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Bioengineering

सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए प्रकाश की मध्यस्थता गठन और Hydrogels के patterning

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54462
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Abstract

chemistries क्लिक दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, और सेल संस्कृति सहित कई biomaterials अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए जांच की गई है। ऐसे photoinitiated thiol-ene और thiol-yne प्रतिक्रियाओं के रूप में विशेष रूप से प्रकाश की मध्यस्थता क्लिक प्रतिक्रियाओं में, सामग्री संपत्तियों पर spatiotemporal नियंत्रण बर्दाश्त और उपयोगकर्ता निर्देशित संपत्ति नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के साथ प्रणालियों के डिजाइन अनुमति देते हैं। निर्माण और हाइड्रोजेल आधारित सटीक प्रकाश और बहुमुखी प्रतिभा के इन thiol एक्स photoclick chemistries द्वारा की पेशकश द्वारा afforded का उपयोग कर biomaterials के संशोधन के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से परिभाषित, biomimetic microenvironments के भीतर कोशिकाओं की संस्कृति के लिए, बढ़ती रुचि के हैं। यहाँ, हम कोशिकाओं और बहुमुखी और मॉड्यूलर इमारत एक thiol-ene photoclick प्रतिक्रिया से polymerized ब्लॉकों का उपयोग हाइड्रोजेल matrices के भीतर जैव रासायनिक संकेतों के बाद photopatterning की photoencapsulation लिए विधियों का वर्णन। विशेष रूप से, एक दृष्टिकोण सह के लिए प्रस्तुत किया जाता हैallyloxycarbonyl से nstructing हाइड्रोजेल (alloc) -functionalized पेप्टाइड crosslinks और लटकन पेप्टाइड moieties और thiol-क्रियाशील पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) है कि तेजी से लिथियम acylphosphinate photoinitiator और लंबे तरंगदैर्ध्य पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश की cytocompatible खुराक की उपस्थिति में भाजन। सतही तकनीक photopatterning कल्पना और कहा वर्णित हैं पेप्टाइड्स की एकाग्रता यों की। इसके अतिरिक्त, तरीकों encapsulating कोशिकाओं के लिए स्थापित कर रहे हैं, विशेष रूप से मानव mesenchymal स्टेम सेल, और उनकी व्यवहार्यता और गतिविधि का निर्धारण। गठन और thiol-alloc हाइड्रोजेल की प्रारंभिक patterning यहाँ दिखाए जाते हैं, वहीं इन तकनीकों को मोटे तौर पर नमूनों substrates उत्पन्न करने के लिए अन्य प्रकाश और कट्टरपंथी-पहल की सामग्री सिस्टम (जैसे, thiol-norbornene, thiol-acrylate) के एक नंबर के लिए आवेदन किया जा सकता है।

Introduction

Chemistries क्लिक करें तेजी से, दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, और नियंत्रित सेल संस्कृति सहित कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए सामग्री के डिजाइन में इस्तेमाल कर रहे हैं उनके चयनात्मक, कुशल, और अक्सर cytocompatible reactivities के कारण। 1-3 Photoclick chemistries कि प्रकाश का उपयोग को गति प्रदान करने के लिए या प्रतिक्रियाओं आरंभ (जैसे, azide-alkyne, 4 thiol-ene, 5 और tetrazole-alkene 6) गठन या biomaterials के संशोधन के लिए विशेष रुचि के हैं। हल्के शर्तों और कब और का नियंत्रण है, जहां वे प्रकाश के साथ जगह लेने के लिए इन प्रतिक्रियाओं कोशिकाओं की उपस्थिति में biomaterial गुण के उपयोगकर्ता निर्देशित नियंत्रण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल। 7,8 विशेष रूप से बनाने के तहत तेजी दरों, thiol-ene photoclick chemistries इस्तेमाल किया गया है मजबूत यांत्रिक गुणों 5.9 के साथ और भी शामिल है, लेकिन सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के encapsulation के लिए हाइड्रोजेल आधारित biomaterials उत्पन्न करने के लिए कोईटी, मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSCs), fibroblasts, chondrocytes, और अग्नाशय कोशिकाओं, सेल संस्कृति और वितरण के लिए वादे के साथ करने के लिए सीमित है। 10,11 इसके अलावा, इन chemistries के प्रमुख पहलुओं को नकल करने के लिए जैव रासायनिक संकेतों के स्थानिक patterning के लिए इस्तेमाल किया गया है मूल निवासी सेल microenvironments और सहित आसंजन, भेदभाव, और आक्रमण उचित सेल मैट्रिक्स बातचीत, सुविधा। 3,12

प्रकाश के साथ thiol-ene हाइड्रोजेल युक्त cysteines (thiol) पेप्टाइड्स सामान्यतः cytocompatible अवस्था में तेज, photoinitiated polymerization के लिए acrylates या norbornenes ( 'एकदा') के साथ क्रियाशील पॉलिमर के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं। के निर्माण के लिए 13 इस उपकरण बॉक्स का विस्तार, हम स्थापित करने की मांग नई बहुमुखी और सुलभ इमारत ब्लॉक कि कम से कम सिंथेटिक प्रसंस्करण की आवश्यकता है या सिंथेटिक कोशिकी matrices के रूप में उनके व्यापक उपयोग की ओर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थे साथ हाइड्रोजेल गठन के लिए तरीकों।14 विशेष रूप से, पेप्टाइड्स allyloxycarbonyl साथ (alloc) संशोधित किया गया -protected lysines: लटकन के लिए एक, इंटीग्रिन बाध्यकारी समूहों गैर degradable या सेल सड़ सकने crosslinks के लिए कोशिका आसंजन [कश्मीर (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] या दो को बढ़ावा देने के लिए [कश्मीर ( alloc) RGKGRKGK (alloc) जी या के.के. (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) कश्मीर = Pep2Alloc क्रमश:]। इन दृश्यों के साथ, की स्थिति तेजी से प्रतिक्रिया (1-5 मिनट) चार भुजा thiol संशोधित पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (PEG4SH) लंबे तरंगदैर्ध्य पराबैंगनी प्रकाश (10 मेगावाट / 365 एनएम पर 2 सेमी) और cytocompatible खुराक का उपयोग कर के साथ के लिए स्थापित किए गए थे photoinitiator लिथियम फिनाइल-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (एलएपी)। जिसके परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल सप्ताह के लिए सेल संस्कृति शर्तों के तहत स्थिर थे। सेल संचालित गिरावट और remodeling सक्षम करने के लिए एक enzymatically-cleavable पेप्टाइड जेल crosslinks (यानी, GPQGIWGQ), 15 और एक मॉडल के प्राथमिक सेल, मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSCs) के भीतर शामिल किया गया था, encapsulation और ड्यूरिन के बाद अत्यधिक व्यवहार्य बनेइन matrices के भीतर छ संस्कृति। इसके अलावा, पेप्टाइड्स स्थानिक इन सामग्रियों के भीतर नमूनों की है, और hMSCs व्यवहार्य और photopatterning की शर्तों के तहत पाचन सक्रिय रहते हैं। वैकल्पिक लटकन पेप्टाइड दृश्यों, नहीं यहाँ दिखाया गया है (जैसे, IKVAV, YIGSR, GFOGER, आदि), भी matrices के भीतर आसपास के microenvironment के साथ अतिरिक्त सेल बातचीत की जांच के लिए शामिल किया जा सकता है। इन परिणामों के सेल प्रकार की एक किस्म के लिए तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति और प्रसव के लिए इन हाइड्रोजेल आधारित सामग्री के आवेदन के अध्ययन करने के लिए और प्रत्यक्ष सेल मैट्रिक्स बातचीत के लिए वादा कर रहे हैं।

इस के साथ साथ, विधियों कोशिकाओं photoencapsulate करने और प्रस्तावित हाइड्रोजेल प्रणाली के भीतर बाद में photopattern जैव रासायनिक संकेतों (चित्रा 1) प्रस्तुत कर रहे हैं। निरीक्षण और भी इन photopatterns यों के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं: विशेष रूप से, मैं) Ellman की परख की मात्रात्मक और गुणात्मक उपयोग modifica निर्धारित करने के लिएनमूनों substrates और द्वितीय) फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स (AF488Pep1Alloc) का पूरक गुणात्मक उपयोग के भीतर मुक्त thiols की tion तीन आयामों में इन नमूनों का निरीक्षण करने के लिए। इसके अलावा, assays व्यवहार्यता (लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity धुंधला) और चयापचय गतिविधि का निर्धारण करने के लिए (एमटीएस; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -5 (3-carboxymethoxyphenyl) -2 (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) प्रस्तुत कर रहे हैं, ताकि उपयोगकर्ताओं हाइड्रोजेल matrices के भीतर अलग-अलग सेल लाइनों के लिए photoencapsulation और photopatterning की स्थिति के cytocompatibility निर्धारित कर सकते हैं। प्रोटोकॉल एक सतही प्रकाश आधारित photoclick हाइड्रोजेल प्रणाली के लिए प्रदर्शन किया है, जबकि तकनीक कोशिकाओं की उपस्थिति में photoencapsulation और photopatterning के लिए कई अन्य मौलिक-शुरू हाइड्रोजेल सिस्टम को लागू किया जा सकता है।

Protocol

हाइड्रोजेल गठन के लिए सामग्री की 1. तैयारी

  1. मानक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS) अंत समूह संशोधन (PEG4SH) के लिए तकनीक और thiol-क्रियाशील बहुलक तीन कदम प्रक्रिया द्वारा लटकन (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) और crosslinking पेप्टाइड्स (Pep2Alloc) synthesize। 14,16 वैकल्पिक रूप से, PEG4SH खरीद (एम n ~ 20 केडीए), Pep1Alloc, और Pep2Alloc व्यावसायिक रूप से।
  2. दो कदम प्रतिक्रिया नीचे वर्णित द्वारा photoinitiator (एलएपी) synthesize। 14,17 एक धूआं हुड में संश्लेषण चरणों का प्रदर्शन (1.2.1-1.2.11) और जब रसायन से निपटने का उपयोग सावधानी (सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और धूप का चश्मा पहनते हैं) । एलएपी भी व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है।
    1. ओवन में सूखी सभी कांच के बने पदार्थ (> 2 घंटा, 80 डिग्री सेल्सियस)।
    2. एक खाली एकल गर्दन दौर नीचे कुप्पी (100 मिलीलीटर) और एक पट के साथ कवर करने के लिए एक हलचल बार जोड़ें।
    3. एक अंगूठी स्टैंड और क्लैंप के साथ एक चुंबकीय सरगर्मी गर्म थाली के शीर्ष पर कुप्पी सुरक्षित।
    4. मैंएक सुई (18 जी) के माध्यम से पट nsert और बाहरी वातावरण के अंत करने के लिए खुला छोड़ दें। एक दूसरा एक निष्क्रिय गैस लाइन से जुड़ी सुई डालें। अक्रिय गैस लाइन (जैसे, आर्गन या नाइट्रोजन) खोलें और 10-15 मिनट के लिए कुप्पी शुद्ध करना।
      नोट: सिस्टम लगातार अक्रिय गैस, आर्गन या नाइट्रोजन के साथ प्रायश्चित किया जाएगा प्रतिक्रिया भर में।
    5. स्थानांतरण 1.5 ग्राम (~ 1.4 एमएल) डाइमिथाइल phenylphosphonite (चेतावनी) फ्लास्क, सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग पट के माध्यम से बेध। हलचल प्लेट (मध्यम गति) को चालू करें और सावधान रहना है कि सामग्री कुप्पी के पक्षों पर छप नहीं करते हैं।
    6. 1.6 ग्राम (~ 1.46 एमएल) 2,4,6-trimethylbenzoyl क्लोराइड (चेतावनी) dropwise कुप्पी युक्त डाइमिथाइल phenylphosphonite को जोड़ें, एक सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग पट पियर्स।
    7. पन्नी के साथ प्रतिक्रिया पोत कवर प्रकाश से बचाने और आर्गन या नाइट्रोजन के तहत 18 घंटे के लिए हलचल।
    8. अगले दिन, कुप्पी की ऊंचाई, एक उठाने के दोषी पर एक तेल स्नान जगह है,ध्यान से तेल स्नान में कुप्पी कम एन डी। जबकि चुंबकीय सरगर्मी को बनाए रखने के 50 डिग्री सेल्सियस के लिए स्नान और कुप्पी हीट।
    9. 2-butanone के 50 मिलीलीटर में 3.05 जी लिथियम ब्रोमाइड भंग। तेल स्नान से बाहर कुप्पी उठाएँ और दौर नीचे कुप्पी के लिए लिथियम ब्रोमाइड समाधान जोड़ने, संक्षेप में पट कुप्पी में डालना हटाने।
      1. पट के साथ फिर से कुप्पी मुहर (चेतावनी: पट अभी भी एक सुई आर्गन लाइनों और बाहर निकलने के लिए एक सुई के लिए अग्रणी होगा), फ्लास्क गर्म तेल स्नान में पीठ के निचले हिस्से, और प्रतिक्रिया 10 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं। एक ठोस वेग बनेगी।
    10. 10 मिनट के बाद बंद कर देते हैं आर्गन, गर्मी से फ्लास्क को हटाने, और मिश्रण 4 घंटा (प्रकाश से बचाने के लिए एक के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील सर्जक उत्पादन किया गया है पन्नी के साथ कवर के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं। वेंट सुई जगह रखें।
    11. एक गिलास मिलाना कीप में उत्पाद डालो या उपयुक्त फिल्टर पेपर के साथ लाइन में खड़ा फ़नल हो। कुल्ला छानना 3 आर 2-butanone के 50 मिलीलीटर के साथ बारकिसी भी unreacted लिथियम ब्रोमाइड निकालें।
    12. सूखी (प्रथम benchtop पर और फिर निर्वात desiccator में) और डी ओ 2 में 1 एच एनएमआर द्वारा उत्पाद का विश्लेषण 1.8-1.9 (6H, एस), 2.1-2.2 (3H, एस), 6.7-6.8 (2H, एस), 7.3-7.4 (2H, मी), 7.4-7.5 (1H, मी), और 7.5 में विशेषता चोटियों -7.7 (2H, मी)। 14,17
  3. मात्रा और प्रत्येक शेयर समाधान (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, एलएपी) कि हाइड्रोजेल (तालिका 1) बनाने के लिए तैयार रहना चाहिए की एकाग्रता की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट का प्रयोग करें। गैर नमूनों जैल बनाने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि [एसएच] = [alloc] ताकि सभी प्रतिक्रियाशील समूहों polymerization के दौरान खपत होती है। जैल के photopatterning की योजना बनाई है, तो एक अतिरिक्त thiol कार्य समूहों की जेल गठन के दौरान stoichiometry के आधार पर (जैसे, 0.2-5 मिमी, [एसएच]> [alloc]) Pep1Alloc के साथ बाद में प्रतिक्रिया के लिए राशि शामिल है।
    नोट: जैल अधिक से अधिक से अधिक 5 प्रतिशत वजन (% WT) PEG4SH शामिल करना चाहिए तेजी से polymerization (5 मिनट के भीतर) सुनिश्चित करने के लिए। हालांकि, कम भार% रेंजयदि आवेदन कम moduli (जैसे, <0.5 किलो पास्कल) के साथ हाइड्रोजेल लिए कहता है रों का पता लगाया जा सकता है; polymerization की जाँच की और इन कम भार% रचनाओं के लिए तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। इसी तरह, Pep1Alloc एकाग्रता विभिन्न अनुप्रयोगों (जैसे, 0.2-5 मिमी) के रूप में thiol-क्रियाशील पेप्टाइड्स के लिए साहित्य में सूचना के लिए समायोजित किया जा सकता है। 18-21 एलएपी एकाग्रता के आसपास 0.067% wt (2.2 मिमी) या कम है, के रूप में वर्णित है, के रूप में सिफारिश की है उच्च सांद्रता सेल व्यवहार्यता कम कर सकते हैं।
  4. तालिका 1 में गणना के आधार पर सेल संस्कृति के लिए बाँझ शर्तों के तहत Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH, और एलएपी के शेयर समाधान तैयार करें।
    1. Pep1Alloc और Pep2Alloc के लिए, व्यक्तिगत रूप से पेप्टाइड संश्लेषण से Pep1Alloc और Pep2Alloc के कुल द्रव्यमान का वजन और बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी एस) और 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल fungizone (FZ) में भंग। तैयार स्टॉक समाधान रेंज की विशिष्ट सांद्रतापेप्टाइड की 20-100 मिलीग्राम / मिलीलीटर से। इन शेयरों मिक्स -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक नरम ऊतक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक अंतिम moduli (यंग मापांक ~ 0.5-5 केपीए) के साथ जैल। 22,23 अशेष और दुकान प्राप्त करने के लिए।
    2. PEG4SH के लिए, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में PEG4SH वजन और पीबीएस + पुनश्च + FZ में भंग। 250-430 मिलीग्राम / मिलीलीटर से इस शेयर समाधान रेंज की विशिष्ट सांद्रता (वजन से 20-30% PEG4SH)।
    3. गोद लिए, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में एलएपी वजन और 7.5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस + पुनश्च + FZ में भंग।
      नोट: PEG4SH और गोद के ताजा समाधान तैयार कर रहा है हर encapsulation या जेल के प्रयोग लगातार polymerization बार यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है।
  5. Hydrogels बनाने के लिए बाँझ सिरिंज टिप Molds तैयार करें।
    1. ध्यान से एक रेजर ब्लेड का उपयोग 1 मिलीलीटर सीरिंज के बंद सुझावों में कटौती और बाद में सिरिंज शाफ्ट से plungers को हटा दें।
    2. 15 मिनट के एक सिरिंज के लिए शाफ्ट और 70% इथेनॉल में plungers डूबएक बाँझ सेल संस्कृति हुड में डी सूखी जगह (30 मिनट)। इथेनॉल से अधिक बूँदें सिरिंज शाफ्ट के अंदर रहते हैं, उन्हें बाहर धक्का सवार का उपयोग करें।
  6. बाँझ कांच Hydrogels बनाने के लिए स्लाइड Molds तैयार करें।
    1. सोख गिलास स्लाइड (2 के गुणकों) और रबर गास्केट, 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में (0.254 मिमी मोटी 2 छोटे shims के रूप में इस्तेमाल टुकड़े, डिस्क के साथ एक आयत बाहर मुक्का मारा, या वर्ग फ्रेम आकार), और बाँझ सेल संस्कृति हुड में जगह सुखाना।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार विरोधी चिपकने वाली कोटिंग के साथ निष्फल स्लाइड के कोट आधा स्लाइड सतह (जैसे, अगर वहाँ 4 स्लाइड कर रहे हैं, 2 स्लाइड विरोधी चिपकने के साथ लेपित किया जाएगा) के लिए जेल के शीर्ष के आसंजन को रोकने के लिए। इन गिलास स्लाइड मोल्ड के शीर्ष के रूप में काम करेगा।
  7. सिरिंज या गिलास स्लाइड के लिए नए नए साँचे दीपक जांचना।
    नोट: इन प्रयोगों के लिए, एक बाहरी फिल्टर एडाप्टर विधानसभा और 365 एनएम बाहरी फिल्टर के साथ एक पारा चाप दीपक इस्तेमाल किया गया था। अन्य दीपककि लंबे तरंगदैर्ध्य पराबैंगनी प्रकाश की उचित तीव्रता का उत्पादन के रूप में दूसरों के द्वारा सूचना दी इस्तेमाल किया जा सकता है। 24-27
    1. सभी नमूनों भर में अपेक्षाकृत भी प्रकाश की तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए तरल भरा प्रकाश गाइड के अंत के लिए एक collimating लेंस संलग्न। जरूरत के रूप में, एक स्थान आकार है कि ब्याज के नमूने को कवर किया जाएगा प्राप्त करने के लिए नमूना (एस) से प्रकाश गाइड की दूरी समायोजित करें।
    2. (ऊर्ध्वाधर स्थिति में सिरिंज ढालना धारण करने के लिए) एक microcentrifuge ट्यूब धारक में कटौती सिरिंज ढालना रखें। जहां नमूने आयोजित किया जाएगा सिरिंज टिप की ऊंचाई पर रेडियोमीटर पकड़ो और 365 एनएम पर 10 मेगावाट / 2 सेमी की एक प्रकाश की तीव्रता को प्राप्त करने के शटर (% खुला) समायोजित करें। बाद में उपयोग के लिए समायोजित सेटिंग्स रिकॉर्ड।
    3. एक बाँझ सतह के शीर्ष पर एक गिलास स्लाइड ढालना की जगह (जैसे, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर एक विंदुक टिप बॉक्स के ऊपर)। गिलास स्लाइड ढालना की ऊंचाई पर रेडियोमीटर डिटेक्टर पकड़ो और 10 मीटर का एक प्रकाश की तीव्रता को प्राप्त करने के शटर (% खुला) को समायोजितडब्ल्यू / 365 एनएम पर 2 सेमी। बाद में उपयोग के लिए समायोजित सेटिंग्स रिकॉर्ड।

2. हाइड्रोजेल गठन और Photopatterning

  1. गैर नमूनों Hydrogels की तैयारी।
    नोट: प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, यदि हाइड्रोजेल सेल संस्कृति अनुप्रयोगों में इस्तेमाल हो रहे हैं, बाद के सभी चरणों बाँझ शर्तों के तहत एक बाँझ कैबिनेट या हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    1. स्प्रेडशीट गणना (तालिका देखें 1 उदाहरण) के अनुसार PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, गोद, और पीबीएस + पुनश्च + FZ के शेयर समाधान मिक्स। जिसके परिणामस्वरूप जेल अग्रदूत समाधान सख्ती पिपेट भी समाधान का मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
    2. एक बाँझ, कट सिरिंज की नोक में जेल अग्रदूत समाधान (खूंटी / पेप / गोद / पीबीएस) के 10-20 μl pipetting द्वारा मोटी हाइड्रोजेल सिरिंज सुझावों में ढाला तैयार करें। सिरिंज प्रति एक जेल बनाने, लगभग 0.5-1.5 मिमी मोटी मात्रा और सिरिंज व्यास पर आधारित है।
      नोट: बड़ी मात्रा का पता लगाया जा सकता है के आधार परवांछित जेल आकार जहां ऊपरी सीमा के दौरान Pep1Alloc के लिए diffusional सीमाओं के आधार पर मौजूद हो सकता है photopatterning और / या पोषक तत्वों / सेल संस्कृति के दौरान समझाया कोशिकाओं से / करने के लिए खर्च करता है।
    3. रबर गैसकेट (0.254 मिमी मोटी) गैर-लेपित गिलास स्लाइड के किनारों के आसपास रखकर कांच स्लाइड नए नए साँचे में पतली हाइड्रोजेल तैयार करें। पिपेट 5-10 μl जेल अग्रदूत समाधान गैर लेपित गिलास स्लाइड पर (एकल या एकाधिक 5-10 μl जैल एक एकल स्लाइड पर समाधान के लिए एक या अधिक डॉट्स pipetting द्वारा बनाया जा सकता है) और गिलास स्लाइड विरोधी चिपकने के साथ लेपित जगह जेल समाधान के शीर्ष पर (बड़ा जैल, गिलास स्लाइड के आकार पर निर्भर है, अंतिम आवेदन के आधार पर बनाया जा सकता है)। स्थिर करने के लिए छोटे बांधने की मशीन क्लिप के साथ कांच स्लाइड सुरक्षित।
    4. दीपक के तहत जगह नए नए साँचे और दीपक तीव्रता सेट (जैसे,% शटर खुला) चरण 1.7.2 में माप के आधार पर सिरिंज टिप molds या गिलास स्लाइड molds के लिए जेल की सतह पर 10 मेगावाट / 2 सेमी प्राप्त करने के लिए और1.7.3, क्रमशः।
    5. 1 से 5 मिनट के लिए प्रकाश लागू जैल की पूरी polymerization की अनुमति है। उच्च PEG4SH सामग्री (8 भार% या अधिक से अधिक, 1 मिनट) और लंबे समय तक कम PEG4SH सामग्री (5-8 भार%, 3-5 मिनट) के साथ जैल के लिए के साथ जैल के लिए एक छोटा polymerization के समय का उपयोग भीतर moduli के साथ पूरी तरह से polymerized हाइड्रोजेल उत्पादन करने के लिए मुलायम ऊतकों की रेंज (0.5-5 केपीए)।
    6. एक बाँझ गैर इलाज 48 अच्छी तरह से थाली में सिरिंज टिप नए नए साँचे से जगह जैल, और एक बाँझ डिश में रखें गिलास स्लाइड।
    7. सेल संस्कृति के माध्यम से या उचित बफर के साथ 3 एक्स 15 मिनट कुल्ला (जैसे, पीबीएस + पुनश्च + FZ, Ellman की प्रतिक्रिया बफर), की योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर नीचे के रूप में विस्तृत जानकारी दी।
  2. नमूनों Hydrogels की तैयारी।
    1. स्प्रेडशीट गणना के अनुसार PEG4SH, Pep2Alloc, गोद, और पीबीएस + पुनश्च + FZ के शेयर समाधान मिक्स, Pep1Alloc के साथ बाद में प्रतिक्रिया के लिए मुफ्त thiols (0.2-5 मिमी) को छोड़कर। अग्रदूत समाधान सख्ती पिपेट भी समाधान का मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
    2. मोटी और पतली हाइड्रोजेल के रूप में 2.1.6 के लिए कदम 2.1.2 में बाहर रखी तैयार करें।
      नोट: photopatterning करने से पहले मध्यम विकास में जैल जगह नहीं है। फ्री thiols मध्यम विकास में प्रजातियों से भस्म हो सकता है (जैसे, thiol युक्त प्रोटीन के साथ डाइसल्फ़ाइड गठन) और अतिरिक्त संसाधन कदम के बिना जेल की patterning अनुमति नहीं दी जाएगी (जैसे, डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी)।
    3. Pep1Alloc का समाधान तैयार (अंतिम एकाग्रता ~ 3-20 मिलीग्राम / एमएल) और 2.2 मिमी गोद।
    4. कवर Pep1Alloc / गोद समाधान के साथ पूर्व गठित जैल और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. अतिरिक्त Pep1Alloc / गोद समाधान निकालें। जैल एक सिरिंज टिप में ढाला रहे थे, तो ध्यान से 48 अच्छी तरह से थाली है जिसमें वे patterning के लिए एक बाँझ गिलास स्लाइड के लिए incubating रहे हैं से जैल हस्तांतरण करने के लिए एक रंग का उपयोग करें।
    6. syringe- और गिलास स्लाइड-ढाला जैल के शीर्ष पर वांछित पैटर्न के साथ सीधे एक photomask रखें। सुनिश्चित करें कि नकाब के मुद्रित हिस्सा इष्टतम Patt के लिए जेल से छूERN निष्ठा (यानी, मुखौटा सही पढ़ा और पायस नीचे की ओर होना चाहिए)। दीपक के तहत प्लेस के नमूने और गिलास स्लाइड (कदम 1.7.3) के लिए इस्तेमाल दीपक सेटिंग्स के साथ 1 मिनट के लिए चमकाना।
    7. patterning के बाद, जगह एक बाँझ, 48 अच्छी तरह से गैर टिशू कल्चर इलाज थाली में सिरिंज-ढाला जैल, और जगह कांच स्लाइड-ढाला जैल कि एक बाँझ डिश में कांच स्लाइड का पालन किया जाता है।
    8. सेल संस्कृति के माध्यम से या उचित बफर के साथ 3 एक्स 15 मिनट कुल्ला (जैसे, पीबीएस + पुनश्च + FZ, Ellman की प्रतिक्रिया बफर) की योजना बनाई प्रयोगों पर आधारित है।

3. visualizing और Photopatterning की मात्रा

  1. Ellman की परख Photopatterned Hydrogels में यों फ्री thiols का पता लगाने और करने के लिए।
    1. Ellman की प्रतिक्रिया बफर, सिस्टीन काम समाधान, मानकों, और नीचे के रूप में वर्णित Ellman अभिकर्मक तैयार करें।
      1. Ellman की प्रतिक्रिया बफर के लिए, भंग 2.4 ग्राम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय (ना 2 HPO4) और 74.4 मिलीग्राम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) 200 मिलीलीटर Dih 2 ओ (0.1 एम ना 2 HPO 4, 1 मिमी EDTA) में। सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) या फॉस्फोरिक एसिड (एच 3 4 पीओ) के समाधान के साथ 7.5-8 पीएच को समायोजित करें।
      2. Cysteine ​​काम समाधान के लिए, 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया बफर (2 मिमी सिस्टीन) में 5.27 मिलीग्राम सिस्टीन भंग।
      3. Cysteine ​​मानकों के लिए, 2, 1.5, 1.25, 1, 0.75, 0.5, 0.25, और 0 मिमी सिस्टीन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रतिक्रिया बफर में सिस्टीन काम समाधान पतला।
      4. Ellman अभिकर्मक के लिए, 1 मिलीलीटर प्रतिक्रिया बफर में 4 मिलीग्राम Ellman अभिकर्मक भंग। Sonicate पूरी तरह से Ellman अभिकर्मक भंग करने के लिए।
    2. Ellman की परख (चित्रा 2) के साथ जैल में मुफ्त thiols की एकाग्रता यों।
      नोट: 'पतली' 5 μl हाइड्रोजेल, कांच स्लाइड्स के बीच ढाला, नीचे प्रक्रिया में वर्णित हैं और Ellman अभिकर्मक टी का तेजी से प्रसार के लिए अनुमति देने की सिफारिश कीजेल hrough (यानी, यह अभिकर्मक मोटी जैल के माध्यम से फैलाना एक लंबे समय लेता है)।
      1. 'पतली' 5 μl जैल (वी एस) बड़ा अनुपात के आधार पर सूजन की सूजन जेल मात्रा का निर्धारण, अतारांकित
        1. तीन 20 μl 'मोटी' सिरिंज का उपयोग कर नए नए साँचे जैल बनाओ। 24 घंटे के लिए और बाद में Ellman की प्रतिक्रिया बफर में जगह जैल (संतुलन सूजन जन, एम एस) वजन। जैल Lyophilize और बाद में तौलना (शुष्क जन, एम डी)।
        2. मोटी जैल के लिए मापा जनता का प्रयोग, बड़ा क्यू द्वारा अनुपात 28 सूजन की गणना = 1 + ρ बहुलक / ρ विलायक (एम एस / एम डी -1) जहां ρ बहुलक = 1.07 ग्राम / 3 सेमी खूंटी के लिए, 29 ρ विलायक = 1.0 ग्राम / 3 सेमी पीबीएस / एच 2 ओ के लिए
        3. गणना जेल की सैद्धांतिक शुष्क जन Ellman की परख (यहाँ के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, 5 μl 'पतली' जैल यू आम तौर पर कर रहे हैंएसईडी), व्यक्तिगत घटकों की जनता PEG4SH, Pep1Alloc, और Pep2Alloc (एम डी = एम PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc) संक्षेप द्वारा। उदाहरण के लिए, एक 5 μl 10% wt PEG4SH युक्त जेल 0.005 सेमी 3 एक्स 1.07 ग्राम / 3 सेमी x 0.10 के रूप में एम PEG4SH द्वारा गणना लगभग 0.000535 जी खूंटी शामिल =। Pep1Alloc और Pep2Alloc जनता (मूल्यों के लिए स्प्रेडशीट देखें) एक समान तरीके से समाधान में भार% के आधार पर गणना की जा सकती है, ρ ≈ 1.0 ग्राम / सेमी इन जलीय समाधान के लिए 3 संभालने।
          नोट: जैल भी सूखे और बजाय सैद्धांतिक शुष्क जन गणना के तौला जा सकता है। हालांकि, यह लगातार पतली, 5 μl जैल के शुष्क जन को मापने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
        4. भविष्यवाणी शुष्क जन और 'मोटी' जैल, (कदम 3.1.2.1.1 में समीकरण) 'पतली' जेल के लिए भविष्यवाणी की सूजन जन एम एस की गणना से निर्धारित क्यू मूल्य के आधार पर। मान लें कि ρ ≈ 1.0 ग्राम / सेमी एस ≈ वी एस। मात्रात्मक Ellman की परख करने के लिए इस गणना वी एस का प्रयोग करें।
          नोट: उपरोक्त विधि का निर्धारण करने के लिए 'पतली' 5 μl जैल के रूप में सूजन जैल के लिए वी एस सिफारिश की है वजन के लिए स्थानांतरण करने के लिए मुश्किल हो जाता है।
      2. patterning के लिए पतली हाइड्रोजेल फार्म खंड 2.2 (5 μl मात्रा) में वर्णित है। विशेष रूप से, अतिरिक्त मुक्त thiols के साथ जैल और एक स्पष्ट coverslip का उपयोग कर प्रकाश के साथ पूरे जेल को बेनकाब करने के लिए बाढ़ Pep1Alloc के साथ इन नमूनों की 'पैटर्न' आधे बनाने के लिए (जैसे, अतिरिक्त thiol के साथ 6 कुल जैल: 3 असंशोधित गैर'patterned 'और 3' नमूनों ')।
        नोट: इस परख के लिए, 'नमूनों' जैल एक photomask बिना प्रकाश के संपर्क में बाढ़ रहे हैं। इस विधि मुक्त thiols पूरे जेल नमूना में सेवन की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए और कैसे प्रदर्शित करने कुशलता से मुक्त thiols पेप्टाइड के साथ संशोधित किया जा सकता है प्रयोग किया जाता है। इस जानकारी से,मुक्त thiols एक photomask साथ patterning के दौरान खपत की संख्या जेल मोटाई और पैटर्न क्षेत्र (प्रकाश के संपर्क में) क्षेत्रों के आधार पर भविष्यवाणी की जा सकती है।
      3. प्लेस 'नमूनों' और एक 48 अच्छी तरह से थाली के कुओं में जैल गैर'patterned 'और कुल्ला Ellman की प्रतिक्रिया बफर के साथ 3 एक्स 15 मिनट जेल और संतुलन के लिए होते हैं सूजन से बाहर unreacted प्रजाति के प्रसार की अनुमति है।
      4. Rinsed जैल करने के लिए अतिरिक्त Ellman की प्रतिक्रिया बफर जोड़ें ताकि वी प्रतिक्रिया के साथ बफर 20 μl की एक बहु है। उदाहरण के लिए, यदि भविष्यवाणी वी एस 15 μl है, 5 μl प्रतिक्रिया बफर (20 μl) जोड़ने के लिए, और अगर भविष्यवाणी वी एस 30 μl है, 10 μl प्रतिक्रिया बफर (40 μl) जोड़ें।
      5. पिछले चरण (यानी, पिछले चरण वी एस था + अतिरिक्त प्रतिक्रिया बी में इस्तेमाल की मात्रा के आधार पर 20 μl के गुणकों में एक 96 अच्छी तरह से थाली की अलग-अलग कुओं में सिस्टीन मानकों (युक्त नहीं जैल) पिपेटuffer = 40 μl, व्यक्तिगत खाली कुओं के लिए प्रत्येक स्तर के 40 μl) जोड़ें।
      6. प्रतिक्रिया बफर (; जैसे, 20 μl या कदम 3.1.2.5 में 40 μl के लिए 367.2 μl के लिए 183.6 180 μl प्रतिक्रिया बफर + 3.6 μl Ellman अभिकर्मक के गुणकों) में Ellman अभिकर्मक पतला।
      7. मानकों और नमूने युक्त कुओं को पतला Ellman अभिकर्मक जोड़ें। 20 μl नमूने के लिए, एक अच्छी तरह से 183.6 μl समाधान जोड़ें। 40 μl नमूने लिए पतला Ellman के अभिकर्मक की डबल इस राशि (या पैमाने के हिसाब से नमूने के आकार के आधार पर)।
      8. सेते हैं या 1 घंटा और (कमरे के तापमान पर) 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर जगह या पीले रंग की 2-नाइट्रो-5-thiobenzoate dianion की पर्याप्त प्रसार सुनिश्चित करने के लिए जब तक समाधान के रंग दृश्य निरीक्षण द्वारा जैल के रंग से मेल खाता (TNB 2-) है, जो जेल से मुक्त thiols साथ Ellman के अभिकर्मक की प्रतिक्रिया पर उत्पन्न होता है।
      9. नमूने और एस से समाधान के 100 μl ले लोtandards और एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में जगह है।
      10. एक प्लेट रीडर पर 405 एनएम पर absorbance पढ़ें।
      11. डेटा की प्रक्रिया करने के लिए, मानक वक्र (कदम 3.1.1.3 से नमूने) (absorbance एकाग्रता बनाम) प्लॉट और एक रेखीय समारोह फिट बैठते हैं। रैखिक समारोह, 'पतला जेल' समाधान (जेल + प्रतिक्रिया बफर) में नि: शुल्क thiols की एकाग्रता का उपयोग absorbance रीडिंग के आधार पर गणना की जा सकती है। अंत में, खाते में प्रतिक्रिया बफर के साथ 'कमजोर पड़ने' ले रही है, प्रतिक्रिया बफर बिना जैल में मुक्त thiol एकाग्रता का निर्धारण। (जैसे, यदि 15 μl जेल 5 μl प्रतिक्रिया बफर के साथ पतला था, 20/15 से गुणा)।
    3. Ellman के अभिकर्मक (चित्रा 3) के साथ photopatterns के दृश्य।
      1. पतली हाइड्रोजेल 1 घंटे के लिए Ellman की प्रतिक्रिया बफर में Pep1Alloc साथ नमूनों लेना।
      2. धीरे एक ऊतक के साथ हाइड्रोजेल के किनारों के आसपास पोंछते द्वारा अतिरिक्त प्रतिक्रिया बफर निकालें।
      3. सीधे जेल की सतह पर पिपेट Ellman अभिकर्मक। इसके तत्काल बाद एक रंग कैमरा के साथ 10X में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप या stereomicroscope पर छवि।
        नोट: जैल तुरंत imaged किया जाना चाहिए, क्योंकि दृश्य पैटर्न पीले TNB 2- आयन जेल भर diffuses गैर नमूनों क्षेत्र में thiols के साथ प्रतिक्रिया पर Ellman अभिकर्मक की दरार द्वारा उत्पादित के रूप में 5 मिनट के भीतर नष्ट करना होगा। गैर नमूनों क्षेत्रों थोड़े बल से नग्न आंखों के लिए पीले रंग दिखाई देते हैं; बेहतर संकल्प और छोटे पैटर्न, बढ़ाई (जैसे, एक माइक्रोस्कोप का उपयोग) के लिए आवश्यक है।
  2. फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स के साथ Photopatterns (चित्रा 3 बी) के दृश्य।
    1. उच्च संकल्प के साथ या तीन आयामों में पैटर्न visualizing के लिए, 2.2 चरण में जैल के लिए एक AF488 संशोधित Pep1Alloc (या इसी तरह फ्लोरोसेंट पेप्टाइड) photopattern।
    2. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर छवि। एक confocal खुर्दबीन यहां इस्तेमाल किया जा सकता लेने के लिए Z-Stजेल इतना है कि पैटर्न y- एक्स में मनाया जा सकता है, के एसीके छवियों, और जेड विमानों।
      नोट: प्रतिदीप्ति साथ, जैल प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए AF488 fluorophore और अधिकतम प्रतिदीप्ति की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए। जैल के बाद से फ्लोरोसेंट पेप्टाइड काफी स्थिर है अगर (एक कंटेनर 4 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी में लपेटा में स्टोर) प्रकाश से सुरक्षित तुरंत imaged किया जा करने की जरूरत नहीं है।

4. hydrogels और Photopatterning में सेल encapsulation

  1. संग्रह और encapsulation के लिए कक्षों की तैयारी।
    1. मानक बाँझ स्तनधारी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं के बाद, trypsinize और प्लेटों से ब्याज की कोशिकाओं को इकट्ठा। मध्यम विकास के साथ trypsin बुझाना टुकड़ी होता है के बाद (जैसे, एक टी -75 फ्लास्क, 5 मिलीलीटर trypsin के लिए, 5 मिलीलीटर माध्यम के साथ बुझाना, कुल 15 मिलीलीटर के लिए 5 मिलीलीटर मध्यम के साथ थाली कुल्ला)।
      नोट: trypsinization बार प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं, लेकिन आम तौर पर 5 और 15 मिनट के बीच होते हैं। वैकल्पिक सेल detachmenटी एजेंट (जैसे, Versene) अगर वांछित कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. कोशिकाओं की गणना एक hemocytometer या अन्य सेल गिनती डिवाइस का उपयोग करते समय थोक सेल निलंबन (90-110 XG, 5 मिनट) centrifuging trypsinized सेल निलंबन की aliquots से (100 की एक न्यूनतम या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार)। पीबीएस की एक न्यूनतम मात्रा या मध्यम विकास और पुन: गिनती में centrifugation के बाद सेल गोली पुनः निलंबित यदि प्रारंभिक trypsinized सेल निलंबन भी पतला है।
    3. microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक जेल हालत के लिए पीबीएस की एक न्यूनतम मात्रा में कोशिकाओं और विभाज्य भागों पुनः निलंबित इतना है कि वहाँ 5000 कोशिकाओं / μl जब जेल समाधान (पूर्व polymerization के लिए) के साथ मिलाया जाएगा।
      नोट: ठेठ सेल aliquots 300,000-500,000 कोशिकाओं होते हैं और जेल / सेल निलंबन जो 5000 कोशिकाओं / μl के साथ 3-5 x 20 μl जैल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की 60-100 μl बनाने के लिए पर्याप्त हैं। अधिक या कम सेल घनत्व, encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सेल सेल की राशि पर निर्भर करता हैबनाम सेल मैट्रिक्स संपर्क वांछित, क्रमशः, और प्रत्येक आवेदन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
    4. अपकेंद्रित्र सेल / पीबीएस aliquots (90-110 XG, 5 मिनट)।
    5. ध्यान से सही encapsulation पहले microcentrifuge ट्यूब में सेल गोली से पीबीएस aspirate।
      नोट: कोशिकाओं बलों कतरनी के प्रति संवेदनशील हैं, तो दूसरी centrifugation कदम गिनती (जैसे, hemocytometer) और बाद में trypsinized सेल निलंबन (trypsin + मीडिया + कोशिकाओं) प्रत्येक जेल हालत के लिए आवश्यक भागों में aliquotting से समाप्त किया जा सकता है। ये aliquots एक बार centrifuged हैं (90-110 XG, 5 मिनट) और trypsin + मीडिया से दूर aspirated है, encapsulation के लिए एक सेल गोली छोड़ने।
  2. गैर नमूनों hydrogels में encapsulating प्रकोष्ठों।
    1. इसके तत्काल बाद पीबीएस aspirating के बाद, 5000 कोशिकाओं / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए स्प्रेडशीट में गणना के रूप में PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, गोद, और पीबीएस + पुनश्च + FZ में pelleted कोशिकाओं को निलंबित।
    2. मोल्ड और Descr के रूप में हाइड्रोजेल भाजनचरणों में ibed 2.1.6 के लिए 2.1.2।
      नोट: जब गिलास स्लाइड नए नए साँचे में कोशिकाओं encapsulating, ध्यान रखा जाना चाहिए जब शीर्ष स्लाइड के बाद polymerization जेल है, जो कोशिका मृत्यु में परिणाम कर सकते हैं कर्तन को रोकने के लिए हटा। मोल्ड से जेल को हटाने के साथ मदद करने के लिए, स्लाइड नए नए साँचे polymerization गैस्केट और हाइड्रोजेल गीला करने के बाद बाँझ पीबीएस या मध्यम विकास में रखा जा सकता है, यह आसान शीर्ष स्लाइड दूर करने के लिए कर रही है। इस कतरनी को पूरी तरह रोकने के लिए एक विधि सिरिंज के नए नए साँचे के उपयोग के माध्यम से होता है।
    3. कुल्ला जैल 3 एक्स 10 मिनट मध्यम विकास में unreacted प्रजातियों और अतिरिक्त एलएपी हटा दें।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए वांछित समय बिंदु तक 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम विकास में जैल सेते हैं और 5% सीओ 2। मध्यम हर 48 घंटा या आवेदन (जैसे, विशेष सेल प्रकार और मध्यम के लिए विशिष्ट खिला अंतराल) के लिए के रूप में निर्धारित की भरपाई होगी।
  3. कोशिकाओं की उपस्थिति में कोशिकाओं और Photopatterning encapsulating।
    1. इसके तत्काल बाद पीबीएस aspirating के बाद,5000 कोशिकाओं / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए स्प्रेडशीट में गणना के रूप में PEG4SH, Pep2Alloc, गोद, और पीबीएस + पुनश्च + FZ में pelleted कोशिकाओं को निलंबित। Pep1Alloc के साथ बाद में प्रतिक्रिया के लिए मुफ्त thiols (जैसे, 2 मिमी) का एक उपयुक्त एकाग्रता छोड़ दें।
    2. मोल्ड, भाजन, और पैटर्न हाइड्रोजेल कदम 2.2.8 के लिए 2.2.2 में वर्णित है।
    3. कुल्ला जैल 3 एक्स 10 unreacted प्रजातियों और अतिरिक्त एलएपी दूर करने के लिए patterning के बाद मध्यम विकास में मि।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए वांछित समय बिंदु तक 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम विकास में जैल सेते हैं और 5% सीओ 2। मध्यम हर 48 घंटा या आवेदन के लिए के रूप में निर्धारित की भरपाई होगी।

5. समझाया कोशिकाओं की व्यवहार्यता और चयापचय गतिविधि का निर्धारण

  1. समझाया सेल व्यवहार्यता (चित्रा -4 ए) निर्धारित करने लाइव / मृत cytotoxicity परख प्रदर्शन।
    1. पीबीएस के साथ जैल से विकास के माध्यम से निकालें और 3 एक्स 15 मिनट कुल्ला जी से माध्यम के प्रसार की अनुमति के लिएएल्स।
    2. पिघलना लाइव / मृत cytotoxicity परख समाधान (ethidium homodimer -1 और calcein AM)।
    3. 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के लिए 4 मिमी calcein AM समाधान 2 मिमी ethidium homodimer -1 और 0.5 μl के 2 μl जोड़ें। भंवर पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
    4. प्रत्येक सिरिंज ढालना जेल के लिए 300 μl धुंधला समाधान 48 अच्छी तरह प्लेटों में जोड़ें, या एक बाँझ थाली में एक गिलास स्लाइड पर जेल की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त है, और 45 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. अतिरिक्त धुंधला समाधान निकालें और जैल (पीबीएस के साथ 3 एक्स 15 मिनट) से अतिरिक्त डाई दूर करने के लिए कुल्ला।
    6. 10X और 488/525 एनएम पूर्व / em पर एक confocal खुर्दबीन (z ढेर छवियों) या जेड ढेर क्षमता के साथ एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर पर छवि। जेड के ढेर में पेश और जीने (सेल पूरे शरीर में हरा) और मृत (लाल नाभिक) इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या यों।
  2. सेल गतिविधि के बाद encapsulation निर्धारित करने के लिए चयापचय गतिविधि परख प्रदर्शन (figuफिर 4 बी)।
    1. 24 घंटा की परख के लिए ताजा मध्यम विकास के साथ, चारा समझाया कोशिकाओं से पहले।
      नोट: कुछ अतिरिक्त कुओं (कोई कोशिकाओं के साथ कोई जैल या जैल युक्त) नियंत्रण (पृष्ठभूमि रीडिंग) के रूप में मध्यम जोड़ें।
    2. ब्याज की समय बिंदु पर, एमटीएस अभिकर्मक समाधान पिघलना।
      नोट: समय के साथ चयापचय गतिविधि का निर्धारण करने के लिए, एक प्रारंभिक समय बिंदु (12-24 घंटा के बाद encapsulation) बाद में समय अंक की तुलना के लिए एक संदर्भ के रूप में सिफारिश की है।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से (20 प्रति 100 μl मध्यम विकास μl) के लिए एमटीएस अभिकर्मक जोड़ें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-4 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए नमूने सेते हैं, निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
      नोट: ऊष्मायन बार पर्याप्त कोशिकाओं एमटीएस को कम करने और जेल से बाहर formazan उत्पाद के प्रसार की अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए। नतीजतन, इस तरह सिरिंज टिप जैल के रूप में मोटा जैल पर्याप्त एमटीएस कमी और प्रसार के लिए अब ऊष्मायन बार (~ 4 घंटा) की आवश्यकता हो सकती है।
    5. 100 μl पिपेट कम हो एमटीएस / मध्यमएक प्लेट रीडर पर 490 एनएम पर एक 96 अच्छी तरह से थाली और रिकॉर्ड absorbance की साफ कुओं में।
    6. नमूना absorbance के मूल्यों से कोशिकाओं को बिना कुओं के लिए पृष्ठभूमि absorbance घटाएँ baselined absorbance के मूल्यों उत्पन्न करते हैं।

Representative Results

सेटअप और प्रक्रिया कोशिकाओं और बाद में photopattern जैल समझाया कोशिकाओं से युक्त चित्र 1 में दिखाया गया है photoencapsulate करने के लिए, और शेयर समाधान तैयार करने के लिए एक उदाहरण के रूप में करने के लिए एक 10% wt जेल तालिका 1 में प्रदान की जाती है। तालिका 1 का उपयोग करना, monomers की राशि (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) और photoinitiator (एलएपी) हाइड्रोजेल भाजन के लिए आवश्यक गणना की जाती है। इन गणनाओं के आधार पर, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, और एलएपी के शेयर समाधान तैयार है और साथ और बनाने और क्रमशः जैल, photopatterning (चित्रा 1 ए) के लिए Pep1Alloc बिना मिलाया जाता है। बाद में, सेल, प्लेटों से एकत्र की गिनती, और encapsulation (चित्रा 1 बी) के लिए उचित मात्रा में centrifuged हैं। सेल गोली जेल के गठन समाधान (पेप्टाइड / बहुलक / पीबीएस में एलएपी) में फिर से निलंबित कर दिया है, और सेल / मोनोमर मिश्रण गिलास या सिरिंज मोल करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैंडी एस। प्रकोष्ठों प्रकाश के आवेदन पर हाइड्रोजेल भीतर समझाया जाता है (चित्रा 1 सी) (10 मेगावाट / 365 एनएम पर 2 सेमी 1-5 मिनट)। Photopatterning (चित्रा -1) के लिए, जैल, 1 घंटा और 30 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए Pep1Alloc और गोद के साथ भिगो कर रहे हैं polymerized मैट्रिक्स में पेप्टाइड और सर्जक के प्रसार की अनुमति है। ये पेप्टाइड से लदी जैल वांछित पैटर्न के साथ photomasks के साथ कवर और प्रकाश (1 मिनट) की दूसरी खुराक के संपर्क में मैट्रिक्स के भीतर मुक्त करने के लिए thiols पेप्टाइड्स एकत्रित करने के लिए कर रहे हैं। लटकन tethers केवल covalently प्रकाश के संपर्क क्षेत्रों में जेल से जुड़े होते हैं, उचित सेल मैट्रिक्स बातचीत की सुविधा और इन विट्रो में सेल समारोह और भाग्य की जांच कर रही की ओर मूल निवासी सेल microenvironment के प्रमुख यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों नकल उतार।

Ellman की परख जेल संशोधन और पेप्टाइड समावेश photopatte भीतर यों तो एक सतही और सस्ता तरीका प्रदान करता हैrned substrates। नमूनों और गैर नमूनों जैल (यानी, के साथ या पेप्टाइड संशोधन के बिना जैल) Ellman की प्रतिक्रिया बफर के बाद polymerization में भिगो कर रहे हैं। अगले, सिस्टीन मानकों और जैल बफर में भिगो 48 अच्छी तरह से प्लेट में रखा गया है और Ellman अभिकर्मक (चित्रा 2A, बाएं) के साथ incubated हैं। 1 घंटे 30 मिनट के बाद, नमूने की aliquots एक 96 अच्छी तरह से थाली की अलग-अलग कुओं में रखा जाता है, और absorbance के 405 एनएम पर दर्ज की गई है। सिस्टीन मानकों से एक अंशांकन वक्र (2A चित्रा, दाएं) साजिश रची है (एकाग्रता बनाम absorbance, रेखीय फिट), और जैल में मुक्त thiols की मात्रा को उनके कमजोर पड़ने कारक के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। एक 10% wt जेल के विभिन्न polymerization और photopatterning स्थितियों के लिए इन मुक्त thiol सांद्रता चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है। (नीले सलाखों, मैं = 1 मिनट और द्वितीय = 5 मिनट) Pep1Alloc बिना 1 या 5 मिनट के लिए polymerized जैल सांख्यिकीय रूप से समान मुक्त thiol सांद्रता है, टी का संकेतटोपी एक तेजी से प्रतिक्रिया होती है और जमाना 1 मिनट (दो पूंछ टी परीक्षण, पी> 0.05) के भीतर पूरा हो गया है। इस प्रकार, प्रकाश के लिए अतिरिक्त जोखिम (2-5 मिनट) कार्य समूहों के आगे रूपांतरण में परिणाम नहीं करता है। Pep1Alloc बिना 1 मिनट के लिए polymerized जैल (, हरे रंग की सलाखों द्वितीय = 30 मिनट और चतुर्थ = 90 मिनट) 30 और 90 मिनट के लिए (3 मिलीग्राम / एमएल) और गोद (2.2 मिमी) Pep1Alloc से लथपथ और प्रकाश की एक दूसरी खुराक से अवगत कराया गया 1 मिनट के लिए। मुक्त thiols में कमी (1 मिनट हालत के संबंध में 60-80%) इन परिस्थितियों में लटकन cues के साथ जैल के कुशल संशोधन इंगित करता है। उच्च संशोधन वांछित है, Pep1Alloc समाधान की वृद्धि की सांद्रता Pep1Alloc की पहुंच के रूप में मुफ्त thiols करने में अधिक पतला पेप्टाइड समाधान रूपांतरण सीमित कर सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि 20 मिलीग्राम तक / एमएल Pep1Alloc सांद्रता> मुफ्त thiols के 90% रूपांतरण का उत्पादन।

विशिष्ट, पेप्टाइड्स के पैटर्न हाइड्रोजेल को जोड़ा गयातेजी से Ellman अभिकर्मक (चित्रा 3 ए, 5 मिनट के तहत) के साथ imaged किया। हालांकि, पैटर्न के दृश्य के समय (अधिक से अधिक 5 मिनट) जेल के माध्यम से पीले TNB 2- dianion के प्रसार के कारण अधिक खो दिया है। इमेजिंग संकल्प में सुधार और तीन आयामों (एक्स, वाई, जेड और विमानों) और कोशिकाओं की उपस्थिति में पैटर्न का पालन करने के लिए, फ्लोरोसेंट पेप्टाइड अलावा (AF488Pep1Alloc) का उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 3 बी एक्स में, वाई और एक confocal खुर्दबीन के साथ लिया छवि के ढेर के Z-अनुमानों को दिखाया जाता है, पैटर्न संकल्प (माइक्रोन पैमाने) का प्रदर्शन है।

लगभग (94 ± 2)% और सड़ सकने जैल (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) के भीतर समझाया hMSCs की (94 ± 1)% व्यवहार्य (हरी सेल निकायों) 1 और 6 दिनों encapsulation के बाद, रहने क्रमशः कुछ मृत कोशिकाओं के साथ (लाल नाभिक ) मनाया (चित्रा 4 क)। इसके अलावा, hMSC प्रसार 6 दिनों के बाद encapsulation (कम से मनाया जाता है रोंग> चित्रा -4 ए, इनसेट), यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को फिर से तैयार करना और इंटीग्रिन बाध्यकारी RGDS के साथ संशोधित इन एमएमपी सड़ सकने matrices के साथ बातचीत कर सकते हैं। चयापचय क्रिया गैर degradable जैल (Pep2Alloc = RGKGRK) में समझाया कोशिकाओं पर प्रदर्शन assays 1 और 3 दिनों के बाद encapsulation (चित्रा 4 बी) सेल व्यवहार्यता का एक दूसरा उपाय प्रदान करते हैं और दिखाना है कि कोशिकाओं के विभिन्न photoencapsulation और photopatterning शर्तों के साथ परीक्षण के लिए सक्रिय रहते हैं Ellman की परख (चित्रा 2 बी)। विशेष रूप से, वहाँ यह दर्शाता है कि प्रक्रिया में photopatterning के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, कोई महत्वपूर्ण Pep1Alloc + गोद (शर्तों के तृतीय और चतुर्थ) और प्रारंभिक encapsulation (शर्तों मैं और द्वितीय) के साथ 30 मिनट और 90 मिनट के बीच incubations चयापचय क्रिया में अंतर समझाया कोशिकाओं की उपस्थिति (दो पूंछ टी परीक्षण, पी> 0.05)।

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चित्रा 1:। हाइड्रोजेल भीतर कोशिकाओं encapsulating और बाद में जैव रासायनिक क्यू के साथ photopatterning के लिए सेटअप (ए) macromers और photoinitiator के शेयर समाधान तैयार कर रहे हैं और मिश्रित (PEG4SH = रीढ़ की हड्डी, Pep2Alloc = Crosslink, Pep1Alloc = लटकन चिपकने वाला आधा भाग (RGDS), एलएपी = photoinitiator )। (बी) प्रकोष्ठों encapsulation के लिए एकत्र कर रहे हैं। (सी) कोशिकाओं के बिना या इंटीग्रिन बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ macromer समाधान के साथ मिश्रित कर रहे हैं (PEG4SH / Pep2Alloc / गोद या PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / गोद, क्रमशः) और प्रकाश के लिए जोखिम पर समझाया जाता है। (डी) जेल गठन के दौरान अतिरिक्त thiol समूहों युक्त जैल (यहाँ, PEG4SH / Pep2Alloc / गोद, 2 मिमी अतिरिक्त thiol के साथ बनाई) एक एकल alloc समूह (Pep1Alloc, जैसे के साथ क्रियाशील पेप्टाइड्स के बाद के अलावा द्वारा जैव रासायनिक संकेतों के साथ नमूनों किया जा सकता है, RGDS, IKVAV, आदि) कोशिका आसंजन बढ़ावा देने के लिएजेल के विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर। इधर, fluorescently लेबल RGDS के साथ जैल की patterning दिखाया गया है। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। मात्रात्मक Ellman की परख सेटअप और परिणाम नमूनों हाइड्रोजेल के संशोधन का मूल्यांकन करने के लिए (ए) जैल और सिस्टीन मानकों Ellman के अभिकर्मक के साथ 48 अच्छी तरह प्लेटों में incubated हैं। एक रेखीय मानक वक्र जेल नमूनों में सिस्टीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए साजिश रची है। द्वितीय = 5 मिनट के polymerization; तृतीय = 30 मिनट ऊष्मायन Pep1Alloc के साथ, (बी) अतिरिक्त मुक्त thiols एक लटकन alloc-पेप्टाइड (मैं = 1 मिनट polymerization के साथ जेल गठन के दौरान हाइड्रोजेल में शामिल और patterning पर सेवन कर रहे हैं चतुर्थ = 90 मिनट ऊष्मायन वाई वें Pep1Alloc; दोनों तृतीय और चतुर्थ polymerized और 1 मिनट के लिए प्रकाश के साथ नमूनों)। दिखाया गया डेटा मतलब (एन = 3) मानक त्रुटि त्रुटि दिखा सलाखों के साथ वर्णन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Ellman की परख और फ्लोरोसेंट छवियों photopatterned हाइड्रोजेल कल्पना करने के लिए (ए) Ellman अभिकर्मक तेजी से एक्स में पैटर्न (लाइनों) और वाई-विमानों (पीला = unpatterned क्षेत्र, स्केल बार = 1 मिमी) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (बी) फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स एक्स में पैटर्न का पालन करने के लिए, वाई इस्तेमाल किया जा सकता है, और जेड विमानों (हरी = नमूनों क्षेत्र, 200 माइक्रोन पैमाने पर पट्टी; 10X पानी की सूई उद्देश्य, पूर्व / एम 488/525 एनएम)।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। चित्रा 4: व्यवहार्यता और गैर degradable photopatterned हाइड्रोजेल भीतर कोशिकाओं की चयापचय क्रिया (ए) उदाहरण confocal जेड ढेर (जेड प्रक्षेपण; 10X पानी की सूई उद्देश्य) व्यवहार्य की (हरा, पूर्व / एम 488/525 एनएम) और मृत hMSCs (लाल, पूर्व / एम 543/580 एनएम) हाइड्रोजेल भीतर समझाया 24 घंटे बाद encapsulation (स्केल बार = 200 माइक्रोन)। 6 दिन encapsulation (इनसेट छवि, स्केल बार = 50 माइक्रोन) के बाद इन हाइड्रोजेल भीतर फैल प्रकोष्ठों। (बी) कोशिकाओं पाचन सक्रिय हैं 1 और 3 दिन (अंधेरे और प्रकाश सलाखों, क्रमशः) विभिन्न polymerization के लिए पोस्ट-Encapsulation (मैं = 1 मिनट polymerization, द्वितीय = 5 मिनट के polymerization) और patterning की स्थिति (तृतीय = Pep1Alloc के साथ 30 मिनट ऊष्मायन ; चतुर्थ = 90 मिनट incubatioPep1Alloc साथ N; दोनों polymerized और 1 मिनट के लिए प्रकाश के साथ नमूनों)। दिखाया गया डेटा मतलब (एन = 3) मानक त्रुटि त्रुटि दिखा सलाखों के साथ वर्णन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: उदाहरण सेटअप हाइड्रोजेल बनाने के लिए स्टॉक समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट कि नीले रंग डाला जाता है के भीतर कोशिकाओं से संकेत मिलता उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मानकों;। अन्य मात्रा इन सेटिंग के आधार पर गणना कर रहे हैं। एक जेल बनाने के लिए प्रत्येक शेयर के समाधान के लिए अंतिम मात्रा में नारंगी डाला जाता है। सफेद कोशिकाओं अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मापदंडों के आधार पर की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल फार्मूले होते हैं। ध्यान दें कि 2.2 मिमी एलएपी की एकाग्रता 0.067 भार% के बराबर है।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया तकनीक दर्शाता thiol-ene क्लिक रसायन शास्त्र द्वारा गठित हाइड्रोजेल भीतर कोशिकाओं photoencapsulate करने के लिए और बाद में जैव रासायनिक संकेतों के साथ जैल photopattern। प्रकाश का उपयोग शुरू में हाइड्रोजेल लिए फार्म बहुलक समाधान polymerization से पहले के भीतर सजातीय मिश्रण और कोशिकाओं के निलंबन की अनुमति देता है। रैपिड polymerization 'ताले' परिभाषित मोल्ड के आकार में जेल और हाइड्रोजेल नेटवर्क के भीतर कोशिकाओं को निलंबित कर दिया encapsulates। जैल भी कई अलग अलग आकार (जैसे, गिलास स्लाइड या सिरिंज सुझावों) वांछित अंतिम आवेदन के आधार पर में ढाला जा सकता है। उदाहरण के लिए, गिलास स्लाइड से जुड़ी हाइड्रोजेल में 3 डी संस्कृति के लिए समझाया कोशिकाओं इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी के रूप में प्रकाश क्षीणन एक पतली नमूना के भीतर ही सीमित है। (कांच स्लाइड की तुलना में सिरिंज नए नए साँचे कोशिकाओं का तेजी से encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नमूने कम समय में तैयार होने के लिए की एक बड़ी संख्या की इजाजत दीs) है कि इस तरह के cytometry या qPCR प्रवाह के रूप में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बाद में, इन जैल तो जैव रासायनिक संकेतों इस तरह के भेदभाव या आक्रमण के रूप में वांछित सेलुलर प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के साथ नमूनों की जा सकती है। 30,31

व्यवहार्यता और चयापचय गतिविधि के लिए assays और प्रस्तुत सामग्री प्रणाली के लिए कोशिकाओं patterning की स्थिति के अस्तित्व का संकेत मिलता है। ध्यान दें कि चयापचय गतिविधि गैर degradable जैल में 3 दिन तक नजर रखी थी (RGKGRK पेप्टाइड Crosslink) सेल समारोह पर polymerization और patterning की स्थिति के प्रारंभिक प्रभाव का आकलन करें। इसके अतिरिक्त, एक झिल्ली अखंडता 1 और 6 दिन एक सड़ सकने पेप्टाइड Crosslink (GPQGIWGQ) के साथ तैयार की जैल में पोस्ट-encapsulation का समर्थन करता है कि कोशिकाओं व्यवहार्य और संस्कृति में 1 हफ्ते में फैल रहने पर hMSCs की परख (लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity धुंधला)। अतिरिक्त सेल लाइनों की व्यवहार्यता photopatterning की स्थिति उन लोगों के लिए 32 समान के लिए सूचित किया गया हैयहां इस्तेमाल किया और लाइव / मृत धुंधला हो जाना और चयापचय गतिविधि assays का उपयोग वर्णित हाइड्रोजेल प्रणाली के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। जब तक हम इस सामग्री प्रणाली और संबंधित प्रक्रियाओं (4.2 और 4.3) का उपयोग सेल व्यवहार्यता के साथ मुद्दों को नहीं देखा है, कुछ प्रकार की कोशिकाओं मुक्त कट्टरपंथी और / या प्रकाश जोखिम के प्रति संवेदनशील हो सकता है। इस मामले में, उपयोगकर्ताओं को ऐसी azide-alkyne, 12 FXIII, 31 या Diels Alder आधारित हाइड्रोजेल गठन chemistries के रूप में गैर photoinitiated सामग्री की व्यवस्था, उपयोग करने पर विचार कर सकता है। 33

सतही तकनीकों का पता लगाने और जैल भी प्रस्तुत कर रहे हैं (3.1 और 3.2) के भीतर जैव रासायनिक संकेतों के patterning यों की। Ellman की परख विशेष रुचि का है क्योंकि अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और कोई अतिरिक्त सिंथेटिक प्रसंस्करण कदम या अधिक महंगा अभिकर्मकों (जैसे, fluorescently लेबल पेप्टाइड) के लिए आवश्यक हैं। Ellman की परख ठीक विभिन्न तहत जैव रासायनिक संकेतों के साथ मुक्त thiols के संशोधन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताNT की स्थिति photopatterning, साथ ही तेजी से पैटर्न कल्पना करने के लिए। , पेप्टाइड समावेश पहले और patterning के बाद thiol कार्यात्मक समूह एकाग्रता बढ़ाता पेप्टाइड समावेश का एक मात्रात्मक उपाय के रूप में के लिए, सीधे Ellman की परख के साथ मूल्यांकन किया है। मात्रा का ठहराव के इस प्रकार के fluorescently लेबल पेप्टाइड्स के साथ किया जा सकता है, 34 इमेजिंग आधारित मात्रा का ठहराव अधिक समय लेने वाली हैंडलिंग और विश्लेषण कदम की आवश्यकता है (जैसे, एक fluorescently लेबल पेप्टाइड और एक अंशांकन वक्र की पीढ़ी के संश्लेषण पेप्टाइड एकाग्रता के लिए प्रतिदीप्ति संबंधित करने के लिए छवि विश्लेषण का उपयोग)। इमेजिंग पेप्टाइड शामिल करने के लिए, Ellman अभिकर्मक सीधे नमूने के लिए लागू किया जा सकता है और तुरंत कल्पना। एक्स और पैटर्न दृश्य के लिए वाई-विमानों तक ही सीमित है, जबकि तकनीक तो यह निर्धारित करने के लिए स्वतंत्र thiol समूहों युक्त matrices नमूनों की है एक सरल, दिनचर्या पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ध्यान रखें कि Ellman की परख सी नहीं है महत्वपूर्ण हैonsidered cytocompatible, इसलिए जब तक यह निरीक्षण और photopatterns यों इस्तेमाल किया जा सकता है, यह नहीं कोशिकाओं की उपस्थिति में किया जा सकता है। तीन आयामों में और कोशिकाओं की उपस्थिति में patterning इमेजिंग के लिए, हाइड्रोजेल matrices के भीतर फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स के विकार एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण रहता है। पैटर्न का संकल्प, एक्स में मूल्यांकन किया जा सकता y-, और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग जेड विमानों, और इस विधि cytocompatible है ताकि नमूनों क्षेत्रों या गैर नमूनों क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है। साथ में ले ली, Ellman की परख और इमेजिंग तकनीक आधारित पूरक उपकरण शोधकर्ताओं दोनों मात्रात्मक और गुणात्मक सामग्री प्रणाली के भीतर जैव रासायनिक संकेतों के photopatterning का आकलन करने के लिए कर रहे हैं।

Photoclick, या अधिक मोटे तौर पर photoinitiated, गठन और कोशिकाओं की उपस्थिति में हाइड्रोजेल के संशोधन के लिए chemistries कई हैं। यहाँ प्रस्तुत मोल्डिंग, encapsulation, और patterning तकनीक लिम नहीं हैंवर्णित सामग्री की व्यवस्था करने के ited और ऐसे thiol-alkyne, 35 azide-alkyne, 4 और अन्य thiol-ene chemistries (जैसे, thiol-norbornene), 10,13 और साथ ही साथ के रूप में वैकल्पिक प्रकाश आधारित chemistries, को लागू किया जा सकता है ऐसे Irgacure 2959, Eosin वाई, और camphorquinone के रूप में विभिन्न photoinitiators। (जैसे, ऊष्मायन बार, polymerization बार, सेल घनत्व) यह सुनिश्चित करने के लिए नोट, उपयोगकर्ताओं प्रक्रिया मापदंडों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती शर्तों इन अन्य प्रणालियों के लिए cytocompatible रहने कि। चूंकि patterning प्रक्रिया हाइड्रोजेल (2.2.3-2.2.5) में alloc संशोधित पेप्टाइड (एस) के प्रसार की आवश्यकता है, इस प्रक्रिया इंटीग्रिन बाध्यकारी moieties (जैसे, पेप्टाइड्स या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के अलावा के लिए सबसे अधिक उपयोगी साबित हो सकता है टुकड़े) हाइड्रोजेल, जहां नेटवर्क से ligand की कुर्की सेल और पूर्ण इंटीग्रिन सक्रियण द्वारा कर्षण बलों की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। 36 नोट, biomolecules के लिए हो सकता है किसमाधान में या स्थिरीकरण (जैसे, वृद्धि कारक या साइटोकिन्स) पर इसी तरह से सक्रिय हो, हाइड्रोजेल में आधा भाग प्रसार (~ 1 घंटा) के लिए ऊष्मायन कदम घटनाओं है कि convolute patterning परिणामों का संकेत करने के लिए ले जा सकता है। अन्य विधियों के विकास का पहलू स्थिरीकरण या उनके patterning के लिए स्थानीय ज़ब्ती के लिए स्थापित किया गया है। 37-39 इसके अतिरिक्त, पैटर्न संकल्प प्रकाश जोखिम पर नियंत्रण से निर्धारित होता है। इधर, photomasks जेल गहराई के माध्यम से और एक्स और वाई-विमानों में पैटर्न के निर्माण की अनुमति; हालांकि, जैल के भीतर जैव रासायनिक संकेतों के patterning पर अधिक नियंत्रण स्थानिक ऐसे एक दो फोटोन confocal खुर्दबीन के उपयोग एक्स में पैटर्न, वाई, और z- विमानों उत्पन्न करने के लिए के रूप में विकिरण के वैकल्पिक तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। 34,40 अंत में, यह ध्यान दें कि जबकि सामग्री प्रणाली इस प्रक्रिया के भीतर उपयोग केवल शुरू में जैव रासायनिक संकेतों के साथ संशोधित किया गया है, orthogonal photoclick chemistries आल्ट अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है महत्वपूर्णसमय के साथ मैट्रिक्स संपत्तियों में राशन। 12 प्रक्रिया और तकनीक यहाँ प्रस्तुत अच्छी तरह से परिभाषित और spatiotemporally नियंत्रित गुणों के साथ सिंथेटिक matrices बनाने के लिए मौजूदा तरीकों की विविधता को जोड़ने। विशेष रूप से, अभिकर्मकों और सामग्री इस प्रक्रिया के भीतर इस्तेमाल की वाणिज्यिक उपलब्धता नियंत्रित सेल संस्कृति में अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल आधारित biomaterials के उपयोग में रुचि शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो जाएगा।

Acknowledgments

इस काम दवाओं की खोज में और उन्नत बायोमैटिरियल्स राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान में जनरल ऑफ मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (P20GM104316 और P30 GM110758-01, क्रमशः) से संस्थागत विकास पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित, बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट में डेलावेयर COBRE कार्यक्रमों के द्वारा समर्थित किया गया (00026178), एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार (डीएमआर-1253906), बरोज़ वेलकम कोष (1006787), और डेलावेयर विश्वविद्यालय में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन IGERT SBE2 कार्यक्रम (एल Sawicki के लिए फैलोशिप)। लेखकों confocal माइक्रोस्कोपी के लिए प्रशिक्षण और पहुँच के लिए डेलावेयर विश्वविद्यालय में जैव प्रौद्योगिकी संस्थान डेलावेयर Bioimaging केंद्र धन्यवाद, सुश्री कैथरीन विले वीडियो शूटिंग के दौरान सहायता के लिए श्री मैथ्यू Rehmann उदारता से अस्थि मज्जा, प्रो क्रिस्टोफर जे से अलग hMSCs प्रदान करने के लिए । Kloxin और श्री स्टीफन मा उदारता से उपलब्ध कराने के लिए photomasks, और प्रो विल्फ्रेड चेन स्वचालित प्लेट पाठक के उपयोग के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Peptides Various Vendors ---- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 ml Chemglass CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors ----
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors ----
Vacuum Dessicator Various Vendors ----
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors ---- 1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation ---- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors ---- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors ---- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors ---- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies ---- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss ---- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH ---- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis

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References

  1. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  2. Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
  3. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
  4. Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
  5. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
  6. Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
  7. Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
  8. Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
  9. Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
  10. Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
  11. Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
  12. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
  13. Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
  14. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
  15. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
  16. Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
  17. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  18. Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
  19. Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
  20. Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
  21. Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
  22. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  23. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  24. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
  25. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
  26. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
  27. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
  28. Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
  29. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
  30. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
  31. Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
  32. Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
  33. Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
  36. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  37. Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  38. Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
  39. Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
  40. Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 115 biomaterials photoencapsulation photopatterning सेल संस्कृति पाड़ हाइड्रोजेल बाह्य मैट्रिक्स की नकल पेप्टाइड्स
सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए प्रकाश की मध्यस्थता गठन और Hydrogels के patterning
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Sawicki, L. A., Kloxin, A. M.… More

Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).

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