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Biochemistry

से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54458
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

Abstract

बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMV) कार्यक्रम के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों को लागू करने में एक बढ़ती रुचि OMV के लिए कुछ बहुत ही रोचक और अद्वितीय अनुप्रयोगों जहां पारंपरिक नैनोकणों भी synthesize करने के लिए मुश्किल साबित हो रहे हैं करने के लिए नेतृत्व कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, सभी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया है कि छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और आनुवंशिक सामग्री शामिल कार्गो की एक किस्म के OMV प्रदर्शन पैकेजिंग उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। उनके विविध माल के आधार पर, OMV कई जैविक सेल सेल संचार से जीन स्थानांतरण और निर्भर करता है जिस पर बैक्टीरिया OMV उत्पादन कर रहे हैं विषैलापन कारकों की डिलीवरी को लेकर प्रक्रियाओं में फंसा रहे हैं। हाल ही में बैक्टीरियल OMV तकनीकों के विकास के माध्यम से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग को नियंत्रित करने और OMV में पुनः संयोजक प्रोटीन की प्रत्यक्ष पैकेजिंग के लिए सुलभ हो गए हैं। इस प्रोटोकॉल के उत्पादन, शुद्धि के लिए एक विधि है, और एंजाइम पैक OMV के उपयोग का वर्णन करता है प्रदान करने के लिए Overa में सुधारपुनः संयोजक एंजाइम, बढ़ vesiculation, और बढ़ाया एंजाइम स्थिरता के डालूँगा उत्पादन। इस प्रोटोकॉल के सफल उपयोग के एक जीवाणु तनाव है कि एक साथ एक पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन और पुनः संयोजक प्रोटीन और एक बाहरी झिल्ली लंगर प्रोटीन के बीच एक कृत्रिम संबंध बनाने के माध्यम से OMV encapsulation के लिए यह निर्देश के निर्माण में परिणाम होगा। दवा दवा वितरण, चिकित्सा निदान, और पर्यावरण remediation: इस प्रोटोकॉल भी बैक्टीरियल संस्कृतियों के साथ ही समुचित से निपटने की तकनीक और चीजों से OMV अलग है जब इस तरह के रूप में अन्य विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल पर विचार करने के लिए तरीके का विवरण।

Introduction

यहाँ प्रस्तुत डिजाइन, उत्पादन, और एंजाइम से भरी हुई बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMV) की शुद्धि के लिए एक विधि है। OMV, proteoliposomes कि 30-200 एनएम 1,2 से आकार में सीमा छोटे, मुख्य रूप से unilamellar हैं। सभी ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया है कि तिथि करने के लिए अध्ययन किया गया है उनकी सतह 3,4 से या तो OMV या बाह्य पुटिकाओं (ईवी) की रिहाई का प्रदर्शन किया है। सटीक व्यवस्था है जिसके द्वारा OMV उत्पादित कर रहे हैं अभी तक पूरी तरह से विविध बैक्टीरियल आबादी है कि उन्हें करने के साथ ही अलग-अलग कार्य करता है कि वे सेवा छिपाना के कारण स्पष्ट किए जाने की है। OMV आनुवंशिक जटिल संकेतन, जीन स्थानान्तरण के एक किस्म की सेवा सामग्री के लिए छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, और प्रोटीन से माल की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन के लिए दिखाया गया है, और डाह में कार्य 5,6।

OMV जीवजनन की सटीक तंत्र अच्छी तरह से होती नहीं कर रहे हैं, और बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच अलग दिखाई देते हैं। थी बावजूदतथ्य यह है, हम ब्याज की एक प्रोटीन और बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली के लिए एक बेहद प्रचुर मात्रा में प्रोटीन अंतर्जात और बाद OMV के बीच एक कृत्रिम संबंध बनाने के द्वारा OMV में एक पुनः संयोजक प्रोटीन की पैकेजिंग दक्षता बढ़ाने के लिए एक विधि विकसित किया है। एक कृत्रिम उठाना, या कृत्रिम रूप से शामिल समानता के अभाव में, recombinantly व्यक्त प्रोटीन और OMV के बीच मनाया पैकेजिंग क्षमता बहुत कम 7 है। यह परिणाम OMV के भीतर प्रोटीन या तो बैक्टीरियल सतह पर या निर्देशित पैकेजिंग के माध्यम से OMV गठन की सटीक पल में यादृच्छिक मौका encapsulation के माध्यम से होता है तंत्र द्वारा कि अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं के समावेश के रूप में उम्मीद की जा रही है। कुछ सफलता periplasmic जो अंतरिक्ष यादृच्छिक मौका encapsulation लेकिन प्रभावी पैकेजिंग पर निर्भर करता है के भीतर अभिव्यक्ति पर बस के माध्यम से प्रोटीन पैकेजिंग में देखा गया है अत्यधिक प्रोटीन कुछ प्रोटीन उच्च दक्षता पर निर्भर पैकेजिंग के साथ दूसरों वीं की तुलनासभी 8-10 पर पर पैकेज नहीं है। आम सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग करके हम कोलाई (ई कोलाई) एक साथ उत्पादन, पैकेज और कहा कि वर्तमान ज्ञान के बारे में कैसे OMV का गठन कर रहे हैं और कैसे कार्गो के लिए बैक्टीरिया द्वारा चुना जाता है सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न OMV में ब्याज की एक सक्रिय एंजाइम छिपाना इंजीनियर करने की मांग की पैकेजिंग।

इस आवेदन के प्रयोजनों के लिए के रूप में पसंद के सिंथेटिक लिंकेज OMV में दिशात्मक पैकेजिंग की सुविधा के लिए एक विभाजन प्रोटीन bioconjugation प्रणाली का चयन किया गया था। जैसा कि नाम से पता चलता है एक विभाजन प्रोटीन bioconjugation प्रणाली दो पूरक सबयूनिट डोमेन है कि एक दूसरे के साथ बातचीत के शामिल है। विभाजन प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए चयनित डोमेन SpyCatcher (एससी) और SpyTag (अनुसूचित जनजाति) डोमेन के रूप में और स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस fibronectin बाध्यकारी प्रोटीन (FbaB) 11 से निकाली गई है करने के लिए भेजा जाता है। इस विभाजन प्रोटीन प्रणाली है कि w में असामान्य हैमुर्गी दो यूनिटों निकटता के भीतर एक isopeptide बंधन हैं अनायास एसिड और अमीनो एसिड लाइसिन एक सहसंयोजक उठाना बनाने के अवशेष aspartic समीपस्थ बीच रूपों। Isopeptide बंधन गठन निगरानी प्रोटीन, उत्प्रेरक एंजाइमों, या सहकारकों के अलावा आवश्यकता नहीं है और आसानी से कमरे के तापमान (आर टी) में और physiologically प्रासंगिक शर्तों 12 की एक विस्तृत श्रृंखला पर हो सकता है।

