Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54458
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

Abstract

עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה ​​של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת ​​התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.

Introduction

אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית ​​הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם 3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת 5,6.

המנגנונים המדויקים של biogenesis OMV אינם מתאפיינים היטב, נראים שונה בין מינים של חיידקים. למרות תיהים למעשה, פתחנו שיטה לשיפור יעיל האריזה של חלבון רקומביננטי לתוך OMV ידי יצירת הצמדה סינטתית בין חלבון של עניין וכן אנדוגני חלבון הנפוץ ביותר בקרום החיצוני חיידקי OMV שלאחר מכן. בהיעדר זיקה סינטתית, או זיקה שולבה באופן מלאכותי, בין חלבון recombinantly הביע ואת OMV את יעילות האריזה הנצפית היא מאוד נמוכה 7. תוצאה זו היא צפויה כמו שילוב של חלבונים בתוך OMV גם מתרחשת דרך אנקפסולציה מקריות בדיוק ברגע של היווצרות OMV על פני השטח חיידקי או באמצעות אריזות בבימויו של המנגנונים אינם מובנים היטב. חלק ההצלחה נצפתה חלבוני אריזה פשוט דרך על ביטוי במרחב periplasmic המסתמך על אנקפסולציה מקרית אלא אריזה יעילה מאוד חלבון תלוי עם כמה חלבוני אריזה ביעילות גבוהה בהשוואה לאחרים הב- אינו לארוז בכלל 8-10. על ידי ניצול טכניקות ביולוגיה סינטתית משותפות חפשנו להנדס Escherichia coli (E. coli) לייצר בו זמנית, חבילה ומפרישי אנזים פעיל עניין לתוך OMV עוקף מגבלות ידע קיימות לגבי איך OMV נוצרת וכיצד מטען נבחר על-ידי החיידקים אריזה.

לעניין יישום זה מערכת bioconjugation חלבון פיצול נבחרת ההצמדה הסינטתית בחירה כדי להקל אריזה כיוונית לתוך OMV. כפי שהשם מרמז מערכת bioconjugation חלבון פיצול מורכבת משני תחומים למקטע ומשלימים אינטראקציה זה עם זה. תחומי חלבון הפיצול שנבחרו לצורך פרוטוקול זה המכונה SpyCatcher (SC) ואת SpyTag (ST) התחום נגזרים פיברונקטין מחייב pyogenes סטרפטוקוקוס החלבון (FbaB) 11. מערכת חלבון פיצול זה הוא יוצא דופן בכך wתרנגולת שתי יחידות המשנה הן בתוך קרבת אג"ח isopeptide יוצרת באופן ספונטני בין הפרוקסימלי אספרטית שאריות חומצת חומצה ליזין אמינו יצירת הצמדה קוולנטי. היווצרות קשר Isopeptide אינה דורשת תוספת של חלבונים מלווים, אנזימים קטליטי, או קו-פקטורים ויכולה להתרחש בקלות בטמפרטורת חדר (RT) על פני טווח רחב של מצבים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית 12.

כהוכחה מושג, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) מ diminuta Brevundimonas נבחרה להיות ארוז לתוך E. coli נגזר OMV 13. PTE מכיל אתר binuclear Zn / Zn פעיל ויש לו את היכולת לשבור זרחנים אורגניים באמצעות תגובה הידרוליזה המרת aryldialkylphosphates לתוך dialkylphosphates ו כהלים aryl 14. חשיפה זרחנים אורגניים פוגעת בתפקוד העצבי הנכון דרך עיכוב הידרוליזה של אצטילכולין על ידי האצטילכולין בצמתים neuromuscular מאקיןתרכובות organophosphate נגזר g 15 מסוכן מאוד. ממושך או חשיפה משמעותית זרחנים אורגניים תוצאות נפוצות עוויתות בלתי נשלטת בדרך כלל גורם למוות באמצעות מחנק. בעוד PTE מציג את הפעילות הקטליטית הגבוהה ביותר כלפי paraoxon, דברה חזקה מאוד, הוא גם מסוגל hydrolyzing מגוון רחב של חומרי הדברה אחרות ו- V / G סוג גזי עצבים כימיים 16. כדי להקל על אריזת OMV, פלסמיד חיידקי תוכנן מקודד מבנה גן המכיל מקדם מושרה, רצף לוקליזציה periplasmic, ואתר שיבוט מרובה קצר במעלה זרם של רצף גן SC. החדרה של גן PTE בין מנהיג רצף SC מותר ליצירת מתג גנטי שמכוון את חלבון היתוך PTE-SC למרחב periplasmic לאריזת OMV. למרות שהמאמצים המתוארים כאן להתמקד PTE, גן האנזים הוא להחלפה יכול להיות מוחלף בקלות עם רצף גן אחר facאריזת ilitate של אנזים או חלבון חלופי.

