Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54458
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

Abstract

En økende interesse for å bruke syntetiske biologiske teknikker for å programmere ytre membran vesikler (OMV) fører til noen svært interessante og unike applikasjoner for OMV hvor tradisjonelle nanopartikler er vist seg for vanskelig å syntetisere. Hittil har alle gram-negative bakterier som er vist å fremstille OMV demonstrere emballering av en rekke last som inkluderer små molekyler, peptider, proteiner og genetisk materiale. Basert på deres mangfoldige last, er OMV innblandet i mange biologiske prosesser som strekker seg fra celle-celle kommunikasjon til genoverføring og levering av virulensfaktorer avhengig av hvilke bakterier produserer den OMV. Bare nylig har bakteriell OMV blitt tilgjengelig for bruk over et bredt spekter av applikasjoner gjennom utvikling av teknikker for å kontrollere og direkte pakking av rekombinante proteiner i OMV. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling, rensing og bruk av enzym pakket OMV sørge for forbedret Overall produksjon av rekombinant enzym, økt blæredannelse, og forbedret enzymstabilitet. Vellykket anvendelse av denne protokollen vil resultere i dannelsen av en bakteriestamme som samtidig produserer en rekombinant protein og dirigerer det til OMV innkapsling gjennom å skape en syntetisk kobling mellom det rekombinante protein og et ytre membranprotein anker. Denne protokollen detaljer også metoder for å isolere OMV fra bakteriekulturer samt riktig håndtering teknikker og ting å vurdere når tilpasse denne protokollen for bruk for andre unike applikasjoner som: farmasøytiske stoffet levering, medisinsk diagnostikk, og miljøtiltak.

Introduction

Presenteres her er en metode for design, produksjon og rensing av enzym lastet bakterie ytre membran vesikler (OMV). OMV er små, primært unilamelære, proteoliposomes som varierer i størrelse 30-200 nm 1,2. Alle Gram-negative og Gram-positive bakterier som er studert hittil har vist frigivelse av enten OMV eller ekstracellulære vesikler (EV) fra deres overflate 3,4. Den nøyaktige mekanismen som OMV er produsert har ennå ikke helt klarlagt på grunn av de ulike bakteriepopulasjoner som skiller dem, samt varierende funksjoner som de tjener. OMV har vist seg å transportere et bredt spekter av last fra små molekyler, peptider og proteiner til genetisk materiale tjener en rekke komplekse signalisering, transgenet, og virulens fungerer 5,6.

De nøyaktige mekanismer OMV biogenese er ikke godt karakterisert, og ser ut til å variere mellom bakteriearter. Til tross this Faktisk har vi utviklet en fremgangsmåte for å forbedre innpakning effektiviteten av et rekombinant protein i OMV ved å skape en syntetisk kobling mellom et protein av interesse og et svært rikt protein endogent for den bakterielle ytre membran og påfølgende OMV. I fravær av en syntetisk binding, eller kunstig innlemmet affinitet, mellom det rekombinant uttrykte proteinet og OMV den observerte emballasjen effektivitet er meget lavt 7. Dette resultatet er å forvente som innlemmelse av proteiner i OMV enten skjer gjennom tilfeldige innkapsling i det øyeblikket av OMV dannelse ved bakterieoverflaten eller gjennom rettet innpakning av mekanismer som ikke er godt forstått. En viss suksess er blitt observert i emballasje proteiner ganske enkelt gjennom over uttrykk i det periplasmatiske rom som er avhengig av tilfeldigheter innkapsling men effektiv pakking er sterkt proteinavhengig med noen proteiner emballasje med høy virkningsgrad i forhold til andre thved ikke å pakke det hele tatt 8-10. Ved å benytte vanlige syntetiske biologiske teknikker vi søkt å konstruere Escherichia coli (E. coli) å samtidig produsere, pakke og utsondrer en aktiv enzym av interesse i OMV som omgår dagens kunnskaps begrensninger når det gjelder hvordan OMV dannes og hvordan lasten er valgt av bakterier for emballasje.

Ved anvendelsen av dette programmet en split protein bioconjugation systemet ble valgt som syntetiske kobling av valget for å lette retnings emballasje inn i OMV. Som navnet antyder en split protein bioconjugation system består av to komplementære underenhets domener som interagerer med hverandre. Splitt proteindomener som velges for anvendelsen av denne protokollen blir referert til som spycatcher (SC) og SpyTag (ST) domene og er avledet fra Streptococcus pyogenes fibronektin-bindende protein (FbaB) 11. Dette delte proteinsystem er uvanlig ved at whøne de to subenheter er innenfor nærhet en isopeptide bindingen spontant danner mellom den nære asparaginsyre og lysin aminosyreresidier skaper en kovalent binding. Isopeptide bindingsdannelse ikke krever tilsetning av chaperonproteiner, katalytiske enzymer eller kofaktorer og kan lett forekomme ved romtemperatur (RT) og over et bredt område av fysiologisk relevante betingelser 12.

