Summary
इन अध्ययनों में, हम उपन्यास, नवजात, murine हृदय पुनर्योजी अध्ययन में इस्तेमाल के लिए scaffolds के लिए कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं।
Introduction
दिल की विफलता आम और घातक है। यह एक प्रगतिशील बीमारी है जो दिल है, जो अंगों को रक्त प्रवाह को बाधित और शरीर unmet की चयापचय की मांग के पत्तों की कमी आई है सिकुड़ना में यह परिणाम है। यह अनुमान है कि 5.7 करोड़ अमेरिकियों को दिल की विफलता है और यह संयुक्त राज्य अमेरिका में 9 अस्पताल में भर्ती का प्राथमिक कारण है। संयुक्त राज्य अमेरिका में दिल की विफलता में रोगियों के उपचार के सामूहिक लागत प्रति वर्ष 9-10 $ 300 अरब डॉलर से अधिक है। अंत में मंच दिल की विफलता के लिए ही निश्चित चिकित्सा ओर्थोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण है। हर साल, यह अनुमान है कि 100,000 से अधिक दाता दिलों में संयुक्त राज्य अमेरिका के 1-2 हृदय प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं। दाताओं की सीमित संख्या के कारण, केवल लगभग 2,400 प्रत्यारोपण अमेरिका में हर साल 2 प्रदर्शन कर रहे हैं। जाहिर है, इस अंग की कमी के रूप में अन्य रणनीतियों transplanta के लिए अतिरिक्त अंगों का निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं जरूरतों को संबोधित कियाtion और, आदर्श, इन अंगों के रूप में तो अस्वीकृति और जीवन भर प्रतिरक्षादमन से संबंधित जटिलताओं से बचने के लिए ऑटोलॉगस होगा।
स्तनधारी वयस्क cardiomyocytes चोट पर एक सीमित पुनर्योजी क्षमता का प्रदर्शन है, लेकिन हाल ही में सबूत से पता चलता है कि स्तनधारी नवजात दिलों चोट 5-8 के बाद एक उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता बनाए रखने के लिए। विशेष रूप से, आंशिक शल्य लकीर के बाद, एक पुनर्योजी खिड़की जन्म और प्रसव के बाद दिन के बीच की खोज की गई है 7. इस पुनर्योजी अवधि fibrotic निशान की कमी है, neovascularization के गठन, epicardium से एन्जियोजेनिक कारकों की रिहाई, और cardiomyocyte प्रसार 5-8 की विशेषता है 11। समय की यह पुनर्योजी खिड़की एक bioartificial दिल के विकास के लिए सामग्री का एक उपन्यास स्रोत के रूप में नवजात दिल प्रयोग करने के लिए क्षमता प्रदान करता है।
बाह्य मैट्रिक्स महत्वपूर्ण संकेतों cardiomyocyt बढ़ावा देने के लिए प्रदान करने के लिए जाना जाता हैई प्रसार और विकास। नवजात और वयस्क matrices 12 और उनके उत्थान को बढ़ावा देने की क्षमता में अणुओं की उपलब्धता में स्पष्ट मतभेद 13 का पता लगाया गया है। Decellularized वयस्क matrices कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर repopulation के लिए एक ईसीएम पाड़ और एक bioartificial दिल की पीढ़ी प्रदान करने के लिए। इन अध्ययनों, और स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों में नई खोजों, तेजी से आगे बढ़ रहे हैं, वहीं कई बाधाओं को अभी तक पूरा किया जाना है। उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स दीवार में मैट्रिक्स के मूल संरचना, सेलुलर एकीकरण के संरक्षण में सीमाओं, और क्षमता प्रसार और विकास के सभी सीमा समर्थन करने के लिए इस दृष्टिकोण की सफलता। बेहतर पुनर्योजी गुण नवजात दिल के लिए जिम्मेदार माना गया है, इस तरह के एक ऊतक का उपयोग करने के व्यावहारिक पहलुओं को अपने अन्वेषण सीमित है।
नवजात दिल का प्रदर्शन किया पुनर्योजी क्षमता के आधार पर, हम एक विकसित करके उपन्यास matrices विकसित किया हैपी 3 माउस दिल के लिए decellularization की तकनीक। पी 3 दिल इन अध्ययनों के लिए चुना गया था के रूप में यह हृदय उत्थान की खिड़की के भीतर है, जैसा कि पहले 6 चुना गया लेकिन दिल फसल, decellularize और recellularize करने के लिए काफी बड़ी है। इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक नवजात माउस दिल से एक मैट्रिक्स बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन है। हमारे अध्ययन करते हुए ईसीएम की संरचनात्मक और प्रोटीन अखंडता को बनाए रखने के लिए एक मिनट, नवजात दिल decellularizing की व्यवहार्यता के लिए सबूत प्रदान करते हैं। हम यह भी mCherry व्यक्त cardiomyocytes के साथ इस हृदय ईसीएम recellularize करने की क्षमता प्रदर्शित और हम Recellularization निम्नलिखित विभिन्न हृदय मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए इन cardiomyocytes की जांच की है। यह तकनीक एक bioartificial दिल के विकास के लिए एक नवजात मैट्रिक्स की श्रेष्ठता के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।
