Bruch und Enzymfreisetzung wurde mit geringen Konzentrationen von Detergens und PTE (hierin Triton X-100), solche Zusätze die Aktivität anderer Enzyme beeinträchtigen kann gesehen.
Plasmid Karten haben auch die Konstruktion eines Plasmids zwei Verpackungsstrategie zu veranschaulichen unter Verwendung der SC / ST - System (Figur 5) aufgenommen.
Abbildung 1: Regie Verpackung von Proteinen in die OMV. Die Kristallstrukturen für die verwendeten Proteine in der beschriebenen OMV Verpackung strategy: OmpA, PTE, SpyTag (ST) und SpyCatcher (SC); HVE: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI sind. Eine schematische Darstellung der OmpA-ST und PTE-SC-Fusionskonstrukte eine Isopeptid-Bindung an der äußeren Membran der Bakterien bildet gezeigt. Diese Membranfusion treibt Inkorporation des PTE innerhalb der Form OMV. Abbildung wiedergegeben (angepasst) von Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: OMV Charakterisierung. (A) SEM von Ultrazentrifuge gereinigt OMV aus nativen E. coli [BL21 (DE3)]. (B) Repräsentative Partikel trac König Größenverteilungen und (C) insgesamt Vesikelkonzentration gemittelt über 90 sec Beispiel liest für Native OMV, PTE-SC in Abwesenheit von Arabinose Aktivierung (PTE-Nr A), PTE-SC in Gegenwart von Arabinose Aktivierung (PTE-A) , N-terminal OmpA-ST cotransformiert mit PTE-SC in Gegenwart von Arabinose und IPTG Aktivierung (PTE / OMV-N) und der Ultrazentrifuge Überstand (UC Supernatant). Ein signifikanter Anstieg der OMV-Produktion wurde in der PTE / OMV-N Probe im Vergleich zur nativen OMV und PTE-SC-Konstrukte alleine beobachtet. OMV wurden in der UC Überstand zu demonstrieren, eine nahezu vollständige Wiederherstellung der OMV in der UC-Pellet so dass wenig bis gar keine OMV im Überstand Post Ultrazentrifugation quantifiziert. Alle Daten stellen Mittelwerte (± SD) von dreifachen Experimenten. Abbildung wiedergegeben (angepasst) von Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Gereinigte OMV Proteingehaltsbestimmung. (A) SDS-PAGE des gereinigten OMV UC Pellet der C-terminalen OmpA-ST - Fusions koexprimiert mit PTE-SC (PTE / OMV) -Konstrukt zeigen repräsentative Fülle von OmpA-ST, india OmpA, PTE-SC und dem OmpA- ST / PTE-SC Isopeptid Fusion. (B) Western - Blot - Analyse mit dem mitgelieferten His-Tag in der OmpA und PTE Verwendung konstruiert Visualisierung über einen anti-6xHis Antikörper zu erleichtern. Es ist wichtig zu beachten, dass PTE zu dimerisieren bekannt ist, wie durch die Anwesenheit von größeren Molekulargewicht auf dem Blot nachgewiesen his-markierte Spezies. Auch wenn es sehr hoch OmpA-ST sind Expressionsniveaus beobachtet es ist keine vollständige Umwandlung von freiPTE-SC an Membran OmpA-ST / PTE-SC gebunden. Trotz dieser Tatsache, empfehlen die Erhöhung der Gesamt PTE Produktion und eine verbesserte Verpackungseffizienz, dass während kovalente Bindungsbildung nicht überall die nicht-kovalente Assoziation der ST und SC Domains ist ein wichtiger Faktor in der gerichteten Verpackung innerhalb der OMV. Abbildung wiedergegeben (angepasst) von Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: PTE Aktivität und Verpackungs Charakterisierung. (A) Insgesamt PTE Expressionsniveaus und OMV Verpackungseffizienz über anfängliche Geschwindigkeitsmessungen bestimmt para VerwendungOxon als chromogenes Substrat Vergleich PTE in den Zellpellets, die UC-Überstand und das gereinigte UC OMV Pellets. (B) Repräsentative Daten die Verwendung von Triton X-100 (0,5% T100) den Nachweis der OMV - Doppelschicht ermöglicht den ungehinderten Zugang des Substrats an die OMV Innere zu stören. Vergleichen dieser Daten Assays in Abwesenheit von T100 durchgeführt erleichtert die Überprüfung der Translokation des Substrats über bilayers intakten OMV wenn enzymatische Anfangsgeschwindigkeiten