Som et bevis på konseptet, ble phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) fra Brevundimonas diminuta valgt å bli pakket inn i E. coli stammer OMV 13. PTE inneholder et binuclear Zn / Zn-aktive sete og har evnen til å bryte ned organofosfater gjennom en hydrolysereaksjon omdannelse aryldialkylphosphates til dialkylphosphates og aryl-alkoholer 14. Eksponering for organofosfater svekker riktig signalfunksjon gjennom å hemme hydrolyse av acetylkolin ved acetylkolinesterase ved nevromuskulære veikryss Making organofosfat avledet forbindelser ekstremt farlige 15. Langvarig eller betydelig eksponering for organofosfater som vanligvis resulterer i ukontrollerte kramper og vanligvis fører til døden via kvelning. Mens PTE oppviser den høyeste katalytiske aktivitet mot paraokson, en meget potent insekticid, er det også i stand til å hydrolysere et bredt spekter av andre plantevernmidler og V / G typen kjemisk nervemidler 16. For å lette OMV emballasje, ble et bakterielt plasmid konstruert som koder for en genkonstruksjon som inneholder en induserbar promoter, et periplasmatisk lokalisering sekvens, og en kort multippelt kloningssete oppstrøms for SC-gensekvensen. Innsetting av PTE genet mellom leder og SC sekvens tillatt for etablering av en genetisk bryter som er rettet mot PTE-SC fusjonsprotein til periplasmarommet for OMV emballasje. Mens arbeidet som er beskrevet her fokusere på PTE, er enzymet genet utskiftbare og kan lett erstattes med en annen gensekvensen til Facilitate emballering av en alternativ enzym eller protein.

I den andre delen av det syntetiske binding, er en rikelig ytre membranprotein (OmpA) valgt å presentere den ST peptid-sekvens. Mens valget av ankeret protein kan variere, er det viktig at proteinet har en ettergivende domene som presenterer i det periplasmatiske rom, tåler fusjonskonstruksjon uten å indusere cytotoksisitet, er kjent for å være tilstede i OMV, og som ikke aggregerer når det er rekombinant produsert. OmpA er en 37,2 kDa trans porin proteiner som er kjent for å være sterkt uttrykt i den bakterielle ytre membran og påfølgende OMV 17. Den er involvert i transport av små molekyler, <2 nm i størrelse, på tvers av bakterielle membranen 18. Native OmpA har to strukturelt unike domener, et transmembran beta fat motiv og et periplasmically løselige C-terminale del kjent for å interagere med det peptidoglykan 19. I mutant OmpA-ST fusjon designed her den C-terminale del av OmpA ble slettet og ST ble smeltet til periplasmically vender N- eller C-termini. Slette periplasmatiske del av OmpA reduserer antall interaksjoner mellom den ytre membranen og peptidoglykan resulterer i membranen destabilisering fører til hyper-blæredannelse 7. Genomisk OmpA ble opprettholdt i tillegg til rekombinant uttrykte OmpA-ST-konstruksjon for å redusere brutto membran destabilisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av plasmider

  1. Forbered et plasmid (f.eks pET22) som inneholder anker protein (OmpA) smeltet til en biorthogonal kobling domene (referert til i denne protokollen som anker-ST), epitop tag (som 6xHis, myc eller flagg koder for rensing og identifikasjon), periplasmatiske lokalisering tag, antibiotikaresistens, og hensiktsmessig replikasjons basert på den valgte bakteriestamme 7.
    1. Utdrag plasmid DNA fra natten kulturer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA kit følge produsentens protokoll.
  2. Fremstille et plasmid (f.eks pACYC184) som inneholder enzymet / protein (PTE) som skal emballeres i OMV kondensert til den komplementære bioorthogonal binding domene til den av ankeret protein (referert til i denne protokollen som enzym-SC), epitop tag, periplasmatisk lokalisering tag, antibiotikaresistens som er annerledes enn den anker protein plasmidet, og passende origi replikasjons basert på den valgte bakteriestamme 7.
    1. Utdrag plasmid DNA fra natten kulturer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA kit følge produsentens protokoll 7.

2. Generering av en OMV Emballasje E. coli Culture

  1. plasmid Isolation
    1. Rens plasmider som koder for enzymet-SC konstruere og anker-ST konstruerer fra separate vedlikehold cellelinjer ved hjelp av et kommersielt plasmid isolasjon kit som per produsentens protokoll 7. Bestemme DNA-konsentrasjon og renhet ved å måle absorbans ved 260 nm og 280 nm.
  2. Co-transformasjon
    1. Velge en E. coli-stamme som er kommersielt tilgjengelig for å lette proteinekspresjon.
      MERK: BL21 (DE3) celler ble brukt her. T7-lysogen er nødvendig for ekspresjon av det anker-ST-konstruksjon, som er avhengig av T7-promoter, og T7 RNA-polymerase for protein uttrykk. Bruk av andre bakteriestammer krever enten tilstedeværelse av T7-lysogen gen eller ved bruk av en annen enn pET22 7 plasmidet.
    2. Fortynnet renset plasmid DNA til tilsvarende molare konsentrasjoner deretter forvandle dem til kompetente bakterieceller via enten varme sjokk transformasjon eller elektroporering følgende produsentens protokoll for de kompetente celler valgt.
    3. Plate forvandlet celler ut mot antibiotika-holdig Luria-Bertani (LB) agar plater med både ampicillin (pET22) og kloramfenikol (pACYC184); begge til stede ved sluttkonsentrasjoner på 25 ug / ml.
    4. Sett kulturskålen ved 37 ° C over natten for å isolere bare kloner som inneholder begge plasmider.
      MERK: Kolonier som overlever antibiotika utvalg vil bli brukt for alle fremtidige OMV forberedelser. Antibiotika (ampicillin og kloramfenikol) vil bli lagt til alle flytende kulturer for å opprettholde seleksjonspress og sikre tilstedeværelse av begge plasmider.

