Summary
In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.
Introduction
Herzinsuffizienz ist häufig und tödlich. Es ist eine progressive Erkrankung, die zu einer verminderten Kontraktilität des Herzens führt, die Durchblutung von Organen und lässt die metabolischen Anforderungen des Körpers unerfüllten beeinträchtigt. Es wird geschätzt , dass 5,7 Millionen Amerikaner an Herzinsuffizienz leiden , und es ist die Hauptursache für Hospitalisierung in den Vereinigten Staaten 9. Die kollektive Kosten der Patienten bei Herzinsuffizienz in den Vereinigten Staaten die Behandlung von mehr als 300.000.000.000 $ Dollar pro Jahr 9-10. Die einzige definitive Therapie für Endstadium Herzinsuffizienz ist orthotope Herztransplantation. Jedes Jahr wird geschätzt , dass mehr als 100.000 Spenderherzen für Herztransplantationsverfahren in den Vereinigten Staaten 1-2 benötigt werden. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Spendern werden nur rund 2.400 Transplantationen pro Jahr in den USA 2 durchgeführt. Offensichtlich muss diese Organmangel behandelt werden als andere Strategien erforderlich sind, für transplanta zusätzliche Organe zu produzierention und im Idealfall würden diese Organe autologe, um die Komplikationen, die mit Ablehnung und Lebensdauer Immunsuppression verbunden zu vermeiden.
Mammalian adulten Kardiomyozyten zeigen eine begrenzte Regenerationsfähigkeit auf Verletzung aber die jüngsten Hinweise darauf , dass Säugetier-neonatalen Herzen eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen 5-8 halten. Insbesondere folgende Teil chirurgische Resektion, ein regeneratives Fenster wurde zwischen der Geburt und der postnatalen Tag entdeckt 7. Diese regenerative Periode wird durch einen Mangel an fibrotische Narbe, die Bildung von Neovaskularisation, die Freisetzung von angiogenen Faktoren aus dem Epikard und Kardiomyozyten Proliferation 5-8 , 11. Diese regenerative Zeitfenster bietet das Potenzial für die Neugeborenen-Herz als neuartige Materialquelle für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herz verwenden.
Die extrazelluläre Matrix ist bekannt, wichtige Hinweise zur Verfügung zu stellen cardiomyocyt zu förderne Proliferation und Wachstum. Deutliche Unterschiede in der Verfügbarkeit von Molekülen in der neonatalen und adulten Matrizen 12 und ihre Fähigkeit , die Regeneration zu fördern , wurden 13 untersucht. ein ECM-Gerüsts für zellulare Repopulation zu bieten und die Erzeugung eines bioartifizielle Herz dezellularisierte erwachsenen Matrices wurden in mehreren Studien verwendet. Während diese Studien und neue Entdeckungen in der Stammzellentechnologien werden schnell voran, haben mehrere Hürden noch erfüllt werden. Zum Beispiel, Einschränkungen bei der Erhaltung native Struktur der Matrix, zellulären Integration in die Matrix Wand, und die Fähigkeit, die Proliferation und das Wachstum aller begrenzen den Erfolg dieses Ansatzes zu unterstützen. Während überlegen haben regenerative Attribute der Neugeborenen-Herz zugeschrieben worden ist, haben sich die praktischen Aspekte der Verwendung eines solchen Gewebes seine Explorations begrenzt.
Basierend auf der nachgewiesenen Regenerationsfähigkeit des Neugeborenen-Herz haben wir durch die Entwicklung eines neuartigen Matrizen entwickeltTechnik der Dezellularisierung für die P3 Maus Herz. Der P3 Herz wurde für diese Studien ausgewählt , da es innerhalb des Fensters von Herzregeneration wie zuvor 6 bestimmt aber das Herz ist groß genug , um zu ernten, und Dezellularisieren recellularize. Das Ziel dieser Studie ist es, die Durchführbarkeit der Schaffung einer Matrix aus einer neonatalen Mäuseherz zu demonstrieren. Unsere Studien belegen für die Machbarkeit von Dezellularisieren einer Minute, Neugeborenen-Herz, während die strukturelle und proteinöse Integrität des ECM beibehalten wird. Wir zeigen auch die Fähigkeit, dieses Herz-ECM mit mCherry exprimierenden Kardiomyozyten recellularize und wir haben diese Kardiomyozyten für die Expression von verschiedenen kardialen Marker folgende Rezellularisierung sucht. Diese Technologie wird für die Prüfung der Überlegenheit einer neonatalen Matrix für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herzens ermöglichen.