unverändert sind. Im Fall von Paraoxon gab es sehr wenig Aktivitätsunterschied in Anwesenheit oder Abwesenheit von T100 beobachtet, was anzeigt, dass paraoxon auf der OMV frei durch die endogene Poren hindurchgeht. (C) PTE-SC kinetischen Daten passen zu Standard - Michaelis-Menten Enzymkinetiken Gleichung für PTE / OMV-N und PTE-A. (D) Eine Analyse Lineweaver-Burk zur Bestimmung K M und k cat / K M (48, 4,4 x 10 7; 44 & mgr; M, 4,9 x10 7 s -1 M -1) kinetischen Parameter als native Enzym ähnlich PTE Literatur (90 & mgr; M, 2,7 x 10 7 s -1 M -1) mit R 2 ≥ 0.999 in allen Fällen zu demonstrieren. Alle Daten stellen Mittelwerte (± SD) von dreifachen Experimenten. Abbildung wiedergegeben (angepasst) von Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Plasmidkonstrukte für das Beispiel hier beschriebene System. SpyCatcher modifizierte Enzym-SC (PTE-SC) Plasmid zur Einkapselung innerhalb der OMV gezielte (links). SpyTag modified Membrananker-ST (OmpA-ST-N) Plasmid (rechts). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Protokoll - Funktionen eine repräsentative gerichtet Verpackungstechnik zu demonstrieren , in dem ein Enzym von Interesse produziert und verpackt in die OMV durch E. coli. Wie bei vielen komplexen Techniken gibt es mehrere Bereiche, in denen das Protokoll zur Verwendung in verschiedenen einzigartigen Anwendungen aufzunehmen modifiziert werden, von denen einige im Folgenden beschrieben. Während der Mechanismus der OMV Verpackung und Enzym Verkapselung kann auf die spezifischen Bedürfnisse angepasst werden gibt es mehrere Schritte innerhalb dieses Protokoll, das für den Erfolg entscheidend sind. Die anfängliche Entfernung von intakten Bakterien und Zelltrümmer ist von wesentlicher Bedeutung und wird alle nachgeschalteten Versuche Quantifizierung oder Probenanalyse beeinflussen. Zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte mit anschließender Filtration in der Regel ausreicht, um diese Verunreinigungen zu entfernen. Allerdings sollte in allen Fällen darauf geachtet werden, wenn Umfüllen Lösungen nach dem Zentrifugieren die Übertragung von Verunreinigungen zu minimieren. In ähnlicher Weise die endgültige OMV Pellet obtained folgenden Ultrazentrifugation ist oft nur lose auf den Boden des Zentrifugenröhrchens geklebt. In der letzten Phase muß darauf geachtet werden, wenn die verbrauchte Kulturmedium zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Pellet am Boden des Gefäßes bleibt ungestört. In einigen Beispiel kann es am besten sein, die endgültige Kulturmedium Gerät, bis nach der Probenanalyse mittels DLS oder Nanopartikel-Tracking zu behalten das OMV-Pellet, um sicherzustellen, wurde in den letzten Schritten des Protokolls verloren. Im Folgenden sind einige weitere Bedenken, die sowohl mit diesem speziellen Protokoll und andere, die zugeschnitten sind auf die spezifischen Bedürfnisse der Forscher entstehen können.
Die Verwendung von PTE in diesem System sorgt für ein hervorragendes Modell Enzym Verkapselung für die Umweltsanierung von Organophosphat kontaminierten Regionen mit PTE durch ein alternatives Enzym oder Protein von Interesse leicht austauschbar zu sein. Wie hier beschrieben, führte die Coexpression von PTE-SC mit OmpA-ST in einer starken Zunahme der Gesamt PTE expressiauf sowie höhere Vesikel Produktionsniveaus mit mehr PTE in den Vesikeln im Vergleich zu PTE und PTE-SC allein ausgedrückt verpackt wird. Durch die Verringerung wird die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und dem Peptidoglycan durch die C-terminale Deletion von OmpA Hyper vesiculation erreicht. Dies bietet einen einfachen Weg für die Bakterien, die das rekombinante PTE zu exportieren, die die toxischen Wirkungen abschwächt, die oft in der Überexpression von nicht-nativen Proteinen beobachtet werden.
