Summary
I disse studiene gir vi metodikk for nye, nyfødte, murine hjerte stillas for bruk i regenerativ studier.
Introduction
Hjertesvikt er vanlig og dødelig. Det er en progressiv sykdom som resulterer i redusert kontraktilitet av hjertet, noe som svekker blodstrømmen til organene og etterlater de metabolske krav av kroppen udekket. Det er anslått at 5,7 millioner amerikanere har hjertesvikt, og det er den primære årsaken til sykehusinnleggelse i USA ni. Den kollektive kostnaden for behandling av pasienter i hjertesvikt i USA overstiger $ 300 milliarder dollar per år 9-10. Den eneste definitive terapi for slutten scenen hjertesvikt er orthotopic hjertetransplantasjon. Hvert år er det anslått at mer enn 100.000 donor hjerter er behov for hjertetransplantasjons prosedyrer i USA 1-2. På grunn av begrenset antall givere, er det bare ca 2400 transplantasjoner utføres hvert år i USA to. Åpenbart må håndteres som andre strategier er nødvendig for å produsere flere organer for transplanta dette organet mangelsjon, og vil ideelt disse organene vil være autolog for derved å unngå komplikasjoner forbundet med avvisning og levetid immunsuppresjon.
Pattedyr voksne cardiomyocytes demonstrere en begrenset evne til reproduksjon ved skade, men nyere bevis tyder på at pattedyr neonatale hjerter opprettholde en bemerkelsesverdig evne til reproduksjon etter skade 5-8. Nærmere bestemt, etter delvis kirurgisk reseksjon, en regenerativ vindu har blitt oppdaget mellom fødsel og postnatal dag 7. Dette regenerativ periode er kjennetegnet ved en mangel på fibrotiske arr, dannelse av neovaskularisering, frigjøring av angiogene faktorer fra epikard og kardiomyocytt proliferasjon 5-8 , 11. Denne regenerative tidsvindu gir mulighet for ved hjelp av neonatal hjertet som en ny kilde av materiale for utvikling av en kunstig biologisk hjerte.
Den ekstracellulære matriks er kjent for å gi viktige signaler for å fremme cardiomyocyte spredning og vekst. Tydelige forskjeller i tilgjengeligheten av molekyler i neonatale og voksne matriser 12 og deres evne til å fremme regenerering har utforsket 13. Decellularized voksen matrikser har blitt anvendt i mange studier for å tilveiebringe en ECM stillas for cellulær repopulation og generering av en kunstig biologisk hjerte. Selv om disse studiene, og nye funn i stamcelleteknologi, er på fremmarsj raskt, flere hindringer ennå ikke er oppfylt. For eksempel, begrensninger i å bevare native struktur hos matriksen, cellulære integrering i matriksen vegg, og evne til å støtte proliferasjonen og veksten alle grense suksess for denne tilnærmingen. Mens overlegne regenerative egenskaper har blitt tilskrevet nyfødt hjertet, har de praktiske sidene ved å bruke en slik vev begrenset sin leting.
Med utgangspunkt i den påviste evne til reproduksjon av den neonatale hjerte, har vi utviklet nye matriser ved å utvikle enTeknikken med decellularization for P3 musen hjerte. P3 hjerte ble valgt for disse studiene som det er innenfor vinduet i hjerte regenerering som tidligere bestemt 6 men hjertet er stort nok til å høste, decellularize og recellularize. Målet med denne studien er å demonstrere gjennomførbarheten av å skape en matrise fra en neonatal mus hjerte. Våre undersøkelser gir bevis for muligheten for decellularizing et minutt, neonatal hjerte og samtidig opprettholde den strukturelle og protein integritet ECM. Vi viser også evnen til å recellularize denne hjerte ECM med mCherry uttrykker kardiomyocytter og vi har undersøkt disse kardiomyocytter for ekspresjon av forskjellige hjertemarkører følgende recellularization. Denne teknologien vil gi rom for testing av overlegenhet av en neonatal matrise for utvikling av en kunstig biologisk hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus forsøkene ble utført i henhold til US dyrevernloven, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Minnesota.
1. Metode for Mus Hjerte Isolation
- Avlive en neonatal mus ved halshogging med en engangsbruk blad.
- Vattpinne thorax med 70% etanol.
- Dissekere huden fra brystet ved å kutte det bort fra brystveggen med standard saks mens du trekker huden lateralt med et par # 5 tang.
- Perforere magen bare dårligere til sternum med saksen ved å kutte gjennom bukveggen. Fatte xiphoid prosessen med # 5 tang, trekke sternum rostrally fra kroppen mens kutte om ribbeina på hver side av brystet med saks. Den brystkassen reflekteres overlegent med pinsett for å avsløre hjertet.
- Rett ut dissekere de to viktigste fliker av thymus ved å trekke sideveis med # 5 tang, utsettebuen på aorta, samt CAVAL og lungevenene.
- Transektet de store arterier fra aortabuen og aorta selv, med 10 cm våren saks. Beholde aorta mellom bunnen av hjertet og brachiocephalic arterie. Gripe endene av de avkuttede fartøy med # 5 tang for å reflektere hjertet fremover, skiller den fra luftrøret og spiserøret.
- Skjære over pulmonale vaskulatur og andre store vener, ved å skjære mellom lungene og hjertet på begge sider av hjertet med 10 cm fjær saks. Venene forbli åpen for å gi drenering.
- Ta hjertet fra mediastinum med # 5 tang, fatte de avkuttede endene av de store skipene. Plassere hjertet i en 60 mm kulturskål inneholdende sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) for kateterisering.
2. Metode for Decellularization av Langendorff Perfusjons
- Forbered kateterenheten på forhånd. Tegn et 4 cm seksjonav PE 50 rør i en liten flamme alkohol for å skape en mindre, tynnere kateter. Trimme endene med et blad for å møte de dimensjoner (ca. 300 um ytterdiameter OD med en flens på ca. 500 um OD) vist i figur 1. Dette vil gi to symmetriske katetere fra hver side av trekk.
- Peke avskårne enden av røret inn i flammen en kort stund for å smelte en flens på åpningen ved den tynne ende.
- Fyll 12 ml sprøyte med PBS og montere kateteret ved å plassere en 3-veis stoppekran på sprøyten. Legg en 22 G x 1 nål til vannkranen og kjøre nålen gjennom septum. Skyv trukket PE rør kateter på nålen (Fig. 1).
- Skyll de monterte delene med PBS, sikre at alle luftbobler er fjernet.
- Føre inn katetret, fremstilt som beskrevet ovenfor, inn i aorta av det isolerte hjertet, ikke strekker seg forbi aorta-ventilen og ligere med en slips av 7-0 sutur. Hvil flens than kateteret i nærheten mot uavgjort, noe som gjør en tett forsegling og hindre hjerte fra kommer av kateteret.
- Observer kateterisering under forstørrelse, mens forsiktig perfusert hjertet ved hjelp av sprøyte som inneholder PBS. Pass på at det ikke er noen lekkasjer i systemet og vevet blanches homogent som latent blod er fjernet.
- Plasser septum inn i halsen av innløpsadapter og forsegle den ved å brette sidene over glasset.
- Fester reservoaret fylt med 60 ml 1% natriumdodecylsulfat (SDS) i destillert vann (dH 2 O) gjennom en rørledning med tilstrekkelig lengde til å fremstille en kolonne som genererer 20 mm Hg trykk, som vist i fig. 1. Beregn trykket fra væskesøylen høyde basert på forholdet av 1 mm Hg er lik 1,3595 cm H 2 O.
Forsiktig: SDS er en svært flocculent pulver med irriterende egenskaper. Kontakt bør unngås. Håndter pulveret ved hjelp av egnet verneutstyr. - Perfuse hjertet med en% SDS i 14 timer. Hjertet blir gjennomsiktig i utseende med noen observerbar gjenværende vev.
- Skyll systemet opp til stoppekranen av den gjenværende SDS-løsning og erstatte den med 10 ml dH 2 O. Perfuse hjertet med 10 ml 1% Triton X-100 (fortynnet i destillert vann), etterfulgt av 10 ml dH 2 O, etterfulgt av 60 ml PBS inneholdende 1 x penicillin streptomycin (Pen-Strep).
- Oppbevar hjerte i PBS med 1x Pen-Strep ved 4 ° C. Hvis den tiltenkte post decellularization applikasjonen krever perfusjon da bør opprettholdes kateteret i aorta, ellers kutte sutur uavgjort og fjerne kateteret.
3. DNA Fastsettelse
- Fremstille et sammendrag av den decellularized ECM eller kontroll hjertet ved anvendelse av 200 ug / ml proteinase K i 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% Tween 20 i 10 mM Tris (pH 8,3).
- Inkuber vevet ved 55 ° C under omrøring inntil vevet er oppløst,vanligvis 4-5 timer.
- Kvantifisere DNA-innhold av homogenatet med et DNA-bindingsanalyse 4,11.
4. Fiksering og Seksjonering av Tissue
- Fiks decellularized, recellularized eller kontroll P3-hjerter i 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask vev i PBS 3x.
- Plasser vevet i en oppløsning av 7,5% sukrose i 0,1 M fosfatbuffer ved 4 ° C inntil det synker.
- Endre oppløsningen til 15% sukrose i 0,1 M fosfatbuffer ved 4 ° C, igjen, før den synker.
- Varm vevet til 37 ° C, å erstatte halvparten av volumet med gelatinoppløsning i 15% sukrose og 0,1 M fosfatbuffer og i likevekt over natten. Konsentrasjoner av gelatin økes trinnvis gjennom 1%, 2,5%, 5% og til slutt 7,5% to ganger.
- Plasser prøvene i cryomolds med ferske 7,5% gelatin. For å gjenopprette formen på decellularized prøvene, kan flytende gelatin bli perfusert inn i kamrene som than hjerter er støpt. Frys av flytende de cryomolds på flytende nitrogen. Oppbevar ved -80 ° C.
- Cut (10 mikrometer tykke) seksjoner med en cryostat. Bringe sleiden nær den seksjon overflate og observere delen beveger seg ut fra kniven på overflaten på grunn av ladningen på de elektrostatisk behandlede objektglass. Tørk glir over natten og oppbevar ved -80 ° C for fremtidig analyse.
- Fjern de glir fra fryseren, nå romtemperatur og deretter i en Coplin krukke inneholdende PBS i 20 minutter ved 37 ° C for å oppløse gelatin.
- Flekk kuttet seksjoner fra trinn 4.7 med Hematoxylin og eosin. Plasser lysbilder i en Coplin krukke. Expose lysbildene hydrert i trinn 4,8 til Hematoxylin for 45 sek, vann fra springen for 1,5 min, buffer for 3 min, vann fra springen i 1 min, bluing agent for 1,5 min, 80% etanol i 1 min, Alkohol Eosin Y for 8 sek, 80% etanol i 1 min, 100% etanol i 1 min 2x, å fjerne middel (xylen erstatning) i 1 min 3x, dekkglass med harpiksbaserte montering medium. Undersøk lysbildene mikroskopisk.
- For å bekrefte oppbevaring av ECM-protein reaktivitet av hjertet ECM, beis for ECM strukturelle proteiner som kollagen IV ved å plassere de hydratiserte glir i et fuktet kammer og behandle med 10% normalt esel serum (NDS) i fosfatbufret saltvann med 0,1% Triton -X100 (PBST) i 1 time ved romtemperatur (RT). Bruk et tilstrekkelig volum til å dekke vevssnitt.
- Bytt løsning med det primære antistoffet av valg på en empirisk bestemt fortynning i 5% NDS / PBST. For eksempel ble kollagen IV antistoff fortynnet til 1: 150. Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Vask lysbildene med PBST 3x og påfør et sekundært antistoff av valget konjugert med et fluorescerende fargestoff. Fortynne antistoff ved en empirisk bestemt beløp. Inkuber i 1 time ved RT. Vask med PBS 3x.
- Flekk objektglassene med et DNA-bindende fargestoff slik som DAPI for å bekrefte fraværet av cellekjerner ved hjelp av et DAPI inneholdende mounting medium når dekselet sklir lysbildene.
- Undersøk lysbilder med et fluorescerende mikroskop på 50 til 400X.
5. P1 Neonatal Murine Ventrikulært cardiomyocytes for Recellularization
- Spray hver valp med 70% etanol og halshogge med et engangsbruk blad.
- Hold hver valp mellom tommel og pekefinger mens thorax er delt på midtlinjen med små steril saks for å avsløre brysthula. Anvende trykk for å gi hjertet til å rage fritt fra brystet, mens det er kuttet fri av de store fartøyene og atriene slik at bare den ventrikulære vev.
- Plasser hver hjerte direkte inn i et 50 ml rør inneholdende 20 ml iskald Kalsium, bikarbonat fri Hanks bufret saltløsning med 20 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (CBFHH) inntil alle hjerter er samlet inn.
- Aspirer CBFHH og tilsett 10-15 ml frisk CBFHH (iskald) til røret. Vask vev ved å svinge vevet i tHan røret flere ganger.
- Dekanter oppløsningen inneholdende hjertene inn i en 60 mm petriskål av plast.
- Dissekere latent atrial vev fra hjerter under forstørrelse på is ved å klippe det vekk fra hjerter med våren saks. Finhakk opp ventriklene inn homogent store små biter. Fjern eventuelle fraskilt ikke-ventrikkel vev fra fatet med # 5 tang.
- Pipetter så mye av CBFHH oppløsning som er nødvendig for å overføre vevfragmenter inn i en liten steril ampulle som inneholder en steril mikrorørestav.
- Tillat vevet for å sedimentere til bunnen av flasken og ta av CBFHH løsning.
- Utgjør 50 ml av en enzymløsning 1,75 mg / ml trypsin, 20 pg / ml DNase II i CBFHH. Pipet 5 ml av denne enzymløsning og legge det til et rør som inneholder kjøttdeig ventrikkel vev og sted på en magnetrører. Omrør ved en konstant hastighet (340 rpm) ved romtemperatur i 8 min.
MERK: røring tiltak bør være forsiktig og likevel tillatefor suspensjonen av slurryen. - Fjern flasken fra røreplate og tillate slurryen å sedimentere i 3 min. Pipette og kast den første fordøye supernatanten, da det først og fremst inneholder blodceller og vev rusk.
- Pipet en andre 5 ml porsjon av enzym løsning og legge den til i fordøye ventrikkel. Rør for 8 min og la den sedimentere for en annen 3 min. Før start av fordøyer, fremstille to 50 ml rør (merket 1 og 2) hver inneholdende 12 ml iskald føtalt bovint serum (FBS). Plasser en 40 mikrometer celle sil på toppen hvert rør. Pipet denne supernatant gjennom filteret på røret en.
- Gjenta fordøyelsen ytterligere 8 ganger, vekslende plassering av spaltningen supernatanten mellom de to rør som inneholder FBS. Kapping av den siste overstående likt mellom rørene 1 og 2 for å sikre like volumer i hvert rør.
MERK: Hver oppsamlingsrøret vil nå inneholde 32,5 ml totalt volum av cellesuspensjon. - Sentrifuger rørene inneholdeing supernatanten 150 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
- Mens samle fordøyelsen porsjoner, forberede fem 100 mm vevskulturplater med 6 ml av media (Dulbeccos modifiserte Eagle Media (DMEM) med 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamin) per plate. Inkuber disse alikvoter ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 minutter for å ekvilibrere media.
- Aspirer CBFHH enzymblandingen og resuspender cellene inn i 30 ml kultur media fremstilt ovenfor, som kombinerer cellene fra begge samling rør.
- Returnere 6 ml cellesuspensjon til hver av de 100 mm plater og inkuberes i 45 min ved 37 ° C.
- Ved slutten av inkubasjonen, overfører de ikke-adherente celler til 5 nye retter og re-inkubert i 45 min (fibroblast fraksjonen vil ha begynt å følge de retter, og kan dyrkes separat om ønskelig).
- Ved slutten av den andre runden av pre-plating, samle media og ikke-adherente celler fra de retter og spinne media ved 150x g i 6 min.
- Trekke ut overflødig media for å bringe cellene til den omtrentlige ønskede konsentrasjon, (4,0 x 10 5 celler pr konstruere i 100 ul av perfusatet). Fjern en delmengde for telling og eller levedyktighet testing 14.
6. Bioreactor Recellularization av P3 Hjerte Matrix
- Forbehandle isolert hjertet matrise med dyrkningsmedier (se trinn 5.15) over natten før du legger cellene.
- Sett sammen elementene i et Langendorff-system som vist på fig. 2. Autoklaver glassdeler og etylenoksid sterilisere plastdeler for å sikre sterilitet. Forskjellige sub-enheter i systemet kan monteres i en laminær strømningshette før de ble montert på bærestativet. Sirkulerende vannbad og oppvarmet vannstrømningsbane er utelatt for klarhets skyld.
- Fyll montert system med 120 ml vev kultur media (se trinn 5.15).
- Plasser kateterisert hjertet matrisen fra trinn 2.14 i en 60 mm culture rett under forstørrelse og koble en 1 ml sprøyte med 22 G x 1 nål lastet med cellesuspensjonen fra trinn 5.20 til kateteret. Sørg for at denne sammenstillingen er fri for luftbobler å unngå embolisere hjertet.
- Forsiktig perfuse de 100 ul cellesuspensjon til hjertet matrise via koronararteriene. Når prosessen er ferdig, ta sprøyten / nål kombinasjon.
MERK: En langsom perfusjon av ca. 20 ul per minutt er nødvendig for å hindre at cellene fra å strømme ut av venene, transitt hjerte. - Med en 22g stump stump festet til Luer montering på undersiden av bioreaktoren hjerte glasset lokk, presse kateteret ut på stubben.
- Starte den peristaltiske pumpe og observerer at den går skjemaet som skissert i figur 2. Flyten fortsetter fra reservoaret via pumpen gjennom boblefelle for å kateteret plassert i aorta i trinn 2,5 (rød bane i fig. 2). Observere strømmen av hjertets sirkulasjon ut av venens og drypp fra apex, resirkulerende til media reservoaret.
MERK: perfusjon strømningshastighet er avhengig av individuelle faktorer som den vaskulære motstand av konstruksjonen, og størrelsen på hjertet, men en hastighet på 50 til 100 ul / min er et godt utgangspunkt. På mellom tidspunkter, kan funksjonelle vurderinger bli henrettet. Størrelsen omfanget av neonatal recellularized hjertet begrenser de vurderinger, som kan utføres, men vi har funnet ut at optisk baserte systemer kan brukes til å kvantifisere slo atferd akkurat som de har blitt brukt i voksen rottehjerter. 4 Konstruksjonen kan dynket for utvidet perioder (opptil 23 timer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization
I gjennomsnitt var på tide å decellularization av en P3 hjerte ved hjelp av denne protokollen er ca 14 timer. gitt en gjennomsnittlig hjertevekt på 23 mg for P3 nyfødte.
Acellularity
Figur 3a viser en fullt intakt P3 neonatal hjerte (hel mount). Figur 3b viser det samme hjerte følgende decellularization. Figurene 4a og 4b viser hematoxylin og eosin farging av intakte og decellularized hjerter, respektivt. Legg merke til fraværet av Hematoxylin positive kjerner og reduksjon av eosinofile strukturer i decellularized hjerte. I tillegg er DNA-innholdet i hjerte decellularized betydelig redusert fra 68,08 ± 2,25 ug i det intakte hjertet (n = 6) til 4,73 ± 2,27 ug i decellularized hjerte (n = 5).
Kollagen immunreaktivitet
Opprettholdelse av den ekstracellulære matriks (ECM) etter decellularization er avgjørende for å repopulation med eksogene celler og til funksjonaliteten av matrisen. For å evaluere innholdet av neonatal ECM i intakt og decellularized ECM, ble immunofarging for kollagen IV utføres. Figur 4c og d viser at kollagen IV er robust uttrykt i både intakte og decellularized hjerte og at lokaliseringen av dette proteinet opprettholdes følgende celle fjerning, mens DAPI positive kjerner er effektivt fjernet (figur 4e-h).
DNA innhold
Tilstedeværelsen av DNA blir brukt som en ytterligere indikasjon på cellularitet. I figur 5 er DNA påvist å være redusert med 93% i neonatal hjerter følgende vaskemiddel basert decellularization. Denne graden av reduksjon DNA er i overensstemmelse medrapporter i litteraturen med oppvaskmiddel, basert decellularization i andre vev 15-16.
Recellularization
Vi har utført immunhistokjemi for å bestemme ekspresjon av ulike cardiomyocyte markører i recellularized hjertet. Figur 6 illustrerer celler som har migrert inn i veggen i venstre ventrikkel (figur 6A og 6B). Figur 6C viser DAPI merking av recellularized hjerte. Figur 6D-G illustrerer celler som er positive for NKX 2,5, mCherry, α-actinin og DAPI, respektivt. NKX2.5 er kjent for å merke hjerte stamceller, mens α-actinin er en sarcomeric protein som markerer differensierte cardiomyocytes. Vi har observert et flertall av celler som uttrykker alle disse markører (rosa; fig 6H), noe som indikerer at disse cellene fortsetter å uttrykke markører ev cardiomyocyteno etter 23 dager med perfusjon.
Figur 1. Skjematisk av decellularization maskinvare. A. 60 cc sprøyte fat reservoar for vaskemiddel. B. Kateterenhet med vanning sprøyte så detaljert. C. Detalj av den tegnede PE rør kateterspissen. D. Decellularization kammer og septum med avløp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av hjertet bioreaktoren. 1. Fukting av carbogen gass (grønne linjer representerer gasstrømmen). 2. Peristaltisk pumpe stasjon for media perfusjon ogoksygenering (Lilla linjene representerer media strømmen gjennom oksygenator). 3. Tynn vegg oksygenator. 4. Sheet oksygenator og media reservoaret. 5. Preload kammer og boble felle. 6. Hjerte kammer (røde linjer representerer media strømmen til og fra hjertet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hele montering av P3 neonatale mus hjerte før (A) og etter decellularization (B). Denne hjertet decellularized ved hjelp av Langendorff-perfusjon fremgangsmåten som beskrevet i metode 2. Legg merke til at hjertet blir gjennomskinnelig og svakt forstørret følgende perfusjon (B) . Scale = 2mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Histologi av nativt og decellularized P3 neonatale mus hjerte. Kryostatsnitt (10 um) ble farget med H & E (A, B), kollagen IV (C, D, G, H) og DAPI (E, F, G, H ). Flettede bildene er representert på G og H. H & E farging viser et fravær av cellekjerner og cytoplasma i decellularized vev (B) sammenlignet med den opprinnelige hjerte (A). Mens Kollagen IV innholdet forblir følgende decellularization (D), DAPI farging (en markør for kjerner) blir opphevet. De fusjonerte bildene demonstrere colocalization av kollagen IV og DAPI i naive hjertet (G) og fravær av dette colocalization i decellularized hjerte (H). Disse data indikerer at celler uten lenger fylle kollagen matrise av hjertet. Scale = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Evaluering av DNA-innhold. Kontroll (n = 6) og decellularized (n = 5) hjerter analysert for DNA-innhold av pico-grønn-metoden. Kvantifisering uttrykt som ug DNA pr hjerte ± standardavvik. Stjerne indikerer p <0,01 sammenlignet med kontroll. Disse dataene indikerer at decellularization reduserer DNA innhold betydelig i P3 neonatal hjertet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
OAD / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
Figur 6. Histologi av P3 hjerte matrise 23 dager etter recellularization med P1 mCherry uttrykker cardiomyocytes. Farget med H & E (A, skala = 250 nm, B, skala = 50 mikrometer), DAPI (C, skala = 250 nm), NKX 2,5, mCherry, α-actinin, DAPI, og fusjonert (D, E, F, G, H, skala = 50 mikrometer). Vi har vist at effektiv repopulation av kollagenmatriksen med P1 kardiomyocytter (AC). I tillegg observerte vi at m-kirsebær positive cardiomyocytes uttrykke Nkx2.5 og a-actinin 23 dager etter innføring i kollagen matrise. Disse dataene indikerer at disse cellene opprettholde sin kardiomyocytt identitet i lengre perioder av gangen. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avhengigheten av denne teknikken ved gjentatte perfusjoner hjertets gjør unngåelse av en embolisme en kritisk komponent for et vellykket resultat. Fra den første kateterisering av hjertet i trinn 2,2-2,6, til endringer av oppløsning mellom trinnene 2.8-2.14, er det manipulasjoner som kan tillate innføring av luftbobler som forstyrrer strømningen av perfusatet til myokard. På grunn av den lille størrelsen på neonatal hjerte, kan selv små bobler i blodkar føre en teknisk infarktet, og dermed gjengi decellularization ufullstendig. I tillegg, i de senere vasketrinn, kan ufullstendig perfusjon resultere i vaskemiddelrester som negativt påvirker biokompatibilitet. Videre raske endringer i temperatur, for eksempel når du tar ut matrisen fra 4 ° C lagring som foreslått i trinn 2.14, bør iverksettes med forsiktighet, da dette kan også være en kilde til luftbobledannelse når oppløst gass beveger seg ut av løsningen med endringen i temperatur. Whøne fortsetter å recellularization, ekstra omsorg bør brukes, når du forbereder sprøyten med cellesuspensjonen, for å sikre tilførsel er boble gratis (trinn 6.4).
Det kan være nødvendig å manipulere detaljene av denne protokollen for å imøtekomme andre vev typer. Det finnes en rekke decellularization protokoller rapportert 4,9,11 som kunne gi veiledning. Det endelige målet (r) i alle decellularization protokollen bør omfatte opprettholdelse av ECM proteinstrukturen og relaterte biokjemi, og tilstrekkelig fjerning av naturlige cellulære komponenter som eksemplifisert ved residual DNA. I denne innstillingen, bruk av overdreven perfusjonstrykk fører til forstyrrelse av ECM ultrastructure, som kan visualiseres histologisk.
Størrelsen på P3 muse hjertet setter noen begrensninger på celle administrasjon i forhold til voksen vev. Mens voksne hjerter presentere en tykk nok ventrikkel vegg som gjør transmuralt injeksjon molna mulig celle levering modalitet er P3 hjerte liten nok til at en nål, hvis størrelse vil ikke lyserer en cellesuspensjon, gjør betydelig skade på hjertet. Perfusjon er et levedyktig levering strategi, men er avhengig av celler av en viss størrelse og form som skal leveres effektivt. Neonatal murine muskelceller fungere godt i denne forbindelse. Andre små sirkulære celler har også vist seg å tjene dette formålet 11. Størrelsen omfanget av disse hjerter utelukker bruk av konvensjonelle fysiologisk funksjonell analyse som trykk volum katetre. Andre tilnærminger basert på videoopptak kan ha for å bli vurdert.
Disse data understøtter muligheten for decellularization og recellularization av den neonatale mus hjerte. Tidligere undersøkelser har vist at bruken av voksne hjerter i den hensikt å decellularization / recellularization studier. Matrisene produsert fra disse voksne hjerter er blitt repopulated med neonatal cardiomyocytes 4 og menneskeliginduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) 17. I tilfelle av hiPSCs, oppviste de repopulated hjerter en reduksjon i pluripotency markører som Nanog, SOX2, og OCT4 og dannet muskel-lignende strukturer; alt tyder på modning. Den ekstracellulære signaler på ECM, men har vist seg å spille en avgjørende rolle i utviklingen av celler, vev og organer som førte oss til å forsøke å generere matriser fra vev som er kjent for å huse evne til reproduksjon. I våre studier, viser vi at recellularized hjerter likevel uttrykke cardiomyocyte markører, selv etter langvarig kultur. Disse data indikerer at, ved hjelp av nye matriser, kan kardiomyocytter opprettholdes i lengre tidsperioder uten å miste sin identitet som kardiomyocytter. Våre data støtter teknikk og gjennomførbarhet for decellularizing neonatal mus hjerte. Den neonatale matrisene har potensial for å gi nye konstrukter for repopulation undersøkelser så vel som for fremstilling av geler som har superior evne til reproduksjon. Ved hjelp av disse neonatal ECM, er vi nå ta opp overlegenhet av disse stillasene for å danne funksjonelle vev med en rekke celletyper, inkludert hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
