Summary
I disse undersøgelser giver vi metodologi for nye, neonatale, murine hjerte-stilladser til brug i regenerative studier.
Introduction
Hjertesvigt er almindelig og dødbringende. Det er en fremadskridende sygdom, som resulterer i nedsat kontraktilitet af hjertet, som hæmmer blodtilførslen til organer og efterlader de metaboliske krav af kroppen udækket. Det anslås, at 5,7 millioner amerikanere har hjertesvigt, og det er den primære årsag til indlæggelse i USA 9. Den kollektive udgifter til behandling af patienter i hjertesvigt i USA overstiger $ 300 milliarder dollars om året 9-10. Den eneste definitive terapi for slutstadiet hjertesvigt er ortotopisk hjertetransplantation. Hvert år skønnes det, at der er behov for mere end 100.000 donorhjerter for hjertetransplantation procedurer i USA 1-2. På grund af de begrænsede antal donorer, er det kun ca. 2.400 transplantationer udføres hvert år i USA 2. Det er klart, skal løses som andre strategier er forpligtet til at producere yderligere organer til transplanta dette organ mangeltion og helst ville disse organer være autologe for at undgå komplikationerne forbundet med afvisning og levetid immunosuppression.
Pattedyr voksne cardiomyocytter demonstrerer en begrænset regenerativ kapacitet på skade, men nye oplysninger tyder på, at pattedyr neonatale hjerter opretholde en bemærkelsesværdig regenerationsevne efter skade 5-8. Specifikt efter delvis kirurgisk resektion, en regenerativ vindue er blevet opdaget mellem fødsel og postnatal dag 7. Denne regenerative periode er kendetegnet ved en mangel på fibrotisk ar, dannelse af neovaskularisering, frigivelse af angiogene faktorer fra epicardiet og cardiomyocyte proliferation 5-8 , 11. Denne regenerative tidsvindue tilvejebringer mulighederne for at anvende den neonatale hjertet som en ny kilde til materiale til udvikling af en biosyntetiske hjerte.
Den ekstracellulære matrix er kendt at tilvejebringe vigtige signaler til fremme cardiomyocyte spredning og vækst. Tydelige forskelle i tilgængeligheden af molekyler i de neonatale og voksne matricer 12 og deres evne til at fremme regenerering er blevet udforsket 13. Decellulariseret voksne matrixer har været anvendt i flere undersøgelser for at tilvejebringe en ECM stillads for cellulær repopulation og genereringen af et biosyntetiske hjerte. Mens disse undersøgelser, og nye opdagelser i stamceller teknologier, der udvikler sig hurtigt, flere forhindringer er endnu ikke opfyldt. For eksempel begrænsninger i bevarelsen native struktur af matrixen, cellulære integration i matricen væg, og evne understøtte proliferation og vækst al grænse succesen af denne tilgang. Mens overlegne regenerative egenskaber er blevet tilskrevet den neonatale hjerte, har de praktiske aspekter af at anvende et sådant væv begrænset sin udforskning.
Baseret på den demonstreret regenerationsevne det neonatale hjerte, har vi udviklet hidtil ukendte matricer ved at udvikle enTeknikken med decellularization for P3 mus hjerte. P3 hjerte blev valgt til disse undersøgelser, da det er inden for vinduet af hjertets regenerering som tidligere bestemte 6 men hjertet er stor nok til høst, decellularize og recellularize. Målet med denne undersøgelse er at demonstrere muligheden for at skabe en matrix fra en neonatal mus hjerte. Vores undersøgelser giver bevis for muligheden for decellularizing et minut, neonatal hjerte samtidig med at den strukturelle og proteinholdige integritet ECM. Vi viser også evnen til at recellularize denne cardiac ECM med mCherry udtrykker cardiomyocytter, og vi har undersøgt disse cardiomyocytter for ekspression af forskellige hjerte-markører efter recellularization. Denne teknologi vil muliggøre afprøvning af overlegenhed en neonatal matrix for udviklingen af en biosyntetiske hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev udført i henhold til US dyreværnsloven og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Minnesota.
1. Metode til Mouse Heart Isolation
- Aflive en neonatal mus ved halshugning med en enkelt anvendelse klinge.
- Svaber brystkassen med 70% ethanol.
- Skær skindet fra brystet ved at skære det væk fra brystvæggen med standard saks, mens du trækker huden lateralt med et par # 5 pincet.
- Perforere maven lige ringere end brystbenet med saksen ved at skære gennem bugvæggen. Gribe formet som et sværd proces med # 5 pincet, trække brystbenet rostrally fra kroppen, mens der skæres selvom ribbenene på begge sider af brystet med saksen. Brystkassen afspejles overlegent med pincet til at afsløre hjertet.
- Ligeud dissekere de to vigtigste kamre af thymus ved at trække til siden med # 5 pincet, udsætterbuen af aorta, samt caVal og pulmonale vener.
- Transekt de store arterier fra aortabuen og aorta selv, med de 10 cm foråret saks. Bevarer aorta mellem bunden af hjertet og den brachiocephale arterie. Fatte enderne af de overskårne fartøjer med # 5 pincet til at afspejle hjertet fremad, adskiller den fra luftrøret og spiserøret.
- Transekt lungekarrene og andre store vener, ved at skære mellem lungerne og hjertet på begge sider af hjertet med 10 cm spring saks. Venerne forblive åben for at give dræning.
- Tag hjerte fra mediastinum med # 5 pincet, greb de afhuggede ender af de store skibe. Placer hjertet i en 60 mm dyrkningsskål indeholdende steril phosphatbufret saltvand (PBS) i kateterisation.
2. Fremgangsmåde til Decellularization ved Langendorff Perfusion
- Forbered kateterkonstruktionen i forvejen. Tegn en 4 cm sektionaf PE 50 rør i en lille alkohol flamme til at skabe en mindre, tyndere kateter. Trim enderne med en kniv til at opfylde dimensionerne (Ca.. 300 um udvendig diameter OD med en flange ca. 500 um OD) vist i figur 1. Dette vil give to symmetriske katetre fra hver side af trækket.
- Pege den afskårne ende af slangen i flammen kortvarigt, at smelte en flange på åbningen ved den tynde ende.
- Fyld 12 ml sprøjte med PBS og samle kateteret ved at placere en 3-vejs stophane på sprøjten. Tilføj en 22 G x 1 nål til stophanen og drive nålen gennem skillevæggen. Skub trukket PE rør kateter på nålen (fig. 1).
- Skyl de samlede dele med PBS, således, at alle luftbobler er fjernet.
- Indsætning af kateteret, fremstillet som beskrevet ovenfor, i aorta af det isolerede hjerte, der ikke strækker sig forbi aortaklappen og liger med én slips af 7-0 sutur. Resten flange than kateter proksimalt mod slips, hvilket gør en tæt forsegling og forhindre hjertet i at komme væk fra kateteret.
- Observere kateterisation under forstørrelse, under forsigtig perfusion af hjertet ved hjælp af sprøjte indeholdende PBS. Sørg for, at der ikke er utætheder i systemet, og vævet homogent blanches som latent blod fjernes.
- Placer skillevæggen ind i halsen af indløbet adapteren og forsegle det ved at folde siderne over glasset.
- Fastgør reservoiret fyldt med 60 ml 1% natriumdodecylsulfat (SDS) i destilleret vand (dH 2 O) via en ledning af tilstrækkelig længde til at frembringe en kolonne, der genererer 20 mm Hg tryk som vist i fig. 1. Beregn trykket fra væskesøjlen højde baseret på forholdet 1 mm Hg er lig med 1,3595 cm H 2 O.
Advarsel: SDS er en meget fnugget pulver med irriterende egenskaber. bør undgås Kontakt. Håndter pulveret ved hjælp passende beskyttelsesbeklædning. - Perfundere hjertet med en% SDS for 14 timer. Hjertet vil blive gennemskinnelig i udseende med ingen observerbar resterende væv.
- Skyl system op til stophanen af den resterende SDS-opløsning og erstatte det med 10 ml dH 2 O. Perfundere hjertet med 10 ml 1% Triton X-100 (fortyndet i destilleret vand), efterfulgt af 10 ml dH2O, efterfulgt af 60 ml PBS indeholdende 1x penicillin streptomycin (Pen-Strep).
- Opbevar hjertet i PBS med 1x Pen-Strep ved 4 ° C. Hvis den påtænkte stolpe decellularization applikation kræver perfusion derefter i aorta kateteret bør opretholdes, ellers skæres suturen slips og fjerne kateteret.
3. DNA-bestemmelse
- Forbered en fordøjelse af den decellulariserede ECM eller kontrol hjerte under anvendelse af 200 ug / ml proteinase K i 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 0,45% Tween 20 i 10 mM Tris (pH 8,3).
- Inkuber vævet ved 55 ° C under omrøring, indtil vævet er opløst,typisk 4-5 timer.
- Kvantificere DNA-indholdet af homogenatet med en DNA bindingsassay 4,11.
4. Fiksering og Sektionsinddeling af Tissue
- Fix decellulariserede, recellularized eller kontrol P3 hjerter i 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask vævet i PBS 3x.
- Placer vævet i en opløsning af 7,5% saccharose i 0,1 M phosphatbuffer ved 4 ° C indtil det synker.
- Skift opløsningen til 15% saccharose i 0,1 M phosphatbuffer ved 4 ° C, igen, indtil det synker.
- Varm vævet til 37 ° C, erstatte halvdelen af volumenet med gelatineopløsningen i 15% saccharose & 0,1 M phosphatbuffer og ækvilibrere natten over. Koncentrationer af gelatine øges trinvist gennem 1%, 2,5%, 5% og endelig 7,5% to gange.
- Placer prøverne i cryomolds med friske 7,5% gelatine. For at genoprette formen på decellulariseret prøver, kan flydende gelatine blive perfunderet ind i kamrene som than hjerter er støbt. Frys ved flyder de cryomolds på flydende nitrogen. Opbevar ved -80 ° C.
- Skær (10 um tyk) sektioner med et kryostat. Bring slide tæt til afsnittet overflade og observere sektionen flytte væk fra kniven på overfladen på grund af afgiften på de elektrostatisk behandlet dias. Tør objektglassene natten over og opbevares ved -80 ° C til fremtidig analyse.
- Fjern objektglassene fra fryseren, ækvilibrere til stuetemperatur og derefter placere i en Coplin beholder indeholdende PBS i 20 minutter ved 37 ° C for at opløse gelatinen.
- Farv de afskårne sektioner fra trin 4.7 med hematoxylin og eosin. Anbring objektglassene i en Coplin-skål. Udsætte objektglassene hydreret i trin 4.8 til Hematoxylin i 45 sekunder, ledningsvand i 1,5 min, buffer i 3 minutter, ledningsvand i 1 minut, blåneringen middel i 1,5 min, 80% ethanol i 1 minut, Alcoholic Eosin Y i 8 sek, 80% ethanol i 1 minut, 100% ethanol i 1 minut 2x, clearing agent (xylen erstatning) i 1 min 3x, dækglas med harpiksbaseret monteringsmedium. Undersøg dias mikroskopisk.
- For at bekræfte tilbageholdelse af ECM-protein-reaktivitet af hjertet ECM, farves for ECM strukturelle proteiner, såsom collagen IV ved at placere de hydratiserede objektglassene i et fugtigt kammer og behandl med 10% normalt æsel serum (NDS) i phosphatpufret saltvand med 0,1% Triton -X100 (PBST) i 1 time ved stuetemperatur (RT). Brug et tilstrækkeligt volumen til at dække vævssnit.
- Udskift løsning med det primære antistof af valg på en empirisk bestemt fortynding i 5% NDS / PBST. For eksempel blev Collagen IV antistof fortyndet til 1: 150. Inkuber natten over ved 4 ° C.
- Vaskes objektglassene med PBST 3x og anvende et sekundært antistof valg konjugeret med et fluorescerende farvestof. Fortynd antistoffet ved en empirisk bestemt mængde. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask med PBS 3x.
- Farv objektglassene med et DNA-bindende farvestof, såsom DAPI at kontrollere fravær af cellekerner ved anvendelse af en DAPI indeholdende mounting medium, når låget glide dias.
- Undersøg dias med et fluorescerende mikroskop ved 50 til 400X.
5. P1 Neonatal Murine ventrikels cardiomyocytter for Recellularization
- Spray hver pup med 70% ethanol og halshugge med en enkelt anvendelse klinge.
- Hold hver pup mellem tommel- og pegefinger, mens thorax bliver opdelt på midterlinjen med små steril saks for at blotlægge brysthulen. Påfør pres for at tillade hjertet at rage frit fra brystet, mens den skæres fri af de store fartøjer og atria så kun ventrikelvæv.
- Placer hvert hjerte direkte i et 50 ml rør indeholdende 20 ml iskold Calcium, bicarbonat fri Hanks saltopløsning med 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (CBFHH), indtil alle de hjerter opsamles.
- Aspirer CBFHH og tilsæt 10-15 ml frisk CBFHH (iskold) til røret. Vask vævet ved omrystning vævet i than rør flere gange.
- Dekanter opløsningen indeholdende hjerter i en 60 mm plastik petriskål.
- Dissekere nogen latent atrievævet fra hjerter under forstørrelse på is ved at trimme den væk fra hjerter med foråret saks. Hakke op hjertekamrene i homogent mellemstore små stykker. Fjern eventuelle adskilt ikke-ventrikulær væv fra fadet med # 5 pincet.
- Pipetter så meget af CBFHH opløsning som er nødvendig for at overføre væv fragmenter i en lille steril hætteglas, der indeholder en steril micro omrører.
- Tillad vævet at sedimentere til bunden af hætteglasset og fjern CBFHH opløsning.
- Udgør 50 ml af en enzymopløsning 1,75 mg / ml trypsin, 20 ug / ml DNase II i CBFHH. Pipetter 5 ml af dette enzym løsning og føje den til et rør indeholdende hakket ventrikel væv og sted på en magnetomrører. Der omrøres ved en konstant hastighed (340 rpm) ved stuetemperatur i 8 min.
BEMÆRK: omrøring indsats bør være blid og alligevel tilladeom suspension af gyllen. - Fjern hætteglasset fra røreplade og tillade opslæmningen at sedimentere i 3 minutter. Pipette og kassér den indledende fordøje supernatanten, da det først og fremmest indeholder blodlegemer og væv debris.
- Pipetter en anden 5 ml alikvot af enzymopløsningen og føje den til den fordøje ventrikel. Omrør i 8 min og lad det bundfælde i yderligere 3 minutter. Inden indledning fordøjelser, forberede to 50 ml rør (mærket 1 og 2) hver indeholdende 12 ml iskold kalvefosterserum (FBS). Placer en 40 um celle si oven hvert rør. Pipetter denne supernatant gennem filteret på røret 1.
- Gentag fordøjelsesprocessen yderligere 8 gange, skiftevis anbringelse af fordøjelsen supernatanten mellem de to rør, der indeholdt FBS. Split den sidste supernatant ligeligt mellem rørene 1 og 2 for at sikre lige mængder i hvert rør.
Bemærk: Hver opsamlingsrøret vil nu indeholde 32,5 ml totalt volumen af cellesuspension. - Centrifuger rørene indeholdering supernatanten 150 xg i 6 min ved 4 ° C.
- Mens indsamling fordøjelsen portioner, forberede fem 100 mm vævskulturplader med 6 ml medier (Dulbeccos Modificerede Eagles Media (DMEM) med 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamin) pr plade. Inkuber disse portioner ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 min til ækvilibrering medierne.
- Aspirer enzymblandingen CBFHH og resuspender celler i 30 ml dyrkningsmedium fremstillet ovenfor kombinere cellerne fra begge opsamlingsrør.
- Retur 6 ml cellesuspension til hver af de mm plader 100 og inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C.
- Ved slutningen af inkubationen overføre ikke-adhærente celler til 5 nye retter og re-inkubation i 45 min (fibroblast fraktion vil være begyndt at klæbe til skålene og kan dyrkes ud separat, hvis det ønskes).
- Ved slutningen af den anden runde af præ-plating, indsamle medier og ikke-adhærente celler fra skålene og spin medierne ved 150xg i 6 min.
- Tegn overskydende medier for at bringe cellerne til den omtrentlige ønskede koncentration, (4,0 x 10 5 celler pr konstrukt i 100 pi perfusat). Fjern en portion til optælling og eller levedygtighed test 14.
6. Bioreactor Recellularization af P3 Heart Matrix
- Forbehandle isolerede hjerte matrix med dyrkningsmedier (se trin 5.15) natten over, før du tilføjer cellerne.
- Saml elementerne i et Langendorff-system som vist i fig. To. Autoklavér glas dele og ethylenoxid sterilisere plastdelene at sikre sterilitet. Forskellige underenheder af systemet kan samles i en laminær strømning før er monteret på stativet. Cirkulerende vandbad og opvarmet vand strømningsvej er blevet udeladt for klarhedens skyld.
- Fyld den samlede systemet med 120 ml vævskulturmedium (se trin 5.15).
- Placer kateter hjerte matrix fra trin 2.14 i en 60 mm cultur fad under forstørrelse og tilslutte en 1 ml sprøjte med 22 G x 1 nål fyldt med cellesuspension fra trin 5.20 til kateteret. Sørg for, at denne samling er fri for luftbobler for at undgå embolisering hjertet.
- Forsigtigt perfundere de 100 pi cellesuspension ind i hjertet matricen via kranspulsårerne. Når du er færdig, tag sprøjten / nål kombination.
BEMÆRK: En langsom perfusion ca. 20 pi per minut er påkrævet for at forhindre cellerne i at strømme ud af venerne i, gennem hjertet. - Med en 22 g stump stub fastgjort til Luer fitting på undersiden af bioreaktoren hjerte jar låg, skubbe kateteret på stubben.
- Start den peristaltiske pumpe og observere, at fortsætter flowet som skitseret i figur 2. Flow udbytte fra reservoiret via pumpen gennem boblerør til kateteret placeres i aorta i trin 2.5 (rød sti i fig. 2). Observere strømmen af hjertets cirkulation ud af venens og drypper fra spidsen, recirkulerende til medierne reservoir.
BEMÆRK: perfusion strømningshastighed afhænger af individuelle faktorer såsom det vaskulære modstand af konstruktionen, og størrelsen af hjertet, men en hastighed på 50 til 100 pl / min er en godt udgangspunkt. Ved mellemliggende tidspunkter, kan funktionelle vurderinger udføres. Størrelsen omfanget af den neonatale recellularized hjertet begrænser vurderingerne, der kan udføres, men vi har konstateret, at optisk baserede systemer kan anvendes til at kvantificere slå adfærd ligesom de er blevet anvendt i voksne rottehjerter. 4 Konstruktionen kan perfunderes for udvidet perioder (op til 23 timer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization
I gennemsnit tid til decellularization af et P3 hjerte ved hjælp af denne protokol er cirka 14 timer. givet en gennemsnitlig hjertevægt af 23 mg til P3 nyfødte.
Acellularity
Figur 3a viser et fuldt intakt P3 neonatal hjerte (hel mount). Figur 3b viser den samme hjerte efter decellularization. Figurerne 4a og 4b viser hematoxylin og eosin-farvning af intakte og decellulariserede hjerter hhv. Bemærk fraværet af hematoxylin- positive kerner og formindskelse af eosinofile strukturer i decellulariserede hjertet. Derudover er DNA-indholdet af den decellulariserede hjerte signifikant reduceret fra 68,08 ± 2,25 ug i ubeskadiget hjertet (n = 6) til 4,73 ± 2,27 ug i decellulariserede hjerte (n = 5).
Collagen Immunoreaktivitet
Opretholdelsen af den ekstracellulære matrix (ECM) efter decellularization er vigtigt at repopulation med eksogene celler og til funktionaliteten af matrixen. At vurdere indholdet af det neonatale ECM i intakt og decellulariseret ECM blev immuno-farvning for kollagen IV udføres. Figur 4c og d viser, at collagen IV robust udtrykkes i både intakt og decellulariserede hjerte og at lokaliseringen af dette protein opretholdes efter cellefjernelse, mens DAPI positive kerner fjernes effektivt (fig 4e-h).
DNA-indhold
Tilstedeværelsen af DNA anvendes som en yderligere indikation af cellularitet. I figur 5 er DNA påvist at blive reduceret med 93% i neonatale hjerter efter detergent baseret decellularization. Denne grad af DNA reduktion er konsistent medrapporter i litteraturen ved hjælp af rengøringsmiddel baseret decellularization i andre væv 15-16.
Recellularization
Vi har udført immunhistokemi til bestemmelse af ekspression af forskellige cardiomyocyte markører i recellularized hjerte. Figur 6 viser celler, der er migreret ind i væggen af den venstre ventrikel (figur 6A og 6B). Figur 6C viser DAPI mærkning af recellularized hjerte. Figur 6D-G illustrerer celler, som er positive for NKX 2.5, mCherry, α-actinin og DAPI hhv. Nkx2.5 er kendt at mærke kardiale progenitorceller, hvorimod α-actinin er en sarcomerisk protein, der markerer differentierede cardiomyocytter. Vi har observeret et flertal af celler, der udtrykker alle disse markører (lyserød; Figur 6H), hvilket indikerer, at disse celler fortsætter med at udtrykke cardiomyocyte markører evOr efter 23 dages perfusion.
Figur 1. Skematisk af decellularization hardware. A. 60 ml sprøjte tønde reservoir for rengøringsmiddel. B. Kateter forsamling med kunstvanding sprøjte så detaljeret. C. Detalje af trukket PE slange kateterspids. D. Decellularization kammer og skillevæg med afløb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk afbildning af hjertet bioreaktoren. 1. Befugtning af carbogen gas (grønne linjer repræsenterer gasstrømmen). 2. Peristaltisk pumpe drev til medier perfusion ogiltning (Lilla linjer repræsenterer media flow gennem oxygenator). 3. Tynd væg oxygenator. 4. Sheet oxygenator og medier reservoir. 5. Preload kammer og boble fælde. 6. Heart kammer (Røde linjer repræsenterer medier flow til og fra hjertet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hele mount of P3 neonatal mus hjerte før (A) og efter decellularization (B). Denne hjerte decellulariserede hjælp Langendorff-perfusion fremgangsmåde som beskrevet i metode 2. Bemærk, at hjertet bliver gennemskinneligt og lidt forstørret efter perfusion (B) . Scale = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Histologi af nativt og decellulariseret P3 neonatal mus hjerte. Kryostat sektion (10 um) blev farvet med H & E (A, B), Collagen IV (C, D, G, H) og DAPI (E, F, G, H ). Flettede billeder er repræsenteret i G og H. H & E-farvning viser et fravær af cellekerner og cytoplasma i decellulariseret væv (B) i forhold til det native hjerte (A). Mens Collagen IV indholdet forbliver følgende decellularization (D), DAPI farvning (en markør for kerner) afskaffes. De fusionerede billeder demonstrerer colokalisering af Collagen IV og DAPI i naive hjerte (G) og fraværet af denne colokalisering i decellulariserede hjerte (H). Disse data indikerer, at celler ikke længere befolke collagen matrix af hjertet. Scale = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Evaluering af DNA-indholdet. Kontrol (n = 6) og decellulariserede (n = 5) hjerter analyseret for DNA-indhold ved pico-grøn metode. Kvantificering, udtrykt som pg DNA pr hjerte ± standardafvigelse. Asterisk angiver p <0,01 sammenlignet med kontrol. Disse data indikerer, at decellularization reducerer DNA-indholdet væsentligt i P3 neonatal hjerte. Klik her for at se en større version af dette tal.
OAD / 54.459 / 54459fig6.jpg "/>
Figur 6. Histologi af P3 hjerte matrix 23 dage efter recellularization med P1 mCherry udtrykker cardiomyocytter. Farves med H & E (A, skala = 250 um, B, skala = 50 um), DAPI (C, skala = 250 um), NKX 2.5, mCherry, α-actinin, DAPI og flettede (D, E, F, G, H, skala = 50 um). Vi har vist den effektive repopulation af collagen matrix med P1 cardiomyocytter (AC). Derudover observerede vi, at m-kirsebær positive cardiomyocytter ekspres Nkx2.5 og a-actinin 23 dage efter indføring i kollagenmatrixen. Disse data indikerer, at disse celler bevarer deres cardiomyocyte identitet i længere tid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afhængigheden af denne teknik på gentagne perfusioner af hjertet gør undgåelse af en blodprop et afgørende element i et vellykket resultat. Fra den indledende kateterisation af hjertet i trin 2,2-2,6, at ændringerne i løsning mellem trin 2.8-2.14, er der manipulationer, der kan tillade indføring af luftbobler som kompromis strømmen af perfusatet i myokardiet. På grund af det ringe omfang af det neonatale hjerte, kan selv små bobler i vaskulaturen forårsage en teknisk infarkt, således gøre decellularization ufuldstændig. Derudover er der i de senere vasketrin, kan ufuldstændig perfusion resultere i vaskemiddel rest, som negativt påvirker biokompatibilitet. Desuden hurtige ændringer i temperatur, som når du fjerner matricen fra 4 ° C opbevaring som foreslået i trin 2.14, bør anvendes med forsigtighed, da det også kan være en kilde til luftboble dannelse, når opløst gas bevæger sig ud af opløsningen med ændringen i temperatur. Whøne videre til recellularization, bør anvendes ekstra pleje, når de forbereder sprøjten med cellesuspensionen, for at sikre, at infusionen er boble fri (Trin 6.4).
Det kan være nødvendigt at manipulere detaljerne i denne protokol til at rumme andre væv typer. Der er en række af decellularization protokoller rapporterede 4,9,11 som kunne vejlede. Det endelige mål (r) af enhver decellularization protokol bør omfatte vedligeholdelse af ECM proteinstruktur og relaterede biokemi, og tilstrækkelig fjernelse af native cellulære komponenter som eksemplificeret af residual DNA. I denne indstilling, anvendelse af overdreven perfusionstryk fører til afbrydelse af ECM ultrastruktur, der kan visualiseres histologisk.
Størrelsen af P3 muse hjertet sætter nogle begrænsninger på celle administration sammenlignet med voksent væv. Mens voksne hjerter præsentere en tyk nok ventrikulær væg, der gør transmural injektionsvæskena mulige levering celle modalitet, P3 hjerte er lille nok, at en nål, hvis størrelse ikke vil lysere en celle suspension, gør betydelig skade på hjertet. Perfusion er en mulig strategi levering, men afhænger af celler af en bestemt størrelse og form, der skal leveres effektivt. Neonatale murine myocytter fungerer godt i denne henseende. Andre små cirkulære celler har også vist sig at tjene dette formål 11. Størrelsen omfanget af disse hjerter udelukker anvendelsen af konventionelle fysiologisk funktionel analyse såsom tryk volumen katetre. Andre metoder baseret på videooptagelse måske skal overvejes.
Disse data understøtter gennemførligheden af decellularization og recellularization af neonatale mus hjerte. Tidligere undersøgelser har vist, at brugen af voksne hjerter med henblik på decellularization / recellularization undersøgelser. De matricer fremstillet af disse voksne hjerter er genopbyggede med neonatale cardiomyocytter 4 og den menneskeligeinducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) 17. I tilfælde af hiPSCs, den genopbyggede hjerter viste et fald i pluripotens markører, såsom NANOG, SOX2, og OCT4 og dannede muskel-lignende strukturer; alle tyder på modning. De ekstracellulære tidskoder af ECM har imidlertid vist sig at spille en kritisk rolle i udviklingen af celler, væv og organer, der har foranlediget os til at forsøge at generere matricer fra væv der vides at indeholde regenerativ kapacitet. I vores undersøgelser, viser vi, at recellularized hjerter stadig udtrykke cardiomyocyte markører, selv efter længere tids kultur. Disse data viser, at ved anvendelse af hidtil ukendte matricer, kan cardiomyocytter opretholdes i længere perioder uden at miste deres identitet som cardiomyocytter. Vores data understøtter teknikken og gennemførlighed for decellularizing neonatal mus hjerte. De neonatale matrixer have potentiale til at tilvejebringe hidtil ukendte konstruktioner på gendannelse studier, såvel som til fremstilling af geler, der har superior regenerativ kapacitet. Ved hjælp af disse neonatale ECM'er, er vi nu fat på overlegenhed af disse stilladser til at danne funktionelle væv med en række celletyper, herunder hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