Während PTE kann leicht in diesem Modellsystem ersetzt werden, ist es wichtig, dass nicht alle Enzymsubstrate frei durch die OMV-Doppelschicht passieren zu beachten wird, und es ist daher unerlässlich, dass jedes einzigartige Enzym-Substrat-Paar auf einem von Fall zu Fall geprüft werden. Selbst wenn ein Substrat noch ein Enzym, in die OMV und die Zugabe von Triton X-100 oder geeignete alternative Tensid werden diese Technik nicht durch die Membran genutzt produzieren und verpacken kann bei ausreichend le hinzugefügt werdenvels die Vesikel vor der Verwendung zu brechen.
In Abwesenheit von rekombinanten Proteinexpression und Verpackung kann dieses Protokoll auch als grundlegende Methode für die OMV Produktion und Reinigung von unterschiedlichen Bakterienarten dienen. Alternative Verfahren zur Reinigung OMV, wie Dichtegradient - Fraktionierung 22, Membranfiltration 23 und die Ultrafiltration 24, gibt es auch und können weitere geeignete Techniken von der beabsichtigten Anwendung abhängig sein. Diese alternativen Reinigungsverfahren kann auch in diesem Protokoll anstelle des Ultrazentrifugation Pelletierung der OMV zur gerichteten Verpackung eines Proteins in eine OMV durch die Verwendung eines synthetischen biorthogonal Gestänge leicht ergänzt werden.
Andere Modifikationen können in diesem Protokoll sowie die ausgewählte Membran Anbinden Protein verwendet, um den spezifischen synthetischen Verbindungssystem hergestellt werden. Es gibt verschiedene Synthesestrategien für die Paarung zwei verschiedene Proteins innerhalb eines biologischen Systems , das sind: Split - Proteine 25, Coiled - Coils 26 und Split Inteinteile 27, um nur einige aufzuzählen. Andere Membran gebunden oder Transmembranproteine wie OmpF und OmpC würde wahrscheinlich für geeignete ST Modifikationsstellen sowie 28. In einigen Fällen kann es auch erforderlich sein, die ST- und SC-Domänen zu tauschen das SC auf dem Verankerungsprotein Platzierung und die viel kleineren ST auf dem rekombinanten Enzym / Protein. Es gibt auch eine Reihe von verschiedenen Klonierungsstrategien, die hier, einschließlich der Verwendung von mehreren Plasmiden unter gleichen oder unterschiedlichen Induktionssystemen implementiert werden kann, ein einziges Plasmid mit mehreren kodierten Proteine oder auch homologe Rekombinationstechniken unter Verwendung aller oder Teile der Ausdruck einzuarbeiten System in das bakterielle Genom.
Die Mikroumgebung der OMV hilft das verpackte Enzym reduzierende enzymatische Inaktivierung zu stabilisieren, die häufig unter weniger auftritt als ideal storage Bedingungen, Frost-Tau und Lyophilisation 29. Es wird auch erwartet, dass die OMV stark verbesserte Beständigkeit gegen proteolytischen Spaltung bieten wird als die OMV-Doppelschicht als eine physikalische Barriere zwischen dem aktiven Enzym funktioniert und die Proteine, die in der extra OMV Raum. Dieses Protokoll kann weiter ausgebaut werden, um eine nach außen liegende kleines Molekül, ein Peptid zu schließen, oder Protein-Tag gezielte Abgabe von OMV verkapselte Proteine und Affinitätsreinigung zu erleichtern. Während PTE die Ergebnisse dieser Studie, und der Inhalt dieses Protokolls für diese einzigartige Anwendung ausgewählt wurde, leicht analog Protein Verpackungsstrategien verwendet werden können in verschiedenen pharmazeutischen Abgabe zur Anwendung zu entwerfen, der medizinischen Diagnostik und der Umweltsanierung Anwendungen 30.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
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