3. OMV Produksjon

  1. Colony Expansion
    1. Vaksinere 5 ml dyrkningsmedier (typisk Terrific buljong (TB) eller LB) som inneholder antibiotika ved de nevnte konsentrasjoner (trinn 2.2.3) med en enkelt koloni fra utvalget plater som er beskrevet i 2.2.4.
    2. Utføre en 1: 100 ganger fortynning av overnattingsstarterkultur i ledeplater kulturflasker.
      MERK: Bruk et volum av media mellom 250-500 ml.
    3. Opprett kulturen ved 37 ° C risting ved 250 rpm for å sikre at tilstrekkelig lufting av kulturen er oppnådd.
  2. Induksjon av hvert plasmid
    1. Tillat den bakteriekultur for å vokse til en OD 600 på 0,6 til 0,8, om lag 3 timer med vekst etter inokulering av den primære vekst kolben.
    2. For å forbedre den endelige utbyttet av PTE-SC anrikede vesikler, sentrifuger hele kulturen ved 7000 xg i 15 min. Resuspender cellepelleten i forvarmet, friske kulturmedier.
      MERK: Dette optional trinn bidrar til å fjerne en tom OMV som er til stede i kulturmediet før PTE-SC-induksjon.
    3. Lage en 20% stamløsning av L-arabinose i vann og sterilfilter ved bruk av et 0,22 um filter. Butikk L-arabinose løsning ved 4 ° C i 2-4 uker.
    4. Tilsett L-arabinose løsning på kulturflaske til en sluttkonsentrasjon 0,2% for å initiere PTE-SC produksjon.
      MERK: Dette bidrar til å forhåndslaste periplasmarommet med PTE-SC før fremme økt blæredannelse gjennom induksjon av mutant OmpA-ST.
    5. Lage en 1 M Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) oppløsning i vann og sterilfilter ved bruk av et 0,22 um filter.
      MERK: IPTG må brukes umiddelbart etter hydrert. Aliquoter av IPTG kan lagres frosset i 3-6 måneder, og kan tines umiddelbart før bruk.
    6. Legg IPTG etter ytterligere 3 timers inkuberingsperiode til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM å initiere produksjonen av OmpA-ST.
    7. La Culture å vokse i ytterligere 8-14 timer ved 37 ° C under rysting.

4. OMV Rensing

  1. Fjerning av Intakte bakterier
    1. Sentrifuger bakteriekulturmedium i 15 minutter ved 7000 xg ved 4 ° C for å pelletere intakte bakterier.
    2. Dekanter og lagre, media på toppen av cellen pellet post sentrifugering er forsiktig med å ikke forstyrre cellen pellet.
    3. Gjenta trinn 4.1.1 og 4.1.2 for en ekstra sentrifugering syklus for å sikre at alle intakte bakterier er fjernet fra kulturmedier være sikker på å dekantere og lagre media.
  2. Fjerning av proteinaggregater
    1. Ytterligere å rense det bakterielle kulturmedia ved hjelp av et 0,45 um membranfilter for å fjerne gjenværende bakterier og uønsket stor cellemateriale.
      MERK: Bruk en biologisk kompatibel membranmateriale for høyere utbytte og lavere protein adsorpsjon som celluloseacetat (CA) eller polyvinylidendifluorid (PVDF). Sprøytefilter volum mindre enn 100 ml og vakuum filtervolum større enn 100 ml.
      1. Å sprøyte filter, tegne dyrkingsmedium i sterile 10-50 ml sprøyte. Fest 0,45 mikrometer filter til Luer enden av sprøyten. Trykk stempelet og samle gjennomstrømning i et nytt fartøy.
      2. Til vakuum-filter, overføre kulturmedium til en steril filtrering apparat. Fest enheten til vakuumpumpe eller synke aspirator å generere sug. Overfør filtrert medium til nye fartøyet.
  3. Isolering av OMV via Ultrasentrifuge
    1. Legg den filtrerte kultur media i sentrifugeringsrør være forsiktig med å balansere motstridende rør i sentrifugen.
    2. Pellet på ~ 150 000 x g i 3 timer ved 4 ° C i en ultrasentrifuge ved bruk av det tilsvarende rotor passer både apparatet og rørene blir utnyttet.
    3. Dekanter OMV utarmet kulturmedier fra OMV pellet, være forsiktig med å forstyrre OMV pellet, umiddelbart ved ferdigstillelse of sentrifugering som tillater OMV pellet for å forbli i media vil myke pellets reduserende OMV utvinning.
      MERK: En slik pellet vil være litt brun og, avhengig av utgangs mengden av bakteriekultur kan eller kan ikke være synlig ved øyet. Aspirere media direkte fra toppen av sentrifugerøret er også et alternativ med tanke på at flere medier fjernet fra OMV klumpe mer ren finale OMV prøven vil være.
    4. Lagre sentrifugeres supernatanten for senere dynamisk lysspredning (DLS) testing for å verifisere at OMV partiklene ble helt utladet fra media.
    5. Legg 0,5-1 ml sterilfiltrert fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 eller 100 mM N-cykloheksyl-2-aminoetansulfonsyre (CHES) buffer ved pH 8,0 til OMV pellet slik at det inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur. Pass på at pelleten ikke tørker.
      MERK: Extremes i løsning ionestyrke, pH og temperatur kan føre til redusert OMV løselighet og fremme aggresøkelsen.
    6. Nøye pipettér den rensede OMV oppløsningen fra sentrifugerøret, å blande forsiktig for å sikre at hele pelleten er blitt solubilisert.

5. OMV Karakterisering

  1. Bruk hvilken som helst kommersielt tilgjengelig DLS eller nanopartikkel sporing programvare følger den medfølgende produsentens protokoller som er unike for hvert instrument for å bestemme OMV størrelsesfordeling og partikkelkonsentrasjonen.
    MERK: Her ble OMV størrelsesfordeling og konsentrasjon bestemmes utnytte NanoSight LM10 partikler Tracking og NTA 2.3 Analyse programvare.
    1. Åpne programvaren.
    2. Slå på mikroskop og rengjør alle flater på mikroskopet og nanopartikkel sporing enhet.
    3. Legg ~ 0,5 ml OMV prøven direkte til visningsvinduet til partikkelen sporingsenhet gjennom Luer passer med en 1 ml steril sprøyte være sikker på å dekke hele visningsvinduet uten å injisere noen luftbobler inn i systemet.
    4. Place tHan nanopartikkel sporing enhet på mikroskopet scenen og slå på laseren.
    5. Klikk på "Capture" i programvaren.
    6. Juster mikroskop fokus og scene til å visualisere partiklene på forhåndsvisningsskjermen til stede i programvaren vinduet.
    7. Juster "Camera Shutter" og "Camera Gain" inntil lyse partikler er tydelig visualisert på en mørk bakgrunn.
    8. Juster fangst varighet 60 sek.
    9. Klikk på "Record".
    10. Når du blir bedt, input / enhetens temperatur prøven, merke prøven, og lagre videodata ved avslutningen av hvert kjøre inn en bruker angitt mappe.
    11. Hold alle analyseparametere (deteksjonsgrensen, Blur, Min Sang Lengde, Min Forventet Particle Size) på automatisk oppdage modus og klikk "Process Sequence."
      MERK: Se i bruksanvisningen for hvordan hver enkelt parameter kan justeres uavhengig for å fininnstille analyseresultater.
    12. Record partikkelstørrelsesfordeling og partikler / ml konsentrasjonen som bestemt av programvaren.
      MERK: En typisk OMV hydrodynamiske størrelsesområdet er mellom 30-200 nm med en partikkel / ml konsentrasjon av ~ 10 x 10 8.
  2. Bestemme OMV proteininnhold
    1. Bruk standard SDS-PAGE og Western blot protokoller for å vurdere OMV renhet, enzym produksjon, og SC-ST kryssbinding effektivitet 7.
      MERK: Tverrbinding effektivitet vil ikke være 100% 7.

6. Verifikasjon av Enzyme emballasje

  1. PTE aktivitetsanalyse
    1. Utføre alle enzymatiske analyser i en egnet buffer, slik som 100 mM CHES-buffer (pH 8) ved 25 ° C i enten en kuvette eller multiplekset i en 96/384-brønners plate.
    2. Tilsett 5 ul av en 1: 1000 fortynning av paraokson i CHES-buffer til 90 ul av CHES og 5 pl av renset OMV (~ 36 ganger konsentrert sammenlignet med konsentrasjonen OMV til stede i kulturmediet).
      Forsiktig: paraokson er en giftig plantevernmiddelog må håndteres per produsent og institusjonelle retningslinjer.
    3. Ta avlesninger ved jevne mellomrom (hvert 20. sekund for ~ 2 timers total reaksjonstid) ved 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) og ved 348 nm (isosbestic punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) til overvåke reaksjonen progresjon av det kromogene paraokson nedbrytningsprodukt, p-nitrofenol.
      MERK: Ved pH-verdier over 8 den dominerende deprotonerte form av p-nitrofenol er til stede slik at for nøyaktig overvåking ved 405 nm. I alle andre komplekse eller lavere pH-løsninger er det nødvendig å anvende den isosbestic punkt av 348 nm som multiple former av p-nitrofenol er til stede.
    4. Beregn innledende reaksjonshastigheter ved å bestemme helningen av den lineære delen av fremdriften kurvene fra trinn 6.1.3 for å sammenligne den relative mengde av PTE i hver prøve, emballasje effektivitet, og total PTE produksjon.
    5. Utfør standard enzymatiskanalyseprotokoller for å bestemme K M, V max og k katt for OMV innkapslet PTE.
      MERK: kan utnyttes A Lineweaver-Burk analyse for bestemmelse av disse kinetiske parametre hvor y-aksen = 1 / V max og skråningen = K M / V max 20.
  2. Trans Underlag / Vare Diffusion.
    1. Utføre den samme kinetisk undersøkelse analyse som beskrevet i trinn 6.1 anvendelse av økende konsentrasjoner av Triton X-100 i CHES-buffer fra 0-3 volum-%.
      MERK: tilsetning av Triton X-100 til de solubiliserte OMV funksjoner for å forstyrre det ytre lipid bilaget slik at for innholdet av OMV å være fritt tilgjengelig til reaksjonsløsningen.
    2. Beregne og sammenligne den opprinnelige hastighetene ved hver Triton X-100-nivå for å bekrefte transmembrane passasje av substratet / produkt indikert med minimal endring i enzymaktivitet (opprinnelige hastighetene) sammenlignet med enzymaktivitet in fravær av Triton X-100. Dersom en betydelig økning i enzymaktivitet er observert i nærvær av Triton X-100 er det sannsynlig at substratet ikke diffundere fritt inn i det OMV.
    3. Assay fri enzymaktiviteten (som beskrevet ovenfor i seksjon 6.1) i nærvær av Triton X-100 for å bekrefte at enzymaktiviteten ikke er hemmet av det overflateaktive middel i seg selv.
      MERK: Hvis aktivitet er sterkt påvirket av Triton X-100, alternative additiver, så som saponiner eller forskjellige polysorbat / tween overflateaktive midler kan være mer egnet til å revne den OMV membranen.

7. OMV Storage

  1. frysing
    1. Place ~ 100 pl prøver av renset OMV direkte i flytende nitrogen til å knipse fryse porsjoner blir sikkert ikke å fullt dukke hetteglassene eller kontakte noen flytende nitrogen med prøven selv.
      MERK: Renset OMV kan hurtigfrosset direkte i bufferen som ble valgt for å løse opp OMV pellet under purification prosess uten ekstra cryoprotectants nødvendige syv.
    2. Oppbevar snap frosset alikvoter ved -80 ° C.
    3. Tine frosne porsjoner fra trinn 7.1.1 ved å plassere dem ved RT å være sikker på ikke å varme prøvene.
    4. Før fremstilling av alle prøvene for lagring på denne måte utfører den enzymanalysen er beskrevet i trinn 6,1 sammenligning opprinnelige hastighetene før og etter frysing for å verifisere at det ikke er noen signifikant tap i enzymaktivitet post frysing og tining.
      MERK: Oppbevar renset OMV ved 4 ° C dersom reduksjonen i enzymaktivitet er observert på grunn av frost.
  2. frysetørking
    1. Lyofilisere snap frosset rensede OMV porsjoner utnytte kommersielt tilgjengelig frysetørking utstyr 21.
    2. Lagres lyofilisert alikvoter ved RT i uker eller ved -80 ° C i flere måneder.
    3. Tilsett samme volum av renset vann til den lyofiliserte OMV som før lyofilisering og la stå ved romtemperatur i 30 minutter for å rehydrere than prøve. Bland forsiktig når det er nødvendig å være sikker på å ikke vortex eller sonikere OMV.
    4. Legg lyofilisert OMV pulver direkte til point-of-care for applikasjoner der før fortynning / solubilization er ikke nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Samtidig ekspresjon av to rekombinante proteiner, som er nødvendig for OMV emballasjen strategien beskrevet i denne protokollen, kan oppnås ved en rekke forskjellige veier. Her ble det to vektorsystem utnyttes med kompatible replikasjons og separate induserbare genet kassetter. For ekspresjon av den PTE-SC konstruere et kommersielt plasmid ryggrad (pACY184) ble konstruert for å inkludere et arabinose induserbar gen kassett og en tvilling arginin periplasmatiske lokalisering av ledersekvensen, fulgt av en serie av unike restriksjonsseter for å lette kloning av enzymet genet som en fusjon til en C-terminal SC protein. Plasmidkonstruksjonen som koder for det ytre membranprotein ankeret er den kommersielle vektoren pET22 som benytter lac-operonet for kontroll av protein ekspresjon og pelB periplasmatiske lokalisering sekvens. Den korte ST sekvens ble klonet inn i det avkortede OmpA-protein før insertion inn i ekspresjonsplasmidet. I begge plasmider ble den C-terminale hexahistidine sekvensen opprettholdes for å tillate for samtidig identifikasjon av fusjonsproteinene i OMV prøver. Konstruksjon og karakterisering av disse genkonstruksjoner, inkludert både de N- og C-terminalen ST-fusjonskonstruksjonene til OmpA, er fullstendig beskrevet i Alves et al. 7. De genkonstruksjoner som beskrives heri, kan ikke bli bidrar til pakking av alle enzymer. I noen tilfeller kan det være nødvendig å endre det periplasmatiske lokaliseringssignal, de regulatoriske elementer, eller epitopen koder. I tillegg kan enkelte proteiner være prohibitivt store og ute av stand til å tverrgående den indre membran helt. Enzymatisk aktivitet og OMV emballasje effektivitet kan ikke bestemmes a priori og må bestemmes empirisk for hvert mål protein.

Nedenfor er resultater som man vanligvis forventer etter vellykket gjennomføring oUt Dette protokollen. Inkludert er et skjematisk riss av de to ST / SC delt proteindomener, OmpA-ST og PTE-SC fusjonskonstruksjoner, så vel som et eksempel på isopeptide formasjonen ved den bakterielle ytre membran og påfølgende innkapsling av PTE-SC innenfor et OMV (Figur 1) . Også inkludert er representative resultater av renset OMV morfologi via SEM samt størrelsesfordeling og absolutt OMV konsentrasjon bestemmes via partikkel sporing av programvare (figur 2). Ytterligere karakterisering av OMV proteininnhold og rekombinant protein uttrykk blir sett via SDS-PAGE og Western blot (figur 3). Molekylvekter for proteiner av interesse som er spesifikk for protokollen gitt her, er som følger: opprinnelig OmpA (37.2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Renset OMV bør ha et mørkt bånd ved tilnærmet 37 kDa som er indikativ for den svært rikelig opprinnelige OmpA. Avhengig av gelen oppløsning det kan være flere bands til stede i dette område av gelen som OmpA, OmpF og ompC er alle relativt rikelig og har en lignende molekylvekt. En ekstra band som er 2,2 kDa større enn OmpA-ST kan også observeres på grunn av feil spalting av ledersekvensen som et resultat av å overskygge E. coli-ekspresjon maskineri. Det er viktig å merke seg at en vellykket renset OMV prøven ikke vil ha mange andre sterkt uttrykte proteiner. Hvis andre band er til stede enten i rensingen ble utført feil eller bakterier belastning blir utnyttet, kan emballasje andre proteiner som ikke ble observert i denne E. coli BL21 (DE3) stamme.

Videre har aktivitetsanalyser og vesikkel bruddforsøk blitt gitt for å vise representative resultater som kan forventes hvis den enzymatiske underlaget kan fritt gå inn i OMV gjennom trans PORIN proteiner (figur 4). Paraokson relativt fritt entrerOMV gjennom endogene transmembrane Porin proteiner for å reagere med den pakkede PTE og reaksjonsproduktet, p-nitrofenol, passerer også forholdsvis fritt gjennom OMV membranen. Dette fenomenet vil ikke være allestedsnærværende blant alle produkt, substrat og enzymsett, og må bestemmes eksperimentelt. Selv om vellykket OMV brudd og frigivelse enzymet har blitt sett på med lave konsentrasjoner av vaskemiddel og PTE (heri Triton X-100), kan slike tilsetninger påvirke aktiviteten av andre enzymer.

Plasmidkart over er også inkludert for å vise utformingen av en to-plasmid emballasje strategi anvendelse av SC / ST-systemet (figur 5).