כמו החלק השני של ההצמדה הסינטתית, חלבון הממברנה חיצוני בשפע (OmpA) נבחר להציג את רצף הפפטיד ST. בעוד הבחירה של חלבון עוגן יכול להשתנות, זה הכרחי כי החלבון יש דומיין מתירנית המציג במרחב periplasmic, סובל את ההיתוך לבנות ללא גרימת cytotoxicity, ידוע להיות נוכח OMV, ואינו מצטבר כאשר הוא recombinantly מיוצר. OmpA הוא חלבון 37.2 kDa הטרנסממברני Porin כי ידוע להיות מבוטא בכמות גבוהה בקרום החיצוני בקטריאלי ולאחר OMV 17. הוא מעורב התחבורה של מולקולות קטנות, <2 ננומטר בגודל, דרך הממברנה בקטריאלי 18. יש Native OmpA שני תחומים ייחודיים מבחינה מבנית, מוטיב חבית בטא הטרנסממברני וחלק periplasmically מסיס בטרמינל C-ידוע אינטראקציה עם 19 פפטידוגליקן. בשנות ה designe היתוך OmpA-ST מוטציהד כאן חלק מסוף-C של OmpA נמחק ואת ST היה התמזג N- periplasmically פונה או C-Termini. מחיקת חלק periplasmic של OmpA מקטינה את מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן וכתוצאה מכך יציבות הממברנה מובילה Hyper-vesiculation 7. הגנום OmpA נשמרה בנוסף לבנות OmpA-ST הביע recombinantly להמתיק יציבות הממברנה ברוטו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פלסמידים

  1. הכן פלסמיד (למשל, pET22) המכיל חלבון העוגן (OmpA) התמזגו לתחום הצמדה biorthogonal (המכונה בפרוטוקול זה כמו עוגן-ST), תג epitope (כגון 6xHis, תגי myc או דגל לטיהור והזדהות), תג לוקליזציה periplasmic, עמידות לאנטיביוטיקה, ומוצא מתאים של שכפול מבוסס על זן החיידקים הנבחר 7.
    1. תמצית ה- DNA פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
  2. כן פלסמיד (למשל, pACYC184) המכיל את האנזים / חלבון (PTE) להיות ארוז בתוך OMV התמזג תחום ההצמדה bioorthogonal משלים לזו של חלבון העוגן (המכונה בפרוטוקול זה כמו-SC אנזים), תג epitope, תג לוקליזציה periplasmic, עמידות לאנטיביוטיקה כי שונה פלסמיד החלבון העוגן, ואת orig המתאיםב של שכפול מבוסס על זן 7 החיידקים שנבחר.
    1. תמצית ה- DNA פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בעקבות של פרוטוקול היצרן 7.

2. דור של תרבות חיידק אריזת OMV

  1. בידוד פלסמיד
    1. לטהר פלסמידים קידוד-SC האנזים לבנות העוגנת-ST בונה שורות תאי תחזוקה נפרדות באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מסחרית לפי הפרוטוקול של יצרן 7. קביעת ריכוז ה- DNA וטוהר ידי מדידת ספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר.
  2. Co-טרנספורמציה
    1. בחר זן חיידק אשר זמין מסחרי כדי להקל ביטוי חלבון.
      הערה: BL21 (DE3) תאים נוצלו כאן. Lysogen T7 נדרש עבור ביטוי של המבנה עוגן-ST, אשר מסתמך על האמרגן T7 ו פולימראז T7 RNA עבור protביטוי עין. השימוש זני חיידקים אחרים דורש גם נוכחות של הגן T7 lysogen או שימוש פלסמיד מלבד pET22 7.
    2. לדלל DNA פלסמיד מטוהר לריכוזים טוחנים שווים אז להפוך אותם תאי חיידקיים מוסמך דרך או שינוי הלם חום או electroporation בעקבות הפרוטוקול של היצרן עבור התאים המוסמכים הנבחרים.
    3. פלייט טרנספורמציה תאים על אנטיביוטיקה המכילים לוריא- Bertani (LB) אגר צלחות בשתי אמפיצילין (pET22) ו chloramphenicol (pACYC184); הן בריכוזים סופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל.
    4. מניחים את צלחת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לבודד שיבוטים רק המכילים פלסמידים שניהם.
      הערה: מושבות ששורדות מבחר אנטיביוטי תשמשנה את כל הכנות OMV בעתיד. אנטיביוטיקה (אמפיצילין ו chloramphenicol) תתווסף לכל ההתרבויות הנוזליות כדי לשמור על לחץ סלקטיבי להבטיח במעמד שני פלסמידים.