अवधारणा के एक सबूत के रूप में, phosphotriesterase (PTE) (ईसी 3.1.8.1) Brevundimonas diminuta से ई कोलाई निकाली गई OMV 13 में पैक किया जा करने के लिए चुना गया था। प्राइवेट एक binuclear Zn / Zn सक्रिय साइट में शामिल है और एक हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया dialkylphosphates और aryl एल्कोहल 14 में aryldialkylphosphates परिवर्तित करने के माध्यम से organophosphates नीचे तोड़ने के लिए की क्षमता है। organophosphates के संपर्क में neuromuscular जंक्शनों makin पर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ द्वारा acetylcholine की हाइड्रोलिसिस बाधा के माध्यम से उचित न्यूरोट्रांसमीटर समारोह impairsजी organophosphate निकाली गई यौगिकों बेहद खतरनाक 15। लंबे समय तक या organophosphates के लिए महत्वपूर्ण जोखिम सामान्यतः बेकाबू आक्षेप में यह परिणाम है और आम तौर पर asphyxiation के माध्यम से मृत्यु का कारण बनता है। प्राइवेट paraoxon की ओर उच्चतम उत्प्रेरक गतिविधि दर्शाती है, वहीं एक बहुत शक्तिशाली कीटनाशक, यह भी अन्य कीटनाशकों और वी / जी प्रकार के रासायनिक तंत्रिका एजेंटों 16 के एक विस्तृत रेंज hydrolyzing में सक्षम है। OMV पैकेजिंग की सुविधा के लिए एक जीवाणु प्लाज्मिड डिजाइन किया गया था कि एक जीन का निर्माण है कि एक inducible प्रमोटर, एक periplasmic स्थानीयकरण अनुक्रम, और अनुसूचित जाति जीन अनुक्रम की नदी के ऊपर एक छोटे से कई क्लोनिंग साइट में शामिल encodes। नेता और अनुसूचित जाति अनुक्रम एक आनुवांशिक स्विच है कि OMV पैकेजिंग के लिए periplasmic अंतरिक्ष के लिए प्राइवेट अनुसूचित जाति संलयन प्रोटीन लक्ष्य के निर्माण के लिए अनुमति के बीच प्राइवेट जीन की प्रविष्टि। प्रयासों यहाँ वर्णित PTE पर ध्यान केंद्रित करते हैं, एंजाइम जीन विनिमेय है और आसानी से Fac को एक और जीन अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकताएक वैकल्पिक एंजाइम या प्रोटीन की ilitate पैकेजिंग।

सिंथेटिक लिंकेज के दूसरे भाग के रूप में, एक प्रचुर मात्रा में बाहरी झिल्ली प्रोटीन (OMPA) अनुसूचित जनजाति पेप्टाइड अनुक्रम पेश करने के लिए चुना जाता है। जबकि लंगर प्रोटीन भिन्न हो सकते हैं की पसंद है, यह जरूरी है प्रोटीन एक अनुमोदक डोमेन कि periplasmic अंतरिक्ष के भीतर प्रस्तुत करता है, cytotoxicity उत्प्रेरण बिना संलयन निर्माण बर्दाश्त, OMV में उपस्थित होने के लिए जाना जाता है, और कुल नहीं है जब यह recombinantly है उत्पादन किया। OMPA एक 37.2 केडीए transmembrane Porin प्रोटीन है कि अत्यधिक बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली और बाद OMV 17 में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है। यह छोटे अणुओं के परिवहन में फंसा है, आकार में 2 एनएम <बैक्टीरियल झिल्ली 18 के पार। मूल निवासी OMPA दो संरचनात्मक रूप से अद्वितीय डोमेन, एक transmembrane बीटा बैरल मूल भाव है और एक periplasmically घुलनशील सी टर्मिनल पेप्टीडॉग्लीकैन 19 के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता भाग है। उत्परिवर्ती OMPA-एसटी फ्यूजन तैयार बनाया गया मेंयहाँ घ OMPA के सी टर्मिनल भाग नष्ट कर दिया गया और अनुसूचित जनजाति periplasmically का सामना करना पड़ एन या सी-रोम से जुड़े हुए किया गया था। OMPA की periplasmic हिस्से को हटाना बाहरी झिल्ली और पेप्टीडॉग्लीकैन झिल्ली अस्थिरता हाइपर-vesiculation 7 के लिए अग्रणी में जिसके परिणामस्वरूप के बीच बातचीत की संख्या कम हो जाती है। जीनोमिक OMPA recombinantly व्यक्त OMPA-एसटी का निर्माण करने के अलावा बनाए रखा गया था सकल झिल्ली अस्थिरता को कम करने के लिए।

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Protocol

1. प्लास्मिड की तैयारी

  1. एक प्लाज्मिड (जैसे, pET22) लंगर प्रोटीन युक्त (OMPA) एक biorthogonal लिंकेज डोमेन के लिए जुड़े हुए (के रूप में लंगर-एसटी इस प्रोटोकॉल में कहा गया है), मिलान टैग (जैसे शुद्धि और पहचान के लिए 6xHis, MYC या ध्वज टैग के रूप में) तैयार periplasmic स्थानीयकरण टैग, एंटीबायोटिक प्रतिरोध, और नकल की उचित मूल का चयन किया बैक्टीरियल तनाव 7 पर आधारित है।
    1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए अलगाव किट निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित का उपयोग कर रात भर संस्कृतियों से प्लास्मिड डीएनए निकालें।
  2. एक प्लाज्मिड (जैसे, pACYC184) एंजाइम / प्रोटीन (PTE) OMV लंगर प्रोटीन की है कि पूरक bioorthogonal लिंकेज डोमेन के लिए जुड़े हुए भीतर पैक किया जा करने के लिए (एंजाइम से अनुसूचित जाति के रूप में इस प्रोटोकॉल में कहा जाता है) से युक्त तैयार करें, मिलान टैग, periplasmic स्थानीयकरण टैग, एंटीबायोटिक प्रतिरोध कि लंगर प्रोटीन प्लाज्मिड से अलग है, और उचित origप्रतिकृति के में चयन बैक्टीरियल तनाव 7 पर आधारित है।
    1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए अलगाव किट निर्माता प्रोटोकॉल 7 निम्न का उपयोग कर रात भर संस्कृतियों से प्लास्मिड डीएनए निकालें।

2. एक OMV पैकेजिंग ई कोलाई संस्कृति की पीढ़ी

  1. प्लाज्मिड अलगाव
    1. एन्कोडिंग एंजाइम से अनुसूचित जाति का निर्माण और लंगर-एसटी निर्माता प्रोटोकॉल 7 के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड अलगाव किट का उपयोग कर अलग रख-रखाव सेल लाइनों से constructs plasmids शुद्ध। 260 एनएम और 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा डीएनए एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण करते हैं।
  2. सह-परिवर्तन
    1. एक ई कोलाई तनाव है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है का चयन करें।
      नोट: BL21 (DE3) कोशिकाओं यहाँ उपयोग किया गया। T7 lysogen लंगर-एसटी निर्माण की अभिव्यक्ति है, जो T7 प्रमोटर और prot के लिए T7 शाही सेना पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है के लिए आवश्यक हैein अभिव्यक्ति। अन्य जीवाणु उपभेदों का उपयोग या तो T7 lysogen जीन की उपस्थिति या pET22 7 अन्य की तुलना में एक प्लाज्मिड के उपयोग की आवश्यकता है।
    2. पतला बराबर दाढ़ सांद्रता के लिए शुद्ध प्लास्मिड डीएनए फिर उन्हें चुना सक्षम कोशिकाओं के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद या तो गर्मी झटका परिवर्तन या electroporation के माध्यम से सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं में बदलना।
    3. ; पर एंटीबायोटिक युक्त Luria-Bertani (पौंड) दोनों एम्पीसिलीन (pET22) और chloramphenicol (pACYC184) के साथ प्लेटों अगर प्लेट बदल कोशिकाओं दोनों 25 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम सांद्रता में मौजूद।
    4. केवल दोनों plasmids युक्त क्लोन को अलग-थलग करने के लिए रात 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति डिश रखें।
      नोट: कालोनियों कि एंटीबायोटिक चयन जीवित रहने के भविष्य की सभी OMV की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। एंटीबायोटिक दवाओं (एम्पीसिलीन और chloramphenicol) चयनात्मक दबाव बनाए रखने और दोनों plasmids की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए सभी तरल संस्कृतियों के लिए जोड़ दिया जाएगा।

3. OMV उत्पादन

  1. कॉलोनी विस्तार
    1. 2.2.4 में वर्णित चयन प्लेटों से एक भी कॉलोनी के साथ संस्कृति मीडिया (आमतौर पर बहुत खूब शोरबा (टीबी) या पौंड) ऊपर उल्लिखित सांद्रता में एंटीबायोटिक दवाओं युक्त (कदम 2.2.3) के 5 मिलीलीटर टीका लगाना।
    2. चकित संस्कृति बोतल में रात भर स्टार्टर संस्कृति का 100 गुना कमजोर पड़ने: एक 1 प्रदर्शन करना।
      नोट: 250-500 मिलीलीटर के बीच मीडिया के एक मात्रा का प्रयोग करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति 250 rpm पर झटकों का रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए है कि संस्कृति की पर्याप्त वेंटिलेशन उपलब्ध हो जाता है।
  2. प्रत्येक प्लाज्मिड की प्रेरण
    1. जीवाणु संस्कृति प्राथमिक विकास कुप्पी का टीका के बाद, एक आयुध डिपो के 600 0.6-0.8 को विकसित करने के लिए विकास के लगभग 3 घंटा की अनुमति दें।
    2. प्राइवेट अनुसूचित जाति लोड पुटिकाओं के अंतिम उपज में सुधार करने के लिए, 15 मिनट के लिए 7000 XG पर पूरी संस्कृति अपकेंद्रित्र। पूर्व गर्म, ताजा संस्कृति मीडिया में सेल गोली Resuspend।
      नोट: इस ऑप्टional कदम किसी भी खाली OMV कि संस्कृति मीडिया प्राइवेट अनुसूचित जाति प्रेरण करने से पहले में मौजूद हैं को दूर करने में मदद करता है।
    3. एक 20% शेयर 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर पानी और बाँझ फिल्टर में एल arabinose का समाधान करें। 2-4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एल arabinose समाधान।
    4. प्राइवेट अनुसूचित जाति उत्पादन आरंभ करने के लिए एक अंतिम 0.2% एकाग्रता के लिए संस्कृति फ्लास्क एल arabinose समाधान जोड़ें।
      नोट: इस उत्परिवर्ती OMPA-ST प्रेरण के माध्यम से वृद्धि हुई vesiculation को बढ़ावा देने के लिए पहले प्राइवेट-अनुसूचित जाति के साथ periplasmic अंतरिक्ष प्रीलोड के लिए मदद करता है।
    5. पानी और बाँझ फिल्टर में एक 1 एम इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) समाधान के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करें।
      नोट: IPTG तुरंत एक बार इस्तेमाल किया जाना चाहिए हाइड्रेटेड। IPTG की aliquots 3-6 महीने के लिए जमे हुए संग्रहित किया जा सकता है और तुरंत उपयोग करने से पहले thawed जा सकता है।
    6. 0.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अतिरिक्त 3 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद IPTG जोड़े OMPA-एसटी के उत्पादन आरंभ करने के लिए।
    7. संस्कृति की अनुमति दें37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 8-14 घंटे के लिए विकसित करने के लिए है, जबकि मिलाते संरचना।

4. OMV शोधन

  1. बरकरार जीवाणु का हटाया
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7000 XG पर 15 मिनट के लिए जीवाणु संस्कृति मीडिया अपकेंद्रित्र बरकरार बैक्टीरिया गोली।
    2. छानना, और बचाने के लिए, मीडिया सेल गोली पद centrifugation सावधान किया जा रहा है के ऊपर से करने के लिए सेल गोली परेशान नहीं।
    3. दोहराएँ 4.1.1 और 4.1.2 कदम एक अतिरिक्त centrifugation चक्र सुनिश्चित करने के लिए सभी बरकरार बैक्टीरिया संस्कृति मीडिया छानना और मीडिया को बचाने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा से हटा रहे हैं।
  2. प्रोटीन समुच्चय का हटाया
    1. इसके अलावा अवशिष्ट बैक्टीरिया और अवांछित बड़े सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग जीवाणु संस्कृति मीडिया शुद्ध।
      नोट: उच्च वसूली और ऐसे सेलूलोज एसीटेट (सीए) या polyvinylidene difluoride के रूप में कम प्रोटीन सोखना के लिए एक जैविक रूप से संगत झिल्ली सामग्री का उपयोग करें (PVDF)। सिरिंज फिल्टर की मात्रा 100 मिलीग्राम और वैक्यूम फिल्टर 100 मिलीलीटर की तुलना में अधिक से अधिक मात्रा से कम है।
      1. सिरिंज फिल्टर करने के लिए, बाँझ 10-50 मिलीलीटर सिरिंज में संस्कृति के माध्यम से आकर्षित। सिरिंज के Luer अंत करने के लिए 0.45 माइक्रोन फिल्टर देते हैं। सवार दबाना और प्रवाह के माध्यम से एक नया बर्तन में इकट्ठा।
      2. फिल्टर वैक्यूम करने के लिए, एक बाँझ निस्पंदन तंत्र के लिए संस्कृति के माध्यम से हस्तांतरण। पंप निर्वात या Aspirator सिंक सक्शन उत्पन्न करने के लिए यूनिट संलग्न। नए पोत के लिए फ़िल्टर मध्यम स्थानांतरण।
  3. Ultracentrifugation के माध्यम से OMV के अलगाव
    1. centrifugation नलियों सेंट्रीफ्यूज में विरोध ट्यूबों के संतुलन के लिए सावधान किया जा रहा में फ़िल्टर संस्कृति मीडिया जोड़ें।
    2. एक ultracentrifuge दोनों साधन और ट्यूबों मिलान इसी रोटर का उपयोग करने में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ~ 150,000 XG गोली उपयोग किया जा रहा है।
    3. OMV गोली से OMV समाप्त संस्कृति मीडिया छानना, OMV गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा तुरंत पूरा होने ओ परOMV गोली की अनुमति के मीडिया में बने रहने के लिए गोली OMV वसूली को कम करने के रूप में नरम होगी च centrifugation।
      नोट: यह गोली थोड़ा भूरा और बैक्टीरियल संस्कृति की प्रारंभिक राशि के आधार पर या आंखों से दिखाई नहीं हो सकता है हो सकता है। मीडिया centrifugation ट्यूब के ऊपर से सीधे Aspirating भी ध्यान में रखते हुए कि अधिक OMV से हटा मीडिया गोली अधिक शुद्ध अंतिम OMV नमूना हो जाएगा एक विकल्प है।
    4. बाद में गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) के परीक्षण के लिए centrifuged सतह पर तैरनेवाला बचाने की पुष्टि है कि OMV कणों को पूरी तरह से मीडिया से समाप्त हो गया था।
    5. जोड़े बाँझ फ़िल्टर फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) 7.4 पीएच या 100 मिमी एन -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic एसिड (CHES) पीएच 8.0 पर OMV गोली यह आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते करने के लिए अनुमति के लिए बफर के 0.5-1 मिलीलीटर। सुनिश्चित करें कि गोली सूखा नहीं है।
      नोट: समाधान ईओण ताकत, पीएच, और तापमान में चरम सीमाओं को कम OMV घुलनशीलता में परिणाम और aggre बढ़ावा कर सकते हैंgation।
    6. ध्यान से, अपकेंद्रित्र ट्यूब से शुद्ध OMV समाधान pipet धीरे मिश्रण पूरे गोली solubilized किया गया है सुनिश्चित करने के लिए।

5. OMV विशेषता

  1. प्रदान की निर्माता के प्रत्येक साधन के लिए अद्वितीय प्रोटोकॉल का पालन OMV आकार के वितरण और कण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएलएस या nanoparticle ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
    नोट: यहाँ, OMV आकार के वितरण और एकाग्रता NanoSight LM10 Nanoparticle ट्रैकिंग और NTA 2.3 विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग निर्धारित किया गया था।
    1. सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और माइक्रोस्कोप और nanoparticle ट्रैकिंग इकाई पर सभी सतहों को साफ।
    3. जोड़े ~ Luer के माध्यम से कण ट्रैकिंग डिवाइस के देखने खिड़की 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज किसी भी हवाई इंजेक्शन लगाने के बिना पूरे देखने खिड़की को कवर करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा के साथ फिटिंग के लिए सीधे OMV नमूना के 0.5 मिलीलीटर प्रणाली में बुलबुले।
    4. प्लेस टीवह खुर्दबीन मंच पर नज़र रखने इकाई nanoparticle और लेजर पर बारी।
    5. सॉफ्टवेयर में "कब्जा" पर क्लिक करें।
    6. माइक्रोस्कोप फोकस समायोजित करें और सॉफ्टवेयर विंडो में पूर्वावलोकन स्क्रीन वर्तमान पर कणों कल्पना करने के लिए मंच।
    7. जब तक उज्ज्वल कणों स्पष्ट रूप से एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर कल्पना कर रहे हैं "कैमरा शटर" और "कैमरे के लाभ" समायोजित करें।
    8. 60 सेकंड के लिए कब्जा अवधि को समायोजित करें।
    9. "रिकॉर्ड" पर क्लिक करें।
    10. के लिए प्रेरित करते हैं, इनपुट नमूना / डिवाइस तापमान, नमूना लेबल, और एक उपयोगकर्ता निर्दिष्ट फ़ोल्डर में चलाने के लिए प्रत्येक के पूरा होने पर वीडियो डेटा को बचाने के।
    11. सभी विश्लेषण मानकों को रखें (पता लगाने की दहलीज, धुंधला, मिन ट्रैक की लंबाई, मिन उम्मीद कण आकार) ऑटो पर मोड का पता लगाने और क्लिक करें "प्रक्रिया अनुक्रम।"
      नोट: कैसे प्रत्येक पैरामीटर ठीक धुन विश्लेषण के परिणाम के लिए स्वतंत्र रूप से समायोजित किया जा सकता है के लिए मैनुअल से परामर्श करें।
    12. रिकार्ड कण आकार के वितरण और कणों / मीएल एकाग्रता के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित की।
      नोट: एक ठेठ OMV hydrodynamic आकार सीमा ~ 10 x 10 8 के एक कण / एमएल एकाग्रता के साथ 30-200 एनएम के बीच है।
  2. निर्धारण OMV प्रोटीन सामग्री
    1. OMV पवित्रता, एंजाइम उत्पादन, और एससी-एसटी crosslinking दक्षता 7 आकलन करने के लिए मानक एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
      नोट: Crosslinking क्षमता 100% 7 नहीं होगा।

6. एनजाइम पैकेजिंग का सत्यापन

  1. प्राइवेट गतिविधि परख
    1. या तो एक क्युवेट में 25 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त बफर जैसे 100 मिमी CHES बफर (8 पीएच) में सभी एंजाइमी assays के प्रदर्शन या एक 96/384 अच्छी तरह से थाली में मल्टिप्लेक्स।
    2. एक 1 का 5 μl जोड़ें: CHES के 90 μl और शुद्ध OMV के 5 μl के लिए CHES बफर में paraoxon के 1,000 कमजोर पड़ने (~ 36 गुना OMV एकाग्रता संस्कृति मीडिया में वर्तमान की तुलना में केंद्रित)।
      सावधानी: Paraoxon एक जहरीले कीटनाशक हैऔर निर्माता और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    3. 405 एनएम पर नियमित अंतराल पर absorbance रीडिंग (~ 2 घंटा कुल प्रतिक्रिया समय के लिए हर 20 सेकंड) ले लो (ε = 18.1 मिमी -1 सेमी -1) और 348 एनएम (isosbestic बिंदु ε = 5.4 मिमी -1 सेमी -1) के लिए कम से chromogenic paraoxon टूटने उत्पाद, पी -nitrophenol की प्रतिक्रिया प्रगति की निगरानी।
      नोट: 8 से ऊपर पीएच मान पर पी -nitrophenol के प्रमुख deprotonated प्रपत्र 405 एनएम पर सही निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए मौजूद है। अन्य सभी जटिल या कम पीएच समाधान में यह 348 एनएम के isosbestic बिंदु का उपयोग करने के रूप में पी -nitrophenol के कई रूपों उपस्थित रहेंगे आवश्यक है।
    4. प्रत्येक नमूना, पैकेजिंग क्षमता, और कुल उत्पादन में प्राइवेट पीटीई के रिश्तेदार मात्रा तुलना करने के लिए कदम 6.1.3 से प्रगति घटता के रैखिक भाग के ढलान के निर्धारण से प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग की गणना।
    5. मानक एंजाइमी प्रदर्शन करनापरख प्रोटोकॉल कश्मीर एम, वी अधिकतम निर्धारित करने के लिए और OMV के लिए कश्मीर बिल्ली PTE समझाया।
      नोट: एक Lineweaver-Burk विश्लेषण इन गतिज मापदंडों का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जहां y अवरोधन = 1 / वी मैक्स और ढलान = कश्मीर एम / वी अधिकतम 20।
  2. Transmembrane सब्सट्रेट / उत्पाद प्रसार।
    1. मात्रा से कदम 6.1 0-3% से CHES बफर में ट्राइटन X-100 की बढ़ती सांद्रता के उपयोग में वर्णित के रूप में एक ही गतिज परख विश्लेषण करते हैं।
      नोट: solubilized OMV कार्यों के लिए ट्राइटन X-100 के अलावा लिपिड bilayer OMV की सामग्री को प्रतिक्रिया समाधान करने के लिए स्वतंत्र रूप से सुलभ होने के लिए अनुमति देने के लिए बाधित करने के लिए।
    2. गणना और सब्सट्रेट / एंजाइम गतिविधि में मामूली बदलाव (प्रारंभिक वेग) ने संकेत दिया उत्पाद की transmembrane पारित होने को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक ट्राइटन X-100 के स्तर पर प्रारंभिक वेग तुलना गतिविधि मैं एंजाइम की तुलनाn ट्राइटन X-100 के अभाव। एंजाइम गतिविधि में पर्याप्त वृद्धि ट्राइटन X-100 की उपस्थिति में मनाया जाता है यह संभावना है कि सब्सट्रेट स्वतंत्र रूप से OMV में फैलाना नहीं करता है।
    3. परख मुक्त एंजाइम गतिविधि (धारा 6.1 में ऊपर वर्णित के रूप में) ट्राइटन X-100 की उपस्थिति है कि एंजाइम गतिविधि को सत्यापित करने में surfactant खुद से हिचकते नहीं है।
      नोट: गतिविधि बहुत ट्राइटन X-100, ऐसे saponins या विभिन्न polysorbate के रूप में वैकल्पिक योजक, पर असर पड़ा है, तो / बीच surfactants OMV झिल्ली टूटना करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है।

7. OMV संग्रहण

  1. जमना
    1. सीधे तरल नाइट्रोजन में शुद्ध OMV के प्लेस ~ 100 μl aliquots तस्वीर aliquots यकीन नहीं पूरी तरह से डूब शीशियों या नमूना के साथ ही किसी भी तरल नाइट्रोजन से संपर्क करने के लिए किया जा रहा है फ्रीज करने के लिए।
      नोट: शुद्ध OMV जा बफर में सीधे जमे हुए तस्वीर कर सकते हैं कि purificat दौरान OMV गोली solubilizing के लिए चयनित किया गया थाआवश्यक 7 कोई अतिरिक्त cryoprotectants साथ आयन प्रक्रिया।
    2. स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर तस्वीर के जमे हुए aliquots।
    3. उन्हें यकीन है कि आर टी नमूने गर्म करने के लिए नहीं जा रहा है पर रखकर कदम 7.1.1 से जमे हुए aliquots गला लें।
    4. इस तरीके से भंडारण के लिए सभी नमूनों की तैयारी से पहले एंजाइम परख कदम 6.1 से पहले प्रारंभिक वेग की तुलना में और एंजाइम गतिविधि पद फ्रीज पिघलना में कोई महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि वहाँ सत्यापित करने के लिए ठंड के बाद वर्णित करते हैं।
      नोट: स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर OMV शुद्ध करता है, तो एंजाइम की गतिविधि में कमी ठंड की वजह से मनाया जाता है।
  2. lyophilization
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lyophilization उपकरण का उपयोग 21 तस्वीर जमे हुए शुद्ध OMV aliquots Lyophilize।
    2. स्टोर सप्ताह के लिए या कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर lyophilized aliquots।
    3. शुद्ध पानी का एक ही मात्रा lyophilization से पहले के रूप में lyophilized OMV में जोड़े और टी rehydrate करने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हो जाओवह नमूना। धीरे मिक्स जब आवश्यक सुनिश्चित किया जा रहा भंवर या OMV sonicate के लिए नहीं।
    4. प्वाइंट की देखभाल करने के लिए आवेदन के लिए सीधे lyophilized OMV पाउडर जोड़ें जहां से पहले कमजोर पड़ने / solubilization आवश्यक नहीं है।

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Representative Results

दो पुनः संयोजक प्रोटीन का एक साथ अभिव्यक्ति, के रूप में OMV पैकेजिंग रणनीति इस प्रोटोकॉल में विस्तृत के लिए आवश्यक है, अलग अलग रास्ते के एक नंबर के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। इधर, एक दो वेक्टर प्रणाली प्रतिकृति और अलग inducible जीन कैसेट की संगत मूल के साथ उपयोग किया गया था। प्राइवेट अनुसूचित जाति की अभिव्यक्ति के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी (pACY184) का निर्माण एक arabinose inducible जीन कैसेट और arginine periplasmic स्थानीयकरण नेता अनुक्रम एक जुड़वां अद्वितीय प्रतिबंध साइटों की एक श्रृंखला के बाद एक के रूप में एंजाइम जीन की क्लोनिंग की सुविधा के लिए शामिल करने के लिए इंजीनियर था एक सी टर्मिनल अनुसूचित जाति प्रोटीन को फ्यूजन। प्लाज्मिड निर्माण बाहरी झिल्ली लंगर प्रोटीन एन्कोडिंग वाणिज्यिक वेक्टर pET22 जो प्रोटीन अभिव्यक्ति की नियंत्रण और pelB periplasmic स्थानीयकरण अनुक्रम के लिए लाख operon का इस्तेमाल करता है। लघु अनुसूचित जनजाति के अनुक्रम छोटा OMPA प्रोटीन INSE करने से पहले में क्लोन किया गया थाअभिव्यक्ति प्लाज्मिड में rtion। दोनों plasmids में, सी टर्मिनल hexahistidine अनुक्रम OMV नमूनों में संलयन प्रोटीन का एक साथ पहचान के लिए अनुमति देने के लिए बनाए रखा गया था। निर्माण और इन जीन निर्माणों के लक्षण वर्णन, OMPA करने के लिए दोनों एन और सी टर्मिनल अनुसूचित जनजाति संलयन निर्माणों सहित, पूरी तरह से अल्वेस एट अल में वर्णित हैं। 7। जीन यहाँ बताया निर्माणों सभी एंजाइमों की पैकेजिंग के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है। कुछ मामलों में यह periplasmic स्थानीयकरण संकेत, नियामक तत्वों, या मिलान टैग बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है। साथ ही, कुछ प्रोटीन बेहद बड़े और भीतर की झिल्ली को पूरी तरह अनुप्रस्थ करने में असमर्थ हो सकता है। Enzymatic गतिविधि और OMV पैकेजिंग दक्षता एक प्राथमिकताओं निर्धारित नहीं किया जा सकता है और अनुभव से प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।

नीचे दिए गए परिणामों को सफलतापूर्वक ले जाने के बाद ओ कि एक आम तौर पर उम्मीद करते हैंइस प्रोटोकॉल ut। (चित्रा 1) शामिल दो अनुसूचित जनजाति / अनुसूचित जाति विभाजन प्रोटीन डोमेन की एक योजनाबद्ध, OMPA-अनुसूचित जनजाति और अनुसूचित जाति-प्राइवेट फ्यूजन का निर्माण करने के साथ ही बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली पर isopeptide गठन का एक उदाहरण है और प्राइवेट-एससी के बाद encapsulation एक OMV के भीतर है । SEM के माध्यम से शुद्ध OMV आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में अच्छी तरह से आकार के वितरण और निरपेक्ष OMV एकाग्रता कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से निर्धारित (चित्रा 2) भी शामिल हैं। OMV प्रोटीन सामग्री और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के आगे लक्षण वर्णन एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा (चित्रा 3) के माध्यम से देखा जाता है। विशेष रुचि यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल के प्रोटीन के लिए आणविक भार इस प्रकार हैं: मूल OMPA (37.2 केडीए), OMPA-एसटी (23 केडीए), प्राइवेट अनुसूचित जाति (51 केडीए), OMPA-एसटी / एससी-PTE (74 केडीए) । शुद्ध OMV एक अंधेरे बैंड पर लगभग 37 केडीए जो अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मूल निवासी OMPA का संकेत है होनी चाहिए। जेल संकल्प के आधार पर वहाँ कई बा हो सकता हैOMPA, OmpF और OmpC के रूप में जेल के इस क्षेत्र में एनडीएस उपस्थित सभी अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में हैं और एक समान आणविक वजन का हिस्सा है। एक अतिरिक्त बैंड है कि 2.2 केडीए से बड़ा OMPA-एसटी भी ई कोलाई अभिव्यक्ति मशीनरी भारी का एक परिणाम के रूप में नेता अनुक्रम के अनुचित दरार की वजह से मनाया जा सकता है। यह ध्यान रखें कि एक सफलतापूर्वक शुद्ध OMV नमूना कई अन्य अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन की जरूरत नहीं होगी महत्वपूर्ण है। अन्य बैंड मौजूद हैं, तो या तो शुद्धि अनुचित तरीके से बाहर किया गया था या बैक्टीरिया इस ई कोलाई BL21 (DE3) तनाव में नहीं मनाया अन्य प्रोटीन पैकेजिंग जा सकता उपयोग किया जा रहा तनाव।

इसके अलावा, गतिविधि assays और पुटिका टूटना प्रयोगों प्रतिनिधि परिणाम है कि अगर एंजाइमी सब्सट्रेट स्वतंत्र रूप से transmembrane Porin प्रोटीन (चित्रा 4) के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं OMV उम्मीद होगी प्रदर्शित करने के लिए प्रदान किया गया है। Paraoxon अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से प्रवेश करती हैअंतर्जात transmembrane Porin प्रोटीन के माध्यम से OMV पैक प्राइवेट और प्रतिक्रिया उत्पाद, पी -nitrophenol के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए है, यह भी अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से गुजरता है OMV झिल्ली के माध्यम से। इस घटना के सभी उत्पाद, सब्सट्रेट, और एंजाइम सेट के बीच में सर्वव्यापी नहीं होगा और प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए। हालांकि सफल OMV टूटना और एंजाइम रिहाई डिटर्जेंट और PTE (यहाँ ट्राइटन X-100) की कम मात्रा के साथ देखा गया है, इस तरह के जोड़ के अन्य एंजाइमों की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है।

प्लाज्मिड नक्शे भी एक दो प्लाज्मिड पैकेजिंग रणनीति अनुसूचित जाति / जनजाति प्रणाली (चित्रा 5) के उपयोग की डिजाइन प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: OMV में प्रोटीन का निर्देशन पैकेजिंग। प्रोटीन वर्णित OMV पैकेजिंग शुरू में उपयोग के लिए क्रिस्टल संरचनाओंegy: ​​OMPA, प्राइवेट, SpyTag (एसटी) और SpyCatcher (अनुसूचित जाति); PDB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, क्रमशः। OMPA-अनुसूचित जनजाति और अनुसूचित जाति-प्राइवेट संलयन बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली पर एक isopeptide बांड बनाने निर्माणों की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाया गया है। यह झिल्ली संलयन बनाने OMV के भीतर पीटीई के समावेश ड्राइव। अल्वेस एट अल से चित्रा reproduced (अनुकूलित)। एसीएस Appl चटाई इंटरफेस (2015), 7 (44), पीपी 24,963-24,972 7। कॉपीराइट 2015 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: OMV विशेषता। (ए) ultracentrifuge के SEM मूल निवासी कोलाई से शुद्ध OMV [BL21 (DE3)]। (बी) के प्रतिनिधि कण Trac राजा आकार वितरण और (सी) कुल पुटिका एकाग्रता 90 सेकंड नमूना मूल निवासी OMV, arabinose सक्रियण (PTE नं ए) arabinose सक्रियण की उपस्थिति में, प्राइवेट अनुसूचित जाति के अभाव में प्राइवेट-अनुसूचित जाति के लिए पढ़ता है पर औसतन (PTE-ए) , एन टर्मिनल OMPA-एसटी सह तब्दील arabinose और IPTG सक्रियण (PTE / OMV-एन) की उपस्थिति में प्राइवेट-अनुसूचित जाति, और ultracentrifuge सतह पर तैरनेवाला (यूसी सतह पर तैरनेवाला) के साथ। OMV उत्पादन में एक महत्वपूर्ण वृद्धि मूल निवासी OMV और प्राइवेट अनुसूचित जाति अकेले constructs की तुलना में प्राइवेट / OMV-एन के नमूने में मनाया गया। OMV यूसी गोली सतह पर तैरनेवाला पद ultracentrifugation में कोई OMV के लिए थोड़ा छोड़ने में OMV के एक लगभग पूरी तरह ठीक होने प्रदर्शित करने के लिए यूसी सतह पर तैरनेवाला में मात्रा निर्धारित किया गया। सभी डेटा तीन प्रतियों प्रयोगों का साधन (± एसडी) का प्रतिनिधित्व करता है। अल्वेस एट अल से चित्रा reproduced (अनुकूलित)। एसीएस Appl चटाई इंटरफेस (2015), 7 (44), पीपी 24,963-24,972 7। कॉपीराइट 2015 अमेरिकन केमिकल सोसायटी।डी / 54458 / 54458fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: शुद्ध OMV प्रोटीन सामग्री दृढ़ संकल्प। (ए) सी टर्मिनल OMPA-एसटी संलयन PTE-अनुसूचित जाति के साथ coexpressed का शुद्ध OMV यूसी गोली के एसडीएस पृष्ठ (PTE / OMV) OMPA-एसटी, मूल निवासी OMPA, प्राइवेट, अनुसूचित जाति और OmpA- के प्रतिनिधि बहुतायत का प्रदर्शन निर्माण अनुसूचित जनजाति / प्राइवेट अनुसूचित जाति isopeptide संलयन। (बी) के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण अपने-टैग OMPA और पीटीई में मौजूद शामिल उपयोग एक विरोधी 6xhis एंटीबॉडी के माध्यम से दृश्य की सुविधा के लिए निर्माण करती है। यह ध्यान रखें कि प्राइवेट के रूप में बड़ा आणविक वजन उनकी टैग प्रजातियों की उपस्थिति से धब्बा पर इसका सबूत dimerize करने के लिए जाना जाता है, महत्वपूर्ण है। वहाँ बहुत अधिक OMPA-एसटी अभिव्यक्ति के स्तर मनाया जाता है हालांकि वहाँ मुफ्त की एक पूर्ण रूपांतरण नहीं हैझिल्ली को प्राइवेट अनुसूचित जाति बाध्य OMPA-एसटी / एससी-PTE। इस तथ्य के बावजूद, समग्र PTE उत्पादन और बेहतर पैकेजिंग दक्षता में वृद्धि का सुझाव है कि जब सहसंयोजक बंधन गठन सर्वव्यापी नहीं है अनुसूचित जनजाति और अनुसूचित जाति डोमेन की गैर-सहसंयोजक एसोसिएशन OMV के भीतर निर्देशित पैकेजिंग में एक महत्वपूर्ण कारक है। अल्वेस एट अल से चित्रा reproduced (अनुकूलित)। एसीएस Appl चटाई इंटरफेस (2015), 7 (44), पीपी 24,963-24,972 7। कॉपीराइट 2015 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्राइवेट गतिविधि और पैकेजिंग विशेषता। (ए) कुल मिलाकर PTE अभिव्यक्ति के स्तर और OMV पैकेजिंग दक्षता पैरा उपयोग प्रारंभिक वेग माप के माध्यम से निर्धारितOXON एक chromogenic सब्सट्रेट सेल छर्रों, यूसी सतह पर तैरनेवाला में प्राइवेट वर्तमान की तुलना, और शुद्ध यूसी OMV छर्रों के रूप में। (बी) के प्रतिनिधि डेटा ट्राइटन X-100 (0.5% T100) के उपयोग का प्रदर्शन OMV bilayer OMV इंटीरियर के लिए सब्सट्रेट की बेरोक उपयोग की अनुमति बाधित करने के लिए। T100 के अभाव में प्रदर्शन assays के लिए इस डेटा की तुलना बरकरार OMV bilayers भर में सब्सट्रेट के स्थानान्तरण के सत्यापन की सुविधा है, तो एंजाइमी प्रारंभिक वेग अपरिवर्तित रहे हैं। paraoxon के मामले में बहुत कम गतिविधि उपस्थिति या T100 यह दर्शाता है कि paraoxon OMV पर अंतर्जात छिद्रों के माध्यम से स्वतंत्र रूप से गुजरता के अभाव में मनाया अंतर था। (सी) पीटीई / OMV-एन और प्राइवेट-A के लिए मानक Michaelis-Menten एंजाइम कैनेटीक्स समीकरण को प्राइवेट अनुसूचित जाति गतिज डेटा फिट। (डी) कश्मीर एम और कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम (48 निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक Lineweaver-Burk विश्लेषण, 4.4 10 x 7, 44 माइक्रोन के, 4.9 x10 7 सेकंड -1 एम -1, क्रमशः) मूल निवासी एंजाइम के रूप में इसी तरह के प्राइवेट साहित्य गतिज पैरामीटर्स का प्रदर्शन (90 माइक्रोन के, 2.7 10 x 7 सेकंड -1 एम -1) आर 2 ≥ 0.999 सभी मामलों में साथ। सभी डेटा तीन प्रतियों प्रयोगों का साधन (± एसडी) का प्रतिनिधित्व करता है। अल्वेस एट अल से चित्रा reproduced (अनुकूलित)। एसीएस Appl चटाई इंटरफेस (2015), 7 (44), पीपी 24,963-24,972 7। कॉपीराइट 2015 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: उदाहरण प्रणाली यहाँ वर्णित के लिए प्रतिनिधि प्लाज्मिड निर्माणों। SpyCatcher संशोधित एंजाइम अनुसूचित जाति (PTE-एससी) प्लाज्मिड OMV (बाएं) के भीतर encapsulation के लिए निशाना बनाया। SpyTag modifआईईडी झिल्ली लंगर-एसटी (OMPA-एसटी-एन) प्लाज्मिड (दाएं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक प्रतिनिधि प्रदर्शित करने के लिए इस प्रोटोकॉल कार्यों पैकेजिंग तकनीक है जिसमें ब्याज की एक एंजाइम का उत्पादन किया और ई कोलाई से OMV में पैक किया जाता है का निर्देश दिया। कई जटिल तकनीक के साथ वहाँ के रूप में कई क्षेत्रों में जो प्रोटोकॉल अलग अद्वितीय अनुप्रयोगों, जिनमें से कुछ नीचे विस्तृत रहे हैं में उपयोग के लिए समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। OMV पैकेजिंग और एंजाइम encapsulation के तंत्र विशिष्ट जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जबकि वहाँ इस प्रोटोकॉल के भीतर कई कदम है जो इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। बरकरार जीवाणु और सेलुलर मलबे की प्रारंभिक हटाने महत्वपूर्ण महत्व का है और quantitation या नमूना विश्लेषण पर सभी बहाव के प्रयासों को प्रभावित करेगा। लगातार दो centrifugation निस्पंदन द्वारा पीछा कदम आम तौर पर इन दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, सभी उदाहरणों देखभाल में जब decanting समाधान centrifugation के बाद प्रदूषणों से हस्तांतरण को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए। इसी तरह, अंतिम OMV गोली ओbtained निम्नलिखित ultracentrifugation अक्सर ही शिथिल अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे का पालन किया है। अंतिम चरण में, देखभाल जब खर्च की संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए सुनिश्चित करें कि गोली पोत के तल पर रहता है अबाधित लिया जाना चाहिए। कुछ उदाहरण में यह सबसे अच्छा होना डीएलएस या nanoparticle ट्रैकिंग डिवाइस का उपयोग OMV गोली प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों में नहीं खोया था सुनिश्चित करने के लिए नमूना विश्लेषण के बाद जब तक अंतिम संस्कृति के माध्यम से बनाए रखने के लिए कर सकता है। नीचे कुछ अतिरिक्त चिंता है कि दोनों इस विशेष प्रोटोकॉल और दूसरों है कि शोधकर्ताओं की विशिष्ट जरूरतों के अनुरूप रहे हैं के साथ पैदा हो सकता है कर रहे हैं।

इस प्रणाली में पीटीई के उपयोग प्राइवेट आसानी से एक वैकल्पिक एंजाइम या ब्याज की प्रोटीन से बदली होने के साथ organophosphate दूषित क्षेत्रों के पर्यावरण remediation के लिए एक शानदार मॉडल एंजाइम encapsulation के लिए प्रदान करता है। यहाँ के रूप में वर्णित OMPA-एसटी के साथ प्राइवेट अनुसूचित जाति के Coexpression समग्र PTE expressi में एक बड़ी वृद्धि के परिणामस्वरूपपर साथ ही और अधिक पीटीई के साथ उच्च पुटिका उत्पादन के स्तर प्राइवेट और प्राइवेट अनुसूचित जाति अकेले व्यक्त की तुलना में पुटिकाओं के भीतर पैक किया जा रहा। OMPA हाइपर-vesiculation के सी टर्मिनल विलोपन के माध्यम से बाहरी झिल्ली और पेप्टीडॉग्लीकैन के बीच बातचीत की संख्या को कम करके उपलब्ध हो जाता है। यह जीवाणु पुनः संयोजक प्राइवेट जो विषाक्त प्रभाव है कि अक्सर गैर देशी प्रोटीन की overexpression में मनाया जाता है mitigates का निर्यात करने के लिए एक आसान मार्ग प्रदान करता है।

प्राइवेट आसानी से इस मॉडल प्रणाली में बदला जा सकता है, जबकि यह नोट करने के लिए नहीं है कि सभी एंजाइम substrates के लिए स्वतंत्र रूप से OMV bilayer से गुजरना होगा महत्वपूर्ण है और इसलिए यह जरूरी है कि प्रत्येक अद्वितीय एंजाइम और सब्सट्रेट जोड़ी मामले के आधार द्वारा एक मामले पर परीक्षण किया जा रहा है। यहां तक ​​कि अगर एक सब्सट्रेट झिल्ली के माध्यम से इस तकनीक को पास नहीं है अभी भी उत्पादन और OMV में एक एंजाइम और ट्राइटन X-100 के अलावा, या उपयुक्त विकल्प surfactant पैकेज करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, पर्याप्त le पर जोड़ा जा सकता हैVELS पुटिकाओं उपयोग करने से पहले टूटना करने के लिए।

पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति और पैकेजिंग के अभाव में इस प्रोटोकॉल भी OMV उत्पादन और विविध प्रजातियों के जीवाणु से शुद्धि के लिए एक बुनियादी पद्धति के रूप में सेवा कर सकते हैं। इस तरह के घनत्व ढाल विभाजन 22, झिल्ली निस्पंदन 23, और अल्ट्रा निस्पंदन 24 के रूप में OMV शुद्धि के लिए वैकल्पिक तरीकों, भी मौजूद हैं और इरादा आवेदन के आधार पर अधिक उपयुक्त तकनीक हो सकता है। ये वैकल्पिक शोधन तकनीक भी आसानी से इस प्रोटोकॉल में एक प्रोटीन की पैकेजिंग के लिए निर्देशित OMV के ultracentrifugation pelleting के स्थान पर एक OMV में एक biorthogonal सिंथेटिक लिंकेज के उपयोग के माध्यम से पूरक हो सकता है।

अन्य संशोधनों के विशिष्ट सिंथेटिक उठाना प्रणाली इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह के रूप में चयनित झिल्ली टेदरिंग प्रोटीन में उपयोग करने के लिए किया जा सकता है। बाँधना दो अलग अलग प्रोटीन के लिए विभिन्न सिंथेटिक रणनीतियों रहे हैंएक जैविक प्रणाली के भीतर भी शामिल है कि: विभाजन प्रोटीन 25, कुंडलित कॉयल 26, और विभाजन inteins 27, बस कुछ ही सूची पर। ऐसे OmpF और OmpC के रूप में अन्य झिल्ली बाध्य या transmembrane प्रोटीन की संभावना उपयुक्त अनुसूचित जनजाति संशोधन साइटों के रूप में अच्छी तरह से 28 के लिए प्रदान करेगा। कुछ मामलों में यह भी पुनः संयोजक एंजाइम / प्रोटीन पर अनुसूचित जनजाति और प्रस्तोता प्रोटीन पर अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति रखने डोमेन और बहुत छोटे अनुसूचित जनजाति स्वैप करने के लिए आवश्यक हो सकता है। वहाँ भी अलग क्लोनिंग रणनीति है कि एक ही है या अलग अलग प्रेरण सिस्टम के तहत कई plasmids के उपयोग सहित यहां लागू किया जा सकता है की एक संख्या हैं, कई प्रोटीन के साथ एक एकल प्लाज्मिड इनकोडिंग, या यहां तक ​​कि मुताबिक़ पुनर्संयोजन तकनीक सभी को शामिल करने या अभिव्यक्ति के कुछ हिस्सों का उपयोग बैक्टीरियल जीनोम में प्रणाली।

OMV के microenvironment एंजाइमी निष्क्रियता है कि आमतौर पर आदर्श सेंट से भी कम समय के कारण होती कम करने पैक एंजाइम को स्थिर करने में मदद करता हैorage की स्थिति, फ्रीज पिघलना, और lyophilization 29। यह भी अनुमान है कि OMV प्रोटिओलिटिक दरार करने के लिए काफी सुधार प्रतिरोध प्रदान करेगा के रूप में OMV bilayer सक्रिय एंजाइम और प्रोटीन के अतिरिक्त OMV अंतरिक्ष में मौजूद बीच शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करेंगे। इस प्रोटोकॉल आगे OMV समझाया प्रोटीन और आत्मीयता शुद्धि के लक्षित वितरण की सुविधा के लिए एक बाहरी का सामना करना पड़ छोटे अणु, पेप्टाइड, या प्रोटीन टैग शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। प्राइवेट इस अनूठी आवेदन के लिए चयनित किया गया था जबकि इस अध्ययन के परिणाम, और इस प्रोटोकॉल की सामग्री, आसानी से विविध दवा वितरण में उपयोग के लिए अनुरूप प्रोटीन पैकेजिंग रणनीतियों डिजाइन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, चिकित्सा निदान, और पर्यावरण remediation आवेदन पत्र 30।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG Any Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose Any Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C.
Ampicillin Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
Chloramphenicol  Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
TB/LB Culture Media Any Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100 Any One of many potential suitable surfactants.  
Baffled culture flasks Any The baffles promote higher levels of aeration.  
CHES Fisher Bioreagents BP318-100 Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon Chem Service N-12816 Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.  
Syringe Filter 0.45 µm Thermo Scientific 60183-221 (30 mm) Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator New Brunswick Excella E24 Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. 
Sorvall Culture Centrifuge Thermo Scientific RC 5B PLUS Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge  Thermo Scientific WX Ultra 90 Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor Thermo Scientific AH-629 Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) Beckman Coulter 344058 Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer  Tecan Infinite M1000 Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS/particle tracking NanoSight  LM10 Necessary for OMV size distribution and concentration determination.  
BL21(DE3) NEB Suitable bacterial expression strain.
pET22 EMD Millipore 69744-3 Other plasmids can be used in place of these.  
pACYC184 NEB Other plasmids can be used in place of these.  
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Example kit.

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References

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

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जैव रसायन अंक 117 बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMV) शुद्धि निर्देशित पैकेजिंग एंजाइम, Bioorthogonal उठाना phosphotriesterase (PTE) बढ़ाया स्थिरता
से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग<em&gt; कोलाई</em&gt;: डिजाइन, उत्पादन और शोधन
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Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification. J. Vis. Exp. (117), e54458, doi:10.3791/54458 (2016).

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