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Protocol
सभी माउस प्रयोगों अमेरिका पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और मिनेसोटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. माउस दिल अलगाव के लिए विधि
- एक प्रयोग के ब्लेड के साथ कत्ल द्वारा एक नवजात माउस euthanize।
- 70% इथेनॉल के साथ छाती झाड़ू।
- मानक कैंची से छाती दीवार से दूर काटने # 5 संदंश की एक जोड़ी के साथ laterally त्वचा खींच जबकि द्वारा सीने से त्वचा काटना।
- पेट सिर्फ पेट की दीवार के माध्यम से काटने से कैंची से उरोस्थि को नीचा छेदना। # 5 संदंश के साथ जिफाएडा प्रक्रिया लोभी, शरीर से rostrally उरोस्थि वापस लेना कैंची के साथ सीने के दोनों तरफ हालांकि पसलियों में कटौती करते हुए। रिब पिंजरे संदंश दिल प्रकट करने के साथ ऊंचा दिखाई देता है।
- दो टूक # 5 संदंश के साथ laterally खींच कर थाइमस के दो मुख्य पालियों काटना, उजागरमहाधमनी के चाप, साथ ही Caval और फेफड़े के नसों।
- 10 सेमी वसंत कैंची से महाधमनी चाप से प्रमुख धमनियों, और महाधमनी ही है, आड़ा काट। दिल का आधार है और प्रगंडशीर्षी धमनी के बीच महाधमनी को बनाये रखें। 5 संदंश # साथ कटे वाहिकाओं के सिरों समझ दिल आगे प्रतिबिंबित करने के लिए, श्वासनली और घेघा से अलग।
- फेफड़े के वाहिका और अन्य प्रमुख नसों आड़ा काट, 10 सेमी वसंत कैंची के साथ दिल के दोनों किनारों पर फेफड़े और दिल के बीच काटने से। नसों जल निकासी प्रदान करने के लिए खुला रहेगा।
- # 5 संदंश के साथ mediastinum से दिल निकालें, प्रमुख वाहिकाओं के कटे सिरों लोभी। एक 60 मिमी संस्कृति कैथीटेराइजेशन के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त डिश में दिल रखें।
2. Langendorff छिड़काव द्वारा Decellularization के लिए विधि
- अग्रिम में कैथेटर विधानसभा तैयार करें। एक 4 सेमी खंड ड्रापीई के एक छोटे से शराब लौ में 50 ट्यूबिंग एक छोटे, पतले कैथेटर बनाने के लिए। एक ब्लेड आयामों को पूरा करने के साथ समाप्त होता है ट्रिम (लगभग। 300 माइक्रोन लगभग। 500 माइक्रोन आयुध डिपो की एक निकला हुआ किनारा के साथ बाहर व्यास ओवर ड्राफ्ट) चित्र 1 में दिखाया गया है। यह दो सममित कैथेटर पुल के दोनों ओर से प्रदान करेगा।
- संक्षेप में लौ में ट्यूबिंग की कटौती अंत बिंदु, पतली अंत में खोलने पर एक निकला हुआ पिघला।
- पीबीएस के साथ 12 मिलीलीटर सिरिंज भरें और सिरिंज पर एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी रखकर कैथेटर को इकट्ठा। पानी निकलने की टोंटी के लिए एक 22 जी एक्स 1 सुई जोड़ें और पट के माध्यम से सुई ड्राइव। सुई (छवि। 1) पर तैयार पीई ट्यूबिंग कैथेटर स्लाइड।
- पीबीएस के साथ इकट्ठे भागों की सिंचाई, आश्वस्त है कि सभी हवाई बुलबुले को हटा दिया गया है।
- कैथेटर, जैसा कि ऊपर उल्लिखित, पृथक दिल की महाधमनी में, पिछले महाधमनी वाल्व का विस्तार नहीं है और 7-0 सीवन में से एक टाई के साथ ligate तैयार डालें। टी के बाकी किनारावह टाई के खिलाफ proximally कैथेटर, एक तंग सील कर रही है और कैथेटर बंद आने से दिल को रोकने।
- आवर्धन के तहत कैथीटेराइजेशन का निरीक्षण, जबकि धीरे दिल पीबीएस युक्त सिरिंज का उपयोग perfusing। सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई लीक कर रहे हैं और अव्यक्त खून निकाल दिया जाता है ऊतक ही ढंग Blanches है।
- पट इनलेट एडाप्टर के गले में रखें और गिलास से अधिक पक्षों तह करके इसे सील।
- पर्याप्त लंबाई की एक पंक्ति एक स्तंभ है कि 20 मिमी पारा दबाव के रूप में छवि में दिखाया गया उत्पन्न निर्माण करने के लिए के माध्यम से आसुत जल में 1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 60 मिलीलीटर (DH 2 हे) के साथ भरा जलाशय संलग्न। 1। 1 मिमी पारा के रिश्ते पर आधारित तरल स्तंभ ऊंचाई से दबाव की गणना 1.3595 सेमी एच 2 ओ के बराबर है
सावधानी: एसडीएस अड़चन गुणों के साथ एक अत्यधिक गुम्फेदार पाउडर है। संपर्क से बचना चाहिए। उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े का उपयोग पाउडर संभाल लेना। - 14 घंटे के लिए 1% एसडीएस के साथ दिल छिड़कना। दिल कोई नमूदार शेष ऊतक के साथ दिखने में पारदर्शी हो जाएगा।
- शेष एसडीएस समाधान का पानी निकलने की टोंटी के लिए सिस्टम को फ्लश और 10 मिलीलीटर DH 2 ओ के साथ बदलें (आसुत जल में पतला) 10 मिलीलीटर 1% ट्राइटन X-100 के साथ दिल, 10 मिलीलीटर DH 2 हे द्वारा पीछा किया, 60 मिलीलीटर 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep) युक्त पीबीएस के द्वारा पीछा छिड़कना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x कलम strep साथ पीबीएस में दिल स्टोर। इरादा पद decellularization आवेदन छिड़काव तो महाधमनी में कैथेटर बनाए रखा जाना चाहिए की आवश्यकता है, अन्यथा सीवन टाई में कटौती और कैथेटर को हटा दें।
3. डीएनए निर्धारण
- 50 मिमी KCl में 200 माइक्रोग्राम / एमएल proteinase कश्मीर का उपयोग कर decellularized ईसीएम या नियंत्रण दिल का एक डाइजेस्ट तैयार करें, 2.5 मिमी 2 MgCl, 0.45% बीच 20 10 मिमी Tris (पीएच 8.3) में।
- आंदोलन के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं जब तक ऊतक भंग कर रहा है,आम तौर पर 4-5 घंटा।
- एक डीएनए बाध्यकारी परख 4,11 साथ homogenate के डीएनए सामग्री quantitate।
4. फिक्सेशन और ऊतकों की सेक्शनिंग
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde में decellularized, recellularized या नियंत्रण पी 3 दिलों को ठीक करें।
- पीबीएस 3x में ऊतक धो लें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 7.5% sucrose के समाधान में ऊतक रखें जब तक यह डूब।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 15% सुक्रोज का हल बदलें, फिर जब तक यह डूब।
- 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म ऊतक, 15% sucrose और 0.1 एम फॉस्फेट बफर में जिलेटिन समाधान के साथ मात्रा का आधा जगह है और रात भर संतुलित करना। जिलेटिन की सांद्रता और 1%, 2.5%, 5% के माध्यम से चरणबद्ध बढ़ रहे हैं अंत में 7.5% दो बार।
- ताजा 7.5% जिलेटिन का उपयोग कर cryomolds में नमूने रखें। decellularized नमूने के आकार को बहाल करने के लिए, तरल जिलेटिन टी के रूप में कक्षों में भरकर रखा जा सकता हैवह दिल ढाला जाता है। तरल नाइट्रोजन पर cryomolds चल द्वारा रुक। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- कट (10 माइक्रोन मोटी) cryostat के साथ वर्गों। स्लाइड खंड सतह के करीब लाने के लिए और निरीक्षण अनुभाग सतह पर चाकू से electrostatically में इलाज स्लाइड्स पर चार्ज के कारण बंद चाल। रात भर स्लाइड सूखी और भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- फ्रीजर से स्लाइड्स निकालें, कमरे के तापमान को संतुलित करना और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पीबीएस युक्त जिलेटिन भंग करने के लिए एक Coplin जार में जगह है।
- Hematoxylin और eosin के साथ कदम से 4.7 वर्गों में कटौती दाग। एक Coplin जार में रखें स्लाइड। स्लाइड 45 सेकंड के लिए Hematoxylin करने के लिए कदम 4.8 में हाइड्रेटेड बेनकाब, 1.5 मिनट के लिए पानी के नल, 3 मिनट के लिए बफर, 1.5 मिनट के लिए एजेंट उदास, 1 मिनट के लिए पानी के नल, 1 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, मादक Eosin Y 8 सेकंड के लिए, 1 मिनट 3x के लिए 1 मिनट, 1 मिनट 2x के लिए 100% इथेनॉल, समाशोधन एजेंट (xylene विकल्प) के लिए 80% इथेनॉल, राल के साथ coverslipआधारित बढ़ते मध्यम। microscopically स्लाइड जांच करते हैं।
- एक humidified कक्ष में हाइड्रेटेड स्लाइड रखकर दिल ईसीएम, ऐसे कोलेजन चतुर्थ के रूप में ईसीएम संरचनात्मक प्रोटीन के लिए दाग की ईसीएम प्रोटीन जेट की अवधारण की पुष्टि करें और 0.1% ट्राइटन के साथ फॉस्फेट बफर खारा में 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) के साथ इलाज -X100 (PBST) (आरटी) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए। ऊतक वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रयोग करें।
- 5% एनडीएस / PBST में एक अनुभव से निर्धारित कमजोर पड़ने पर पसंद के प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ समाधान बदलें। उदाहरण के लिए, कोलेजन चतुर्थ एंटीबॉडी 1 पर पतला था: 150। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
- PBST 3x साथ स्लाइड्स धो लें और एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संयुग्मित पसंद का एक माध्यमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं। एक अनुभव से निर्धारित राशि से एंटीबॉडी पतला। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। पीबीएस 3x के साथ धोएं।
- एक डीएनए बाध्यकारी डाई के साथ स्लाइड दाग जैसे DAPI एक DAPI युक्त mounti का उपयोग करके सेल नाभिक के अभाव सत्यापित करने के लिएएनजी मध्यम जब कवर स्लाइड जा रहा है।
- 400X के लिए 50 पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड जांच करते हैं।
5. Recellularization के लिए P1 नवजात Murine वेंट्रिकुलर cardiomyocytes
- 70% इथेनॉल के साथ एक पिल्ला स्प्रे और एक एकल उपयोग ब्लेड के साथ सिर काटना।
- अंगूठे और तर्जनी के बीच एक पिल्ला पकड़ो, जबकि छाती छोटे बाँझ कैंची से midline पर विभाजित है वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए। दिल सीने से स्वतंत्र रूप से बहर करने के लिए है, जबकि यह प्रमुख वाहिकाओं और अटरिया केवल निलय ऊतक छोड़ने के लिए स्वतंत्र कट जाता है अनुमति देने के लिए दबाव लागू करें।
- हर दिल में सीधे 20 मिलीलीटर ठंडा कैल्शियम, 20 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (CBFHH) जब तक सब के दिल एकत्र कर रहे हैं के साथ बिकारबोनिट मुक्त हांक बफर खारा समाधान युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।
- CBFHH Aspirate और ट्यूब के लिए ताजा CBFHH (ठंडा) के 10-15 मिलीलीटर जोड़ें। टी में ऊतक घूमता द्वारा ऊतक धोवह कई बार ट्यूब।
- समाधान के लिए एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में दिल युक्त छानना।
- यह वसंत कैंची के साथ दिल से दूर trimming द्वारा बर्फ पर बढ़ाई तहत दिल से किसी भी अव्यक्त आलिंद ऊतक काटना। homogenously आकार छोटे टुकड़ों में निलय अप कीमा। # 5 संदंश के साथ पकवान से किसी भी अलग गैर-निलय ऊतक निकालें।
- के रूप में एक छोटे से बाँझ शीशी कि एक बाँझ सूक्ष्म हलचल बार शामिल है में ऊतक टुकड़े हस्तांतरण करने की जरूरत है CBFHH समाधान के रूप में ज्यादा Pipet।
- ऊतक शीशी के नीचे करने के लिए तलछट और CBFHH समाधान निकालने के लिए अनुमति दें।
- एक एंजाइम समाधान 1.75 मिलीग्राम / एमएल trypsin, 20 माइक्रोग्राम / एमएल DNase द्वितीय CBFHH में से 50 मिलीलीटर अप करें। Pipet इस एंजाइम समाधान के 5 मिलीलीटर और एक ट्यूब एक चुंबकीय दोषी पर कीमा निलय ऊतक और जगह से युक्त करने के लिए जोड़ें। 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक स्थिर दर (340 आरपीएम) में हिलाओ।
नोट: सरगर्मी कार्रवाई कोमल हो सकता है और अभी तक की अनुमति चाहिएघोल के निलंबन के लिए। - हलचल थाली से शीशी निकालें और गारा 3 मिनट के लिए तलछट के लिए अनुमति देते हैं। Pipet और सतह पर तैरनेवाला त्यागें प्रारंभिक पचाने, के रूप में यह मुख्य रूप से रक्त कोशिकाओं और ऊतकों के मलबे में शामिल है।
- Pipet एंजाइम समाधान का एक दूसरा 5 मिलीलीटर विभाज्य और पचाने वेंट्रिकल में जोड़ें। 8 मिनट के लिए हलचल और यह एक और 3 मिनट के लिए तलछट के लिए अनुमति देते हैं। हज़म शुरू करने से पहले, दो 50 मिलीलीटर ट्यूब (लेबल 1 और 2) तैयार प्रत्येक युक्त 12 मिलीलीटर ठंडा भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)। प्रत्येक ट्यूब के ऊपर एक 40 माइक्रोन सेल झरनी रखें। Pipet ट्यूब पर 1 फिल्टर के माध्यम से इस सतह पर तैरनेवाला।
- पाचन प्रक्रिया को दोहराएं एक अतिरिक्त 8 बार, FBS युक्त दो ट्यूबों के बीच डाइजेस्ट सतह पर तैरनेवाला की नियुक्ति की बारी। प्रत्येक ट्यूब में बराबर मात्रा सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों के 1 और 2 के बीच समान रूप से पिछले सतह पर तैरनेवाला विभाजित।
नोट: प्रत्येक संग्रह ट्यूब अब सेल निलंबन के 32.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा में शामिल होंगे। - ट्यूबों शामिल4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला 150 XG हैैं।
- पाचन aliquots एकत्रित करते समय, 6 (Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) 10% FBS, 1x कलम strep, 1x एल glutamine के साथ) प्रति प्लेट मीडिया की मिलीलीटर के साथ पाँच 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेटें तैयार करते हैं। मीडिया संतुलित करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इन aliquots सेते हैं।
- CBFHH एंजाइम मिश्रण Aspirate और संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर से ऊपर तैयार में कोशिकाओं resuspend, दोनों संग्रह ट्यूब से कोशिकाओं के संयोजन।
- 100 मिमी प्लेट से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 6 मिलीलीटर लौटें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
- ऊष्मायन के अंत में, 5 नए व्यंजन को गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हस्तांतरण और 45 मिनट के लिए फिर से सेते (fibroblast अंश व्यंजन का पालन करना शुरू कर दिया है जाएगा और अलग से बाहर हो सकता है अगर वांछित)।
- पूर्व चढ़ाना के दूसरे दौर के अंत में, व्यंजन से मीडिया और गैर पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 150 में मीडिया स्पिन6 मिनट के लिए XG।
- अतिरिक्त मीडिया से दूर ड्रा कोशिकाओं अनुमानित वांछित एकाग्रता के लिए (perfusate के 100 μl में निर्माण प्रति 4.0 x 10 5 कोशिकाओं), लाने के लिए। गिनती और या व्यवहार्यता का परीक्षण 14 के लिए एक विभाज्य निकालें।
6. पी 3 हार्ट मैट्रिक्स के बायोरिएक्टर Recellularization
- रातोंरात कोशिकाओं को जोड़ने से पहले संस्कृति मीडिया (चरण 5.15 देखें) के साथ पृथक दिल मैट्रिक्स Pretreat।
- के रूप में छवि में दिखाया गया एक Langendorff प्रणाली के तत्वों को इकट्ठा करो। 2। कांच भागों आटोक्लेव और एथिलीन ऑक्साइड प्लास्टिक भागों बाँझ बाँझपन आश्वस्त करने के लिए। प्रणाली के विभिन्न उप इकाइयों समर्थन स्टैंड पर रखा जा रहा से पहले एक लामिना का प्रवाह हुड में इकट्ठा किया जा सकता है। परिसंचारी पानी से स्नान और गर्म पानी के प्रवाह पथ स्पष्टता के लिए हटा दिया गया है।
- टिशू कल्चर मीडिया के 120 मिलीलीटर के साथ इकट्ठे प्रणाली भरें (चरण 5.15 देखें)।
- चरण 2.14 से catheterized दिल मैट्रिक्स एक 60 मिमी संस्कृति में रखेंआवर्धन के तहत संरचना पकवान और 22 जी एक्स 1 सुई कैथेटर के लिए कदम 5.20 से सेल निलंबन के साथ लोड के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट। सुनिश्चित करें कि इस विधानसभा हवा के बुलबुले के मुफ्त दिल embolizing से बचना है।
- धीरे कोरोनरी धमनियों के माध्यम से दिल मैट्रिक्स में सेल निलंबन के 100 μl छिड़कना। एक बार जब पूरा, सिरिंज / सुई संयोजन अलग।
नोट: लगभग एक धीमी गति से छिड़काव। प्रति मिनट 20 μl नसों से बाहर बहने, दिल गुजर से कोशिकाओं को रोकने के लिए आवश्यक है। - एक 22G कुंद बायोरिएक्टर दिल जार ढक्कन के नीचे पर Luer फिटिंग के लिए सुरक्षित ठूंठ के साथ, ठूंठ पर कैथेटर धक्का।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू करो और पालन कि प्रवाह आय के रूप में चित्रा 2 में उल्लिखित। जलाशय से प्रवाह आगम कैथेटर चरण 2.5 में महाधमनी में रखा गया (छवि। 2 में लाल पथ) के लिए बुलबुला जाल के माध्यम से पंप के माध्यम से। नस से बाहर हृदय संचलन के प्रवाह का निरीक्षणएपेक्स, मीडिया जलाशय में recirculating से है और ड्रिप।
नोट: छिड़काव प्रवाह की दर में इस तरह के निर्माण के संवहनी प्रतिरोध, और दिल के आकार, लेकिन 100 μl करने के लिए 50 की दर के रूप में व्यक्तिगत कारकों पर निर्भर है / मिनट के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। मध्यवर्ती समय बिंदुओं पर, कार्यात्मक आकलन क्रियान्वित किया जा सकता है। नवजात recellularized दिल के आकार के पैमाने आकलन की सीमा है, कि प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन हम निर्धारित किया है कि ऑप्टिकली आधारित प्रणालियों व्यवहार की धड़कन बस के रूप में वे वयस्क चूहे दिलों में इस्तेमाल किया गया है यों इस्तेमाल किया जा सकता है। 4 का निर्माण बढ़ाया भरकर रखा जा सकता है (23 मानव संसाधन तक) के समय की अवधि।
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Representative Results
decellularization
औसत पर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक पी 3 दिल की decellularization के लिए समय लगभग 14 घंटा है। पी 3 नवजात शिशु के लिए 23 मिलीग्राम की एक औसत दिल वजन दिया।
Acellularity
चित्रा 3A एक पूरी तरह से बरकरार पी 3 नवजात दिल (पूरे माउंट)। चित्रा 3 बी decellularization के बाद एक ही दिल से पता चलता है। -4 ए के आंकड़े और बरकरार है और decellularized दिल की hematoxylin और eosin धुंधला दिखाने 4 बी, क्रमशः को दर्शाता है। hematoxylin सकारात्मक नाभिक के अभाव और decellularized दिल में इओसिनोफिलिक संरचनाओं की कमी पर ध्यान दें। इसके अलावा, decellularized दिल के डीएनए सामग्री काफी बरकरार दिल (एन = 6) 4.73 ± 2.27 माइक्रोग्राम decellularized दिल में करने के लिए से 68.08 ± 2.25 माइक्रोग्राम प्रति कम हो जाता है (एन = 5)।
कोलेजन immunoreactivity
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) decellularization निम्नलिखित के रखरखाव बहिर्जात कोशिकाओं के साथ और मैट्रिक्स की कार्यक्षमता के लिए Repopulation करने के लिए आवश्यक है। बरकरार है और decellularized ईसीएम में नवजात ईसीएम की सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए, कोलेजन चतुर्थ के लिए इम्युनो-धुंधला प्रदर्शन किया गया था। 4C चित्रा और दिखाना है कि घ कोलेजन चतुर्थ मजबूती के साथ दोनों बरकरार है और decellularized दिल में व्यक्त किया है और कहा कि इस प्रोटीन का स्थानीयकरण बनाए रखा है सेल निकालने के बाद, जबकि DAPI सकारात्मक नाभिक को प्रभावी ढंग से (चित्रा 4E-ज) हटा रहे हैं।
डीएनए सामग्री
डीएनए की उपस्थिति कोषमयता के एक अतिरिक्त संकेत के रूप में प्रयोग किया जाता है। चित्रा 5 में, डीएनए निम्नलिखित डिटर्जेंट आधारित decellularization नवजात दिलों में 93% की कमी होने का प्रदर्शन किया जाता है। डीएनए में कमी के इस डिग्री के साथ संगत हैसाहित्य में रिपोर्ट अन्य ऊतकों 15-16 में डिटर्जेंट आधारित decellularization का उपयोग कर।
Recellularization
हम immunohistochemistry प्रदर्शन किया है recellularized दिल में विभिन्न cardiomyocyte मार्करों की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए। चित्रा 6 दिखाता है कि कोशिकाओं के बाएं वेंट्रिकल की दीवार (चित्रा 6A और 6B)। चित्रा 6C recellularized दिल के DAPI लेबलिंग दर्शाता में चले गए हैं। चित्रा 6D-जी कोशिकाओं है कि NKX 2.5, mCherry, α-actinin और DAPI, क्रमशः के लिए सकारात्मक रहे हैं दिखाता है। NKX2.5, हृदय पूर्वज कोशिकाओं लेबल जबकि α-actinin एक sarcomeric प्रोटीन है कि विभेदित cardiomyocytes के निशान है जाना जाता है। (गुलाबी, चित्रा 6) हम जो इन मार्करों के सभी व्यक्त कोशिकाओं के बहुमत देखा है, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं cardiomyocyte मार्करों ईवी को व्यक्त करने के लिए जारीएन छिड़काव के 23 दिनों के बाद।
चित्रा 1. decellularization हार्डवेयर। ए के योजनाबद्ध। डिटर्जेंट समाधान। बी के लिए 60 सीसी सिरिंज प्रति बैरल जलाशय। सिंचाई सिरिंज के रूप में विस्तृत। सी के साथ कैथेटर विधानसभा। तैयार पीई ट्यूबिंग कैथेटर टिप का विस्तार। डी। Decellularization कक्ष और नाली के साथ पट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. दिल बायोरिएक्टर की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 1। carbogen गैस की Humidification (ग्रीन लाइनों गैस के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करते हैं)। मीडिया छिड़काव के लिए 2. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ड्राइव औरऑक्सीजन (बैंगनी लाइनों oxygenator के माध्यम से मीडिया के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करते हैं)। 3. पतली दीवार oxygenator। 4. शीट oxygenator और मीडिया जलाशय। 5. प्रीलोड कक्ष और बुलबुला जाल। 6. दिल कक्ष (लाल लाइनों से और दिल से मीडिया प्रवाह प्रतिनिधित्व करते हैं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. पी 3 नवजात माउस दिल के पूरे माउंट (ए) के पहले और decellularization (बी)। इस दिल Langendorff छिड़काव विधि का प्रयोग करने में विधि 2 नोट के रूप में वर्णित है कि दिल पारदर्शी हो जाता है decellularized है और थोड़ा निम्नलिखित छिड़काव (बी) के बढ़े बाद । स्केल = 2 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
देशी और decellularized पी 3 नवजात माउस दिल की चित्रा 4. प्रोटोकॉल। Cryostat खंड (10 माइक्रोन) एच एंड ई (ए, बी), कोलेजन चतुर्थ (सी, डी, जी, एच) और DAPI (ई, एफ, जी, एच के साथ दाग थे )। मर्ज किए गए छवियों जी में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और एच एच एंड ई धुंधला decellularized ऊतक (बी) में सेल नाभिक और कोशिका द्रव्य की अनुपस्थिति से पता चलता है जब देशी दिल (ए) की तुलना में। जबकि कोलेजन चतुर्थ सामग्री निम्न decellularization (डी), DAPI धुंधला (नाभिक का एक मार्कर) रहता समाप्त कर दिया है। मर्ज किए गए चित्र भोले दिल (जी) और decellularized दिल (ज) में इस colocalization के अभाव में कोलेजन चतुर्थ और DAPI की colocalization प्रदर्शित करता है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि कोशिकाओं को कोई अब दिल की कोलेजन मैट्रिक्स आबाद। स्केल = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. डीएनए सामग्री का मूल्यांकन। नियंत्रण (एन = 6) और decellularized (एन = 5) दिल पिको-हरे रंग की विधि द्वारा डीएनए सामग्री के लिए यत्न किया। Quantitation मानक विचलन ± दिल प्रति डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति के रूप में व्यक्त किया। Asterisk नियंत्रण की तुलना में पी <0.01 इंगित करता है। इन आंकड़ों कि decellularization पी 3 नवजात दिल में काफी कम कर देता डीएनए सामग्री का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 6 पी 3 दिल मैट्रिक्स के ऊतक विज्ञान 23 दिनों के बाद P1 mCherry व्यक्त cardiomyocytes एच ई (ए, पैमाने = 250 माइक्रोन, बी, पैमाने = 50 माइक्रोन), DAPI (सी, पैमाने = 250 माइक्रोन), NKX 2.5 के साथ। सना के साथ Recellularization, mCherry, α-actinin, DAPI, और विलय (डी, ई, एफ, जी, एच, पैमाने = 50 माइक्रोन)। हम P1 cardiomyocytes (एसी) के साथ कोलेजन मैट्रिक्स के प्रभावी repopulation प्रदर्शन किया है। इसके अतिरिक्त, हम ने कहा कि एम-चेरी सकारात्मक cardiomyocytes Nkx2.5 और कोलेजन मैट्रिक्स में शुरूआत के बाद α-actinin 23 दिनों व्यक्त करते हैं। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इन कोशिकाओं समय की विस्तारित अवधि के लिए उनकी cardiomyocyte पहचान बनाए रखें। इस च का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंigure।
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Discussion
दिल के दोहराया perfusions पर इस तकनीक की निर्भरता एक दिल का आवेश के परिहार के एक सफल परिणाम के एक महत्वपूर्ण घटक बना देता है। कदम 2.2-2.6 में दिल की प्रारंभिक कैथीटेराइजेशन, कदम 2.8-2.14 के बीच समाधान के परिवर्तन के लिए, वहाँ जोड़तोड़ कि हवा के बुलबुले जो समझौता perfusate के प्रवाह मायोकार्डियम में की शुरूआत के लिए अनुमति दे सकते हैं। नवजात दिल का छोटा आकार के कारण, वाहिका में भी मिनट बुलबुले एक तकनीकी रोधगलितांश पैदा कर सकता है, इस प्रकार decellularization अधूरा प्रतिपादन। इसके अतिरिक्त, बाद में धोने के चरणों में, अधूरा छिड़काव डिटर्जेंट अवशेषों कि नकारात्मक प्रभावों biocompatibility में परिणाम कर सकते हैं। इसके अलावा, चरण 2.14 में सुझाव के रूप में इस तरह जब 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से मैट्रिक्स हटाने के रूप में तापमान में तेजी से बदलाव, देखभाल के साथ संपर्क किया जाना चाहिए क्योंकि यह भी हवा बुलबुला गठन के एक स्रोत है जब परिवर्तन के साथ समाधान के बाहर गैस चाल भंग किया जा सकता तापमान में। डब्ल्यूRecellularization को मुर्गी कार्यवाही, अतिरिक्त देखभाल, लागू किया जाना चाहिए जब सेल निलंबन के साथ सिरिंज की तैयारी, आसव सुनिश्चित करने के लिए स्वतंत्र बुलबुला (चरण 6.4) है।
यह इस प्रोटोकॉल की बारीकियों हेरफेर करने के लिए अन्य ऊतकों प्रकार समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। Decellularization प्रोटोकॉल की एक नंबर की सूचना दी 4,9,11 जो मार्गदर्शन प्रदान कर सके हैं। किसी भी decellularization प्रोटोकॉल के अंत तक लक्ष्य (ओं) ईसीएम प्रोटीन संरचना के रखरखाव और संबंधित जैव रसायन, और देशी सेलुलर घटकों की पर्याप्त हटाने के रूप में अवशिष्ट डीएनए द्वारा उदाहरण शामिल करना चाहिए। इस सेटिंग में, अत्यधिक छिड़काव दबाव के आवेदन ईसीएम फैटी, जो histologically देखे जा सकते हैं के विघटन की ओर जाता है।
पी 3 माउस दिल के आकार के सेल प्रशासन पर कुछ बाधाओं डालता है वयस्क ऊतक की तुलना में। जबकि वयस्क दिल एक मोटी पर्याप्त वेंट्रिकुलर दीवार है कि transmural injectio बनाता पेशna संभव सेल वितरण साधन, पी 3 दिल छोटा करने के लिए पर्याप्त है कि एक सुई, आकार, जिनमें से एक सेल निलंबन lyse नहीं होगा, दिल को पर्याप्त नुकसान करता है। छिड़काव एक व्यवहार्य वितरण रणनीति है, लेकिन एक निश्चित आकार और आकार की कोशिकाओं पर निर्भर करता है को प्रभावी ढंग से वितरित किया जाना है। नवजात murine myocytes इस संबंध में अच्छी तरह से काम करते हैं। अन्य छोटे परिपत्र कोशिकाओं को भी इस उद्देश्य के 11 सेवा करने के लिए दिखाया गया है। ये दिल के आकार के पैमाने इस तरह के दबाव मात्रा कैथेटर के रूप में पारंपरिक शारीरिक कार्य विश्लेषण के उपयोग के अलग करता है। वीडियो पर कब्जा के आधार पर अन्य दृष्टिकोण से विचार किया जाना पड़ सकता है।
इन आंकड़ों decellularization और नवजात माउस दिल की Recellularization की व्यवहार्यता का समर्थन करते हैं। पिछले अध्ययनों decellularization / Recellularization के अध्ययन के उद्देश्य के लिए वयस्क दिलों के उपयोग का प्रदर्शन किया है। इन वयस्क दिल से उत्पादित matrices नवजात cardiomyocytes 4 और मानव के साथ repopulated कर दिया गया हैप्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) 17। hiPSCs के मामले में, repopulated दिलों ऐसे NANOG, Sox2, और OCT4 और गठन पेशी संरचनाओं की तरह के रूप में pluripotency मार्कर में कमी प्रदर्शित किया; सभी परिपक्वता का सूचक। ईसीएम के बाह्य cues, हालांकि, की कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों जो हमें पुनर्योजी क्षमता बंदरगाह के लिए जाना जाता ऊतकों से matrices उत्पन्न करने के लिए प्रयास करने के लिए कहा जाए, विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। हमारे अध्ययन में, हम उस recellularized दिल अभी भी cardiomyocyte मार्करों व्यक्त, लंबे समय तक संस्कृति के बाद भी प्रदर्शित करता है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, उपन्यास matrices का उपयोग कर, cardiomyocytes cardiomyocytes के रूप में अपनी पहचान खोने के बिना समय की विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है। हमारे डेटा नवजात माउस दिल decellularizing के लिए तकनीक और व्यवहार्यता समर्थन करते हैं। नवजात matrices repopulation अध्ययन के लिए उपन्यास निर्माणों को उपलब्ध कराने के लिए और साथ ही समर्थन किया है कि जैल के उत्पादन के लिए संभावित पकड़erior पुनर्योजी क्षमता। इन नवजात ईसीएम का उपयोग करना, हम अब इन scaffolds की श्रेष्ठता को संबोधित कर रहे hiPSCs सहित सेल प्रकार की एक किस्म के साथ कार्यात्मक ऊतकों के रूप में।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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