3. הפקת OMV

  1. הרחבת המושבה
    1. לחסן 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות (מרק מצוין בדרך כלל (TB) או LB) המכילה אנטיביוטיקה בריכוזים הנ"ל (שלב 2.2.3) עם מושבה אחת מצלחות הבחירה המתוארות 2.2.4.
    2. בצע 1: דילול פי 100 של תרבות המתנע הלילה לתוך צלוחיות תרבות מבולבלות.
      הערה: השתמש נפח התקשורת בין 250-500 מ"ל.
    3. שמירה על תרבות ב 37 ° C רועד ב 250 סל"ד על מנת להבטיח כי אוורור מספיק של התרבות מושגת.
  2. אינדוקציה של כל פלסמיד
    1. אפשר תרבות החיידקים לגדול ל OD 600 של 0.6-0.8, כ 3 שעות של צמיחה לאחר החיסון של בקבוק הצמיחה העיקרי.
    2. כדי לשפר את התשואה הסופית של שלפוחית ​​טיעון PTE-SC, בצנטריפוגה התרבות השלמה ב 7,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend התא הגלול בתקשורת התרבות המחוממת מראש, טריה.
      הערה: זה optצעד ional מסייע להסיר כל OMV ריק שנמצאים התקשורת והתרבות לפני אינדוקצית PTE-SC.
    3. בצע פתרון המניה 20% של L-arabinose במים ולסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. פתרון L-arabinose חנות ב 4 ° C. במשך 2-4 שבועות.
    4. מוסיף את פתרון L-arabinose אל בקבוק התרבות לריכוז 0.2% סופי ליזום ייצור PTE-SC.
      הערה: זה עוזר לטעון מראש את המרחב periplasmic עם PTE-SC לפני קידום vesiculation מוגברת באמצעות אינדוקציה של מוטציה OmpA-ST.
    5. בצע פתרון 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במים ולסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: IPTG חייב לשמש מיד לאחר התייבשות. Aliquots של IPTG ניתן לאחסן קפוא במשך 3-6 חודשים ניתן להפשיר מיד לפני השימוש.
    6. הוספת IPTG לאחר תקופת דגירה 3 שעות נוספת לריכוז סופי של 0.5 מ"מ ליזום ייצור של OmpA-ST.
    7. אפשר המבוי הסתוםture לגדול במשך 8-14 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס תוך רעד.

4. טיהור OMV

  1. הסרת חיידקים שלמים
    1. צנטריפוגה תקשורת תרבית החיידקים במשך 15 דקות ב 7000 XG ב 4 ° C עד גלולות חיידקים שלמים.
    2. למזוג, ולשמור, התקשורת את החלק העליון של צנטריפוגה פוסט תא הגלול נזהר לא להפריע תא גלול.
    3. חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 עבור מחזור צנטריפוגה אחת נוספת על מנת להבטיח את כל החיידקים שלמים יוסרו מן התקשורת והתרבות וישלהקפיד למזוג ולשמור התקשורת.
  2. הסרת אגרגטים חלבון
    1. בהמשך לטהר את התקשורת ותרבות חיידקים באמצעות מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר להסיר שיירי חיידקים וחומר סלולר גדול לא רצוי.
      הערה: השתמש חומר הממברנה תואם ביולוגית החלמה גבוה חלבון ספיחה נמוכה כגון אצטט תאית (CA) או polyvinylidene difluoride (PVDF). כרכים מסנן מזרק פחות מ -100 מ"ל ואמצעי אחסון ואקום מסנן יותר מ -100 מ"ל.
      1. לסנן מזרק, לצייר בינוני תרבות לתוך מזרק 10-50 מ"ל סטרילי. צרף 0.45 מיקרומטר מסנן כדי Luer סוף המזרק. לדכא בוכנה ולאסוף זרימה דרך בכלי חדש.
      2. כדי לשאוב מסנן, להעביר בינוני תרבות מנגנון סינון סטרילי. צרף יחידת ואקום משאבה או לשקוע aspirator כדי ליצור יניקה. העבר בינוני מסוננים כלי חדש.
  3. בידוד של OMV באמצעות ultracentrifugation
    1. מוסיף את התקשורת והתרבות המסוננת לתוך צינורות צנטריפוגה נזהרו לאזן צינורות יריבים בצנטריפוגה.
    2. גלולה ב ~ 150,000 XG במשך 3 שעות ב 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge באמצעות הרוטור המקביל התאמה הן המכשיר וצינורות מנוצלים.
    3. למזוג תקשורת וההתרבות המדולדלת OMV מן גלולת OMV, נזהר שלא להפריע גלולת OMV, מייד עם השלמת oצנטריפוגה f כמאפשר גלולת OMV להישאר בתקשורת ירכך גלול צמצום התאוששות OMV.
      הערה: גלולה זו תהיה חום מעט בהתאם לכמות התחלתי של תרבות חיידקים עשוי או לא עשוי להיות גלוי על ידי עין. Aspirating התקשורת ישירות מהחלק העליון של הצינור צנטריפוגה היא גם אופציה תוך התחשבות שהתקשורת יותר יוסר OMV גלולה יותר טהור המדגם OMV הסופי יהיה.
    4. שמור את supernatant centrifuged עבור פיזור אור דינאמי מאוחר יותר בדיקות (DLS) על מנת לוודא כי חלקיקי OMV היו מתרוקנים לחלוטין מהתקשורת.
    5. להוסיף 0.5-1 מ"ל של בופר פוספט מסוננים סטרילית (PBS) pH 7.4 או 100 מ"מ N חומצה -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic (צ 'ס) חיץ ב- pH 8.0 כדי גלולה OMV שמאפשר לו דגירה במשך 30 דקות ב RT. ודא כי הגלולה לא להתייבש.
      הערה: קצות כוח יוני פתרון, pH וטמפרטורה עלולה לגרום מסיסות מופחתת OMV ולקדם aggregation.
    6. בזהירות pipet פתרון OMV מטוהר מצינור צנטריפוגות, ערבוב בעדינות כדי להבטיח הגלולה כולה כבר solubilized.

