Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lys-mediert Dannelse og fordelingen av Hydrogeler for cellekultur Applications

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54462
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Abstract

Klikk kjemi har blitt undersøkt for bruk i en rekke biomaterialer programmer, inkludert levering av legemidler, tissue engineering, og cellekultur. Spesielt lys-medierte klikk reaksjoner som photoinitiated tiol-en og tiol-yn reaksjoner, ga spatiotemporal kontrollen over materialegenskaper og tillate konstruksjon av systemer med en høy grad av brukerstyrt egenskap kontroll. Fabrikasjon og modifikasjon av hydrogel-baserte biomaterialer ved hjelp av presisjons by av lys og allsidighet som tilbys av disse tiol-X Photo kjemi er av økende interesse, spesielt for kulturen i celler i veldefinerte, biomimetic microenvironments. Her beskriver vi metoder for photoencapsulation av celler og påfølgende photopatterning av biokjemiske signaler innen hydrogel matriser ved hjelp av allsidige og modulære byggeklosser polymerisert av en tiol-ene Photo reaksjon. Spesielt er en tilnærming presenteres for constructing hydrogeler fra allyloksykarbonyl (Alloc) -functionalized peptid tverrbindinger og anheng peptid-molekyldeler og tiol-funksjonaliserte poly (etylenglykol) (PEG) som hurtig polymeriserer i nærvær av litium acylphosphinate fotoinitiator og cytocompatible doser av langbølget ultrafiolett (UV) lys. Lettvinte teknikker for å visualisere photopatterning og kvantifisere konsentrasjonen av peptider lagt beskrives. I tillegg er fremgangsmåter etablert for innkapsling av celler, spesielt humane stamceller, og bestemme deres levedyktighet og aktivitet. Mens dannelsen og innledende mønstring av thiol-Alloc hydrogeler er vist her, er disse teknikkene grovt kan anvendes på en rekke andre lys og radikal-initierte materialsystemer (f.eks tiol-norbornen, tiol-akrylat) for å generere mønstrede underlag.

Introduction

Klikk kjemi blir stadig mer brukt i utformingen av materialer for mange biomedisinske applikasjoner, inkludert levering av legemidler, tissue engineering, og kontrollerte cellekultur, på grunn av deres selektive, effektive, og ofte cytocompatible reaktivitet. 1-3 Photo kjemi som bruker lys til å utløse eller innlede reaksjoner (f.eks azid-alkyn, 4-tiol-en, fem og tetrazol-alken 6) er av spesiell interesse for dannelsen eller modifikasjon av biomaterialer. Rapid priser under milde betingelser og kontroll av når og hvor de finner sted med lys gjør disse reaksjonene velegnet for brukerstyrt kontroll av biomateriale egenskaper i nærvær av celler. 7,8 Spesielt har tiol-en Photo kjemikalier blitt brukt å generere hydrogel-baserte biomaterialer med robuste mekaniske egenskaper og 5,9 for innkapsling av et stort utvalg av celletyper, inkludert, men ikke i noet begrenset til, humane stamceller (hMSCs), fibroblaster, kondrocytter og pankreatiske celler, med løftet for cellekultur og levering. 10,11 Videre har disse kjemi blitt anvendt for den romlige fordelingen av biokjemiske signaler for å etterligne nøkkelaspekter innfødte celle microenvironments og legge til rette for hensiktsmessige celle-matriks interaksjoner, inkludert heft, differensiering, og invasjon. 3,12

For bygging av tiol-ene hydrogeler med lys, peptider som inneholder cysteiner (tiol) vanligvis omsettes med polymerer funksjon med akrylater eller norbornener ( 'fiendtlige') for rask, photoinitiated polymerisasjon henhold cytocompatible forhold. 13 Utvide denne verktøykassen, søkte vi å etablere metoder for dannelsen hydrogel med nye allsidige og tilgjengelig byggeklosser som krevde minimal syntetisk behandling eller var kommersielt tilgjengelig mot deres bred bruk som syntetiske ekstracellulære matriser.14 Spesielt peptider ble modifisert med allyloksykarbonyl (Alloc) beskyttede lysines: en for anheng, integrin-bindende grupper for å fremme celle adhesjon [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller to for ikke-nedbrytbare eller celle-nedbrytbart tverrbindinger [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc henholdsvis]. Med disse sekvensene, ble forhold etablert for hurtig reaksjon (1-5 minutter) med fire-arm thiol-modifisert poly (etylenglykol) (PEG4SH) ved anvendelse av cytocompatible doser av lang bølgelengde UV-lys (10 mW / cm 2 ved 365 nm) og fotoinitiatoren litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogeler var stabilt under celledyrkningsbetingelser for uker. For å aktivere celledrevet degradering og ombygging, ble en enzymatisk spaltbar peptid innlemmet i gelen tverrbindinger (dvs. GPQGIWGQ), 15 og en modell primær celle, menneskelige stamceller (hMSCs), forble svært levedyktig etter innkapsling og during kultur innenfor disse matriser. Videre peptider er romlig mønster i disse materialene, og hMSCs være levedyktig og metabolsk aktiv i henhold photopatterning forhold. Alternativ anheng peptidsekvenser som ikke er vist her (f.eks IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), også kan innarbeides i grunnmasser for å undersøke ytterligere celle interaksjoner med det omgivende mikromiljøet. Resultatene er lovende for anvendelse av disse hydrogel-baserte materialer for tre-dimensjonale (3D) cellekultur og levering til å studere og direkte celle-matriks-interaksjoner for en rekke forskjellige celletyper.

Heri, metoder for å photoencapsulate celler og senere photopattern biokjemiske signaler innenfor det foreslåtte hydrogel systemet presenteres (figur 1). Teknikker for å observere og kvantifisere disse photopatterns også demonstreres: spesielt, i) den kvantitative og kvalitative bruk av Ellmans analyse for å bestemme den modifikasjonav frie tioler innenfor mønstrede substrater og ii) den komplementære kvalitativ bruk av fluorescerende peptider (AF488Pep1Alloc) å observere disse mønstrene i tre dimensjoner. Videre analyser for å bestemme levedyktigheten (levende / død levedyktighet / cytotoksisitet farging) og metabolsk aktivitet (MTS, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) presenteres slik at brukerne kan bestemme cytocompatibility av photoencapsulation og photopatterning forhold for ulike cellelinjer innen hydrogel matriser. Mens protokollen er vist for en lettvint lysbaser Photo hydrogel systemet, kan teknikker brukes til en rekke andre radikal-initierte hydrogel systemer for photoencapsulation og photopatterning i nærvær av celler.