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Protocol
Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den US-Tierschutzgesetz durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Minnesota genehmigt.
1. Verfahren zur Maus Herz Isolation
- Euthanize eine Neugeborenen-Maus durch Enthauptung mit einem einzigen Einsatz Klinge.
- Tupfer, um den Brustkorb mit 70% Ethanol.
- Präparieren Sie die Haut von der Brust, indem sie es weg von der Brustwand mit Standard-Schere schneiden, während die Haut seitlich mit einem Paar # 5 Pinzette ziehen.
- Perforieren den Bauch unmittelbar unterhalb des Brustbeins mit der Schere durch durch die Bauchwand zu schneiden. Greifen die Xiphoidbasis mit # 5 Pinzette ziehen sich die Brustbeins rostral aus dem Körper, während auf beiden Seiten der Brust mit der Schere obwohl die Rippen zu schneiden. Der Brustkorb wird reflektiert kranial mit der Zange, das Herz zu offenbaren.
- Unverblümt sezieren die beiden Hauptkeulen des Thymus durch Ziehen seitlich mit # 5 Pinzette, Belichtender Bogen der Aorta sowie die Kava-und Lungenvenen.
- TRANSECT die großen Arterien aus dem Aortenbogen und die Aorta selbst, mit den 10 cm Feder Schere. Bewahren Sie die Aorta zwischen der Basis des Herzens und der brachiocephalic Arterie. Fassen Sie die Enden der abgetrennten Gefäße mit der # 5 Pinzette das Herz nach vorn zu reflektieren, es aus der Luft- und Speiseröhre trennt.
- TRANSECT den Lungengefäßen und anderen großen Venen, indem sie zwischen den Lungen Schneiden und das Herz auf beiden Seiten des Herzens mit den 10 cm Feder Schere. Die Venen offen bleiben Entwässerung zu sorgen.
- Entfernen Sie das Herz aus dem Mediastinum mit den # 5 Zange, die abgeschlagenen Enden der großen Gefäße zu erfassen. Platzieren Sie die Herzen in eine 60 mm Kulturschale mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für die Katheterisierung.
2. Verfahren zur Dezellularisierung von Langendorff-Perfusion
- Bereiten Sie die Katheteranordnung im Voraus. Zeichnen Sie einen 4 cm langen Abschnittvon PE 50 Schläuchen in einem kleinen Spiritusflamme ein kleiner, dünner Katheter zu schaffen. Schneiden Sie die Enden mit einer Klinge , die Abmessungen zu erfüllen (ca. 300 & mgr; m Außendurchmesser OD mit einem Flansch von rd. 500 & mgr; m OD) in 1 gezeigt. Dies wird zwei symmetrische Katheter von jeder Seite des Zuges.
- Zeigen das Schnittende der Rohrleitung in die Flamme kurz, einen Flansch auf der Öffnung an dem dünnen Ende zu schmelzen.
- Füllen Sie die 12-ml-Spritze mit PBS und montieren Sie den Katheter durch ein 3-Wege-Hahn Platzierung auf der Spritze. Fügen Sie eine 22 G x 1 Nadel auf den Hahn und treiben die Nadel durch das Septum. Schieben des verstreckten Schlauch PE - Katheter auf die Nadel (Fig. 1).
- Spülen Sie die zusammengebauten Teile mit PBS, sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt wurden.
- Setzen Sie den Katheter, hergestellt wie oben beschrieben, in die Aorta des isolierten Herzens, nicht über die Aortenklappe erstreckt und abzubinden mit einer Bindung von 7-0 Naht. Seien Sie den Flansch von ter Katheter proximal gegen die Krawatte, eine dichte Abdichtung zu machen und das Herz ablöst, den Katheter zu verhindern.
- Beachten Sie die Katheterisierung unter Vergrößerung, während sanft das Herz mit der Spritze mit PBS Perfusion. Stellen Sie sicher, dass es keine Lecks im System sind und das Gewebe blanches homogen als latente Blut entfernt wird.
- Platzieren des Septums in den Hals des Einlassadapter und abdichten, indem die Seiten über das Glas zu falten.
- Bringen Sie den Behälter gefüllt mit 60 ml 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser (dH 2 O) über eine Leitung von ausreichender Länge , um eine Spalte zu erzeugen , die 20 mm Hg Druck erzeugt , wie in Fig. 1. Berechne den Druck von der Flüssigkeitssäulenhöhe basierend auf der Beziehung von 1 mm Hg ist gleich 1,3595 cm H 2 O.
Achtung: SDS ist ein sehr flockiges Pulver mit reizenden Eigenschaften. Kontakt sollte vermieden werden. Behandeln Sie das Pulver geeignete Schutzkleidung verwenden. - Perfuse das Herz mit 1% SDS für 14 Stunden. Das Herz wird ohne beobachtbare verbleibende Gewebe in Erscheinung durchscheinend sein.
- Spülen Sie das System bis zum Absperrhahn der verbleibenden SDS - Lösung und ersetzen Sie es mit 10 ml dH 2 O. Perfundieren das Herz mit 10 ml 1% Triton X-100 (in destilliertem Wasser verdünnt), gefolgt von 10 ml dH 2 O, gefolgt von 60 ml PBS 1x Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) enthält.
- Lagern Sie das Herz in PBS mit 1x Pen-Strep bei 4 ° C. Falls die vorgesehene Beitrag Dezellularisierung Anwendung Perfusion erfordert dann sollte der Katheter in die Aorta eingehalten werden, schneiden sonst die Naht Krawatte und den Katheter zu entfernen.
3. DNA-Bestimmung
- Vorbereiten eines Digest des dezellularisierten ECM oder Kontroll Herzen unter Verwendung von 200 & mgr; g / ml Proteinase K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,45% Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3).
- Inkubieren des Gewebes bei 55 ° C unter Rühren, bis das Gewebe gelöst,typischerweise 4-5 Stunden.
- Quantifizieren der DNA - Gehalt des Homogenisats mit einem DNA - Bindungsassay 4,11.
4. Fixierung und Schnitt von Tissue
- Fix dezellularisiert, rezellularisiertes oder Kontroll P3 Herzen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie das Gewebe in PBS 3x.
- Platzieren des Gewebes in einer Lösung von 7,5% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, bis es sinkt.
- Ändern, um die Lösung zu 15% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, wieder, bis sie sinkt.
- Wärmen Sie das Gewebe auf 37 ° C, ersetzen die Hälfte des Volumens mit Gelatine-Lösung in 15% Saccharose und 0,1 M Phosphatpuffer und Äquilibrieren über Nacht. Konzentrationen von Gelatine werden schrittweise erhöht bis 1%, 2,5%, 5% und schließlich 7,5% zweimal.
- Legen Sie die Proben in cryomolds mit frischen 7,5% Gelatine. Um die Form der dezellularisierten Proben wiederherstellen, flüssige Gelatine können in die Kammern als t perfundiert werdener Herzen geformt sind. Frieren durch die cryomolds auf flüssigem Stickstoff schwimmen. Bei -80 ° C.
- Schneiden (10 & mgr; m dick) Abschnitte mit einem Kryostaten. Bringen Sie die Folie nahe an der Schnittfläche und beobachten den Abschnitt von dem Messer auf die Oberfläche auf den elektrostatisch behandelten Folien aufgrund der Ladung losfahren. Trocknen Sie die Dias über Nacht und bei -80 ° C für eine spätere Analyse.
- Entfernen Sie die Folien aus der Gefriertruhe, ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur und dann in einem Coplin Gefäß mit PBS für 20 min bei 37 ° C, um die Gelatine aufzulösen.
- Stain die geschnittenen Abschnitte aus Schritt 4.7 mit Hematoxylin und Eosin. Die Objektträger in einem Glas Coplin. Setzen Sie die hydratisiert Dias in Schritt 4,8 bis Hämatoxylin für 45 sec, Leitungswasser für 1,5 min, Puffer für 3 min, Leitungswasser für 1 min, Bläuungsmittel für 1,5 min, 80% Ethanol für 1 min, Alkoholisches Eosin Y für 8 sec, 80% Ethanol für 1 min, 100% Ethanol für 1 min 2x, Mittel (Xylol-Ersatz) für 1 min 3x, Deck mit Harz ClearingBasis Eindeckmittel. Untersuchen Sie die mikroskopisch Dias.
- Um die Retention von ECM-Protein Reaktivität des Herzens ECM, Fleck für ECM-Strukturproteine wie Kollagen IV bestätigen Sie mit der hydratisierten Folien in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 10% normalem Eselserum (NDS) in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,1% Behandlung von Triton -X100 (PBST) für 1 h bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen der Gewebeabschnitte zu bedecken.
- Ersetzen Sie die Lösung mit dem primären Antikörper der Wahl bei einer empirisch ermittelten Verdünnung in 5% NDS / PBST. Zum Beispiel wurde die Collagen IV-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 150. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen der Objektträger mit PBST 3x und gelten mit einem Fluoreszenzfarbstoff ein sekundärer Antikörper der Wahl konjugiert. Verdünnen Sie die Antikörper durch einen empirisch ermittelten Betrag. Inkubieren für 1 h bei RT. Waschen mit PBS 3x.
- Stain die Folien mit einem DNA-bindenden Farbstoff wie DAPI Abwesenheit von Zellkernen zu überprüfen, indem Sie einen DAPI enthält mounti mitng Medium, wenn die Abdeckung die Folien rutscht.
- Untersuchen Sie die Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 50 bis 400-fache.
5. P1 Neonatal Murine Kardiomyozyten für Rezellularisierung
- Spray jeden Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten mit einem einzigen Einsatz Klinge.
- Halten jedes Welpen zwischen dem Daumen und Zeigefinger, während der Brustkorb in der Mittellinie mit kleinen sterilen Schere aufgespalten wird, um die Brusthöhle zu exponieren. Wenden Sie Druck das Herz zu ermöglichen, sich frei von der Brust hervorstehen, während es frei von den großen Gefäße geschnitten wird und die Vorhöfe nur das ventrikuläre Gewebe zu verlassen.
- Legen Sie jedes Herz direkt in ein 50 ml Röhrchen mit 20 ml eiskaltem Calcium, Bikarbonat frei Hanks gepufferte Salzlösung mit 20 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (CBFHH), bis alle Herzen gesammelt werden.
- Saugen Sie das CBFHH und fügen 10-15 ml frischem CBFHH (eiskaltes) auf das Rohr. Waschen Sie das Gewebe durch das Gewebe in t wirbelner Rohr mehrmals.
- Dekantiert die Lösung, die Herzen in eine 60 mm Kunststoff-Petrischale enthält.
- Sezieren jede latent Vorhofgewebe aus den Herzen unter Vergrößerung auf Eis, indem sie es weg von den Herzen mit den Feder Schere trimmen. Mince bis die Ventrikel in homogene Größe kleine Stücke schneiden. Entfernen Sie alle getrennt nicht ventrikuläre Gewebe aus der Schale mit # 5 Pinzette.
- Pipette so viel von der Lösung CBFHH wie erforderlich, um die Gewebefragmente in eine kleine sterile Fläschchen zu übertragen, das eine sterile Mikro Rührstab enthält.
- Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Fläschchens zu sedimentieren und die CBFHH Lösung entfernen.
- Make-up 50 ml einer Enzymlösung 1,75 mg / ml Trypsin, 20 ug / ml DNase II in CBFHH. Pipettieren 5 ml dieser Enzymlösung und fügen Sie sie in ein Röhrchen gehackten ventrikuläre Gewebe und auf einem Magnetrührer enthält. Rühre bei einer konstanten Geschwindigkeit (340 UpM) bei Raumtemperatur für 8 min.
HINWEIS: Die Rührwirkung sollte schonend sein und doch erlaubenfür die Suspension der Schlämme. - Entfernen Sie die Fläschchen aus der Rührplatte und lassen Sie den Brei 3 min zu sedimentieren. Pipettieren und verwerfen die anfängliche verdauen Überstand, wie es Blutzellen und Gewebereste in erster Linie enthält.
- Pipettieren eine zweite 5 ml Aliquot der Enzymlösung und fügen Sie es zum Verdauen Ventrikel. Man rührt 8 min und lassen Sie es für weitere 3 min zu sedimentieren. Bevor die Digests beginnen, bereiten zwei 50-ml-Röhrchen (mit der Bezeichnung 1 und 2), die jeweils mit 12 ml eiskaltem fötalen Rinderserum (FBS). Legen Sie eine 40 & mgr; m Zelle Sieb oben auf jedes Röhrchen. Pipettieren dieser Überstand durch den Filter auf dem Rohr 1.
- Wiederholen Sie die Verdauung zusätzlich 8 mal, um die Platzierung des Digest Überstand zwischen den beiden Röhrchen, die FBS abwechseln. Teilen Sie die letzte Überstand gleichmäßig zwischen den Rohren 1 und 2 zu gleichen Volumina in jedem Röhrchen gewährleisten.
HINWEIS: Jedes Röhrchen Sammlung wird nun 32,5 ml Gesamtvolumen der Zellsuspension enthalten. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen enthaltening den Überstand 150 xg für 6 min bei 4 ° C.
- Während die Verdauung Teilmengen zu sammeln, bereiten fünf 100-mm-Gewebekulturplatten mit 6 ml Medium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-Glutamin) pro Platte. Inkubieren diese Aliquots bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min , um die Medien zu äquilibrieren.
- Saugen Sie das CBFHH Enzymmischung und Resuspendieren der Zellen in den 30 ml Kulturmedien oben hergestellt, die Zellen aus den beiden Sammelröhrchen kombiniert.
- Rück 6 ml der Zellsuspension zu jeder der 100-mm-Platten und Inkubation für 45 min bei 37 ° C.
- Am Ende der Inkubation übertragen die nicht-adhärenten Zellen zu 5 neue Speisen und erneut inkubieren 45 min (die Fibroblastenfraktion dem Geschirr anhaften begonnen wird und getrennt werden können, falls gewünscht, ausgewachsen).
- Am Ende der zweiten Runde der Pre-Plating, sammeln die Medien und nicht-haftenden Zellen aus den Schalen und drehen Sie die Medien bei 150xg für 6 min.
- Abzusaugen überschüssige Medien , die Zellen auf die ungefähre gewünschte Konzentration zu bringen, (4,0 x 10 5 Zellen pro Konstrukt in 100 ul Perfusat). Entfernen eines aliquoten zum Zählen und oder Vitalitätstests 14.
6. Bioreactor Rezellularisierung von P3 Herz Matrix
- Vorbehandeln die isolierten Herzen Matrix mit Kulturmedien (siehe Schritt 5.15) über Nacht vor der Zugabe der Zellen.
- Bauen Sie die Elemente einer Langendorff - System , wie in gezeigt. 2. Autoclave die Glasteile und Ethylenoxid sterilisieren die Plastikteile Sterilität zu gewährleisten. Verschiedenen Untereinheiten des Systems können in einer laminaren Strömungshaube zusammengebaut werden, bevor sie auf dem Stützgestell angebracht ist. Zirkulierende Wasserbad und beheizten Wasserströmungspfad wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen.
- Füllen Sie das zusammengefügte System mit 120 ml Gewebekulturmedien (siehe Schritt 5.15).
- Legen Sie die katheterisierte Herz Matrix aus Schritt 2.14 in einer 60 mm culeine 1-ml-Spritze mit 22 G x 1 Nadel beladen mit Zellsuspension aus Schritt 5.20 an den Katheter unter Vergrößerung ture Schale und zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass diese Anordnung das Herz zu vermeiden frei von Luftblasen ist Embolisation.
- die 100 & mgr; l der Zellsuspension in das Herz Matrix über den Koronararterien vorsichtig perfuse. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Spritze / Nadel-Kombination.
HINWEIS: Eine langsame Perfusion von ca. 20 & mgr; l pro min ist erforderlich, um die Zellen fließt aus den Adern zu verhindern, das Herz im Transit. - Mit einem stumpfen 22g Stummel an den Luer-Anschluss an der Unterseite des Bioreaktors Herzgefäßdeckel befestigt ist, schieben Sie den Katheter auf den Stummel.
- Starten Sie die peristaltische Pumpe und zu beobachten , dass der Fluss geht wie in Abbildung 2 dargestellt. Der Ablauf geht aus dem Reservoir über die Pumpe durch die Blasenfalle in die in der Aorta in Schritt platziert Katheter 2.5 (rot Pfad in Fig. 2). Beachten Sie die Strömung des Herz-Kreislauf aus der Venes und tropft von der Spitze, Umlauf zum Medienspeicher.
HINWEIS: Die Perfusionsfördermenge von individuellen Faktoren wie dem Gefäßwiderstand des Konstrukts und der Größe des Herzens, aber eine Rate von 50 bis 100 & mgr; l abhängt / min ist ein guter Ausgangspunkt. An Zwischenzeitpunkten können Funktionsprüfungen durchgeführt werden. Die Größenskala des Neugeborenen rezellularisiertes Herz begrenzt die Beurteilungen, die durchgeführt werden können , aber wir haben festgestellt , dass optisch - basierten Systemen verwendet werden können , das Verhalten zu quantifizieren zu schlagen , so wie sie bei erwachsenen Rattenherzen verwendet wurden. 4 Das Konstrukt kann für längere perfundiert werden Zeiträume (bis zu 23 h).
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Representative Results
Dezellularisierung
Im Durchschnitt ist die Zeit, um Dezellularisierung eines P3 Herz dieses Protokoll verwenden etwa 14 Stunden. eine durchschnittliche Herzgewicht von 23 mg für den P3 Neugeborener gegeben.
Acellularity
3a zeigt eine völlig intakte P3 neonatale Herz (whole mount). 3b zeigt das gleiche Herz folgende Dezellularisierung. 4a und die Hämatoxylin- und Eosin - Färbung von intakten und dezellularisierter Herzen 4b sind. Beachten Sie das Fehlen von Hämatoxylin positiven Kerne und die Verminderung der eosinophilen Strukturen im dezellularisierter Herz. Darüber hinaus wird der DNA-Gehalt des dezellularisierten Herzens signifikant reduziert von 68,08 ± 2,25 & mgr; g in dem intakten Herzen (n = 6) 4,73 ± 2,27 ug in der dezellularisierten Herz (n = 5).
Collagen Immunoreactivity
Die Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) nach der Dezellularisierung ist wesentlich mit exogenen Zellen und auf die Funktionalität der Matrix Repopulation. Um den Inhalt des neonatalen ECM in intakten und dezellularisierten ECM, Immuno-Färbung für Kollagen IV auszuwerten wurde durchgeführt. 4c Figur und d , dass Kollagen IV zeigen , wird sowohl in der intakten und dezellularisierten Herz und dass die Lokalisierung dieses Proteins kräftig exprimiert wird beibehalten folgende Zellentfernung, während DAPI positiven Kerne effektiv entfernt werden (Abbildung 4e-h).
DNA - Inhalt
Die Anwesenheit von DNA wird als zusätzlicher Hinweis auf Zellularität verwendet. In 5 wird die DNA demonstriert um 93% in der neonatalen Herzen verringert werden folgende Reinigungsmittel auf Basis Dezellularisierung. Dieser Grad der DNA-Reduktion steht im Einklang mitBerichte in der Literatur Waschmittel basieren Dezellularisierung in anderen Geweben 15-16 verwendet wird .
Rezellularisierung
Wir haben Immunhistochemie durchgeführt , um die Expression von verschiedenen cardiomyocyte Marker im rezellularisiertes Herzen zu bestimmen. 6 zeigt Zellen , die in die Wand des linken Ventrikels (6A und 6B). 6C veranschaulicht die DAPI Markierung des rezellularisiertes Herz migrierten. Figure 6D-G zeigt Zellen , die für positiv sind NKX 2.5, mCherry, α-Actinin und DAPI sind. Nkx2.5 ist bekannt, Herz-Vorläuferzellen zu kennzeichnen, während α-Actinin ein sarcomeric Protein ist, das differenzierte Kardiomyozyten markiert. Wir haben eine Mehrzahl von Zellen beobachtet , die alle diese Marker exprimieren (pink; 6H), was anzeigt , dass diese Zellen weiterhin cardiomyocyte Marker exprimieren even nach 23 Tagen der Perfusion.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Dezellularisierung Hardware. A. 60 cc Spritzenzylinder Reservoir für Reinigungslösung. B. Die Katheteranordnung mit Spülspritze wie detailliert. C. Ausschnitt aus dem PE - Schlauch Katheterspitze gezogen. D. Dezellularisierung Kammer und Septum mit Ablauf. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Herzens Bioreaktor. 1. Luftbefeuchtung von Carbogen Gas (grüne Linien stellen Gasstrom). 2. Schlauchpumpenantrieb für Medien Perfusion undSauerstoffversorgung (lila Linien Medienfluss durch Oxygenator darstellen). 3. Dünne Wand Oxygenator. 4. Blatt Oxygenator und Medienspeicher. 5. Preload Kammer und Blasenfalle. 6. Herzkammer (Rote Linien Medienfluss zum und vom Herzen darstellen). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Ganze Berge von P3 Neugeborenen Maus Herz vor (A) und nach Dezellularisierung (B). Das Herz ist dezellularisiert die Methode Langendorff - Perfusion unter Verwendung der in Methode 2. Hinweis beschrieben , dass das Herz wird es transparent und leicht folgende Perfusion (B) vergrößert . Maßstab = 2 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Histologie von nativen und dezellularisierter P3 neonatalen Maus Herz. Kryostatschnitt (10 & mgr; m) wurden mit H & E (A, B), Collagen IV (C, D, G, H) und DAPI (E, F, G, H gebeizt ). Zusammengeführt Bilder werden in G und H. H & E-Färbung zeigt ein Fehlen von Zellkernen und Zytoplasma in dezellularisierter Gewebe (B) dargestellt, wenn auf das native Herz (A) verglichen. Während die Collagen IV Gehalt folgenden Dezellularisierung (D), DAPI-Färbung (eine Markierung der Kerne) verbleibt, wird beseitigt. Die fusionierten Bilder zeigen die Co-Lokalisation von Collagen IV und DAPI im naiven Herz (G) und das Fehlen dieser Kolokalisation im dezellularisierter Herz (H). Diese Daten zeigen, dass die Zellen keine Auffüllen länger die Kollagenmatrix des Herzens. Maßstab = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Auswertung von DNA - Gehalt. Control (n = 6) und dezellularisiert (n = 5) Herzen für den DNA - Gehalt von pico-grün - Verfahren untersucht. Die Quantifizierung ausgedrückt als ug DNA pro Herz ± Standardabweichung. Asterisk zeigt p <0,01 im Vergleich zur Kontrolle. Diese Daten zeigen , dass Dezellularisierung verringert DNA - Gehalt signifikant im P3 neonatale Herz. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 6. Histologie von P3 Herz Matrix 23 Tage folgende Rezellularisierung mit P1 mCherry exprimierenden Kardiomyozyten. Stained mit H & E (A, Maßstab = 250 & mgr; m, B, scale = 50 & mgr; m), DAPI (C, scale = 250 & mgr; m), NKX 2.5, mCherry, α-Actinin, DAPI, und fusionierte (D, E, F, G, H, scale = 50 & mgr; m). Wir haben die effektive Repopulation der Kollagenmatrix mit P1 Kardiomyozyten (AC) gezeigt. Darüber hinaus beobachteten wir, dass m-cherry positive Kardiomyozyten exprimieren Nkx2.5 und α-Actinin 23 Tage nach der Einführung in die Kollagenmatrix. Diese Daten zeigen , dass diese Zellen für längere Zeit ihre Kardiomyozyten Identität bewahren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieses f anzuzeigenild.
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Discussion
Die Abhängigkeit dieser Technik auf wiederholte Perfusionen des Herzens ist die Vermeidung einer Embolie eine wichtige Komponente für ein erfolgreiches Ergebnis. Von der anfänglichen Katheterisierung des Herzens in den Schritten 2,2-2,6, zu den Veränderungen der Lösung zwischen den Schritten von 2,8 bis 2,14, sind Manipulationen, die Einführung von Luftblasen, die Kompromiss den Fluss des Perfusats in das Myokard zulassen. Aufgrund der geringen Größe des neonatale Herz, auch in das Gefßsystem winzige Blasen kann eine technische Infarkt verursachen, wodurch die Dezellularisierung unvollständig macht. Zusätzlich wird in den späteren Waschschritte können unvollständige Perfusion in Waschmittelrückstände ergeben, die einen negativen Einfluss auf die Biokompatibilität. Darüber hinaus schnelle Temperaturänderungen, wie zum Beispiel, wenn die Matrix von 4 ° C Lagerung zu entfernen, wie in Schritt vorgeschlagen 2.14, sollte mit Vorsicht angegangen werden, da dies auch eine Quelle der Luftblasenbildung sein kann, wenn mit dem Wechsel Gas bewegt sich aus der Lösung gelöst in der Temperatur. WHenne Verfahren zu Rezellularisierung sollten zusätzliche Pflege, angewendet werden, wenn die Spritze mit der Zellsuspension bereitet, ist die Infusion, um sicherzustellen, blasenfreie (6,4 Schritt).
Es kann notwendig sein, die Besonderheiten dieses Protokolls zu manipulieren anderen Geweben Typen zu unterstützen. Es gibt eine Reihe von Protokollen Dezellularisierung berichtet 4,9,11 die Führung bieten könnte. Das Endziel (e) von jedem Dezellularisierung Protokoll sollte die Wartung der ECM Proteinstruktur und verwandte Biochemie und ausreichende Entfernung der nativen Zellkomponenten umfassen, wie durch Rest-DNA veranschaulicht. In dieser Einstellung führt die Anwendung von übermäßigen Perfusionsdruck zu einer Störung der ECM Ultrastruktur, die histologisch sichtbar gemacht werden kann.
Die Größe der P3 Maus Herz legt einige Einschränkungen auf die Zell Verabreichung im Vergleich zu erwachsenen Gewebe. Während erwachsene Herzen präsentieren eine dick genug Ventrikelwand, die transmurale injectio machtna mögliche Zellabgabe Modalität ist das Herz P3 klein genug, dass eine Nadel, deren Größe nicht um eine Zellsuspension zu lysieren, hat erhebliche Schädigung des Herzens. Perfusion ist eine praktikable Lieferstrategie, sondern hängt von Zellen einer bestimmten Größe und Form effektiv geliefert werden. Neonatal murine Myozyten funktionieren gut in dieser Hinsicht. Andere kleine runde Zellen haben auch zu diesem Zweck 11 dienen gezeigt. Die Größenskala dieser Herzen schließt die Verwendung von herkömmlichen physiologischen Funktionsanalyse wie Druckvolumen Katheter. Andere Ansätze auf Basis von Video-Capture können müssen berücksichtigt werden.
Diese Daten unterstützen die Möglichkeit der Dezellularisierung und Rezellularisierung der neonatalen Mäuseherz. Frühere Studien haben die Verwendung von erwachsenen Herzen zur Dezellularisierung / Rezellularisierung Studien nachgewiesen. Die Matrizen aus diesen erwachsenen Herzen produziert haben mit neonatalen Kardiomyozyten 4 und Mensch neu besiedelt wordeninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) 17. Im Falle der hiPSCs zeigten die repopulated Herzen eine Abnahme in Pluripotenz Marker wie NANOG, SOX2, und OCT4 und gebildet muskelähnliche Strukturen; alle suggestive der Reifung. Die extrazelluläre Signale des ECM, wurden jedoch eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Zellen, Geweben und Organen zu spielen gezeigt, die uns dazu veranlasst, zu versuchen, Matrizen aus dem Gewebe zu erzeugen bekannten Regenerationsfähigkeit zu beherbergen. In unseren Studien zeigen wir, dass rezellularisiertes Herzen noch Kardiomyozyten Marker, auch nach längerer Kultur auszudrücken. Diese Daten zeigen, dass unter Verwendung von neuen Matrizen können Kardiomyozyten für längere Zeiträume aufrechterhalten werden, ohne ihre Identität als Kardiomyozyten verlieren. Unsere Daten unterstützen die Technik und die Machbarkeit für Dezellularisieren neonatalen Maus Herz. Die Neugeborenen-Matrizen halten das Potenzial für neue Konstrukte für die Neubesiedlung Studien sowie für die Herstellung von Gelen, die Bereitstellung von sup habenerior Regenerationsfähigkeit. Unter Verwendung dieser neonatal ECMs, adressieren wir nun die Überlegenheit dieser Gerüste mit einer Vielzahl von Zelltypen funktionelle Gewebe zu bilden, einschließlich hiPSCs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