5. אפיון OMV

  1. השתמש בכל מעקב DLS או ננו-חלקיקים זמינות מסחרי תוכנות באות הפרוטוקולים של היצרן ספק ייחודיים לכל מכשיר כדי לקבוע התפלגות גודל OMV וריכוז חלקיקים.
    הערה: כאן, התפלגות גודל OMV וריכוז נקבע ניצול NanoSight LM10 מעקב Nanoparticle ו נ.ת.ע 2.3 תוכנת ניתוח.
    1. פתח את התוכנה.
    2. הפעל מיקרוסקופ ולנקות את כל המשטחים על היחידה מיקרוסקופ ומעקב ננו-חלקיקים.
    3. הוסף ~ 0.5 מ"ל של מדגם OMV ישירות בחלון התצוגה של מכשיר מעקב החלקיקים דרך Luer הולם עם מזרק 1 מ"ל סטרילי להיות בטוח כדי לכסות את חלון הצפייה כולו ללא הזרקת כל בועות אוויר לתוך המערכת.
    4. מקום tהוא ננו-החלקיקים לעקוב אחר יחידה על במת מיקרוסקופ ולהדליק את הליזר.
    5. לחץ על "לכיד" בתוכנה.
    6. התאם את המיקוד מיקרוסקופ הבמה כדי להמחיש את חלקיקי על ההווה במסך התצוגה המקדימה בחלון התוכנה.
    7. התאם את "תריס המצלמה" ו "מצלמת רווח" עד חלקיקים בהירים הם דמיינו בבירור על רקע כהה.
    8. התאם ללכוד משך זמן עד 60 שניות.
    9. לחץ על "שיא".
    10. כשתתבקש, קלט המדגם / טמפרטורה המכשיר, לתייג המדגם, ולשמור את הנתונים וידאו על השלמת כל נתקלים בתיקייה הייעודית המשתמש.
    11. שמור את כל פרמטרי הניתוח (סף זיהוי, לטשטש, אורך מסלול Min, גודל חלקיקים צפוי מינ ') על זיהוי אוטומטי' ולחץ על "רצף תהליך."
      הערה: עיין במדריך למשתמש עבור כיצד כל פרמטר יכול להיות מותאם באופן עצמאי לתוצאות ניתוח לכוונן.
    12. הפצת חלקיקי גודל חלקיקי שיא / mריכוז l כפי שנקבע על ידי התוכנה.
      הערה: טווח גודל הידרודינמית טיפוסי OMV היא בין 30-200 ננומטר עם ריכוז החלקיקים / מ"ל של ~ 10 x 10 8.
  2. קביעת תכולת חלבון OMV
    1. השתמש SDS-PAGE תקן ופרוטוקולים כתמים מערביים להעריך טוהר OMV, ייצור אנזים, ואת יעילות crosslinking SC-ST 7.
      הערה: יעילות Crosslinking לא תהיה 100% 7.

6. אימות של אריזת האנזים

  1. Assay פעילות PTE
    1. לבצע את כל מבחני אנזימטיות חיץ מתאים כגון 100 מ"מ צ'ס חיץ (pH 8) במהירות של 25 מעלות צלזיוס או קובט או מרובבים בצלחת 96/384 היטב.
    2. הוסף 5 μl של דילול 1: 1,000 של paraoxon במאגר צ'ס 90 μl של צ'ס ו -5 μl של OMV מטוהרים (~ 36-לקפל מרוכז לעומת ריכוז OMV נוכח התקשורת והתרבות).
      זהירות: Paraoxon הוא חומר הדברה רעילויש לטפל לפי יצרן והנחיות מוסדיות.
    3. קח קריאות ספיגות במרווחי זמן קבועים (כל 20 שניות ~ 2 hr זמן תגובה כולל) ב 405 ננומטר (ε = 18.1 מ"מ -1 -1 סנטימטר) ועל 348 ננומטר (ε נקודת isosbestic = 5.4 מ"מ -1 -1 סנטימטר) כדי לפקח על התקדמות התגובה של מוצר התמוטטות paraoxon chromogenic, p -nitrophenol.
      הערה: בערכי pH מעל 8 בצורת deprotonated הדומיננטית של p -nitrophenol קיימת המאפשרת ניטור מדויק ב 405 ננומטר. בכל פתרונות pH המורכב או אחרים התחתונים יש צורך לנצל את נקודת isosbestic של 348 ננומטר כמו צורות שונות של -nitrophenol p תהיינה נוכחות.
    4. חישוב מהירויות התגובה הראשונית על ידי קביעת השיפוע של החלק הליניארי של עקומות התקדמות משלב 6.1.3 להשוות את הכמות היחסית של PTE בכל מדגם, יעילות אריזה, וייצור PTE הכולל.
    5. בצע האנזימטית תקןפרוטוקולים assay כדי לקבוע K M, V מקס החתול k עבור OMV כמוס PTE.
      הערה: ניתוח Lineweaver-בורק יכול להיות מנוצל עבור קביעת פרמטרים קינטיים אלה שבהם y ליירט = 1 / V max והשיפוע = K M / V מקסימום 20.
  2. המצע הטרנסממברני / דיפוזיה מוצרים.
    1. לבצע את ניתוח assay הקינטית אותו כמתואר בשלב 6.1 ניצול ריכוזים גוברים של טריטון X-100 ב חיץ צ'ס מן 0-3% לפי נפח.
      הערה: התוספת של טריטון X-100 לפונקציות OMV solubilized לשבש את bilayer השומנים המאפשר את התוכן של OMV שיהיה נגיש בקלות לפתרון התגובה.
    2. לחשב ולהשוות את מהירויות הראשונית בכל רמת טריטון X-100 כדי לוודא מעבר הטרנסממברני של מוצר המצע / שמציין שינוי מזערי פעילות אנזים (מירויות ראשוניות) לעומת אנזים פעילות in בהיעדר טריטון X-100. אם גידול משמעותי בפעילות האנזים הוא ציין בנוכחות טריטון X-100 סביר להניח כי המצע אינו מפוזר באופן חופשי לתוך OMV.
    3. פעילות אנזים חינם Assay (כמתואר לעיל בסעיף 6.1) בנוכחות של טריטון X-100 כדי לוודא פעילות אנזימים לא מעוכבת על ידי הפעיל השטח עצמו.
      הערה: אם הפעילות מושפעת במידה רבה על ידי Triton X-100, תוספים אלטרנטיביים כגון ספונינים או polysorbate השונה / שטח tween עשוי להיות מתאים יותר כדי לקרוע את קרום OMV.

7. אחסון OMV

  1. קְפִיאָה
    1. aliquots המקום ~ 100 μl של OMV מטוהר ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להצמיד להקפיא את aliquots להיות בטוח שלא להטביע את הצלוחיות או ליצור קשר עם כל חנקן נוזלי מלאים עם המדגם עצמו.
      הערה: מטוהרים OMV ניתן הצמד קפוא ישירות למאגר כי נבחר solubilizing גלולה OMV במהלך purificatתהליך היון ללא cryoprotectants נוסף 7 צורך.
    2. אחסן את aliquots קפוא הצמד ב -80 מעלות צלזיוס.
    3. להפשיר aliquots קפוא משלב 7.1.1 ידי הצבתם ב RT להיות בטוח שלא לחמם את דגימות.
    4. לפני הכנת כל הדגימות לאחסון באופן זה לבצע את assay האנזים המתואר בשלב 6.1 השוואת מהירויות הראשונית לפני ואחרי הקפאה כדי לוודא כי אין אובדן משמעותי להקפיא להפשיר פוסט פעילות האנזים.
      הערה: חנות מטוהרים OMV ב 4 ° C אם הפחתה בפעילות האנזים הוא ציין עקב ההקפאה.
  2. lyophilization
    1. Lyophilize את aliquots OMV המטוהר קפוא צמד שימוש בציוד lyophilization הזמין מסחרי 21.
    2. חנות lyophilized aliquots ב RT במשך שבועות או ב -80 מעלות צלזיוס במשך חודשים רבים.
    3. להוסיף את אותו נפח של מים מטוהרים אל OMV lyophilized כמו לפני lyophilization ולתת לעמוד ב RT למשך 30 דקות רעננותם tהוא לדגום. מערבבים בעדינות בעת הצורך להיות בטוח שלא מערבולת או sonicate OMV.
    4. להוסיף אבקת OMV lyophilized ישירות Point-of-care עבור יישומים בהם / דילול לפני solubilization אינו הכרחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביטוי סימולטני של שני חלבונים רקומביננטיים, כפי שנדרש לצורך אסטרטגית אריזת OMV המפורטים בפרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות מספר דרכים שונות. כאן, מערכת וקטור שני נוצלה עם מקורותיה התואמים של שכפול קלטות גן מושרים נפרדות. על מנת לתת הביטוי של PTE-SC לבנות עמוד שדרת פלסמיד המסחרי (pACY184) תוכנן לכלול קלטת גן arabinose מושרה ו תאום ארגינין רצף מנהיג לוקליזציה periplasmic ואחריו שורה של אתרי הגבלה ייחודיים כדי להקל שיבוט של גן האנזים בתור היתוך חלבון SC C-terminal. הבונה פלסמיד המקודד את החלבון עוגן הקרום החיצוני הוא pET22 וקטור מסחרי אשר מנצל את אופרון הלקטוז לבקרה של ביטוי חלבון ואת רצף לוקליזציה pelB periplasmic. רצף ST קצר שובט לתוך חלבון OmpA קטום לפני insertion לתוך פלסמיד ביטוי. בשני פלסמידים, רצף hexahistidine מסוף-C נשמר כדי לאפשר זיהוי סימולטני של חלבוני ההיתוך בדגימות OMV. בנייה ואפיון של מבנים גן אלה, כולל הן את המבנים היתוך N- ו- C- מסוף ST כדי OmpA, מתוארים באופן מלא אלבס et al. 7. קונסטרוקציות הגן המתוארות כאן לא יכולות להיות תורמות את כל האריזות של האנזימים. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך לשנות את אות לוקליזציה periplasmic, אלמנטים רגולטוריות, או את תגיות epitope. בנוסף, כמה חלבונים עשויים להיות גדולים להחריד ולא מסוגלים רוחביים את הקרום הפנימי לגמרי. הפעילות האנזימטית ויעילות האריזה OMV לא ניתן לקבוע מראש ויהיה צורך לקבוע באופן אמפירי עבור כל חלבון המטרה.

להלן תוצאות שאחד בדרך כלל היה לצפות לאחר o נושאת בהצלחהut בפרוטוקול זה. כולל הוא סכימטי של תחומי חלבון השני ST / SC המפוצל, OmpA-ST ואיחוי PTE-SC בונה וכן דוגמא של היווצרות isopeptide על הממברנה החיצונית חיידקי אנקפסולציה הבאה של PTE-SC בתוך OMV (איור 1) . כמו כן, נכללים תוצאות נציגי מורפולוגיה OMV מטוהר באמצעות SEM וכן התפלגות גודל וריכוז OMV מוחלט נקבע באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים (איור 2). אפיון נוסף של תכולת חלבון OMV ביטוי חלבון רקומביננטי נתפס באמצעות SDS-PAGE ו כתם מערבי (איור 3). משקולות מולקולרית של חלבונים של עניין ספציפי לפרוטוקול המובאים כאן הם כדלקמן: OmpA הילידים (37.2 KDA), OmpA-ST (23 KDA), PTE-SC (51 KDA), OmpA-ST / PTE-SC (74 KDA) . מטוהרי OMV צריך להקה בחושך ב כ 37 kDa וזה מעיד על OmpA יליד בהיקף הנרחב ביותר. בהתאם לרזולוצית ג'ל ייתכנו ba המרובהnds הנוכחי באזור זה של הג'ל כמו OmpA, OmpF ו OmpC כולם בשפע יחסית ולשתף משקל מולקולרי דומה. להקה נוספת שהוא פי 2.2 kDa גדול יותר OmpA-ST עשוי להיות גם ציין עקב מחשוף לא תקין של רצף המנהיג כתוצאת מכריע מכונה ביטוי E. coli. חשוב לציין כי מדגם OMV מטוהר בהצלחה לא יהיה הרבה חלבונים אחרים מבוטאים בכמות גבוהה. אם להקות אחרות נוכחות גם הטיהור בוצעה כהלכה או חיידקי זן מנוצלים ניתן חלבוני אריזה אחרים לא נצפו זה BL21 E. coli (DE3) זן.

יתר על כן, מבחני פעילות וניסויים קרע שלפוחית סופקו להפגין תוצאות נציג שניתן היה לצפות אם המצע האנזימטית יכול באופן חופשי להיכנס OMV באמצעות חלבונים Porin הטרנסממברני (איור 4). Paraoxon יחסית בחופשיות נכנסהOMV באמצעות חלבונים Porin הטרנסממברני אנדוגני להגיב עם PTE ארוז המוצר התגובה, p -nitrophenol, גם עובר יחסית בחופשיות דרך קרום OMV. תופעה זו לא תהיה בכל מקום בין כל המוצר, המצע, וערכות האנזים חייב להיקבע באופן ניסיוני. למרות שחרורו קרע ואנזים מוצלחים OMV כבר ראו עם ריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי PTE (להלן טריטון X-100), תוספות עשויות להשפיע על הפעילות של אנזימים אחרים.

מפות פלסמיד גם נכללו כדי להדגים את העיצוב של אסטרטגית אריזת שני פלסמיד ניצול SC / מערכת ST (איור 5).

איור 1
איור 1: אריזת בימוי של חלבונים לתוך OMV. מבנים גבישיים עבור החלבונים מנוצלים strat אריזת OMV תארEGY: OmpA, PTE, SpyTag (ST) ו SpyCatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, בהתאמה. ייצוג סכמטי של מבני היתוך OmpA-ST והטוראי-SC ויוצרים אג"ח isopeptide על הממברנה החיצונית של החיידקים מוצג. היתוך קרום זה שמניע התאגדות של PTE בתוך OMV הטביעה. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ '24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: אפיון OMV. (א) SEM של ultracentrifuge מטוהרים OMV מן החיידק הילידים [BL21 (DE3)]. (ב) טראק חלקיקים נציג המלך הפצות גודל ו- (ג) ריכוז שלפוחית הכולל בממוצע לכל 90 שניות מדגם קורא עבור Native OMV, PTE-SC בהעדר ההפעלה arabinose (PTE-No A), PTE-SC בנוכחות ההפעלה arabinose (PTE-A) , טרנספורמציה שיתוף OmpA-ST N-terminal עם-SC PTE בנוכחות arabinose והפעלה IPTG (PTE / OMV-N), ואת supernatant ultracentrifuge (UC supernatant). עלייה משמעותית בייצור OMV נצפתה במדגם PTE / OMV-N לעומת OMV Native וטוראי-SC בונה לבד. OMV כומתו ב supernatant UC להפגין התאוששות מלאה כמעט של OMV גלולה UC עוזב לא מעט על מנת OMV ב ultracentrifugation פוסט supernatant. כל הנתונים מייצגים אמצעי (± סטיית תקן) של ניסויים בשלושה עותקים. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ '24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה.ד / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: קביעת תכולת חלבון המטוהר OMV. (א) SDS-PAGE של גלולת OMV UC המטוהרת של ההיתוך בטרמינל C-OmpA-ST coexpressed עם-SC PTE (PTE / OMV) לבנות הוכחת שפע נציג OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC ואת OmpA- ST / PTE-SC היתוך isopeptide. (ב) ניתוח כתם מערבי ניצול ההווה שלו-התג הכלול OmpA וטוראי בונה כדי להקל להדמיה באמצעות נוגדן אנטי 6xHis. חשוב לציין כי PTE ידוע dimerize, כפי שמעיד על הכתם על ידי הנוכחות של משקל מולקולרי גדול מינה-tagged. למרות שישנם מאוד גבוהות רמות ביטוי OmpA-ST נצפו אין המרה מלאה של בחינםPTE-SC קרום כבול OmpA-ST / PTE-SC. למרות זאת, העלייה בייצור PTE הכולל ויעילות שיפור באריזה מראה כי בעוד היווצרות קשר קוולנטי היא לא נמצא בכל מקום העמותה הלא קוולנטיים של ST ותחומי SC היא גורם חשוב באריזה מכוונת בתוך OMV. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ '24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: פעילות PTE ואפיון האריזה. (א) PTE בסך הכל רמות הביטוי ויעילות האריזה OMV נקבע באמצעות מדידות מהירות התחלתית ניצול סעיףOxon כמו מצע chromogenic השוואת ההווה PTE של כדורי תא, supernatant UC, ואת כדורי UC OMV מטוהרים. (ב) נציגי נתונים הוכיחו את השימוש טריטון X-100 (0.5% T100) לשבש את bilayer OMV המאפשר גישה ללא הפרעה של מצע אל OMV הפנים. השוואת נתונים אלה מבחנים שבוצעו בהעדר T100 מקלה אימות של טרנסלוקציה של מצע ברחבי bilayers שלמי OMV אם מירויות ראשוניות האנזימטית הן ללא שינוי. במקרה של paraoxon היה הבדל פעילות מעט מאוד שנצפתה קיומו או אי קיומו של T100 המציין paraoxon עובר בחופשיות דרך נקבוביות אנדוגני על OMV. (C) PTE-SC בכושר נתונים הקינטית משוואה קינטיקה אנזימטית תקן מיכאליס-מנטן עבור PTE / OMV-N וטוראי-A. (ד) ניתוח Lineweaver-בורק המשמש לקביעת K M וחתול k / K M (48, 4.4 x 10 7; 44 מיקרומטר, 4.9 x10 7 שניות -1 M -1, בהתאמה) הוכחת פרמטרים קינטיים ספרות PTE דומים כמו אנזים הילידים (90 מיקרומטר, 2.7 x 10 7 שניות -1 M -1) עם R 2 ≥ 0.999 בכל המקרים. כל הנתונים מייצגים אמצעי (± סטיית תקן) של ניסויים בשלושה עותקים. איור לשכפל (מותאם) מאל et אלבס. ACS Appl Mat ממשקים (2015), 7 (44), עמ '24,963-24,972 7. זכויות יוצרים 2015 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: בונה פלסמיד נציג למערכת הדוגמה המתוארת כאן. אנזים-SC שונה SpyCatcher (PTE-SC) פלסמיד ממוקד עבור אנקפסולציה בתוך OMV (משמאל). SpyTag modifקרום מטען עוגן-ST (OmpA-ST-N) פלסמיד (מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולציה האריזה אנזים OMV ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ישנם מספר צעדים בתוך פרוטוקול זה אשר הם קריטיים להצלחתו. ההסרה הראשונית של חיידק שלם ופסולת הסלולר היא בעל חשיבות משמעותית תשפיע על כל הניסיונות במורד הזרם ב quantitation או ניתוח מדגם. שני צעדים צנטריפוגה רצופים ואחריו הסינון הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר מזהמים אלה. עם זאת, בכל טיפול במקרים יש לנקוט בעת פתרונות decanting לאחר צנטריפוגה כדי למזער העברת מזהמים. באופן דומה, o הגלולה הסופית OMVultracentrifugation הבא btained הוא לעתים קרובות רק דבק רופף התחתון של הצינור צנטריפוגות. בשלבים הסופיים, יש להקפיד בעת הסרת בינוני התרבות בילה על מנת להבטיח כי הגלולה נשארת באין מפריעה בחלק התחתון של הספינה. במקרה מסוים זה עשוי להיות טוב ביותר כדי לשמור על מדיום התרבות הסופי עד לאחר ניתוח מדגם באמצעות מכשיר DLS או מעקב ננו-חלקיקים על מנת להבטיח גלולת OMV לא נעלמה מעיניו של השלבים הסופיים של הפרוטוקול. להלן כמה חששות נוספים שעלולים להתעורר עם שני פרוטוקול המסוים הזה ואחרים המותאמות לצרכים הספציפיים של החוקרים.

השימוש PTE במערכת זו מספקת עבור אנקפסולציה אנזים מודל מצוין עבור תיקון הסביבה של אזורים מזוהמים organophosphate עם PTE להיות להחלפה בקלות על ידי אנזים חלופי או חלבון של עניין. כפי שתואר כאן Coexpression של PTE-SC עם OmpA-ST הביאה לעלייה גדולה expressi PTE הכוללתעל וכן רמות ייצור שלפוחית ​​גבוהות עם יותר PTE שצריך לארוז בתוך השלפוחית ​​לעומת PTE והטוראי-SC הביע לבד. על ידי הפחתת מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן דרך המחיקה C- מסוף של OmpA Hyper-vesiculation מושגת. זה מספק נתיב קל עבור חיידקים לייצא את PTE רקומביננטי, הממתנת את ההשפעות הרעילות כי הם נצפו לעתים קרובות ביטוי יתר של חלבונים שאינם ילידי הארץ.

בעוד PTE ניתן להחליף בקלות במערכת מודל זה חשוב לציין שלא כל מצעי אנזים יעברו בחופשיות דרך bilayer OMV ועל כן הכרחי כי כל אנזים ייחודי זוג מצע להיבדק בכל מקרה לגופו. גם אם מצע אינו עובר דרך הממברנה טכניקה זו יכול עדיין להיות מנוצל כדי לייצר ולארוז אנזים לתוך OMV והוסיף טריטון X-100, או פעיל שטח חלופי הולם, ניתן להוסיף מספיק levels להתפקע השלפוחית ​​לפני השימוש.

בהיעדר ביטוי חלבון רקומביננטי ואריזת פרוטוקול זה יכול לשמש גם שיטה בסיסית לייצור וטיהור OMV ממיני חיידקי מגוונים. שיטות חלופיות לטיהור OMV, כגון חלוקת שיפוע צפיפות 22, קרום סינון 23, ו-סינון אולטרה 24, קיימות גם ועלולות להיות טכניקות מתאימות יותר בהתאם ליישום המיועד. טכניקות טיהור חלופיות אלו יכולות גם להיות בתוספת בנקל בפרוטוקול זה במקום של pelleting ultracentrifugation של OMV עבור האריזה בבימויו של חלבון לתוך OMV וזאת באמצעות כלי הצמדה סינטתית biorthogonal.

שינויים אחרים יכולים להתבצע למערכת ההצמדה הסינטתית הספציפית מנוצלת בפרוטוקול זה, כמו גם את חלבון קשירת קרום שנבחר. ישנן אסטרטגיות סינטטיות שונות עבור זיווג שני חלבונים שוניםהים בתוך מערכת ביולוגית הכוללים: חלבוני פיצול 25, סלילים מפותלים 26, ולפצל 27 inteins, רק לרשימה כמה. חלבונים בממברנה אחרים כבול או הטרנסממברני כגון OmpF ו OmpC יספקו סבירים עבור אתרי ST שינוי מתאימים גם 28. במקרים מסוימים זה יכול להיות גם צורך להחליף את ST ותחומי SC צבת SC על חלבון העיגון ואת ST הקטן בהרבה על האנזים / חלבון רקומביננטי. ישנם גם מספר אסטרטגיות שיבוט שונים שניתן ליישם כאן כוללים שימוש פלסמידים מרובים תחת מערכות אינדוקציה הזהות או שונות, פלסמיד אחד עם חלבונים מרובים מקודד, או אפילו תוך שימוש בטכניקות הומולוגיות לשלב את כל או חלקים של הביטוי המערכת לתוך הגנום של חיידקים.

במיקרו-סביבה של OMV עוזר לייצב את האנזים ארוז צמצום איון האנזימטית המתרחשת כלל מתחת פחות אידיאלי stתנאי orage, ההפשרה להקפיא, ו lyophilization 29. זה צפוי גם כי OMV יספק עמידות משופרת מאוד כדי מחשוף פרוטאוליטים כמו bilayer OMV יתפקד כמחסום פיזי בין האנזים פעיל ואת החלבונים המצויים במרחב החוץ-OMV. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר לכלול פפטיד, מולקולה קטן חיצוני מול, או תג חלבון כדי להקל משלוח ממוקד של חלבונים וטיהור זיקה כמוסים OMV. בעוד PTE נבחר יישום ייחודי זה את התוצאות של מחקר זה, ואת התוכן של פרוטוקול זה, יכולים להיות מנוצלים בקלות לעצב אסטרטגיות אריזת חלבון מקבילות לשימוש משלוח תרופות מגוון, יישומים רפואיים אבחון, וטיפול סביבתי 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG Any Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose Any Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C.
Ampicillin Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
Chloramphenicol  Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
TB/LB Culture Media Any Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100 Any One of many potential suitable surfactants.  
Baffled culture flasks Any The baffles promote higher levels of aeration.  
CHES Fisher Bioreagents BP318-100 Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon Chem Service N-12816 Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.  
Syringe Filter 0.45 µm Thermo Scientific 60183-221 (30 mm) Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator New Brunswick Excella E24 Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. 
Sorvall Culture Centrifuge Thermo Scientific RC 5B PLUS Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge  Thermo Scientific WX Ultra 90 Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor Thermo Scientific AH-629 Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) Beckman Coulter 344058 Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer  Tecan Infinite M1000 Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS/particle tracking NanoSight  LM10 Necessary for OMV size distribution and concentration determination.  
BL21(DE3) NEB Suitable bacterial expression strain.
pET22 EMD Millipore 69744-3 Other plasmids can be used in place of these.  
pACYC184 NEB Other plasmids can be used in place of these.  
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Example kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

Tags

ביוכימיה גיליון 117 שלפוחית ​​קרום חיצוני (OMV) טיהור אריזה מכוונת אנזים, הצמדת bioorthogonal phosphotriesterase (PTE) יציבות משופרת
אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, … More

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification. J. Vis. Exp. (117), e54458, doi:10.3791/54458 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter