Summary
Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.
Introduction
L'insuffisance cardiaque est fréquente et mortelle. Il est une maladie progressive qui se traduit par une diminution de la contractilité du coeur, ce qui altère le flux sanguin vers les organes et laisse les besoins métaboliques de la non satisfaite du corps. On estime que 5,7 millions d' Américains ont une insuffisance cardiaque et il est la principale cause d'hospitalisation aux États-Unis 9. Le coût collectif de traitement des patients en insuffisance cardiaque aux États-Unis dépasse les 300 milliards de dollars par an 9-10. Le seul traitement définitif de l'insuffisance cardiaque au stade terminal est une greffe cardiaque orthotopique. Chaque année, on estime que plus de 100.000 coeurs donateurs sont nécessaires pour les procédures de transplantation cardiaque aux États-Unis 1-2. En raison du nombre limité de donateurs, seuls environ 2.400 transplantations sont réalisées chaque année aux États - Unis 2. De toute évidence, cette pénurie d'organes doit être abordée que d'autres stratégies sont nécessaires pour produire des organes supplémentaires pour transplantationtion et, idéalement, ces organes seraient autologue de manière à éviter les complications associées au rejet et de la durée de vie immunosuppression.
Cardiomyocytes adultes Mammifères démontrent une capacité de régénération limitée sur blessure , mais des données récentes suggèrent que les cœurs néonatals mammifères maintiennent une capacité de régénération remarquable suite à une lésion 5-8. Plus précisément, après une résection chirurgicale partielle, une fenêtre de régénération a été découverte entre la naissance et le jour post - natal 7. Cette période de régénération se caractérise par une absence de cicatrice fibrotique, la formation de la néovascularisation, la libération de facteurs angiogéniques , de l'épicarde, et la prolifération des cardiomyocytes 8/5 , 11. Cette fenêtre de régénération du temps fournit la possibilité d'utiliser le cœur du nouveau-né comme une nouvelle source de matériel pour le développement d'un cœur bioartificiel.
La matrice extracellulaire est connu pour fournir des indices importants pour promouvoir cardiomyocyte prolifération et la croissance. Différences distinctes dans la disponibilité des molécules dans les matrices néonatales et adultes 12 et leur capacité à promouvoir la régénération ont été explorées 13. les matrices adultes décellularisés ont été utilisées dans plusieurs études pour fournir un échafaudage de l'ECM pour la repopulation cellulaire et la génération d'un coeur bioartificiel. Bien que ces études, et de nouvelles découvertes dans les technologies de cellules souches, progressent rapidement, plusieurs obstacles doivent encore être remplies. Par exemple, les limitations dans la préservation de la structure native de la matrice, l'intégration cellulaire dans la paroi de la matrice, et la capacité de soutenir la prolifération et à la croissance de toute limite le succès de cette approche. Alors que les attributs de régénération supérieures ont été attribuées au cœur du nouveau-né, les aspects pratiques de l'utilisation d'un tel tissu ont limité son exploration.
Sur la base de la capacité de régénération démontré du cœur néonatale, nous avons développé de nouvelles matrices en développant unetechnique de décellularisation pour le coeur P3 de la souris. Le cœur P3 a été choisi pour ces études car il est dans la fenêtre de régénération cardiaque comme précédemment déterminé 6 mais le cœur est assez grand pour la récolte, decellularize et recellularize. Le but de cette étude est de démontrer la faisabilité de la création d'une matrice à partir d'un cœur de souris néonatale. Nos études fournissent des preuves de la faisabilité de décellularisation d'une minute, le cœur du nouveau-né, tout en maintenant l'intégrité structurelle et protéinique de l'ECM. Nous démontrons également la capacité de recellularize cette ECM cardiaque avec mCherry cardiomyocytes exprimant et nous avons examiné ces cardiomyocytes pour l'expression de différents marqueurs cardiaques suivants recellularization. Cette technologie permet à l'essai de la supériorité d'une matrice du nouveau-né à l'élaboration d'un coeur bioartificiel.
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Protocol
Toutes les expériences de souris ont été effectuées en conformité avec loi sur la protection des animaux et des États-Unis ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université du Minnesota.
1. Méthode de coeur Souris Isolation
- Euthanasier une souris néonatale par décapitation avec une lame à usage unique.
- Badigeonner le thorax avec 70% d'éthanol.
- Disséquer la peau de la poitrine en réduisant l'écart de la paroi thoracique, avec des ciseaux standards tout en tirant la peau latéralement par une paire de pinces # 5.
- Perforer l'abdomen juste en dessous du sternum avec les ciseaux en coupant à travers la paroi abdominale. Saisissant le processus xiphoïde avec # 5 forceps, rétracter le sternum rostrale du corps pendant la coupe que les nervures de chaque côté de la poitrine avec les ciseaux. La cage thoracique est réfléchie supérieurement avec la pince pour révéler le cœur.
- disséquer Carrément les deux lobes principaux du thymus en tirant latéralement avec # 5 forceps, exposerla crosse de l'aorte, ainsi que les veines Caval et pulmonaires.
- Transect les artères principales de la crosse de l'aorte et l'aorte elle-même, avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Maintenir l'aorte entre la base du coeur et l'artère brachiocéphalique. Saisir les extrémités des vaisseaux sectionnés avec le # 5 forceps pour refléter le cœur vers l'avant, la séparant de la trachée et de l'œsophage.
- Transect la vascularisation pulmonaire et d'autres veines principales, en coupant entre les poumons et le coeur des deux côtés du cœur avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Les veines restent ouvertes pour assurer le drainage.
- Retirer le cœur du médiastin avec les # 5 pinces, saisir les extrémités coupées des grands navires. Placez le coeur dans une boîte de culture de 60 mm contenant du phosphate saline stérile tamponnée (PBS) pour le cathétérisme.
2. Méthode de décellularisation par Langendorff Perfusion
- Préparer l'ensemble de cathéter à l'avance. Dessiner une section 4 cmPE 50 tube dans une petite flamme d'alcool pour créer un plus petit, plus mince cathéter. Couper les extrémités d'une lame pour atteindre les dimensions (env. 300 um de diamètre extérieur OD avec une bride d'env. 500 um DO) représentée sur la figure 1. Ceci fournira deux cathéters symétriques de chaque côté de la traction.
- Pointez l'extrémité du tube de coupe dans la flamme brièvement, pour faire fondre une bride sur l'ouverture à l'extrémité mince.
- Remplir la seringue 12 ml avec du PBS et assembler le cathéter en plaçant un robinet d'arrêt à 3 voies sur la seringue. Ajouter un 22 G x 1 aiguille du robinet et conduire l'aiguille à travers le septum. Faites glisser le PE tube cathéter dessiné sur l'aiguille (Fig. 1).
- Irriguer les pièces assemblées avec du PBS, assurant que toutes les bulles d'air ont été enlevés.
- Insérez le cathéter, préparé comme décrit ci-dessus, dans l'aorte du coeur isolé, pas étendant au-delà de la valve aortique et ligaturer avec un match nul de 7-0 suture. Reste la bride de til cathéter à proximalement contre la cravate, ce qui rend un joint étanche et empêchant le cœur de se détacher du cathéter.
- Observer le cathétérisme sous grossissement, tandis que perfuser doucement le cœur à l'aide de la seringue contenant du PBS. Veiller à ce qu'il n'y ait pas de fuites dans le système et le tissu homogène que le sang blanches latente est retirée.
- Placer la cloison dans le col de l'adaptateur d'entrée et le sceller en pliant les côtés au-dessus de la vitre.
- Fixer le réservoir rempli avec 60 ml de 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l' eau distillée (dH 2 O) par l' intermédiaire d' une ligne de longueur suffisante pour produire une colonne qui génère 20 mm Hg de pression comme indiqué sur la Fig. 1. Calculer la pression de la hauteur de colonne de liquide en fonction de la relation de 1 mm de Hg est égale à 1,3595 cm H 2 O.
Attention: SDS est une poudre hautement floculant avec des propriétés irritantes. Le contact doit être évité. Manipulez la poudre en utilisant des vêtements de protection appropriés. - Perfuser cœur avec 1% SDS pendant 14 heures. Le cœur sera translucide en apparence sans tissu restant observable.
- Rincer le système jusqu'à le robinet de la solution SDS restant et le remplacer par 10 ml dH 2 O. Perfuser le cœur avec 10 ml de 1% de Triton X-100 (dilué dans de l' eau distillée), suivie par 10 ml dH 2 O, suivie par 60 ml de PBS contenant de la pénicilline streptomycine 1x (Pen-Strep).
- Rangez le coeur dans du PBS avec 1x Pen-Strep à 4 ° C. Si l'application post-décellularisation destinée nécessite perfusion puis le cathéter dans l'aorte doit être maintenue, sinon couper l'attache de suture et retirer le cathéter.
3. Détermination de l'ADN
- Préparer un condensé de l'ECM ou le contrôle cardiaque décellularisé utilisant 200 pg / ml de proteinase K dans 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,45% de Tween 20 dans du Tris 10 mM (pH 8,3).
- Laisser incuber le tissu à 55 ° C avec agitation jusqu'à ce que le tissu est dissous,généralement 4-5 h.
- Quantifier la teneur en ADN de l'homogénat avec un dosage de liaison à l' ADN 4,11.
4. Fixation et Sectionnement des tissus
- Fix décellularisé, coeurs recellularized ou le contrôle P3 dans 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Laver le tissu dans du PBS 3x.
- Placer le tissu dans une solution de 7,5% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C jusqu'à ce qu'il coule.
- Modifier la solution à 15% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C, encore une fois, jusqu'à ce qu'il coule.
- Chauffer le tissu à 37 ° C, de remplacer la moitié du volume avec une solution de gélatine à 15% de saccharose et 0,1 M de tampon phosphate et équilibrer pendant une nuit. Les concentrations de gélatine sont augmentées par paliers par l'intermédiaire de 1%, 2,5%, 5% et enfin 7,5% deux fois.
- Placer les échantillons dans cryomoules utilisant fraîche 7,5% de gélatine. Pour restaurer la forme des échantillons décellularisés, liquide gélatine peut être perfusée dans les chambres comme til les cœurs sont moulés. Congeler par flottage cryomoules sur l'azote liquide. Conserver à -80 ° C.
- Couper (10 um d'épaisseur) sections avec un cryostat. Apportez la lame près de la surface de section et d'observer la section se déplacer hors du couteau sur la surface en raison de la charge sur les lames électrostatiquement traitées. Sécher les diapositives pendant la nuit et stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
- Retirer les lames du congélateur, équilibrer à température ambiante puis placer dans un bocal de Coplin contenant du PBS pendant 20 min à 37 ° C pour dissoudre la gélatine.
- Colorer les sections coupées de l'étape 4.7 à l'hématoxyline et de l'éosine. Placer les lames dans une jarre de Coplin. Exposer les diapositives hydratés à l'étape 4.8 à hématoxyline pendant 45 sec, l'eau du robinet pendant 1,5 min, tampon pendant 3 minutes, l'eau du robinet pendant 1 min, agent de bleuissement pendant 1,5 min, l'éthanol 80% pendant 1 min, alcooliques éosine Y pendant 8 sec, éthanol 80% pendant 1 min, l'éthanol à 100% pour 1 min 2x, agent de compensation (remplaçant du xylène) pour 1 min 3x, lamelle avec de la résinemoyen de montage sur la base. Examiner les lames au microscope.
- Pour confirmer le maintien de l'ECM protéine réactivité de l'ECM cardiaque, une teinture pour ECM des protéines structurales telles que le collagène IV, en plaçant les lames hydratés dans une chambre humidifiée et on traite avec 10% d'âne sérum normal (PDN) dans un tampon phosphate salin à 0,1% de Triton -X100 (PBST) pendant 1 heure à la température ambiante (RT). Utiliser un volume suffisant pour couvrir les coupes de tissu.
- Remplacer la solution avec l'anticorps primaire de choix à une dilution déterminée empiriquement dans 5% NDS / PBST. Par exemple, l'anticorps de collagène IV a été dilué à 1: 150. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Laver les lames avec du PBST 3x et à appliquer un anticorps secondaire de choix conjugué à un colorant fluorescent. Diluer l'anticorps par une quantité déterminée de manière empirique. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS 3x.
- Colorer les lames avec un colorant de liaison à l'ADN tels que le DAPI afin de vérifier l'absence de noyaux cellulaires en utilisant un mounti contenant DAPIng moyen lorsque le couvercle de glisser les diapositives.
- Examiner les lames avec un microscope à fluorescence de 50 à 400X.
5. P1 néonatal murin Ventricular cardiomyocytes pour Recellularization
- Vaporiser chaque chiot avec 70% d'éthanol et décapite avec une lame à usage unique.
- Tenir chaque chiot entre le pouce et l'index tandis que le thorax est divisé sur la ligne médiane avec de petits ciseaux stériles pour exposer la cavité thoracique. Appliquer une pression pour permettre au coeur de faire saillie librement de la poitrine alors qu'il est coupé libre des gros vaisseaux et les oreillettes ne laissant que le tissu ventriculaire.
- Placez chaque coeur directement dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de glace-froid calcium, la solution saline tamponnée de Bicarbonate libre Hank avec mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic 20 (CBFHH) jusqu'à ce que tous les cœurs sont recueillis.
- Aspirer le CBFHH et ajouter 10-15 ml de CBFHH frais (glacé) au tube. Laver le tissu en faisant tourbillonner le tissu en til le tube plusieurs fois.
- Décanter la solution contenant les coeurs dans une boîte de Petri en plastique de 60 mm.
- Disséquer tout tissu auriculaire latente du cœur sous un grossissement sur la glace en rognant loin de les coeurs avec les ciseaux à ressort. Émincer les ventricules en taille homogène petits morceaux. Retirez tout tissu non-ventriculaire séparé du plat avec # 5 forceps.
- Pipet autant de la solution CBFHH que nécessaire pour transférer les fragments de tissus dans un petit flacon stérile qui contient une barre d'agitation micro stérile.
- Laisser le tissu dans les sédiments au fond du flacon et retirer la solution CBFHH.
- Compenser 50 ml d'une solution d'enzyme de 1,75 mg / ml de trypsine, 20 pg / ml de DNase II CBFHH. Pipet 5 ml de cette solution d'enzyme et l'ajouter à un tube contenant du tissu ventriculaire émincé et le placer sur un agitateur magnétique. Agiter à une vitesse constante (340 rpm) à température ambiante pendant 8 min.
NOTE: L'action d'agitation doit être doux et pourtant permettrela suspension de la suspension. - Retirer la cuvette de la plaque d'agitation et de permettre la suspension de sédiments pendant 3 min. Pipeter et jeter le surnageant digérer initiale, car elle contient principalement des cellules sanguines et des débris de tissu.
- Pipeter une seconde partie aliquote de 5 ml de la solution d'enzyme et l'ajouter au ventricule digestion. Agiter pendant 8 min et laisser sédimenter pendant encore 3 min. Avant de commencer les digestions, préparer deux tubes de 50 ml (marqué 1 et 2) contenant chacun 12 ml glacé sérum de veau fœtal (FBS). Placer un tamis cellulaire de 40 pm au sommet de chaque tube. Pipet ce surnageant à travers le filtre sur le tube 1.
- Répétez le processus de digestion une 8 fois supplémentaires, en alternant le placement du surnageant de digestion entre les deux tubes contenant du FBS. Divisez le dernier surnageant à parts égales entre les tubes 1 et 2 pour assurer des volumes égaux dans chaque tube.
NOTE: Chaque tube de collection contient maintenant 32,5 ml volume total de la suspension cellulaire. - Centrifuger les tubes contiennentment le surnageant 150 g pendant 6 min à 4 ° C.
- Lors de la collecte des aliquotes de digestion, préparer cinq 100 tissus mm plaques de culture avec 6 ml de milieu (Modified Eagle Media (DMEM de Dulbecco) avec 10% de FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamine) par plaque. Incuber ces aliquotes à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 30 minutes pour équilibrer les médias.
- Aspirer le mélange d'enzymes CBFHH et remettre en suspension les cellules dans 30 ml de milieu de culture préparé ci-dessus, en combinant les cellules des deux tubes de prélèvement.
- Retour 6 ml de suspension cellulaire dans chacune des plaques de 100 mm et incuber pendant 45 min à 37 ° C.
- A la fin de l'incubation, transférer les cellules non-adhérentes à 5 nouveaux plats et re-incuber pendant 45 minutes (la fraction de fibroblaste aura commencé à adhérer aux plats et peuvent être cultivées séparément si on le souhaite).
- A la fin du second tour de pré-placage, recueillir les médias et les cellules non-adhérentes de la vaisselle et faire tourner les supports à 150xg pendant 6 min.
- Soutirer l' excès support pour amener les cellules à la concentration désirée approximative (4,0 x 10 5 cellules par recombinaison dans 100 ul de solution de perfusion). Retirer une aliquote de comptage et ou la viabilité des tests 14.
6. bioréacteur Recellularization de P3 Coeur Matrice
- Prétraiter la matrice de coeur isolé avec des milieux de culture (voir l'étape 5.15) pendant la nuit avant d'ajouter les cellules.
- Assembler les éléments d'un système Langendorff comme représenté sur la Fig. 2. Autoclaver les pièces de verre et d' oxyde d'éthylène et stériliser les pièces en matière plastique pour assurer la stérilité. Différentes sous-unités du système peuvent être assemblés dans une hotte à flux laminaire, avant d'être monté sur la béquille de support. Circulant bain d'eau et le chemin d'écoulement d'eau chauffée a été omis pour la clarté.
- Remplir le système assemblé avec 120 ml de milieu de culture de tissu (voir l'étape 5.15).
- Placez la matrice de coeur cathétérisé de l'étape 2.14 dans un 60 mm culAntenne ture sous grossissement et connecter une seringue de 1 ml avec 22 G x 1 aiguille chargée de suspension cellulaire de l'étape 5.20 au cathéter. Assurez-vous que cette assemblée est libre de bulles d'air pour éviter embolisation cœur.
- perfuser doucement les 100 pi de suspension cellulaire dans la matrice cardiaque par les artères coronaires. Une fois terminé, détacher la combinaison seringue / aiguille.
NOTE: Une perfusion lente d'env. 20 ul par minute est nécessaire pour empêcher les cellules de couler des veines, qui transite sur le cœur. - Avec un bout émoussé 22g solidaire du raccord Luer sur la face inférieure du couvercle du bocal de coeur bioréacteur, pousser le cathéter sur la tubulure.
- Démarrer la pompe péristaltique et observer que les flux se déroule comme décrit dans la figure 2. Produit de débit du réservoir par la pompe à travers le piège à bulles au cathéter placé dans l'aorte à l' étape 2.5 (chemin rouge sur la figure. 2). Observer l'écoulement de la circulation cardiaque en dehors de la veines et au goutte à goutte de l'apex, recirculation vers le réservoir de médias.
REMARQUE: Le débit de perfusion dépend de différents facteurs tels que la résistance vasculaire de la construction et de la taille du cœur, mais un taux de 50 à 100 ul / min est un bon point de départ. Aux points de temps intermédiaires, les évaluations fonctionnelles peuvent être exécutées. L'échelle de la taille du cœur recellularized néonatale limite les évaluations, qui peuvent être réalisées , mais nous avons déterminé que les systèmes basés optiquement peuvent être utilisés pour quantifier en battant le comportement comme ils ont été utilisés dans des coeurs de rats adultes. 4 La construction peut être perfusé pour étendu périodes de temps (jusqu'à 23 h).
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Representative Results
décellularisation
En moyenne, le temps de décellularisation d'un cœur de P3 en utilisant ce protocole est d'environ 14 heures. étant donné un poids cardiaque moyenne de 23 mg pour le nouveau-né de P3.
Acellularity
Figure 3a montre un coeur néonatal P3 intact (toute la montagne). Figure 3b montre le même cœur suivant décellularisation. Les figures 4a et 4b montrent l'hématoxyline et éosine des cœurs intacts et décellularisé, respectivement. Notez l'absence de hématoxyline noyaux positifs et la diminution des structures éosinophiles dans le cœur décellularisé. En outre, la teneur en ADN du cœur décellularisé est significativement réduite de 68,08 ± 2,25 ug dans le coeur intact (n = 6) 4,73 ± 2,27 ug dans le cœur décellularisé (n = 5).
Collagène immunoréactivité
Le maintien de la matrice extracellulaire (ECM) après décellularisation est essentiel de repeuplement des cellules exogènes et à la fonctionnalité de la matrice. Pour évaluer le contenu de l'ECM néonatal dans ECM intacte et dépourvue de cellules, immuno-coloration pour le collagène IV a été réalisée. La figure 4C et D montrent que le collagène IV est solidement exprimé à la fois le coeur intact et décellularisé et que la localisation de cette protéine est conservée après l' élimination des cellules, tandis que les noyaux positifs DAPI sont efficacement éliminés (Figure 4E-h).
ADN contenu
La présence d'ADN est utilisée comme une indication supplémentaire de la cellularité. Dans la figure 5, l' ADN est démontré être diminué de 93% dans les cœurs néonatals suivant détergent décellularisation base. Ce degré de réduction de l'ADN est compatible avecrapports dans la littérature en utilisant un détergent décellularisation base dans d' autres tissus 15-16.
Recellularization
Nous avons réalisé une immunohistochimie pour déterminer l'expression de divers marqueurs cardiomyocytes dans le coeur recellularized. La figure 6 illustre les cellules qui ont migré dans la paroi du ventricule gauche (figure 6A et 6B). La figure 6C illustre l'étiquetage DAPI du coeur recellularized. Figure 6D-G représente des cellules qui sont positives pour 2,5 NKX, mCherry, α-actinine et DAPI, respectivement. Nkx2.5 est connu de marquer des cellules souches cardiaques, tandis que les α-actinine est une protéine sarcomère qui marque les cardiomyocytes différenciés. Nous avons observé une majorité des cellules qui expriment tous ces marqueurs (rose; Figure 6H), ce qui indique que ces cellules continuent à exprimer des marqueurs de cardiomyocytes even après 23 jours de perfusion.
Figure 1. Schéma de matériel décellularisation. A. 60 cc réservoir de seringue pour la solution de détergent. B. Ensemble de cathéter avec irrigation seringue détaillée. C. Détail de la pointe PE tube de cathéter étiré. D. Chambre de décellularisation et le septum avec drain. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentation schématique du bioréacteur cardiaque. 1. Humidification de gaz carbogène (lignes vertes représentent l'écoulement de gaz). 2. péristaltique entraînement de la pompe pour la perfusion des médias etoxygénation (lignes violettes représentent un flux de média à travers oxygénateur). 3. Thin oxygénateur murale. 4. Feuille oxygénateur et le réservoir des médias. chambre 5. précharge et piège à bulles. 6. chambre de coeur (lignes rouges représentent le flux de médias et du cœur). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Toute montagne de coeur de la souris néonatale P3 avant (A) et après décellularisation (B). Ce cœur est décellularisé selon la méthode de perfusion Langendorff tel que décrit dans la méthode 2. Notez que le cœur devient translucide et légèrement agrandie suivant la perfusion (B) . Echelle = 2mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. histologie de P3 cœur de souris néonatale natif et décellularisé. Section cryostat (10 um) ont été colorées avec H & E (A, B), le collagène IV (C, D, G, H) et DAPI (E, F, G, H ). images fusionnées sont représentées dans G et H. coloration H & E montre une absence de noyaux cellulaires et cytoplasme dans le tissu décellularisé (B) par rapport au coeur natif (A). Bien que le contenu du collagène IV reste décellularisation suivante (D), la coloration DAPI (un marqueur des noyaux) est supprimée. Les images fusionnées démontrent la co-localisation de collagène IV et de DAPI dans le cœur naïf (G) et l'absence de cette colocalisation dans le cœur décellularisé (H). Ces données indiquent que les cellules non plus remplir la matrice de collagène du coeur. Echelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Evaluation de la teneur en ADN. Témoin (n = 6) et décellularisé (n = 5) de cœurs analysées pour déterminer la teneur en ADN par la méthode pico-vert. Quantification exprimée en pg d'ADN par coeur ± écart-type. Asterisk indique p <0,01 par rapport au témoin. Ces données indiquent que la décellularisation réduit de manière significative la teneur en ADN dans le cœur du nouveau - né P3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. histologie de P3 matrice de coeur 23 jours suivant recellularization avec cardiomyocytes P1 mCherry exprimant. Stained avec H & E (A, échelle = 250 um, B, échelle = 50 pm), DAPI (C, échelle = 250 um), NKX 2.5, mCherry, α-actinine, DAPI, et a fusionné (D, E, F, G, H, échelle = 50 pm). Nous avons démontré l'efficacité de repeupler la matrice de collagène avec des cardiomyocytes P1 (AC). En outre, nous avons observé que les cardiomyocytes m-cerise positives expriment Nkx2.5 et a-actinine 23 jours après introduction dans la matrice de collagène. Ces données indiquent que ces cellules conservent leur identité cardiomyocytes pendant de longues périodes de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La dépendance de cette technique sur des perfusions répétées du cœur fait éviter d'une embolie, une composante essentielle d'un résultat positif. À partir de la première cathétérisation du cœur dans les étapes 2,2-2,6, aux changements de solution entre les étapes 2.8-2.14, il y a des manipulations qui peuvent permettre l'introduction de bulles d'air qui compromettent l'écoulement du liquide de perfusion dans le myocarde. En raison de la petite taille du cœur du nouveau-né, même de minuscules bulles dans la vasculature peuvent provoquer un infarctus du technique, rendant ainsi la décellularisation incomplète. En outre, dans les étapes de lavage ultérieures, la perfusion incomplète peut entraîner des résidus de détergent qui a un impact négatif sur la biocompatibilité. De plus, les changements rapides de température, comme lors du retrait de la matrice de 4 ° C stockage proposées à l'étape 2.14, devrait être abordée avec prudence, car cela peut aussi être une source de formation de bulles d'air lorsque dissous se déplace de gaz hors de la solution avec le changement de la température. Wpoule procédure à recellularization, des soins supplémentaires doit être appliqué, lors de la préparation de la seringue avec la suspension de cellules, pour assurer la perfusion est sans bulles (étape 6.4).
Il peut être nécessaire de manipuler les détails de ce protocole pour accueillir d'autres types de tissus. Il y a un certain nombre de protocoles de décellularisation rapporté 4,9,11 qui pourrait fournir des orientations. L'objectif (s) de fin de tout protocole de décellularisation devrait comprendre le maintien de la structure des protéines d'ECM et la biochimie liés, et l'élimination adéquate des composants cellulaires natifs comme exemplifié par l'ADN résiduel. Dans ce contexte, l'application de la pression de perfusion excessive entraîne une dégradation de l'ultrastructure ECM, qui peut être visualisé histologiquement.
La taille du coeur P3 souris met des contraintes sur l'administration des cellules par rapport aux tissus adultes. Alors que les cœurs adultes présentent une paroi ventriculaire assez épaisse qui fait transmural injectiona livraison cellulaire possible modalité, le cœur P3 est assez petit qu'une aiguille, dont la taille ne sera pas lyser une suspension cellulaire, fait des dommages importants au cœur. Perfusion est une stratégie de prestation viable, mais dépend de cellules d'une certaine taille et la forme à livrer efficacement. myocytes murins néonatales fonctionnent bien à cet égard. Ont également été montré Autres petites cellules circulaires pour servir cet objectif 11. L'échelle de la taille de ces coeurs exclut l'utilisation de l'analyse fonctionnelle physiologique classique tels que les cathéters de volume de pression. D'autres approches basées sur la capture vidéo peuvent être envisagées.
Ces données confirment la faisabilité de décellularisation et recellularization du cœur de la souris néonatale. Des études antérieures ont démontré que l'utilisation des cœurs adultes pour des fins d'études décellularisation / de recellularization. Les matrices produites à partir de ces coeurs adultes ont été repeuplé avec des cardiomyocytes néonataux 4 et humaineLes cellules souches pluripotentes induites (17) de hiPSCs. Dans le cas des hiPSCs, les cœurs repeuplée ont montré une diminution des marqueurs de la pluripotence tels que NANOG, SOX2, et OCT4 et des structures musculaires analogue formées; tout suggestive de maturation. Les indices extracellulaires de l'ECM, cependant, se sont avérés jouer un rôle crucial dans le développement des cellules, des tissus et des organes qui nous a incité à tenter de générer des matrices de tissus connus pour abriter la capacité de régénération. Dans nos études, nous démontrons que les cœurs recellularized expriment encore des marqueurs de cardiomyocytes, même après culture prolongée. Ces données indiquent que, à l'aide de nouvelles matrices, les cardiomyocytes peuvent être maintenus pendant de longues périodes sans perdre leur identité en tant que cardiomyocytes. Nos données appuient la technique et la faisabilité d'décellularisation cœur de souris néonatale. Les matrices néonatales ont le potentiel de fournir de nouvelles constructions pour les études de repopulation ainsi que pour la production de gels qui ont superior capacité de régénération. L'utilisation de ces ECM néonatales, nous sommes maintenant attaquons la supériorité de ces échafauds pour former des tissus fonctionnels avec une variété de types de cellules, y compris hiPSCs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