Figur 1
Figur 1: Rettet pakking av proteiner til OMV. Krystallstrukturer for proteiner benyttes i den beskrevne OMV emballasje strategy: ​​OmpA, PTE, SpyTag (ST) og spycatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI hhv. En skjematisk fremstilling av OmpA-ST og PTE-SC fusjonskonstruksjonene som danner en isopeptide binding i den ytre membran av bakterier er vist. Denne membranfusjon driver inkorporering av PTE innenfor formings OMV. Figur reproduseres (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat grensesnitt (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: OMV karakterisering. (A) SEM av ultra renset OMV fra innfødte E. coli [BL21 (DE3)]. (B) Representant partikkel trac king size-distribusjoner og (C) total vesikkel konsentrasjon, fordelt på 90 sek prøven leser for Native OMV, PTE-SC i fravær av arabinose aktivering (PTE-No A), PTE-SC i nærvær av arabinose aktivering (PTE-A) N-terminal OmpA-ST ko-transformert med PTE-SC i nærvær av arabinose og IPTG aktivering (PTE / OMV-N), og den ultrasentrifuge supernatanten (UC supernatant). En betydelig økning i OMV produksjonen ble observert i PTE / OMV-N prøven i forhold til Native OMV og PTE-SC konstruerer alene. OMV ble kvantifisert i UC supernatanten å demonstrere en nesten fullstendig gjenoppretting av OMV i UC pellet forlater lite eller ingen OMV i supernatanten etter ultrasentrifugering. All data viser gjennomsnitt (± SD) av tredoble eksperimenter. Figur reproduseres (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat grensesnitt (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Renset OMV proteininnhold besluttsomhet. (A) SDS-PAGE av renset OMV UC pellet av C-terminal OmpA-ST fusjon koekspresjon med PTE-SC (PTE / OMV) konstruere demonstrere representant overflod av OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC og OmpA- ST / PTE-SC isopeptide fusjon. (B) Western blot-analyse benytter den medfølgende His-merke tilstede i OmpA og PTE-konstruksjonene for å lette visualiseringen via et anti-antistoff 6xHis. Det er viktig å merke seg at PTE er kjent for å dimerisere, som vist på blot ved nærvær av større molekylvekt His-merkede arter. Selv om det er svært høye OmpA-ST uttrykk nivåer observert det er ikke en fullstendig konvertering av gratisPTE-SC til membranbundne OmpA-ST / PTE-SC. Til tross for dette faktum, er økningen i total produksjon PTE og forbedret emballasje effektivitet antyder at mens kovalent bindingsdannelse ikke er allestedsnærværende den ikke-kovalent assosiasjon av ST og SC domener er en viktig faktor i rettet emballasje i OMV. Figur reproduseres (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat grensesnitt (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: PTE aktivitet og pakking karakterisering. (A) Samlet PTE uttrykk nivåer og OMV emballasje effektivitet bestemmes via innledende hastighetsmålinger utnytte paraoxon som et kromogent substrat som sammenligner PTE til stede i cellepelletene, UC supernatanten, og de rensede UC OMV pellets. (B) Representative data som demonstrerer bruken av Triton X-100 (0,5% T100) for å forstyrre OMV bilaget som tillater uhindret adgang av substratet til det indre OMV. Sammenligning av disse data til analyser som utføres i fravær av T100 muliggjør verifikasjon av translokasjon av substratet på tvers av intakte OMV dobbeltlag hvis enzymatiske opprinnelige hastighetene er uendret. I tilfelle av paraokson var der meget liten aktivitet forskjell observeres i nærvær eller fravær av T100 indikerer at paraokson passerer fritt gjennom de endogene porene på OMV. (C) PTE-SC kinetiske data passer til standard Michaelis-Menten enzymkinetikk ligningen for PTE / OMV-N og PTE-A. (D) en Lineweaver-Burk-analyse benyttes for å bestemme K M og k cat / K M (48, 4,4 x 10 7; 44 uM, 4,9 x10 7 sek -1 M -1, henholdsvis), som viser tilsvarende PTE litteraturkinetiske parametere som naturlig enzym (90 uM, 2,7 x 10 7 sek -1 M -1) med R2 ≥ 0,999 i alle tilfeller. All data viser gjennomsnitt (± SD) av tredoble eksperimenter. Figur reproduseres (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat grensesnitt (2015), 7 (44), pp 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Representative plasmidkonstruksjoner for eksempel systemet som er beskrevet her. SpyCatcher modifisert enzym-SC (PTE-SC) plasmid målrettet for innkapsling i OMV (til venstre). SpyTag modifIED membran anker-ST (OmpA-ST-N) plasmid (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen funksjoner for å demonstrere en representativ rettet emballasjeteknikk der et enzym av interesse blir produsert og pakket inn i OMV av E. coli. Som med mange komplekse teknikker det er flere områder hvor protokollen kan endres for å imøtekomme til bruk i ulike unike applikasjoner, hvorav noen er beskrevet nedenfor. Mens mekanismen for OMV emballasje og enzym innkapsling kan tilpasses spesifikke behov er det flere trinn i denne protokollen som er avgjørende for dens suksess. Den innledende fjerning av intakt bakterien og cellerester er av vesentlig betydning og vil påvirke alle nedstrøms forsøk på kvantifisering eller analyse av prøver. To suksessive sentrifugeringstrinn etterfulgt av filtrering er vanligvis tilstrekkelig for å fjerne disse forurensninger. Men i alle tilfeller bør man være forsiktig når dekantering løsninger etter sentrifugering for å redusere overføring av forurensninger. Tilsvarende den endelige OMV pellet obtained etter ultrasentrifugering er ofte kun løst festet til bunnen av sentrifugerøret. I sluttfasen, må man være forsiktig ved fjerning av det anvendte kulturmediet for å sikre at den forblir uforstyrret pellet på bunnen av beholderen. I noen tilfelle kan det være best å beholde den endelige kulturmediet før etter analysen bruker DLS eller nanopartikkel sporingsenhet for å sikre at OMV pellet ble ikke tapt i de siste trinnene i protokollen. Nedenfor er noen flere bekymringer som kan oppstå med både denne protokollen og andre som er skreddersydd til spesifikke behov hos forskerne.

Bruken av PTE i dette systemet gir en utmerket modell enzym innkapsling for miljøtiltak for organofosfat forurenset regioner med PTE være lett skiftes ut av en alternativ enzym eller protein av interesse. Som beskrevet her koekspresjon av PTE-SC med OmpA-ST resulterte i en stor økning i den generelle PTE expressipå samt høyere vesikkel produksjonsnivå med mer PTE blir pakket i vesikler i forhold til PTE og PTE-SC uttrykt alene. Ved å redusere antallet av interaksjoner mellom den ytre membranen og det peptidoglykan gjennom den C-terminale delesjon av OmpA hyper-blæredannelse er oppnådd. Dette gir en enkel rute for bakterier å eksportere rekombinant PTE som reduserer de toksiske effektene som ofte observert i overekspresjon av ikke-native proteiner.

Mens PTE kan lett byttes ut i denne modellen systemet er det viktig å merke seg at ikke alle enzymsubstrater vil fritt passere gjennom OMV bilaget, og det er derfor viktig at hver unike enzym og substrat par testes på en sak til sak. Selv om et substrat som ikke passerer gjennom membranen denne teknikken kan likevel anvendes for å fremstille og pakke et enzym til OMV og tilsetning av Triton X-100, eller alternativt passende overflateaktivt middel, kan tilsettes på et tilstrekkelig leVELS å sprekke vesiklene før bruk.

I fravær av rekombinant proteinekspresjon og innpakking denne protokollen kan også tjene som en grunnleggende metode for OMV produksjon og rensing fra forskjellige bakteriearter. Alternative metoder for OMV rensing, som f.eks densitetsgradient fraksjonering 22, membranfiltrering 23, og ultrafiltrering 24, eksisterer også og kan være mer egnede teknikker avhengig av den påtenkte anvendelse. Disse alternative renseteknikker kan også lett suppleres inn i denne protokollen i stedet for ultrasentrifugering pelletering av OMV for den rettede pakking av et protein i en OMV ved bruk av en syntetisk biorthogonal binding.

Andre modifikasjoner kan gjøres til de spesifikke syntetiske leddsystemet anvendt i denne protokollen, så vel som den valgte membranprotein deling. Det finnes forskjellige syntetiske strategier for sammenkobling to forskjellige proteins innenfor et biologisk system som inkluderer: split proteiner 25, coiled spoler 26, og delt inteins 27, bare for å nevne noen. Andre membranbundne eller trans proteiner som OmpF og ompC vil trolig sørge for egnede ST modifikasjons nettsteder samt 28. I noen tilfeller kan det også være nødvendig å bytte ST og SC-domener plassere SC på forankrings proteinet og mye mindre ST på det rekombinante enzym / protein. Det finnes også en rekke forskjellige kloningsstrategier som kan iverksettes her inkludert bruken av flere plasmider under de samme eller forskjellige induksjonssystem, et enkelt plasmid med flere proteiner kodet, eller benytte homologe rekombinasjonsteknikker for å innlemme hele eller deler av uttrykket systemet i det bakterielle genomet.

Mikromiljøet av OMV bidrar til å stabilisere den pakkede enzymet reduserer enzymatisk inaktivering som ofte oppstår under mindre enn ideelle storage forhold, fryse-tine og frysetørking 29. Det er også forventet at den OMV vil gi sterkt forbedret resistens mot proteolytisk spaltning som OMV bilaget vil virke som en fysisk barriere mellom det aktive enzym og proteinene som er tilstede i ekstra-OMV plass. Denne protokollen kan videre utvides til å omfatte en utvendig vender lite molekyl, peptid eller protein tag å lette målrettet levering av OMV innkapslede proteiner og affinitet rensing. Mens PTE ble valgt for denne unike applikasjonen resultatene av denne studien, og innholdet i denne protokollen, kan lett brukes til å designe analoge protein emballasje strategier for bruk i forskjellige farmasøytiske levering, medisinsk diagnostikk og miljømessig utbedring programmer 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG Any Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose Any Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C.
Ampicillin Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
Chloramphenicol  Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
TB/LB Culture Media Any Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100 Any One of many potential suitable surfactants.  
Baffled culture flasks Any The baffles promote higher levels of aeration.  
CHES Fisher Bioreagents BP318-100 Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon Chem Service N-12816 Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.  
Syringe Filter 0.45 µm Thermo Scientific 60183-221 (30 mm) Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator New Brunswick Excella E24 Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. 
Sorvall Culture Centrifuge Thermo Scientific RC 5B PLUS Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge  Thermo Scientific WX Ultra 90 Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor Thermo Scientific AH-629 Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) Beckman Coulter 344058 Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer  Tecan Infinite M1000 Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS/particle tracking NanoSight  LM10 Necessary for OMV size distribution and concentration determination.  
BL21(DE3) NEB Suitable bacterial expression strain.
pET22 EMD Millipore 69744-3 Other plasmids can be used in place of these.  
pACYC184 NEB Other plasmids can be used in place of these.  
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Example kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

Tags

Biokjemi ytre membranblærer (OMV) rensing regissert emballasje enzym, Bioorthogonal sammenhengen phosphotriesterase (PTE) forbedret stabilitet
Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produksjon og rensing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, … More

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification. J. Vis. Exp. (117), e54458, doi:10.3791/54458 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter