Summary
En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.
Introduction
La insuficiencia cardíaca es común y mortal. Es una enfermedad progresiva que da como resultado la contractilidad disminuida del corazón, lo que impide el flujo de sangre a los órganos y las hojas de las demandas metabólicas de la insatisfecha cuerpo. Se estima que 5,7 millones de estadounidenses tienen insuficiencia cardiaca y es la primera causa de hospitalización en los Estados Unidos 9. El costo colectiva de tratamiento de los pacientes en la insuficiencia cardíaca en los Estados Unidos excede $ 300 mil millones de dólares por año 9-10. El único tratamiento definitivo para la insuficiencia cardíaca en fase terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100.000 corazones de donantes para procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos 1-2. Debido al limitado número de donantes, sólo aproximadamente 2.400 trasplantes se realizan cada año en los EE.UU. 2. Claramente, esta escasez de órganos debe ser abordado ya que se requieren otras estrategias para producir órganos adicionales para Transplantala e, idealmente, estos órganos sería autólogo a fin de evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida.
Cardiomiocitos adultos de mamíferos demuestran una capacidad regenerativa limitada después de la lesión, pero la evidencia reciente sugiere que los corazones neonatales de mamíferos mantienen una notable capacidad de regeneración después de la lesión 5-8. En concreto, después de la resección quirúrgica parcial, una ventana regenerativa ha descubierto entre el nacimiento y postnatal día 7. Este período de regeneración se caracteriza por una falta de cicatriz fibrótica, formación de neovascularización, liberación de factores angiogénicos del epicardio, y la proliferación de los cardiomiocitos 5-8 , 11. Esta ventana de regeneración de tiempo proporciona la posibilidad de utilizar el corazón neonatal como una nueva fuente de material para el desarrollo de un corazón bioartificial.
La matriz extracelular es conocido proporcionar señales importantes para promover cardiomyocytproliferación e y el crecimiento. Claras diferencias en la disponibilidad de las moléculas en las matrices neonatales y adultos 12 y su capacidad para promover la regeneración se han explorado 13. matrices adultos descelularizado se han utilizado en varios estudios para proporcionar un andamio ECM para la repoblación celular y la generación de un corazón bioartificial. Si bien estos estudios, y los nuevos descubrimientos en tecnologías de células madre, están avanzando rápidamente, varios obstáculos aún no se han cumplido. Por ejemplo, las limitaciones en la preservación de la estructura nativa de la matriz, la integración celular en la pared de la matriz, y la capacidad para apoyar la proliferación y el crecimiento de todos limitan el éxito de este enfoque. Mientras que los atributos regenerativos superiores se han atribuido al corazón neonatal, los aspectos prácticos del uso de un pañuelo de papel tales han limitado su exploración.
Sobre la base de la capacidad de regeneración demostrado del corazón neonatal, hemos desarrollado nuevas matrices mediante el desarrollo de unatécnica de descelularización para el corazón P3 ratón. El corazón P3 fue elegido para estos estudios, ya que se encuentra dentro de la ventana de la regeneración cardiaca como se determina previamente 6 pero el corazón es lo suficientemente grande para la cosecha, decellularize y recellularize. El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de crear una matriz de un corazón neonatal de ratón. Nuestros estudios proporcionan evidencia de la viabilidad de decellularizing un minuto, corazón neonatal mientras se mantiene la integridad estructural y proteico de la ECM. También demostramos la capacidad de recellularize este ECM cardiaca con mCherry cardiomiocitos expresan y hemos examinado estos cardiomiocitos para la expresión de diversos marcadores cardíacos siguientes recelularización. Esta tecnología permitirá para la prueba de la superioridad de una matriz neonatal para el desarrollo de un corazón bioartificial.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Minnesota.
1. Método para el ratón El aislamiento del corazón
- La eutanasia a un ratón neonatal por decapitación con una sola pala uso.
- Hisopo el tórax con 70% de etanol.
- Diseccionar la piel del pecho por el corte lejos de la pared del pecho con unas tijeras estándar, mientras que tirando de la piel lateralmente con un par de fórceps # 5.
- Perforar el abdomen justo por debajo del esternón con las tijeras de corte a través de la pared abdominal. Agarrando el proceso xifoides con # 5 pinzas, retraer el esternón rostral del cuerpo durante el corte, aunque los nervios de cada lado del pecho con las tijeras. La caja torácica se refleja superiormente con las pinzas para revelar el corazón.
- Sin rodeos diseccionar los dos lóbulos principales del timo tirando lateralmente con # 5 pinzas, exponiendoel arco de la aorta, así como las venas cavas y pulmonares.
- Seccionar las arterias principales de la arco aórtico, y la propia aorta, con las tijeras de primavera 10 cm. Conservar la aorta entre la base del corazón y la arteria braquiocefálica. Agarre los extremos de los vasos cortados con el # 5 fórceps para reflejar el corazón hacia delante, separándola de la tráquea y el esófago.
- Seccionar la vasculatura pulmonar y otras venas principales, mediante el corte entre los pulmones y el corazón en ambos lados del corazón con las tijeras de primavera 10 cm. Las venas permanecen abiertos para proporcionar un drenaje.
- Retire el corazón del mediastino con el # 5 pinzas, agarrando los extremos cortados de los grandes vasos. Coloque el corazón en una placa de cultivo de 60 mm que contiene solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para la cateterización.
2. Método para la descelularización por perfusión de Langendorff
- Preparar el conjunto de catéter con antelación. Dibuje una sección de 4 cmde PE 50 tubos en una pequeña llama de alcohol para crear un catéter más pequeño, más delgado. Recorte los extremos con una cuchilla para cumplir con las dimensiones (aprox. 300 m OD diámetro exterior con una brida de aprox. OD 500 micras) que se muestra en la Figura 1. Esto proporcionará dos catéteres simétricas a cada lado de la lengüeta de arrastre.
- Apunte el extremo cortado de la tubería en la llama brevemente, para fundir una brida en la abertura en el extremo delgado.
- Llene la jeringa 12 ml con PBS y montar el catéter mediante la colocación de una llave de paso de 3 vías en la jeringa. Añadir un 22 G x 1 aguja a la llave de paso y empujar la aguja a través del septum. Deslizar el catéter tubo de PE dibujado en la aguja (Fig. 1).
- El riego de las piezas ensambladas con PBS, asegurando que todas las burbujas de aire se han eliminado.
- Insertar el catéter, preparado como se describe anteriormente, en la aorta del corazón aislado, que no se extiende más allá de la válvula aórtica y se liga con un lazo de sutura 7-0. Descansar la brida de tél catéter proximalmente contra el lazo, haciendo un sellado hermético y evitando que el corazón se salga del catéter.
- Observe el cateterismo con una lupa, mientras que la perfusión suavemente el corazón usando la jeringa que contiene PBS. Asegúrese de que no hay fugas en el sistema y el tejido blanches homogéneamente como se extrae la sangre latente.
- Coloque el septum en el cuello del adaptador de entrada y sellarlo por plegado de los lados sobre el cristal.
- Una el depósito lleno con 60 ml de 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS) en agua destilada (dH 2 O) a través de una línea de longitud suficiente para producir una columna que genera 20 mm Hg de presión como se muestra en la Fig. 1. Calcular la presión de la altura de la columna de líquido basado en la relación de 1 mm Hg es igual a 1,3595 cm H 2 O.
Precaución: El SDS es un polvo altamente floculante con propiedades irritantes. Contacto debe ser evitado. Manejar el polvo usando la ropa protectora adecuada. - Perfundir el corazón con SDS al 1% durante 14 horas. El corazón será transparente en apariencia sin tejido restante observable.
- Enjuague el sistema hasta la llave de paso de la solución de SDS restante y reemplazarlo con 10 ml de dH2O Perfundir el corazón con 10 ml 1% de Triton X-100 (diluido en agua destilada), seguido de 10 ml dH 2 O, seguido de 60 ml de PBS que contenía penicilina estreptomicina 1x (Pen-Strep).
- Almacenar el corazón en PBS con 1 Pen-Strep a 4 ° C. Si la aplicación de post descelularización destinado requiere perfusión entonces el catéter en la aorta se debe mantener, de lo contrario cortar el lazo de sutura y retirar el catéter.
Determinación 3. ADN
- Preparar un resumen del corazón ECM o control descelularizada utilizando 200 mg / ml de proteinasa K en KCl 50 mM, MgCl 2,5 mM 2, 0,45% de Tween 20 en Tris 10 mM (pH 8,3).
- Incubar el tejido en 55 ° C con agitación hasta que se disuelve el tejido,típicamente 4-5 horas.
- Cuantificar el contenido de ADN del homogeneizado con un ensayo de unión al ADN 4,11.
4. La fijación y seccionamiento de Tejido
- Fijar descelularizado corazones, recelularizado o P3 de control en 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar el tejido en PBS 3x.
- Coloque el tejido en una solución de 7,5% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C hasta que se hunde.
- Cambie la solución a 15% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C, de nuevo, hasta que se hunde.
- Calentar el tejido a 37 ° C, sustituir la mitad del volumen con una solución de gelatina en 15% de sacarosa y tampón fosfato 0,1 M y equilibrar durante la noche. Las concentraciones de gelatina se incrementan por etapas a través de 1%, 2,5%, 5% y finalmente 7,5% dos veces.
- Colocar las muestras en criomoldes utilizando fresca 7,5% de gelatina. Para restaurar la forma de las muestras descelularizados, gelatina líquida se puede perfundió en las cámaras como tél corazones se moldean. Congelar flotando los criomoldes en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C.
- Cut (10 m de espesor) secciones con un criostato. Llevar la corredera cerca de la superficie de la sección y observe la sección de moverse fuera de la cuchilla sobre la superficie debido a la carga de los portaobjetos tratados electrostáticamente. Se secan los portaobjetos durante la noche y almacenar a -80 ° C para su posterior análisis.
- Retire los portaobjetos del congelador, se equilibre a temperatura ambiente y luego se coloca en un frasco Coplin con PBS durante 20 minutos a 37 ° C para disolver la gelatina.
- Manchar las secciones de corte desde el paso 4.7 con hematoxilina y eosina. Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin. Exponer las diapositivas hidratados en el paso 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, el agua del grifo durante 1,5 min, tampón durante 3 minutos, el agua del grifo durante 1 minuto, agente de azulado durante 1,5 minutos, etanol al 80% durante 1 min, alcohólica eosina Y durante 8 s, 80% de etanol durante 1 min, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de eliminación (sustituto xileno) durante 1 min 3x, cubreobjetos con resinaMedio de montaje basado. Examinar los portaobjetos al microscopio.
- Para confirmar la retención de proteínas ECM reactividad de la ECM corazón, mancha para las proteínas estructurales de ECM tales como colágeno IV mediante la colocación de las diapositivas hidratados en una cámara humidificada y se trata con 10% de suero normal de burro (NDS) en solución salina tamponada con fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Utilizar un volumen suficiente para cubrir las secciones de tejido.
- Reemplazar la solución con el anticuerpo primario de elección a una dilución determinada empíricamente en 5% NDS / PBST. Por ejemplo, el anticuerpo de colágeno IV se diluyó en 1: 150. Incubar toda la noche a 4 ° C.
- Lavar los portaobjetos con PBST 3 veces y aplicar un anticuerpo secundario de elección conjugado con un colorante fluorescente. Diluir el anticuerpo en una cantidad determinada empíricamente. Incubar durante 1 hora a RT. Lavar 3x con PBS.
- Tinción de los portaobjetos con un tinte de unión al ADN tales como DAPI para verificar la ausencia de núcleos de células mediante el uso de un mounti DAPI que contieneng medio cuando la cubierta se deslice las diapositivas.
- Examinar los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia de 50 a 400X.
5. P1 neonatal murino ventricular cardiomiocitos para recelularización
- Rociar cada cachorro con un 70% de etanol y decapitar con una sola pala uso.
- Mantenga cada cachorro entre el pulgar y el índice, mientras que el tórax se divide en la línea media con pequeñas tijeras estériles para exponer la cavidad torácica. Aplicar presión para permitir que el corazón sobresalga libremente desde el pecho mientras se corta libre de los grandes vasos y las aurículas dejando sólo el tejido ventricular.
- Coloque cada corazón directamente en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de calcio enfriado en hielo, solución salina tamponada de bicarbonato libre de Hank con mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico 20 (CBFHH) hasta que se recogen todos los corazones.
- Aspirar el CBFHH y añadir 10 a 15 ml de CBFHH fresco (enfriado con hielo) en el tubo. Lavar el tejido haciendo girar el tejido en tél tubo varias veces.
- Decantar la solución que contiene el corazón en una placa de Petri de plástico 60 mm.
- Diseccionar cualquier tejido auricular latente de los corazones con una lupa en el hielo por el recorte alejado de los corazones con las tijeras de primavera. Picar los ventrículos en trozos pequeños de tamaño homogénea. Eliminar cualquier tejido no ventricular separado del plato con # 5 pinzas.
- Pipet tanto de la solución de CBFHH como se necesita para la transferencia de los fragmentos de tejido en un pequeño vial estéril que contiene una barra de agitación micro estéril.
- Permitir que el tejido de sedimento al fondo del vial y eliminar la solución de CBFHH.
- Completar hasta 50 ml de una solución de enzima 1,75 mg / ml de tripsina, 20 mg / ml de ADNasa II en CBFHH. Pipeta de 5 ml de esta solución de enzima y añadirlo a un tubo que contiene tejido ventricular picada y el lugar en un agitador magnético. Se agita a una velocidad constante (340 rpm) a temperatura ambiente durante 8 min.
NOTA: La acción de agitación debe ser suave y sin embargo permitirpara la suspensión de la suspensión. - Retire el vial de la placa de agitación y permitir la suspensión para sedimentar durante 3 min. Pipetear y desechar el sobrenadante inicial de digerir, ya que contiene principalmente células de sangre y restos de tejido.
- Pipetear una segunda alícuota de 5 ml de la solución de enzima y añadirlo al ventrículo digestión. Se agita durante 8 minutos y dejar que se sedimente durante otras 3 min. Antes de comenzar las digestiones, preparar dos tubos de 50 ml (marcado 1 y 2) que contienen cada uno 12 ml de suero bovino fetal de hielo frío (FBS). Coloque un filtro de células de 40 micras encima de cada tubo. Pipeta de este sobrenadante a través del filtro en el tubo 1.
- Repetir el proceso de digestión adicionales 8 veces, alternando la colocación del sobrenadante digest entre los dos tubos que contienen FBS. Dividir el último sobrenadante por igual entre los tubos 1 y 2 para asegurar volúmenes iguales en cada tubo.
NOTA: Cada tubo de recogida contendrá ahora 32,5 ml de volumen total de suspensión de células. - Centrifugar los tubos contienening el gx 150 sobrenadante durante 6 min a 4 ° C.
- Durante la percepción de las alícuotas de digestión, se preparan cinco placas de cultivo de 100 mm de tejido con 6 ml de medio de Dulbecco (Modificado de Eagle Media (DMEM) con 10% de SFB, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alícuotas a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min para equilibrar los medios de comunicación.
- Aspirar la mezcla de enzimas CBFHH y resuspender las células en el 30 ml de medio de cultivo preparado anteriormente, la combinación de las células de ambos tubos de recogida.
- Retorno 6 ml de suspensión celular a cada uno de las placas de 100 mm y se incuba durante 45 min a 37 ° C.
- Al final de la incubación, transferir las células no adherentes a 5 nuevos platos y volver a incubar durante 45 min (la fracción de fibroblastos habrá comenzado a adherirse a los platos y se puede cultivar por separado si se desea).
- Al final de la segunda ronda de pre-recubrimiento, recoger los medios de comunicación y las células no adherentes de los platos y hacer girar los medios de comunicación en 150g durante 6 min.
- Dibuje el exceso de medios de comunicación para llevar las células a la concentración aproximada deseada, (4,0 x 10 5 células por constructo en 100 l de líquido de perfusión). Retirar una alícuota para el recuento y la viabilidad o la prueba 14.
6. Bioreactor recelularización de P3 Matrix corazón
- Tratar previamente la matriz de corazón aislado con medios de cultivo (véase el paso 5.15) durante la noche antes de añadir las células.
- Montar los elementos de un sistema Langendorff como se muestra en la Fig. 2. Autoclave las piezas de vidrio y óxido de etileno esterilizar las piezas de plástico para asegurar la esterilidad. Varias unidades secundarias del sistema se pueden montar en una campana de flujo laminar antes de ser montado en el soporte de apoyo. Baño de agua circulante y la trayectoria del flujo de agua caliente se ha omitido para mayor claridad.
- Llenar el sistema ensamblado con 120 ml de medio de cultivo tisular (véase el paso 5.15).
- Coloque la matriz corazón sondaje de la Etapa 2,14 en un 60 mm culplato tura bajo ampliación y conectar una jeringa de 1 ml con 22 G x 1 de la aguja cargada con suspensión de células de la Etapa 5,20 al catéter. Asegúrese de que este montaje es libre de burbujas de aire para evitar la embolización del corazón.
- perfundir suavemente los 100 l de suspensión de células en la matriz de corazón a través de las arterias coronarias. Una vez completado, desconecte la combinación jeringa / aguja.
NOTA: Una perfusión lenta de aprox. Se requiere 20 l por min para evitar que las células de las que fluye hacia fuera de las venas, que transitan por el corazón. - Con un trozo romo 22g asegurado a la conexión Luer en la parte inferior de la tapa del frasco corazón biorreactor, empujar el catéter sobre el trozo.
- Arrancar la bomba peristáltica y observar que el flujo como se indica en la Figura 2. El flujo avanza desde el depósito a través de la bomba a través de la trampa de burbujas al catéter colocado en la aorta en el paso 2.5 (camino rojo en la Fig. 2). Observar el flujo de la circulación cardiaca de la venas y gotear desde el ápice, de recirculación al depósito de los medios de comunicación.
NOTA: La velocidad de flujo de perfusión depende de factores individuales, tales como la resistencia vascular de la construcción, y el tamaño del corazón, pero una tasa de 50 a 100 l / min es un buen punto de partida. En los puntos de tiempo intermedios, evaluaciones funcionales se pueden ejecutar. La escala de tamaño del corazón recelularizado neonatal limita las evaluaciones, que se pueden realizar, pero hemos determinado que los sistemas basados ópticamente se pueden utilizar para cuantificar superando el comportamiento de la misma manera que se han utilizado en corazones de ratas adultas. 4 El constructo puede ser perfundido para Extended períodos de tiempo (hasta 23 horas).
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Representative Results
descelularización
En promedio, el tiempo para la descelularización de un corazón P3 usando este protocolo es de aproximadamente 14 hr. dado el peso del corazón promedio de 23 mg para el recién nacido P3.
Acellularity
La figura 3a muestra un corazón neonatal P3 completamente intacto (todo el montaje). La Figura 3b muestra el mismo corazón después de descelularización. Las figuras 4a y 4b muestran la tinción de hematoxilina y eosina de los corazones intactos y descelularizados, respectivamente. Nótese la ausencia de núcleos positivos hematoxilina y la disminución de las estructuras de eosinófilos en el corazón descelularizado. Además, el contenido de ADN del corazón descelularizado se reduce significativamente de 68,08 ± 2,25 g en el corazón intacto (n = 6) a 4,73 ± 2,27 g en el corazón descelularizado (n = 5).
La inmunorreactividad del colágeno
El mantenimiento de la matriz extracelular (ECM) después de descelularización es esencial para la repoblación con células exógenas y a la funcionalidad de la matriz. Para evaluar el contenido de la ECM neonatal en ECM intacta y descelularizado, se realizó la inmuno-tinción para colágeno IV. Figura 4c y d demuestran que el colágeno IV se expresa robusta, tanto en el corazón intacto y descelularizado y que se mantenga la localización de esta proteína después de la extracción de células, mientras que DAPI núcleos positivos se eliminan de manera efectiva (Figura 4e-h).
El contenido de ADN
La presencia de ADN se utiliza como una indicación adicional de la celularidad. En la Figura 5, el ADN se demostró que ser disminuido en un 93% en los corazones neonatales siguiente descelularización a base de detergente. Este grado de reducción de ADN es coherente coninformes en la literatura utilizando descelularización a base de detergente en otros tejidos 15-16.
recelularización
Hemos realizado inmunohistoquímica para determinar la expresión de diversos marcadores de cardiomiocitos en el corazón recelularizado. La figura 6 ilustra las células que han migrado en la pared del ventrículo izquierdo (Figura 6A y 6B). La Figura 6C demuestra el etiquetado DAPI del corazón recelularizado. Figura 6D-G ilustra células que son positivas para NKX 2.5, mCherry, α-actinina y DAPI, respectivamente. NKX2.5 es conocido para marcar las células progenitoras cardíacas, mientras que α-actinina es una proteína que marca sarcoméricas cardiomiocitos diferenciados. Hemos observado una mayoría de células que expresan todos estos marcadores (rosa; Figura 6H), lo que indica que estas células continúan expresando marcadores cardiomiocitos eves después de 23 días de la perfusión.
Figura 1. Esquema de hardware descelularización. A. 60 cc depósito de cilindro de la jeringa para la solución de detergente. B. Conjunto de catéter con una jeringa de irrigación como detallada. C. Detalle de la punta del catéter tubo de PE dibujado. D. Cámara de descelularización y el tabique con drenaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representación esquemática del biorreactor corazón. 1. Humidificación del gas Carbógeno (líneas verdes representan flujo de gas). 2. accionamiento de la bomba peristáltica para la perfusión y mediosoxigenación (líneas púrpuras representan flujo de medios a través de oxigenación). 3. oxigenador de pared delgada. 4. Hoja oxigenador y el depósito de los medios de comunicación. 5. cámara de precarga y la trampa de burbujas. 6. cámara del corazón (líneas rojas representan el flujo de los medios de comunicación hacia y desde el corazón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Todo el montaje de P3 corazón neonatal de ratón antes (A) y después de descelularización (B). Este corazón se descelularizados utilizando el método de perfusión de Langendorff como se describe en el Método 2. Observe que el corazón se vuelve translúcida y ligeramente ampliada tras la perfusión (B) . Escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Histología de P3 corazón de ratón neonatal nativo y descelularizado. Sección de criostato (10 micras) fueron teñidas con H & E (A, B), colágeno IV (C, D, G, H) y DAPI (E, F, G, H ). las imágenes fusionadas se representan en G y H. H & E tinción muestra una ausencia de núcleos celulares y citoplasma en el tejido descelularizado (B) en comparación con el corazón nativo (A). Mientras que el contenido en colágeno IV sigue siendo siguiente descelularización (D), tinción DAPI (un marcador de núcleos) se suprime. Las imágenes fusionadas demuestran la colocalización de colágeno IV y DAPI en el corazón naïve (G) y la ausencia de esta colocalización en el corazón descelularizado (H). Estos datos indican que las células no ya poblar la matriz de colágeno del corazón. Escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Evaluación del contenido de ADN. Control (n = 6) y descelulariza (n = 5) corazones ensayó el contenido de ADN por el método de pico-verde. La cuantificación expresa como g de ADN por corazón ± desviación estándar. El asterisco indica p <0,01 comparado con el control. Estos datos indican que descelularización reduce significativamente el contenido de ADN en el corazón neonatal P3. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. Histología de P3 matriz de corazón 23 días siguientes recelularización con P1 mCherry que expresan los cardiomiocitos. Teñidas con H & E (A, escala = 250 micras, B, escala = 50 micras), DAPI (C, escala = 250 m), NKX 2.5, mCherry, α-actinina, DAPI, y se fusionó (D, e, F, G, H, escala = 50 micras). Hemos demostrado la repoblación efectiva de la matriz de colágeno con cardiomiocitos P1 (AC). Además, se observó que m-cereza cardiomiocitos positivos expresan Nkx2.5 y alfa-actinina 23 días después de la introducción en la matriz de colágeno. Estos datos indican que estas células mantienen su identidad cardiomiocitos durante largos períodos de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La dependencia de esta técnica en repetidas perfusiones del corazón hace que la evitación de una embolia un componente crítico de un resultado exitoso. Desde el cateterismo inicial del corazón en los pasos 2,2-2,6, a los cambios de solución entre pasos 2.8-2.14, existen manipulaciones que pueden permitir la introducción de burbujas de aire que comprometen el flujo de líquido de perfusión en el miocardio. Debido al tamaño diminuto del corazón neonatal, incluso burbujas hora en la vasculatura pueden causar un infarto técnica, con lo cual la descelularización incompletos. Además, en las etapas de lavado posteriores, la perfusión incompleta puede dar lugar a residuos de detergente que repercute negativamente en la biocompatibilidad. Además, los cambios rápidos de temperatura, como cuando la eliminación de la matriz de almacenamiento de 4 ° C como se sugiere en el paso 2.14, debe abordarse con cuidado ya que esto también puede ser una fuente de formación de burbujas de aire cuando se disuelve de gas se mueve fuera de la solución con el cambio de la temperatura. Wgallina proceder a recelularización, cuidado adicional se debe aplicar, en la preparación de la jeringa con la suspensión de células, para garantizar la infusión es libre de burbujas (Paso 6.4).
Puede que sea necesario para manipular los detalles de este protocolo para dar cabida a otros tipos de tejidos. Hay una serie de protocolos de descelularización informó 4,9,11 que podría proporcionar orientación. El objetivo (s) final de cualquier protocolo de descelularización debe incluir el mantenimiento de la estructura de proteínas ECM y bioquímica relacionada, y la eliminación adecuada de los componentes celulares nativas como se ejemplifica por el ADN residual. En esta configuración, la aplicación de la presión de perfusión excesiva conduce a la interrupción de la ultraestructura ECM, que se puede visualizar histológicamente.
El tamaño del corazón P3 ratón pone algunos problemas para la administración celular en comparación con el tejido adulto. Mientras que los corazones adultos presentan una pared ventricular suficientemente gruesa que hace injectio transmuralna modalidad entrega posible celular, el corazón P3 es lo suficientemente pequeño que una aguja, el tamaño de los cuales no lisar una suspensión de células, hace un daño sustancial al corazón. De perfusión es una estrategia viable entrega, sino que depende de las células de un cierto tamaño y forma para ser entregado de manera efectiva. miocitos murinos neonatales funcionan bien en este sentido. Otras pequeñas células circulares también se han demostrado para servir a este fin 11. La escala de tamaño de estos corazones impide el uso de análisis funcional fisiológica convencional, tal como catéteres de volumen de presión. Otros enfoques basados en la captura de vídeo pueden tener que ser considerado.
Estos datos apoyan la factibilidad de descelularización y recelularización del corazón neonatal de ratón. Estudios anteriores han demostrado el uso de corazones para adultos para el propósito de los estudios descelularización / recelularización. Las matrices producidos a partir de estos corazones adultos han sido repoblado con cardiomiocitos neonatales 4 y humanaLas células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) 17. En el caso de los hiPSCs, los corazones repoblados muestran una disminución en los marcadores de pluripotencia como NANOG, SOX2, y Oct4 y estructuras musculares como formados; todos sugerente de maduración. Las señales extracelulares de la ECM, sin embargo, se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en el desarrollo de células, tejidos y órganos que nos llevó a intentar generar matrices de tejidos conocidos por albergar capacidad regenerativa. En nuestros estudios, hemos demostrado que los corazones recelularizado todavía expresan marcadores de cardiomiocitos, incluso después de cultivo prolongado. Estos datos indican que, utilizando nuevas matrices, los cardiomiocitos se pueden mantener durante largos periodos de tiempo sin perder su identidad como cardiomiocitos. Nuestros datos apoyan la técnica y la viabilidad de decellularizing corazón neonatal de ratón. Las matrices neonatales tienen el potencial para proporcionar nuevas construcciones para estudios de repoblación, así como para la producción de geles que tienen superior capacidad regenerativa. El uso de estas ECM neonatales, ahora estamos abordando la superioridad de estos andamios para formar tejidos funcionales con una variedad de tipos de células, incluyendo hiPSCs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