Protocol

1. Utarbeidelse av materialer for Hydrogel Formation

  1. Syntetisere anheng (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) og kryssbindende peptider (Pep2Alloc) ved standard fastfasepeptidsyntese (SPPS) teknikker og tiol-funksjon polymer av tre-trinns prosedyre for slutt gruppe modifikasjon (PEG4SH). 14,16 Alternativt kjøpe PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc, og Pep2Alloc kommersielt.
  2. Syntetisere fotoinitiatoren (LAP) ved to-trinns reaksjon beskrevet nedenfor. 14,17 Utfør syntesetrinn (1.2.1-1.2.11) i et avtrekksskap og bruke forsiktighet ved håndtering av kjemikalier (bruk vernehansker, klær og briller) . LAP også kan kjøpes kommersielt.
    1. Tørr alle glass i ovnen (> 2 timer, 80 ° C).
    2. Legg til en rørestav til en tom én-halset rundbunnet kolbe (100 ml) og deksel med et septum.
    3. Fest kolbe på toppen av en magnetisk rørevarmeplate med et oppheng.
    4. Jegnsert en nål (18 G) gjennom septum og la den ytre ende åpen til atmosfæren. Sette inn en annen nål festet til en inert gass linje. Åpne den inerte gassledningen (for eksempel argon eller nitrogen) og spyle kolben i 10-15 min.
      MERK: Systemet vil kontinuerlig spylt med inert gass, argon eller nitrogen, gjennom hele reaksjonen.
    5. Overføring 1,5 g (~ 1,4 ml) dimetyl phenylphosphonite (FORSIKTIG) til kolben ved hjelp av en sprøyte med nål til å stikke gjennom septum. Slå på røreplate (middels hastighet) og pass på at innholdet ikke sprute på sidene av kolben.
    6. Legg 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimetylbenzoyl-klorid (FORSIKTIG) dråpevis i kolben inneholdende dimetyl- phenylphosphonite, ved hjelp av en sprøyte med en nål for å stikke hull i skilleveggen.
    7. Dekk reaksjonsbeholderen med folie for å beskytte mot lys og omrørt i 18 timer under argon eller nitrogen.
    8. Den neste dag, øker høyden av kolben, plasserer et oljebad på røreverk, ennd senk kolben ned i oljebadet. Varm badekaret og kolben til 50 ° C under opprettholdelse av magnetisk omrøring.
    9. Oppløs 3,05 g lithiumbromid i 50 ml 2-butanon. Hev kolben ut av oljebadet og tilsett litiumbromid løsning på rundbunnet kolbe, kort fjerne skilleveggen for å strømme inn i kolben.
      1. Forsegl kolben igjen med septum (FORSIKTIG: Septum vil fortsatt ha en nål som fører til argon linjer og en nål for å ventilere), lavere kolben tilbake i oppvarmet oljebad, og tillate reaksjonen å skride frem i 10 min. En solid bunnfall vil dannes.
    10. Etter 10 min, slå av argon, fjern kolben fra varmen og la blandingen hvile i fire timer (dekket med folie for å beskytte mot lys som en lysfølsom initiativtaker har blitt produsert. Hold ventilen nål sted.
    11. Hell produkt inn i en glass-fritte-trakt eller trakt foret med egnet filterpapir. Skyll filtratet 3 ganger med 50 ml 2-butanon å rEDra noen reagert litium bromide.
    12. Tørk (først på benkeplaten og deretter i vakuum-eksikator) og analysere produktet ved 1H NMR i D 2 O. Karakteristiske topper ved 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3 H, s), 6,7-6,8 (2 H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m), og 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17
  3. Bruk et regneark til å beregne volum og konsentrasjon av hver stamløsning (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) som må være forberedt på å gjøre hydrogeler (tabell 1). For å gjøre ikke-mønstrede gels, sørge for at [SH] = [Alloc] slik at alle reaktive grupper er konsumert under polymerisasjon. Hvis photopatterning av geler er planlagt, omfatte en overskuddsmengde av tiol-funksjonelle grupper i løpet av gel-dannelse på grunnlag av støkiometri (for eksempel 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) for senere omsetning med Pep1Alloc.
    MERK: Geler bør inneholde mer enn 5 vektprosent (vekt%) PEG4SH for å sikre hurtig polymerisering (i løpet av 5 min). Men lavere vekt% ranges kan utforskes dersom søknaden krever hydrogeler med lavere moduler (for eksempel <0,5 kPa); polymerisasjon bør sjekkes og justeres etter disse lave vekt% komposisjoner. På lignende måte kan Pep1Alloc konsentrasjonen justeres for forskjellige applikasjoner (for eksempel 0,2-5 mM) som rapportert i litteraturen for tiol-funksjonaliserte peptider. 18-21 LAP konsentrasjon anbefales omkring 0,067 vekt-% (2,2 mM) eller mindre, slik som beskrevet, som høyere konsentrasjoner kan redusere celle levedyktighet.
  4. Forbered lager løsninger av Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH, og LAP under sterile forhold for cellekultur basert på beregninger i tabell 1.
    1. For Pep1Alloc og Pep2Alloc, individuelt veie den totale massen av Pep1Alloc og Pep2Alloc fra peptidsyntesen og oppløses i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 1% penicillin / streptomycin (PS) og 0,5 ug / ml Fungizone (FZ). Typiske konsentrasjoner av forberedt lagerløsninger utvalg20-100 mg / ml peptid. Bland disse bestandene å oppnå geler med endelig moduler relevant for bløtvev applikasjoner (Youngs modulus ~ 0,5-5 kPa). 22,23 Delmengde og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
    2. For PEG4SH, veie PEG4SH i en steril mikrosentrifugerør og løses i PBS + PS + FZ. Typiske konsentrasjoner av denne stamløsningen i området fra 250 til 430 mg / ml (20-30% PEG4SH etter vekt).
    3. For LAP, veie LAP i en steril mikrosentrifugerør og oppløses i PBS + PS + FZ til en sluttkonsentrasjon på 7,5 mg / ml.
      MERK: Forbereder nye løsninger av PEG4SH og LAP er anbefalt for hver innkapsling eller gel eksperiment for å sikre konsekvent Polymerisasjon ganger.
  5. Forbered Sterile sprøytespissen Former for Forming Hydrogeler.
    1. Klipp forsiktig tipsene off av 1 ml sprøyter ved hjelp av et barberblad og deretter fjerne stempler fra sprøyten sjakter.
    2. Senk sprøyte sjakter og stempler i 70% etanol i 15 min end plass i en steril cellekultur hette til å tørke (30 min). Dersom overskytende dråper etanol forbli inne sprøyte skaftet, bruke stempelet for å presse dem ut.
  6. Forbered Sterile Glass Slide Former for Forming Hydrogeler.
    1. Sug glass (multipler av 2) og gummipakninger (0,254 mm tykk, 2 små biter som brukes som mellomlegg, et rektangel med plater stanset ut, eller firkantet ramme form) i 70% etanol i 15 min, og plasser i sterile cellekultur hette å tørke.
    2. Coat halvparten av de steriliserte lysbilder med anti-klebende belegg per produsentens anvisninger for å hindre adhesjon av toppen av gelen til glideflate (for eksempel hvis det er 4 lysbilder, 2 lysbilder vil være belagt med anti-lim). Disse vil tjene som toppen av glass-slide formen.
  7. Kalibrere lampe for sprøyte eller glass lysbilde muggsopp.
    NB: For disse forsøk ble en kvikksølv buelampe med et utvendig filter adapterenheten og 365 nm utvendig filter som brukes. andre lampes som produserer egnede intensitetene av lang bølgelengde UV-lys kan anvendes som rapportert av andre. 24-27
    1. Feste en kollimasjonslinse til enden av det væskefylte lysleder for å sikre en relativt jevn lysintensitet over alle prøver. Etter behov, justere avstanden lyset guide fra prøven (e) for å oppnå en spot størrelse som vil dekke prøver av interesse.
    2. Plasser et kutt sprøyte mold i en mikro rørholder (for å holde sprøyten mold i vertikal posisjon). Hold radiometer på høyden av sprøytespissen hvor prøvene vil bli holdt og juster lukkeren (% åpen) for å oppnå en lysintensitet på 10 mW / cm 2 ved 365 nm. Spill de justerte innstillingene for senere bruk.
    3. Plasser en glass-slide formen på toppen av en steril overflate (for eksempel, viser toppen av en pipettespiss boks innenfor et biosikkerhet skap). Hold radiometer detektoren ved høyden av glass-slide formen og justere lukkeren (% åpen) for å oppnå en lysintensitet på 10 mW / cm 2 ved 365 nm. Spill de justerte innstillingene for senere bruk.

2. Hydrogel Dannelse og Photopatterning

  1. Fremstilling av ikke-mønstrede Hydrogeler.
    MERK: På dette punktet i protokollen, hvis hydrogeler skal brukes i cellekultur anvendelser, alle etterfølgende trinn bør utføres under sterile betingelser i et sterilt skap eller hette.
    1. Bland stamløsninger av PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ ifølge regnearket beregningen (se tabell 1 eksempel). Pipetter resulterende gelen forløper løsning kraftig for å sikre jevn blanding av løsningen.
    2. Fremstille tykke hydrogeler innstøpt i sprøyte tips ved å pipettere 10-20 ul av gel-forløper-løsning (PEG / pep / LAP / PBS) inn i spissen av en steril, kutt sprøyte. Lag et enkelt gel per sprøyte, ca 0,5-1,5 mm tykt basert på volum og sprøyte diameter.
      MERK: Større mengder kan bli utforsket basert påønsket gel størrelse hvor øvre grenser kan eksistere basert på diffusjonelle begrensninger for Pep1Alloc under photopatterning og / eller næringsstoffer / avfall til / fra innkapslede celler under cellekultur.
    3. Fremstille tynne hydrogeler i glass glidestøpeformer ved å plassere gummipakningen (0,254 mm tykk) rundt kantene av den ikke-belagte objektglass. Pipetter 5-10 ul gel-forløper-løsning (enkle eller multiple 5-10 ul geler kan fremstilles ved å pipettere en eller flere punkter av oppløsningen på et enkelt lysbilde) på den ikke-belagte objektglass og plasser av objektglass belagt med anti-klebende på toppen av gelen oppløsning (større geler opp til størrelsen av glass-slide, kan gjøres avhengig av den endelige anvendelse). Fest glass med små bindemiddel klipp for å stabilisere.
    4. Plasser formene under lampen og sette lampen intensitet (for eksempel% lukkeren åpen) for å oppnå 10 mW / cm 2 ved gel overflaten for sprøytespissen former eller glass glideformer basert på målinger i trinn 1.7.2 og1.7.3 hhv.
    5. Søke lys i 1 til 5 minutter for å sikre fullstendig polymerisasjon av geler. Bruke en kortere polymerisasjonstid for geler med høyere PEG4SH innhold (8 vekt% eller større, 1 min) og lengre tid for geler med lavere PEG4SH innhold (5-8 vekt%, 3-5 min) for å frembringe fullstendig polymerisert hydrogeler med moduler innen utvalget av myke vev (0,5-5 kPa).
    6. Plasser gels fra sprøytespissen muggsopp i et sterilt ubehandlet 48-brønns plate og sted glass i en steril fatet.
    7. Skyll 3 x 15 min med cellekulturmedium eller hensiktsmessig buffer (f.eks PBS + PS + FZ, Ellman reaksjon buffer) basert på planlagte eksperimenter, som beskrevet nedenfor.
  2. Utarbeidelse av mønstret Hydrogeler.
    1. Bland stamløsninger av PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ ifølge beregningsarket, slik at frie tiol (0,2-5 mm) for senere reaksjon med Pep1Alloc. Pipetter forløper løsning kraftig for å sikre jevn blanding av løsningen.
    2. Forbered tykke og tynne hydrogeler som legges ut i trinn 2.1.2 til 2.1.6.
      MERK: Ikke plasser gels i vekstmedium før photopatterning. Frie tioler kan forbrukes av arter i vekstmediet (f.eks formasjon disulfid med tiol-inneholdende proteiner) og vil ikke tillate mønstring av gelen uten ytterligere behandlingstrinn (for eksempel reduksjon av disulfidbindinger).
    3. Fremstille oppløsninger av Pep1Alloc (sluttkonsentrasjon ~ 3-20 mg / ml) og 2,2 mM LAP.
    4. Dekk pre-dannet geler med Pep1Alloc / LAP-løsning og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    5. Fjern overflødig Pep1Alloc / LAP løsning. Hvis gelene ble støpt i en sprøytespiss, bruke en spatel for å nøye overføre gelene fra den 48-brønns plate i hvilke de er inkubere til en steril glass-slide for mønstring.
    6. Plasser en fotomaske med ønsket mønster direkte på toppen av syringe- og glass glidestøpte geler. Sørg for at den trykte delen av masken berører gel for optimal pattern fidelity (dvs. maske bør lese riktig og være emulsjon siden ned). Plasser prøvene under lampen og strålebehandling i 1 min med lampe innstillingene som brukes for glassplater (trinn 1.7.3).
    7. Etter mønster, sted sprøyte-støpte geler i en steril, 48-brønnen ikke-vev kultur behandlet plate, og stedet glass slide-støpte gels som følges til glassplater i et sterilt parabolen.
    8. Skyll 3 x 15 min med cellekulturmedium eller egnet buffer (f.eks PBS + PS + FZ, Ellmans reaksjonsbuffer) basert på planlagte eksperimenter.

3. Visualisere og Kvantifisering av Photopatterning

  1. Ellmans analyse for å påvise og kvantifisere Gratis Tioler i Photopatterned Hydrogeler.
    1. Forbered Ellmans reaksjonsbuffer, cystein arbeidsoppløsning, standarder, og Ellmans reagens som beskrevet nedenfor.
      1. For Ellmans reaksjonsbuffer, oppløse 2,4 g dinatriumhydrogenfosfat (Na 2 HPO4) og 74,4 mg etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 200 ml DIH 2 O (0,1 M Na HPO 2 4, 1 mM EDTA). Justere pH til 7,5-8 med oppløsninger av natriumhydroksid (NaOH) eller fosforsyre (H 3 PO 4).
      2. For Cystein arbeidsløsning, oppløse 5,27 mg cystein i 15 ml reaksjonsbuffer (2 mM cystein).
      3. For cystein Standards, fortynnet cystein arbeidsoppløsningen i reaksjonsbuffer til en sluttkonsentrasjon på 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25,, 0 mM cystein.
      4. For Ellmans reagens, oppløse 4 mg Ellmans reagens i 1 ml reaksjonsbuffer. Sonicate å løse opp Ellman reagens.
    2. Kvantifisere konsentrasjonen av frie tioler i geler med Ellmans analyse (Figur 2).
      MERK: 'Tynne' 5 pl hydrogeler, støpt mellom glassplater, er beskrevet i prosedyren nedenfor, og anbefales å tillate rask spredning av Ellman reagens through gelen (dvs. tar det reagenset lengre tid å diffundere gjennom tykke gels).
      1. Bestem hovne gel volumet av "tynne" 5 pl gels (V S) basert på volum hevelse ratio, Q.
        1. Lag tre 20 mL 'tykke' gels bruker sprøytestøpeformer. Plasser gels i Ellman reaksjon buffer for 24 timer og senere veie (likevekt hoven masse, M S). Lyofilisere gelene og deretter veie (tørr masse, M D).
        2. Ved å bruke de målte masser av tykke geler, beregne det volumetriske svelling forholdet 28 ved Q = 1 + ρ polymer / ρ oppløsningsmiddel (M S / M D-1) hvor ρ polymer = 1,07 g / cm 3 for PEG, 29 ρ løsningsmiddel = 1.0 g / cm 3 for PBS / H 2 O.
        3. Beregne den teoretiske tørrvekt av gelen som skal brukes til Ellmans analyse (her og 5 ul "tynne" geler er typisk used), ved å summere massene av enkeltkomponenter PEG4SH, Pep1Alloc, og Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc). For eksempel, et 5 ul gel inneholdende 10 vekt% PEG4SH inneholder ca. 0,000535 g PEG som beregnes ved M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc og Pep2Alloc masser kan beregnes på lignende måte på grunnlag av vekt% i oppløsning (se arket for verdier), forutsatt ρ ≈ 1,0 g / cm 3 for disse vandige oppløsninger.
          MERK: Geler også kan tørkes og veies stedet for å beregne den teoretiske tørr masse. Imidlertid kan det være utfordrende å konsekvent måle den tørre masse av de tynne, 5 ul geler.
        4. Basert på den antatte tørr masse og Q-verdien bestemmes fra 'tykke' geleer, beregne den anslåtte hovne masse M S for "tynn" gel (ligningen i trinn 3.1.2.1.1). Anta at ρ ≈ 1,0 g / cm S ≈ V S. Bruk dette beregnet V S til å utføre kvantitative Ellmans analysen.
          MERK: Ovennevnte metode er anbefalt å bestemme V s for hovne gels som "tynne" 5 pl gels er vanskelig å overføre til veiing.
      2. Form tynne hydrogeler for mønster som beskrevet i kapittel 2.2 (5 mL volum). Nærmere bestemt lage geler med overskudd av frie tioler og «mønster» halvparten av disse prøver med Pep1Alloc ved hjelp av et dekkglass klar til å oversvømme eksponere hele gelen med lys (f.eks, 6 totale geler med overskudd av tiol: 3 umodifisert ikke-'patterned 'og 3' mønstrede ').
        MERK: For denne analysen, 'mønstret' gels er flom utsatt for lys uten en fotomaske. Denne metoden er benyttet for å bestemme det totale antall av frie tioler forbrukes i hele gelen prøven og for å vise hvordan effektivt fri tioler kan modifiseres med peptid. Fra denne informasjonen,antallet av frie tioler som forbrukes under mønstring med en fotomaske, kan forutsies på grunnlag av gelen tykkelse og mønsterområde (områder som er utsatt for lys).
      3. Stedet 'mønstret' og ikke-'patterned 'geler i brønner i en 48-brønns plate og skyll 3 x 15 min med Ellmans reaksjonsbuffer for å tillate diffusjon av uomsatte arter ut av gelen og likevekt hevelse å forekomme.
      4. Legge til ekstra Ellmans reaksjonsbuffer til de rensede gelene, slik at V er med reaksjonsbuffer er et multiplum på 20 ul. For eksempel, hvis den predikerte V S er 15 pl, tilsett 5 ul reaksjonsbuffer (20 ul), og hvis den predikerte V S er 30 ul, tilsett 10 ul reaksjonsbuffer (40 ul).
      5. Pipetter cystein-standarder i individuelle brønner (ikke inneholdende geler) i en 96-brønns plate i multipler av 20 ul, avhengig av det som brukes i det foregående trinn (dvs. hvis det foregående trinn hadde V S + ekstra reaksjon bUffer = 40 mL, tilsett 40 ul av hver standard til individuelle tomme brønner).
      6. Fortynnet Ellman reagens i reaksjonsbuffer (multipler av 180 ul reaksjonsbuffer + 3,6 mL Ellman reagens, for eksempel, 183,6 for 20 ul eller 367,2 ul i 40 ul i trinn 3.1.2.5).
      7. Legg fortynnet Ellmans reagens til brønner inneholdende standarder og prøver. For 20 ul prøver, legge til 183,6 mL løsning til hver brønn. Dobbelt så mye fortynnet Ellmans reagens i 40 ul prøver (eller skalere følgelig basert på størrelsen av prøven).
      8. Inkuber eller plasseres på en rister i 1 time og 30 min (ved romtemperatur) eller inntil fargen på oppløsningen tilsvarer fargen av gelene ved visuell inspeksjon for å sikre tilstrekkelig diffusjon av gul 2-nitro-5-tiobenzoat dianion (TNB 2-), som genereres ved reaksjon av Ellmans reagens med frie tioler, fra gelen.
      9. Ta 100 mL av løsningen fra prøver og standards og fyll i brønner i en 96-brønns plate.
      10. Les absorbansen ved 405 nm på en plateavleser.
      11. Å behandle dataene, plotte standardkurven (prøver fra trinn 3.1.1.3) (absorbans versus konsentrasjon) og passer en lineær funksjon. Ved hjelp av den lineære funksjon, idet konsentrasjonen av frie tioler i 'fortynnede gel' oppløsning (gel + reaksjonsbuffer) kan beregnes på grunnlag av avlesninger. Til slutt, idet det tas hensyn til "fortynning" med reaksjonsbuffer, bestemme den frie tiol-konsentrasjonen i gelene uten reaksjonsbuffer. (For eksempel hvis 15 mL gel ble fortynnet med 5 pl reaksjonsbuffer, multipliser med 20/15).
    3. Visualisering av photopatterns med Ellman reagens (figur 3A).
      1. Sug tynne hydrogeler mønstret med Pep1Alloc i Ellman reaksjon buffer for en time.
      2. Fjern overflødig reaksjon buffer ved å tørke forsiktig rundt kantene på hydrogel med en vev.
      3. Pipetter Ellmans reagens direkte på overflaten av gelen. Umiddelbart bilde på et lysmikroskop ved 10X eller stereomikroskop med en fargekamera.
        Note: Geler skal avbildes umiddelbart fordi visualiseringsmønstre vil forsvinne i løpet av 5 minutter som en gul TNB 2- ion produsert ved spaltning av Ellmans reagens ved reaksjon med tioler i ikke-mønstrede område diffunderer gjennom gelen. Ikke-mønstrede regionene vises svakt gul for det blotte øye; for bedre oppløsning og mindre mønstre, forstørrelse (f.eks bruk av et mikroskop) er påkrevd.
  2. Visualisering av Photopatterns med Fluorescent Peptider (figur 3B).
    1. For å visualisere mønstre med høyere oppløsning eller i tre dimensjoner, photopattern en AF488-modifisert Pep1Alloc (eller lignende fluorescerende peptid) til gelene i trinn 2.2.
    2. Bildet på en fluorescerende mikroskop. En konfokalmikroskop kan brukes her for å ta z-stACK-bilder av gelen, slik at mønsteret kan observeres i x-, y-, og z-plan.
      MERK: Med fluorescens, må gels beskyttes mot lys for å sikre stabiliteten i AF488 fluoroforen og maksimal fluorescens. Gel trenger ikke å være umiddelbart avbildes siden fluorescerende peptid er ganske stabil hvis beskyttet mot lys (butikk i en beholder innpakket i folie ved 4 ° C).

4. Cell Innkapsling i Hydrogeler og Photopatterning

  1. Samle og forberede celler for innkapsling.
    1. Etter standard sterile pattedyrcellekultur prosedyrer, trypsineres og samle celler av interesse fra platene. Slukke trypsin med vekstmedium etter adskillelse finner sted (f.eks, for en T-75 flaske, 5 ml trypsin, tilsett 5 ml medium, skylles plate med 5 ml medium for totalt 15 ml).
      MERK: trypsinering tider kan variere mellom celletypene, men oppstår vanligvis mellom 5 og 15 min. Alternative celle detachment midler (f.eks Versene) kan brukes til å samle celler hvis ønskelig.
    2. Telle-celler (et minimum på 100 eller per produsentens protokoll) fra alikvoter av trypsinert cellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer eller annen celle-telleinnretning når sentrifugering av bulkcellesuspensjonen (90-110 x g, 5 min). Re-suspen cellepellet etter sentrifugering i et minimalt volum av PBS eller vekstmedium og re-teller hvis utgangs trypsinert cellesuspensjonen blir for tynn.
    3. Re-suspendere celler i et minimalt volum PBS og delmengder for hver gel tilstand inn i mikrosentrifugerør, slik at det vil være 5.000 celler / mL når blandet med gelen oppløsning (før polymeriseringen).
      MERK: Typiske celle aliquoter inneholde 300,000-500,000 celler og er nok til å gjøre 60-100 ul av gel / cellesuspensjon som kan brukes til 3-5 x 20 mL geler med 5.000 celler / mL. Høyere eller lavere celletettheter kan anvendes for innkapsling, avhengig av mengden av celle-celle-vs. celle-matriks kontakt ønsket, henholdsvis, og bør bestemmes for hver enkelt applikasjon.
    4. Sentrifuger celle / PBS alikvoter (90-110 x g, 5 min).
    5. Nøye aspirer PBS fra cellepelleten i mikrosentrifugerør rett før innkapsling.
      MERK: Hvis cellene er følsomme for skjærkrefter, kan det andre sentrifugeringstrinn bli eliminert ved å telle (f.eks hemocytometer) og deretter aliquotting den trypsinert cellesuspensjonen (trypsin + medium + celler) i deler som trengs for hvert gel-tilstand. Disse alikvoter ble sentrifugert én gang (90-110 x g, 5 min), og trypsin + mediet sugd av og etterlater en cellepellet for innkapsling.
  2. Innkapsle Celler i Non-mønstrede Hydrogeler.
    1. Umiddelbart etter å aspirere PBS, suspendere pelle celler i PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ som beregnet i regnearket til en sluttkonsentrasjon på 5000 celler / mikroliter.
    2. Mold og polymer hydrogeler som descrIbed i trinn 2.1.2 til 2.1.6.
      MERK: Når innkapsle cellene i glass glideformer, må man være forsiktig når du fjerner den øverste lysbildet etter polymerisering for å hindre klipping gel, noe som kan føre til celledød. For å hjelpe med fjerningen av gelen fra formen, kan glidestøpeformer plasseres i steril PBS eller vekstmedium etter polymerisering for å fukte pakningen og hydrogel, noe som gjør det lettere å fjerne det øverste lysbildet. En fremgangsmåte for å forhindre dette skjær helt er gjennom bruk av sprøytestøpeformer.
    3. Skyll geler 3 x 10 minutter i dyrkningsmedium for å fjerne uomsatte arter og overskytende LAP.
    4. Inkuber geler i vekstmedium ved 37 ° C og 5% CO2 inntil det ønskede tidspunkt for videre analyse. Etterfyll medium hver 48 time, eller som bestemt for programmet (f.eks typiske fôring intervall for bestemt celletype og medium).
  3. Innkapsling Cells og Photopatterning i nærvær av celler.
    1. Umiddelbart etter å aspirere PBS,suspendere pelle celler i PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ som beregnet i regnearket til en sluttkonsentrasjon på 5000 celler / mikroliter. La en passende konsentrasjon av frie tioler (f.eks, 2 mm) for senere omsetning med Pep1Alloc.
    2. Mold, polymerisere, og mønster hydrogeler som beskrevet i trinn 2.2.2 til 2.2.8.
    3. Skyll geler 3 x 10 min i vekstmedium etter mønstring for å fjerne uomsatte arter og overskytende LAP.
    4. Inkuber geler i vekstmedium ved 37 ° C og 5% CO2 inntil det ønskede tidspunkt for videre analyse. Etterfyll medium hver 48 time eller bestemt ved søknaden.

5. Fastsettelse av Livskraftig og metabolsk aktivitet av innkapslede celler

  1. Opptre live / Døde Cvtotoksisitetsmålinq fastslår Encapsulated Cell Livskraftig (Figur 4A).
    1. Fjern vekstmedium fra geler og skyll 3 x 15 minutter med PBS for å tillate diffusjon av mediet fra gels.
    2. Tine levende / døde cytotoksisitet analyseløsninger (ethidium homodimer-1 og calcein am).
    3. Tilsett 2 mL av de 2 mM etidium homodimer-1 og 0,5 mL av 4 mm calcein AM løsninger til 1 ml steril PBS. Vortex for å sikre fullstendig blanding.
    4. Tilsett 300 ul fargeløsning til hver sprøyte mugg gel i 48-brønners plater, eller tilstrekkelig til å dekke overflaten av gelen på en glassplate i en steril fatet, og inkuber i 45 min.
    5. Fjern overskudd fargeløsning og skylling for å fjerne overskudd av fargestoff fra gelene (3 x 15 minutter med PBS).
    6. Bildet på en konfokal mikroskop (z-stack bilder) eller på en epi-fluorescens mikroskop med z-stack evne til 10X og 488/525 nm Ex / Em. Kvantifisere antallet levedyktige celler ved å projisere z-stabler og telle antall levende (grønn hele cellen kroppen) og døde (røde kjerner) celler med bildebehandlingsprogrammer.
  2. Utfør metabolsk aktivitet analyse for å bestemme celleaktivitet etter innkapsling (Figure 4B).
    1. 24 timer før analyse, mate innkapslede celler med friskt vekstmedium.
      MERK: Legg medium til et par ekstra brønner (inneholder ingen gels eller gels med ingen celler) som kontroll (bakgrunnsavlesninger).
    2. På tidspunktet severdighet, tine MTS-reagens løsning.
      MERK: For å bestemme metabolsk aktivitet over tid, er en innledende tidspunkt (12-24 timer etter innkapsling) anbefales som en referanse for sammenligning med senere tidspunkter.
    3. Legg MTS-reagens til hver brønn (20 ul per 100 ul vekstmedium).
    4. Inkuber prøvene for 1-4 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Inkubasjonstider bør være tilstrekkelig for cellene til å redusere MTS og tillate diffusjon av formazanprodukt ut av gelen. Følgelig kan tykkere geleer som sprøytespissen gels krever lengre inkubasjonstid (~ 4 t) for tilstrekkelig MTS reduksjon og diffusjon.
    5. Pipetter 100 mL redusert MTS / Mediumi rene brønner i en 96-brønns plate og plate absorbans ved 490 nm på en plateavleser.
    6. Trekk bakgrunnen absorbans for brønner uten celler fra prøve absorbans verdier for å generere frosset absorbans verdier.

Representative Results

Oppsettet og fremgangsmåte for å photoencapsulate celler og deretter photopattern geler inneholdende innkapslede celler er vist i figur 1, og et eksempel for fremstilling av forrådsoppløsninger for å danne en 10 vekt% gel er gitt i tabell 1. Ved hjelp av tabell 1, er mengden av monomerene (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) og fotoinitiatoren (LAP) som kreves for å polymerisere hydrogeler beregnes. På grunnlag av disse beregningene, er stamløsninger av PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, og LAP fremstilt og blandet med og uten Pep1Alloc for forming og photopatterning geler, respektivt (figur 1A). Deretter blir cellene oppsamlet fra platene, telles og sentrifugert i passende mengder for innkapsling (figur 1B). Cellepelleten blir resuspendert i gel-dannende oppløsning (peptid / polymer / LAP i PBS), og celle / monomerblandinger er overført til glass eller sprøyte molds. Celler blir innkapslet i den hydrogel ved tilførsel av lys (1-5 minutter på 10 mW / cm 2 ved 365 nm) (figur 1C). For photopatterning (figur 1D), er gels dynket med Pep1Alloc og LAP i 30 min til 1 time og 30 min, slik at spredning av peptid og initiativtaker til den polymeriserte matrise. Disse peptid-laden geler er dekket med fotomasker med ønskede mønstre og utsatt for en andre dose av lys (1 min) for å konjugere peptidene til frie tioler inne i matriksen. Anheng tjoringer er bare kovalent bundet til gelen i områder som er utsatt for lys, tilrettelegging passende celle-matriks-vekselvirkninger og å etterligne nøkkel mekaniske og biokjemiske egenskaper av det native cellemikromiljøet mot sentret cellefunksjon og skjebne in vitro.

Ellmans analysen gir en lettvint og billig metode for å kvantifisere gel modifikasjon og peptid innlemmelse innen photopatterned underlag. Mønstret og ikke-mønstrede gels (dvs. gels med eller uten peptid modifikasjon) er dynket i Ellman reaksjon buffer post-polymerisasjon. Deretter blir cystein-standarder og gelene dynket i buffer plassert i 48-brønners plater og inkubert med Ellmans reagens (figur 2A, til venstre). Etter 1 time og 30 minutter, blir porsjoner av prøvene plassert i individuelle brønner i en 96-brønners plate, og absorbansen blir registrert ved 405 nm. En kalibreringskurve (figur 2A, høyre) fra cystein standarder plottes (absorbans vs konsentrasjon, lineær tilpasning), og mengden av frie tioler i gels kan bestemmes på grunnlag av deres fortynningsfaktoren. Disse frie tiol konsentrasjoner for forskjellige polymerisasjons- og photopatterning betingelser for en 10 vekt% gel er vist i figur 2B. Geleer polymeriserte for 1 eller 5 min uten Pep1Alloc (blå søyler, I = 1 min og II = 5 min) har statistisk lignende gratis tiol konsentrasjoner, noe som indikerer that en rask reaksjon, og gelatinering er fullstendig i løpet av 1 min (to-halet t-test, p> 0,05). Dermed gjør ytterligere eksponering for lys (2-5 minutter) ikke resulterer i ytterligere omdannelse av funksjonelle grupper. Geler polymerisert i 1 min uten Pep1Alloc ble fuktet med Pep1Alloc (3 mg / ml) og LAP (2,2 mM) i 30 og 90 min (grønne linjer, II = 30 min og IV = 90 min) og utsatt for en andre dose av lyset i 1 min. Nedgangen i frie tioler (60-80% i forhold til 1 min tilstand) viser effektiv modifikasjon av geler med anheng signaler under disse betingelser. Hvis høyere endring er ønskelig, kan økte konsentrasjoner av Pep1Alloc oppløsningen brukes som tilgjengelighet av Pep1Alloc til frie tiol i mer fortynnet peptid løsninger kan begrense konvertering; for eksempel har vi funnet at konsentrasjoner på opp til 20 mg / ml Pep1Alloc produsere> 90% omdannelse av frie tioler.

Unikt, mønstre av peptider til hydrogelen kanhurtig avbildes med Ellmans reagens (figur 3A, under 5 min). Imidlertid er visualiseringen av mønsteret tapt over tid (mer enn 5 min) på grunn av diffusjon av den gule TNB 2- dianionet gjennom gelen. For å forbedre avbildning oppløsning og observere mønstre i tre dimensjoner (x-, y-, og z-fly) og i nærvær av celler, kan fluorescerende peptid tilsetning (AF488Pep1Alloc) anvendes. I figur 3B x-, er y- og z-projeksjoner av bildestakker tatt med et konfokalmikroskop vist, viser mønsteret oppløsning (mikrometer skala).

Omtrent (94 ± 2)% og (94 ± 1)% av hMSCs innkapslet i nedbrytbare gels (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) forblir levedyktige (grønne cellelegemer) 1 og 6 dager etter innkapsling, henholdsvis med noen døde celler (røde kjerner ) observert (figur 4A). Videre HMSC spredning er observert på 6 dager etter innkapsling ( rong> 4A, innfelt), som indikerer at cellene kan fornye og samhandle med disse MMP-nedbrytbart matriser modifisert med integrin-bindende RGDS. Metabolsk aktivitet analyser utført på celler innkapslet i ikke-nedbrytbare gels (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 og 3 dager etter innkapsling (figur 4B) gir en andre mål på celle levedyktighet og vise at cellene forblir aktive for de ulike photoencapsulation og photopatterning forhold testet med Ellmans analyse (figur 2B). Spesielt er det ingen signifikant forskjell i metabolsk aktivitet mellom 30 min og 90 min inkubering Pep1Alloc + LAP (forhold III og IV) og den første innkapsling (betingelser I og II), noe som indikerer at prosedyren er egnet for anvendelser av photopatterning i nærværet av innkapslede celler (to-halet t-test, p> 0,05).

2fig1.jpg "/>
Figur 1:. Oppsett for innkapsling av celler i hydrogeler og deretter photopatterning med biokjemiske cue (A) Stamløsninger av makromerene og fotoinitiator er forberedt og blandet (PEG4SH = ryggrad, Pep2Alloc = crosslink, Pep1Alloc = anheng lim-delen (RGDS), LAP = fotoinitiator ). (B) Celler ble oppsamlet for innkapsling. (C) Cellene ble blandet med makromer oppløsninger uten eller med integrin-bindende peptider (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP eller PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, henholdsvis) og er innkapslet ved eksponering for lys. (D) Geler inneholdende overskudd av tiolgrupper i løpet av geldannelse (her, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, dannet med 2 mM overskudd av tiol) kan være mønstret med biokjemiske signaler ved etterfølgende tilsetning av peptider funksjonalisert med en enkelt alloc gruppe (Pep1Alloc, f.eks RGDS, IKVAV, etc.) for å fremme celle adhesjoninnenfor bestemte områder av gelen. Her fordelingen av geler med fluoresceinmerkede RGDS vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Kvantitativ Ellmans analyseoppsett og resultatene for å evaluere modifikasjon av mønstrede hydrogeler (A) Gels og cystein-standarder blir inkubert i 48-brønners plater med Ellmans reagens. En lineær standardkurve plottes for å bestemme cystein konsentrasjon i gel prøver. (B) overskytende frie tioler er innarbeidet i hydrogeler under geldannelse og forbrukes ved mønstring med et anheng alloc-peptid (I = 1 min polymerisasjon; II = 5 min polymerisasjon; III = 30 min inkubering med Pep1Alloc; IV = 90 minutters inkubering wi th Pep1Alloc; både III og IV polymerisert og mønstret med lys i 1 min). Dataene som vises illustrerer gjennomsnittet (n = 3) med feilfelt som viser standard feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Ellmans analyse og fluorescerende bilder for å visualisere photopatterned hydrogeler (A) Ellmans reagens kan brukes for å raskt detektere mønstre (linjer) i x- og y-plan (gul = umønstret region, Skala bar = 1 mm). (B) Fluorescerende peptider kan anvendes til å observere mønstre i x-, y-, og z-plan (grønn = mønstret region; 200 um skala bar; 10X vann-dypp målsetting, Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
. Figur 4: Livskraftig og metabolsk aktivitet i celler i ikke-nedbrytbare photopatterned hydrogeler (A) Eksempel confocal z-stack (z-projeksjon; 10X vann-dipping objektiv) av levedyktig (grønn, Ex / Em 488/525 nm) og døde hMSCs (rød, Ex / Em 543/580 nm) innkapslet i hydrogeler 24 timer etter innkapsling (Scale bar = 200 nm). Celler spredt innenfor disse hydrogeler 6 dager etter innkapsling (innfelt bilde, Scale bar = 50 mikrometer). (B) Celler er metabolsk aktiv 1 og 3 dager (mørke og lyse barer, henholdsvis) post-innkapsling for de forskjellige polymerisasjonstrinn (I = 1 min polymerisering; II = 5 min polymeriseringen) og mønstrings forhold (III = 30 min inkubering med Pep1Alloc ; IV = 90 min inkubering, blen med Pep1Alloc; både polymerisert og mønstret med lys i 1 min). Dataene som vises illustrerer gjennomsnittet (n = 3) med feilfelt som viser standard feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Eksempel oppsett for å beregne volum av stamløsninger for å gjøre hydrogeler celler i regnearket som er markert blått indikerer brukerdefinerte parametere;. de andre mengdene er beregnet basert på disse innstillingene. De endelige volum for hver lageroppløsning for å lage en gel som er fremhevet orange. De hvite cellene inneholder formler som brukes til å beregne de endelige volumer basert på brukerdefinerte parametere. Merk at en konsentrasjon på 2,2 mM LAP tilsvarer 0,067 vekt%.

Discussion

Prosedyren som presenteres her demonstrerer teknikker for å photoencapsulate celler i hydrogeler dannet av tiol-ene klikk kjemi og senere photopattern gels med biokjemiske signaler. Bruken av lyset til å begynne med danne hydrogeler gir homogen blanding og suspensjon av cellene i løpet av polymeroppløsningen før polymerisasjon. Rapid polymeriseringsbetingelser "låser" av gelen i form av den definerte formen og innkapsler suspenderte celler i den hydrogel-nettverket. Gel også kan støpes inn i mange forskjellige former (f.eks glass eller sprøyte tips) avhengig av den endelige søknaden ønsket. For eksempel kan celler innkapslet for 3D-kultur i hydrogeler som er knyttet til objektglass er særlig anvendbare for bildebehandlingsapplikasjoner som lett demping er begrenset innenfor en tynn prøve. Sprøytestøpeformer kan benyttes for hurtig innkapsling av celler, slik at et større antall prøver som fremstilles i løpet av kort tid (i forhold til glass-slidee) som kan brukes til eksperimenter som krever et stort antall celler slik som strømningscytometri eller qPCR. Deretter disse gels så kan mønstret med biokjemiske signaler for å lokke fram ønskede cellulære responser som differensiering eller invasjon. 30,31

Analyser for levedyktighet og metabolsk aktivitet indikerer overlevelse av celler for materialet system og mønstring av betingelser som er presentert. Legg merke til at den metabolske aktiviteten ble monitorert inntil dag 3 i ikke-nedbrytbare geler (RGKGRK peptid fornettes) å vurdere den første effekten av polymerisasjons- og mønstrings forhold på cellefunksjon. I tillegg er en membran integritet analyse (live / dead levedyktighet / cytotoksisitet farging) av hMSCs 1 og 6 dager etter innkapsling i geleer formulert med et nedbrytbart peptid tverrbinding (GPQGIWGQ) støtter at celler forblir levedyktige og spres på en uke i kultur. Levedyktigheten av ytterligere cellelinjer som er blitt rapportert for photopatterning betingelser 32 som ligner de sombrukt her og kan bli vurdert for den beskrevne hydrogel systemet med live / dead farging og metabolske aktivitetsanalyser. Selv om vi ikke har observert problemer med celleviabilitet bruker dette materiale system og tilhørende prosedyrer (4.2 og 4.3), kan enkelte celletyper være følsomme for fri-radikal og / eller lys. I dette tilfellet kan brukere anser ved hjelp av ikke-photoinitiated materialer systemer, så som azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserte hydrogel formasjons kjemi. 33

Lettvinte teknikker for å oppdage og kvantifisere fordelingen av biokjemiske signaler innenfor gels også presenteres (3,1 og 3,2). Ellmans analyse er av særlig interesse fordi reagensene er kommersielt tilgjengelige, og ingen ekstra syntetiske behandlingstrinn, eller mer kostbare reagenser (for eksempel fluorescens-merkede peptid) kreves. Ellmans analyse kan benyttes til å bestemme nøyaktig den modifikasjon av frie tioler med biokjemiske signaler i henhold til ulike geografiskent photopatterning tilstander, samt for å visualisere hurtig mønstre. For å kvantifisere inkorporering peptid, tiol-funksjonell gruppe konsentrasjon før og etter mønstring, som et kvantitativt mål på peptid innlemmelse, er direkte vurderes med Ellmans analyse. Selv om denne type kvantifisering kan utføres med fluoresceinmerkede peptider, krever 34 bildebasert kvantifisering mer tidkrevende håndtering og analysetrinn (for eksempel syntese av et fluorescensmerket-merket peptid og generering av en kalibreringskurve for å relatere fluorescens til peptidkonsentrasjonen ved hjelp av bildeanalyse). For avbildning peptid inkorporering, kan Ellmans reagens være direkte brukes til prøver og umiddelbart visualisert. Mens begrenset til x- og y-planene for visualisering mønster, kan den teknikk som brukes som en enkel, rutinemetode for å bestemme om matriser inneholdende frie tiolgrupper er mønstret. Det er viktig å merke seg at Ellmans analyse er ikke considered cytocompatible, slik at selv om det kan anvendes til å observere og kvantifisere photopatterns, kan det ikke gjøres i nærvær av celler. For avbilding av mønster i tre dimensjoner, og i nærvær av celler, forblir konjugering av fluorescerende peptider innenfor hydrogel matriser et kraftig og mye brukt metode. Oppløsning av mønstre kan evalueres i x-, y-, og z-plan ved hjelp av konfokal mikroskopi, og denne fremgangsmåte er cytocompatible, slik at cellene i mønstrede områder eller ikke-mønstrede områder kan identifiseres. Til sammen Ellmans analyse og bildebaserte teknikker er komplementære verktøy for forskere å vurdere både kvantitativt og kvalitativt photopatterning av biokjemiske signaler innenfor materialer system.

Photo, eller i videre forstand photoinitiated, kjemi for dannelse og modifikasjon av hydrogeler i nærvær av celler er mange. Profilstålene, innkapsling, og mønstrings teknikkene som presenteres her er ikke limset til det beskrevne materiale system og kan anvendes til alternative lys-basert kjemi, slik som tiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 og andre tiol-en kjemi (f.eks tiol-norbornen), 10,13 så vel som med forskjellige fotoinitiatorer, så som Irgacure 2959, Eosin Y, og kamferkinon. Obs, kan brukerne trenger å justere prosedyren parametere (f.eks inkubasjonstid, Polymerisasjon ganger, celle tetthet) for å sikre at forholdene fortsatt cytocompatible for disse andre systemer. Siden mønstringsprosess krever diffusjon av det alloc-modifiserte peptid (e) inn i hydrogelen (2.2.3-2.2.5) Denne prosessen kan vise seg å være mest nyttige for tilsetningen av integrin-bindende grupper (for eksempel peptider eller ekstracellulært matriksprotein fragmenter) til hydrogelen, hvor festing av liganden til nettverket er nødvendig for generering av trekkrefter av cellen og full-integrin-aktivering. 36 Note, til biomolekyler som kanskjeå være like aktiv i oppløsning eller ved immobilisering (f.eks, vekstfaktorer eller cytokiner), kan det inkuberingstrinn for delen diffusjon (~ 1 time) inn i hydrogelen føre til at signaleringshendelser som convolute mønster resultater. Andre fremgangsmåter er blitt etablert for vekstfaktor immobilisering eller lokal lagring for deres mønster. 37-39 tillegg er mønsteret oppløsning diktert av kontroll over lyseksponering. Her, fotomasker tillate opprettelse av mønstre gjennom gelen dybde og i x- og y-plan; imidlertid kan større romlig kontroll over fordelingen av biokjemiske signaler innenfor geler oppnås ved alternative metoder for bestråling, slik som bruk av en to-foton konfokalt mikroskop for å generere mønstre i x-, y- og z- plan. 34,40 til slutt er det viktig å merke seg at mens materialet systemet utnyttes innen denne prosedyren er kun innledningsvis modifisert med biokjemiske signaler, kunne ortogonale Photo kjemi anvendes for å tillate alterasjoner i matrise egenskaper over tid. 12 prosedyren og teknikkene som presenteres her legge mangfold til dagens metoder for å lage syntetiske matriser med veldefinerte og spatiotemporally-kontrollerte egenskaper. Spesielt vil den kommersielle tilgjengeligheten av reagenser og materialer som brukes i denne fremgangsmåten være nyttig for et bredt spekter av forskere som er interessert i bruk av hydrogel-baserte biomaterialer for bruk i kontrollert cellekultur.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Delaware Cobre programmene i Drug Discovery og i Avanserte biomaterialer finansiert av institusjonell utvikling Awards fra National Institute of Generals medisinske basalfag ved National Institutes of Health (P20GM104316 og P30 GM110758-01, henholdsvis), Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), den Burroughs Wellcome Fund (1.006.787), og National Science Foundation IGERT SBE2 program ved University of Delaware (fellesskap til L. Sawicki). Forfatterne takker Delaware Bioteknologi Institute Bioimaging Center ved University of Delaware for opplæring og tilgang til konfokalmikroskopi, Ms Katherine Wiley for assistanse under videoen skyte, Mr. Matthew Rehmann for sjenerøst gi hMSCs isolert fra benmarg, professor Christopher J . Kloxin og Mr. Stephen Ma for sjenerøst gi fotomasker, og Prof. Wilfred Chen for bruk av automatisert plateleser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Peptides Various Vendors ---- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 ml Chemglass CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors ----
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors ----
Vacuum Dessicator Various Vendors ----
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors ---- 1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation ---- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors ---- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors ---- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors ---- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies ---- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss ---- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH ---- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  2. Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
  3. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
  4. Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
  5. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
  6. Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
  7. Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
  8. Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
  9. Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
  10. Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
  11. Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
  12. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
  13. Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
  14. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
  15. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
  16. Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
  17. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  18. Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
  19. Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
  20. Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
  21. Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
  22. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  23. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  24. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
  25. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
  26. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
  27. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
  28. Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
  29. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
  30. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
  31. Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
  32. Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
  33. Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
  36. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  37. Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  38. Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
  39. Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
  40. Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).

Tags

Bioteknologi biomaterialer photoencapsulation photopatterning cellekultur stillas hydrogel ekstracellulære matrise ligne peptider
Lys-mediert Dannelse og fordelingen av Hydrogeler for cellekultur Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sawicki, L. A., Kloxin, A. M.… More

Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter