Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Light-medieret dannelse og mønsterdannelse af hydrogeler til celledyrkningsapplikationer

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54462
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Abstract

Klik kemier er blevet undersøgt til anvendelse i talrige biomaterialer applikationer, herunder drug delivery, tissue engineering, og cellekultur. Især lys-medierede klik reaktioner, såsom photoinitiated thiol-en og thiol-yn-reaktioner, hvilket gav Spatiotemporal kontrol over materialeegenskaber og tillade udformningen af ​​systemer med en høj grad af brugervenlighed rettet ejendom kontrol. Fabrikation og ændring af hydrogel-baserede biomaterialer ved hjælp af præcision ydes af lys og den alsidighed, der tilbydes af disse thiol-X PhotoClick kemier er af stigende interesse, især til dyrkning af celler i veldefinerede, biomimetiske mikromiljøer. Her beskriver vi fremgangsmåder til photoencapsulation af celler og efterfølgende photopatterning af biokemiske signaler inden hydrogelmatricer vha alsidige og modulære byggeklodser polymeriseres ved en thiol-en PhotoClick reaktion. Specifikt er en strategi, der fremlægges for constructing hydrogeler fra allyloxycarbonyl (Alloc) -funktionaliserede peptid tværbindinger og vedhæng peptidgrupper og thiol-funktionaliserede poly (ethylenglycol) (PEG), der hurtigt polymeriserer i nærværelse af lithium acylphosphinate fotoinitiator og cytocompatible doser af langbølget ultraviolet (UV) lys. Overfladiske teknikker til at visualisere photopatterning og kvantificere koncentrationen af ​​peptider der adderes, er beskrevet. Derudover er etablerede metoder til indkapsling celler, specifikt humane mesenkymale stamceller, og bestemmelse af deres levedygtighed og aktivitet. Mens dannelsen og indledende mønsterdannelse af thiol-Alloc hydrogeler Her vises, disse teknikker bredt kan anvendes på en række andre lette og radikal-initierede materiale systemer (f.eks thiol-norbornen, thiol-acrylat) til at generere mønstrede substrater.

Introduction

Klik kemier anvendes i stigende grad i udformningen af materialer til mange biomedicinske applikationer, herunder drug delivery, tissue engineering, og kontrolleret cellekultur, på grund af deres selektive, effektive, og ofte cytocompatible reaktiviteter. 1-3 PhotoClick kemier, der udnytter lys til at udløse eller indlede reaktioner (f.eks, azid-alkyn, 4 thiol-en, fem og tetrazole-alken 6) er af særlig interesse for dannelsen eller ændring af biomaterialer. Rapid satser under milde betingelser og kontrol over, hvornår og hvor de finder sted med lys gør disse reaktioner velegnede for bruger-rettet styring af biomateriale egenskaber i overværelse af celler. 7,8 Især har thiol-en PhotoClick kemier blevet brugt at generere hydrogel-baserede biomaterialer med robuste mekaniske egenskaber 5,9 og til indkapsling af en lang række celletyper, herunder, men ikket begrænset til, humane mesenkymale stamceller (hMSC'er), fibroblaster, chondrocytter og pancreasceller, med løftet til celledyrkning og levering. 10,11 Yderligere har disse kemier blevet anvendt til den rumlige mønsterdannelse af biokemiske signaler til at efterligne centrale aspekter af native celle mikromiljøer og lette passende celle-matrix-interaktioner, herunder adhæsion, differentiering og invasion. 3,12

Til konstruktion af thiol-en hydrogeler med lys, peptider der indeholder cysteiner (thiol) reageres sædvanligvis med polymerer funktionaliseret med acrylater eller norbornener ( 'en-") for hurtig, photoinitiated polymerisering under cytocompatible betingelser. 13. Udvidelse denne værktøjskasse, vi søgte at etablere metoder til hydrogel formation med nye alsidige og tilgængelige byggesten, der krævede minimal syntetisk forarbejdning eller var kommercielt tilgængelige mod deres brede anvendelse som syntetiske ekstracellulære matricer.14 Konkret blev peptider modificeret med allyloxycarbonyl (Alloc) -beskyttet lysiner: en for vedhæng, integrin-bindende grupper for at fremme celleadhæsion [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller to for ikke-nedbrydelige eller celle-nedbrydeligt tværbindinger [K ( alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc hhv]. Med disse sekvenser, blev fastsat betingelser for hurtig reaktion (1-5 min) med fire-arm thiol-modificerede poly (ethylenglycol) (PEG4SH) ved anvendelse cytocompatible doser af langbølget UV-lys (10 mW / cm2 ved 365 nm) og fotoinitiatoren lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogeler var stabile under celle dyrkningsbetingelser for uger. At muliggøre celle-drevet nedbrydning og remodellering blev en enzymatisk spaltelig peptid indarbejdet i gelen tværbindinger (dvs. GPQGIWGQ), 15 og en model primær celle, humane mesenkymale stamceller (hMSC'er), forblev stærkt levedygtige efter indkapsling og During kultur i disse matricer. Endvidere er peptider blevet rumligt mønstret inden for disse materialer, og hMSC'er forbliver levedygtige og metabolisk aktive under photopatterning betingelser. Alternative vedhæng peptidsekvenser, som ikke er vist her (f.eks IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), også kan inkorporeres i matricer til at probe yderligere celle-interaktioner med det omgivende mikromiljø. Disse resultater er lovende for anvendelse af disse hydrogel-baserede materialer til tredimensionel (3D) cellekultur og levering til at studere og direkte celle-matrix-interaktioner for en række forskellige celletyper.

Heri, fremgangsmåder photoencapsulate celler og efterfølgende photopattern biokemiske signaler inden for den foreslåede hydrogelsystem præsenteres (figur 1). Teknikker til at observere og kvantificere disse photopatterns også er påvist: især, i) den kvantitative og kvalitative brug af Ellmans assay til at bestemme ændringer udvition af frie thioler inden mønstrede substrater og ii) den komplementære kvalitative brug af fluorescerende peptider (AF488Pep1Alloc) at observere disse mønstre i tre dimensioner. Endvidere kan assays bestemme levedygtigheden (live / dead levedygtighed / cytotoksicitet farvning) og metabolisk aktivitet (MTS; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) 2H-tetrazolium) præsenteres, så brugerne kan bestemme cytocompatibility af photoencapsulation og photopatterning betingelser for forskellige cellelinjer inden hydrogel matricer. Mens protokollen påvises en let lysbaseret PhotoClick hydrogelsystem, kan teknikkerne anvendes på talrige andre radikalt initieret hydrogel systemer til photoencapsulation og photopatterning i nærvær af celler.

Protocol

1. Forberedelse af materialer til Hydrogel Formation

  1. Syntetisere vedhæng (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) og tværbindende peptider (Pep2Alloc) ved standard fastfasepeptidsyntese (SPPS) teknikker og thiol-funktionaliserede polymer med tre-trins procedure for enden gruppe modifikation (PEG4SH). 14,16 Alternativt købe PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc, og Pep2Alloc kommercielt.
  2. Syntetisere fotoinitiator (LAP) ved to-trins reaktion beskrevet nedenfor. 14,17 Udfør syntese trin (1.2.1-1.2.11) i et stinkskab og forsigtig omgang med kemikalier (bære beskyttelseshandsker, tøj og briller) . LAP også kan købes kommercielt.
    1. Tør alle glas i ovnen (> 2 timer, 80 ° C).
    2. Tilføj en omrørerstav til en tom enkelt-halset rundbundet kolbe (100 ml) og dækkes med en skillevæg.
    3. Fastgør kolbe på toppen af ​​en magnetisk omrøring varmeplade med en ring stativ og klemme.
    4. jegnsert en nål (18 G) gennem skillevæggen og efterlade den ydre ende åben til atmosfæren. Indsætte en anden nål fastgjort til en inaktiv gas linje. Åbn inaktiv gas linie (f.eks, argon eller nitrogen) og rense kolben i 10-15 min.
      BEMÆRK: Systemet vil løbende blive gennemskyllet med inaktiv gas, argon eller nitrogen, under reaktionen.
    5. Transfer 1,5 g (~ 1,4 ml) dimethyl phenylphosphonite (PAS) til kolben under anvendelse af en sprøjte med nål til at stikke gennem skillevæggen. Tænd opsigt plade (medium hastighed), og passe på, at indholdet ikke plaske på siderne af kolben.
    6. Tilføj 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimethylbenzoyl chloride (PAS) dråbevis til kolben indeholdende dimethyl phenylphosphonite, under anvendelse af en sprøjte med en nål til at gennembore septum.
    7. Dæk reaktionsbeholderen med folie for at beskytte mod lys og omrøres i 18 timer under argon eller nitrogen.
    8. Den næste dag, hæve højden af, anbringes et oliebad på omrører,kolben ind i oliebad nd sænk forsigtigt. Varm bad og kolben til 50 ° C under opretholdelse magnetisk omrøring.
    9. Opløs 3,05 g lithiumbromid i 50 ml 2-butanon. Kolben Hæv ud af oliebadet og tilsæt lithiumbromid løsning på det rundbundet kolbe, kortvarigt at fjerne skillevæggen at hælde i kolben.
      1. Kolben lukkes igen med skillevæggen (ADVARSEL: Septum vil stadig have en nål, der fører til de argon linjer og en nål til at lufte), kolben sænkes tilbage i opvarmet oliebad, og reaktionen lades forløbe i 10 min. Et fast bundfald vil dannes.
    10. Efter 10 min, sluk argon, kolben fjernes fra varmen, og lad blandingen hvile i 4 timer (dækket med folie for at beskytte mod lys som en lysfølsom initiativtager er blevet produceret. Hold udluftning nål sted.
    11. Hæld produktet i et glas fritte tragt eller tragt foret med passende filter papir. Skyl filtrat 3 gange med 50 ml 2-butanon til rEFlyt eventuelt uomsat lithiumbromid.
    12. Tør (først på benchtop og derefter i vakuum ekssikkator) og analysere produkt ved 1H NMR i D 2 O. Karakteristiske toppe ved 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m), og 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17
  3. Brug et regneark til beregning af volumen og koncentrationen af hver stamopløsning (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP), der skal være parat til at gøre hydrogeler (tabel 1). For at gøre ikke-mønstrede geler, at [SH] = [Alloc], således at alle reaktive grupper forbruges under polymerisation. Hvis der er planlagt photopatterning af geler, omfatter en overskydende mængde funktionelle thiolgrupper under geldannelse baseret på støkiometrien (f.eks 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) til senere omsætning med Pep1Alloc.
    BEMÆRK: Geler bør indeholde mere end 5 vægtprocent (vægt%) PEG4SH at sikre hurtig polymerisation (inden for 5 min). Men lavere vægt-% intervals kan udforskes, hvis ansøgningen kræver hydrogeler med lavere moduler (f.eks <0,5 kPa); polymerisering skal kontrolleres og justeres for disse lave vægt-% kompositioner. Tilsvarende kan Pep1Alloc koncentration justeres til forskellige anvendelser (f.eks 0,2-5 mM) som rapporteret i litteraturen for thiol-funktionaliserede peptider. 18-21 LAP koncentration anbefales omkring 0,067 vægt-% (2,2 mM) eller derunder, som beskrevet, som højere koncentrationer kan falde cellelevedygtighed.
  4. Forbered stamopløsninger af Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH, og LAP under sterile forhold for cellekultur baseret på beregninger i tabel 1.
    1. For Pep1Alloc og Pep2Alloc, individuelt vejer den samlede masse af Pep1Alloc og Pep2Alloc fra peptidsyntesen og opløses i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% penicillin / streptomycin (PS) og 0,5 ug / ml fungizon (FZ). Typiske koncentrationer af tilberedt stamopløsninger interval20-100 mg / ml peptid. Bland disse bestande at opnå geler med afsluttende moduler relevant for blødt væv applikationer (Youngs modul ~ 0,5-5 kPa). 22,23 alikvot og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
    2. For PEG4SH, vejer PEG4SH i en steril mikrocentrifugerør og opløses i PBS + PS + FZ. Typiske koncentrationer af denne stamopløsning spænder fra 250 til 430 mg / ml (20-30% PEG4SH vægt).
    3. For LAP afvejes LAP i en steril mikrocentrifugerør og opløses i PBS + PS + FZ til en endelig koncentration på 7,5 mg / ml.
      BEMÆRK: Forberedelse friske opløsninger af PEG4SH og LAP anbefales til enhver indkapsling eller gel eksperiment for at sikre ensartede polymerisationstiderne.
  5. Fremstille sterile sprøjtespidsen forme til Forming Hydrogeler.
    1. Skær forsigtigt spidserne ud af 1 ml sprøjter bruger et barberblad og efterfølgende fjerne stemplerne fra sprøjten aksler.
    2. Nedsænkes sprøjten aksler og stempler i 70% ethanol i 15 min end sted i et sterilt cellekultur hætte for at tørre (30 min). Hvis overskydende dråber af ethanol forblive inde sprøjte skaft, bruge stemplet til at skubbe dem ud.
  6. Fremstille sterile glas-slide forme til Forming Hydrogeler.
    1. Soak objektglas (multipla af 2) og gummipakninger (0,254 mm tyk, 2 små stykker, der anvendes som shims, et rektangel med skiver udstanset eller firkantet ramme form) i 70% ethanol i 15 min, og sted i steril cellekultur hætte at tørre.
    2. Coat halvdelen af de steriliserede dias med anti-klæbende belægning ifølge producentens anvisninger for at forhindre adhæsion af toppen af gelen til glidefladen (fx hvis der er 4 slides, 2 slides vil være coatet med anti-adhæsiv). Disse vil fungere som toppen af ​​objektglasset formen.
  7. Kalibrere lampe til sprøjte eller glas slide forme.
    BEMÆRK: Til disse eksperimenter blev en kviksølvbuelampe med et eksternt filter adapter samling og 365 nm eksternt filter anvendes. Andre lampes, der producerer passende intensiteter af langbølget UV-lys kan anvendes som rapporteret af andre. 24-27
    1. Vedhæfte en kollimatorlinse til slutningen af ​​væskefyldte lysleder at sikre relativt jævn lysintensitet på tværs af alle prøver. Efter behov, justere afstanden af ​​lyslederen fra prøven (er) for at opnå en pletstørrelse som vil dække prøver af interesse.
    2. Placer en nedskæring sprøjte skimmelsvamp i en holder mikrocentrifugerør (at holde sprøjten mug i lodret position). Hold radiometer på højden af sprøjtespidsen, hvor prøverne opbevares og justere lukkeren (% åben) for at opnå en lysintensitet på 10 mW / cm2 ved 365 nm. Optag de justerede indstillinger til senere brug.
    3. Placer et objektglas støbeform på toppen af en steril overflade (f.eks toppen af en pipettespids kasse inden et bio kabinet). Hold radiometer detektor ved højden af ​​objektglasset skimmel og justere lukkeren (% åben) for at opnå en lysintensitet på 10 mW / cm2 ved 365 nm. Optag de justerede indstillinger til senere brug.

2. Hydrogel Dannelse og Photopatterning

  1. Fremstilling af ikke-mønstrede Hydrogeler.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt i protokollen, hvis hydrogeler skal anvendes i celledyrkningsapplikationer, bør alle efterfølgende trin under sterile betingelser i et sterilt kabinet eller hætte.
    1. Bland stamopløsninger af PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ henhold til beregningsmetoden regneark (se tabel 1 eksempel). Pipettere den resulterende gel forstadium opløsning kraftigt for at sikre ensartet opblanding af opløsningen.
    2. Forbered tykke hydrogeler støbt i syringe tip ved pipettering 10-20 pi af gelen precursor-opløsning (PEG / Pep / LAP / PBS) ind i spidsen af ​​en steril, cut sprøjte. Lav en enkelt gel per sprøjte, ca. 0,5-1,5 mm tyk baseret på volumen og sprøjte diameter.
      BEMÆRK: Større mængder kan udforskes på grundlagden ønskede gel størrelse, hvor øvre grænser kan eksistere baseret på diffusionsmæssige begrænsninger for Pep1Alloc under photopatterning og / eller næringsstoffer / affald til / fra indkapslede celler under celledyrkning.
    3. Forbered tynde hydrogeler i objektglas forme ved at placere gummipakningen (0,254 mm tykt) omkring kanterne af det ikke-coatede objektglas. Pipette 5-10 pi gel forstadium-opløsning (enkelt eller flere 5-10 pi geler kan fremstilles ved pipettering en eller flere prikker i opløsning på et enkelt objektglas) på den ikke-coatede objektglas og placere objektglasset overtrukket med anti-klæbende på toppen af ​​gelen opløsning (større geler, op til størrelsen af ​​objektglasset, kan fremstilles afhængigt af det endelige anvendelse). Fastgør objektglas med små bindemiddel klip for at stabilisere.
    4. Placer forme under lampen og indstille lampen intensitet (f.eks% lukkeren åben) for at opnå 10 mW / cm2 ved geloverfladen for sprøjtespidsen forme eller objektglas forme baseret på målinger i trin 1.7.2 og1.7.3 hhv.
    5. Påfør lys i 1 til 5 minutter for at tillade fuldstændig polymerisation af geler. Brug en kortere polymerisationstid for geler med højere PEG4SH indhold (8 vægt% eller større, 1 min) og længere for geler med lavere PEG4SH indhold (5-8 vægt-%, 3-5 min) for at fremstille fuldt polymeriseret hydrogeler med moduli inden udvalget af blødt væv (0,5-5 kPa).
    6. Place geler fra sprøjtespidsen forme i en steril ikke-behandlet 48-brønds plade, og anbring objektglas i en steril skål.
    7. Skyl 3 x 15 min med celledyrkningsmedium eller passende buffer (fx PBS + PS + FZ, Ellmans reaktionsbuffer) baseret på planlagte eksperimenter, som beskrevet nedenfor.
  2. Fremstilling af mønstrede hydrogeler.
    1. Bland stamopløsninger af PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ efter beregningsmåde regnearket, efterlader frie thioler (0,2-5 mm) til senere reaktion med Pep1Alloc. Pipettere forstadieopløsningen kraftigt for at sikre ensartet opblanding af opløsningen.
    2. Forbered tykke og tynde hydrogeler som fastlagt i trin 2.1.2 til 2.1.6.
      BEMÆRK: Anbring ikke geler i vækstmedium før photopatterning. Frie thioler kan forbruges af arter i vækstmediet (f.eks disulfiddannelse med thiolholdige proteiner) og vil ikke tillade mønsterdannelse af gelen uden yderligere procestrin (f.eks, reduktion af disulfidbindinger).
    3. Forbered opløsninger af Pep1Alloc (slutkoncentration ~ 3-20 mg / ml) og 2,2 mM LAP.
    4. Omfatte forhånd dannede geler med Pep1Alloc / LAP-opløsning og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    5. Fjern overskydende Pep1Alloc / LAP opløsning. Hvis geler blev støbt i en sprøjte tip, brug en spatel til forsigtigt overføre gelerne fra 48-brønds plade, hvor de er inkubering til et sterilt glasplade til mønsterdannelse.
    6. Placer en fotomaske med det ønskede mønster direkte oven på syringe- og objektglas-støbte geler. Sørg for, at den trykte del af masken rører gel til optimal pattern troskab (dvs. maske bør læse højre og være emulsion nedad). Anbring prøverne under lampen og bestråle i 1 min med lampen indstillinger, der bruges til objektglas (trin 1.7.3).
    7. Efter mønsterdannelse, sted sprøjte-støbt geler i en steril, 48-brønds ikke-vævskulturbehandlet plade, og sted objektglas støbte geler, der er klæbet til objektglas i en steril skål.
    8. Skyl 3 x 15 min med celledyrkningsmedium eller passende buffer (fx PBS + PS + FZ, Ellmans reaktionsbuffer) baseret på planlagte eksperimenter.

3. Visualisering og Kvantificering af Photopatterning

  1. Ellmans Assay at påvise og bestemme frie thioler i Photopatterned hydrogeler.
    1. Forbered Ellmans reaktionsbuffer, cystein arbejdsopløsning, standarder, og Ellmans reagens som beskrevet nedenfor.
      1. For Ellmans Reaction Buffer, opløses 2,4 g natrium dibasisk (Na 2 HPO4) og 74,4 mg ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 200 ml DIH 2 O (0,1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA). PH justeres til 7,5-8 med opløsninger af natriumhydroxid (NaOH) eller phosphorsyre (H 3 PO 4).
      2. For cystein Working Solution, opløses 5,27 mg cystein i 15 ml reaktion buffer (2 mM cystein).
      3. Cystein Standarder fortyndet cystein arbejdsopløsning i reaktionsbuffer til en slutkoncentration på 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 og 0 mM cystein.
      4. For Ellmans Reagent, opløses 4 mg Ellmans reagens i 1 ml reaktionspuffer. Soniker for at opløse Ellmans reagens.
    2. Kvantificere koncentrationen af frie thioler i geler med Ellmans assay (figur 2).
      BEMÆRK: "Tynde" 5 pi hydrogeler, støbt mellem objektglas, er beskrevet i nedenstående procedure, og anbefalede at tillade hurtig diffusion af Ellman reagens through gelen (dvs. det tager reagenset længere tid til at diffundere gennem tykke geler).
      1. Bestem den opsvulmede gel volumen af 'tynde' 5 ul geler (V S) baseret på den volumetriske hævelse ratio, Q.
        1. Lav tre 20 pi 'tykke' geler bruger sprøjte forme. Place geler i Ellmans reaktionsbuffer i 24 timer og efterfølgende vejes (ligevægt opsvulmet masse, M S). Lyofilisere gelerne og efterfølgende vejes (tørvægt, M D).
        2. Under anvendelse af de målte masser for tykke geler, beregne den volumetriske opkvældningsgrad 28 af Q = 1 + ρ polymer / ρ opløsningsmiddel (M S / M D -1) hvor ρ polymer = 1,07 g / cm3 for PEG, 29 ρ opløsningsmiddel = 1,0 g / cm3 for PBS / H 2 O.
        3. Beregner det teoretiske tørvægt af gelen skal anvendes til Ellmans assay (her, 5 pi "tynd" geler er typisk used), som summen af masserne af de enkelte komponenter PEG4SH, Pep1Alloc, og Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc). For eksempel er en 5 pi gel indeholdende 10 vægt-% PEG4SH indeholder ca. 0,000535 g PEG som beregnet af M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc og Pep2Alloc masserne kan beregnes på lignende måde baseret på vægt-% i opløsning (se regnearket for værdier), forudsat ρ ≈ 1,0 g / cm3 for disse vandige opløsninger.
          BEMÆRK: Gels kan også tørres og vejes stedet for at beregne den teoretiske tørre masse. Det kan dog være en udfordring at konsekvent måle tørvægt af de tynde, 5 gl geler.
        4. Baseret på den forudsagte tørvægt og Q-værdi bestemmes ud fra 'tykke' geler, beregne den forudsagte opsvulmet masse M S for "tynde" gel (ligning i trin 3.1.2.1.1). Antag, at ρ ≈ 1,0 g / cm S ≈ V S. Brug denne beregnede V S at udføre kvantitativ Ellmans assay.
          BEMÆRK: Det anbefales Ovenstående metode til at bestemme V s for hævede geler som "tynde" 5 pi geler er vanskelige at overføre til vejning.
      2. Form tynde hydrogeler til mønsterdannelse som beskrevet i afsnit 2.2 (5 pi volumen). Specifikt gør geler med overskydende frie thioler og "mønster" halvdelen af disse prøver med Pep1Alloc bruger klart dækglas at oversvømme eksponere hele gel med lys (fx 6 af total geler med overskydende thiol: 3 umodificeret ikke-'patterned 'og 3' mønstrede ').
        BEMÆRK: For denne analyse, "mønstrede" geler er oversvømmelse udsat for lys uden en fotomaske. Denne metode anvendes til at bestemme det samlede antal af frie thioler forbruges i hele gel prøven og at demonstrere, hvor effektivt frie thioler kan modificeres med peptid. Ud fra denne informationantallet af frie thioler forbrugt i mønstring med en fotomaske kan forudsiges baseret på gelen tykkelse og mønster område (regioner udsat for lys).
      3. Place 'mønstrede' og ikke-'patterned 'geler i brønde i en 48-brønds plade og skyl 3 x 15 min med Ellmans reaktionspuffer for at tillade diffusion af uomsatte arter ud af gelen og ligevægtskvældning at forekomme.
      4. Få ekstra Ellmans reaktionsbuffer til de skyllede geler således at V s med reaktionsbuffer er et multiplum af 20 pi. For eksempel, hvis den forudsagte Vs er 15 pi tilsættes 5 pi reaktionsbuffer (20 pi), og hvis den forudsagte Vs er 30 pi, tilsættes 10 pi reaktionsbuffer (40 pi).
      5. Pipettere cystein standarder i individuelle brønde (ikke indeholdende geler) af en 96-brønds plade i multipla af 20 pi afhængigt af mængden anvendt i det foregående trin (dvs. hvis det foregående trin havde Vs + ekstra reaktion Buffer = 40 pi, tilsættes 40 pi hver standard til individuelle tomme brønde).
      6. Fortynd Ellmans reagens i reaktionspuffer (multipla af 180 pi reaktionsbuffer + 3.6 pi Ellmans reagens, fx 183,6 i 20 pi eller 367,2 pi til 40 pi i trin 3.1.2.5).
      7. Tilføj fortyndet Ellmans reagens til brønde indeholdende standarder og prøver. For 20 pi prøver tilsættes 183,6 pi opløsning til hver brønd. Dobbelt denne mængde fortyndet Ellman reagens i 40 ul prøver (eller skalere derfor baseret på størrelsen af ​​stikprøven).
      8. Inkuber eller placere på et rysteapparat i 1 time og 30 min (ved stuetemperatur) eller indtil opløsningens farve svarer til farven af ​​gelerne ved visuel inspektion for at sikre tilstrækkelig diffusion af det gule 2-nitro-5-thiobenzoate dianion (TNB 2-), som genereres ved reaktion af Ellmans reagens med frie thioler, fra gelen.
      9. Tag 100 ul løsning fra prøver og standards og anbringes i brønde i en 96-brønds plade.
      10. Absorbansen aflæses ved 405 nm på en pladelæser.
      11. For at behandle dataene, plotte standardkurven (prøver fra trin 3.1.1.3) (absorbans versus koncentration) og passer til en lineær funktion. Brug af den lineære funktion, koncentrationen af ​​frie thioler i »fortyndede gel 'opløsning (gel + reaktionspuffer) kan beregnes baseret på absorbanslæsninger. Endelig, under hensyntagen til den "fortynding" med reaktionspuffer, fastlægge den frie thiol koncentration i gelerne uden reaktionsbuffer. (Fx hvis 15 pi gel blev fortyndet med 5 pi reaktion buffer, ganges med 20/15).
    3. Visualisering af photopatterns med Ellmans reagens (figur 3A).
      1. Sættetid tynde hydrogeler mønstret med Pep1Alloc i Ellmans reaktionsbuffer i 1 time.
      2. Fjern overskydende reaktionspuffer ved forsigtigt at tørre omkring kanterne af hydrogelen med en serviet.
      3. Pipette Ellmans reagens direkte på overfladen af ​​gelen. Umiddelbart billede på et lysmikroskop ved 10X eller stereomikroskop med et farvekamera.
        Bemærk: Gels skal afbildes straks, fordi visualisering mønstre vil fjerne inden for 5 min som den gule TNB 2- ion fremstillet ved spaltning af Ellmans reagens ved reaktion med thioler i ikke-mønstrede region diffunderer gennem gelen. Ikke-mønstrede regioner synes svagt gul for det blotte øje; til bedre opløsning og mindre mønstre, forstørrelse (fx anvendelse af et mikroskop) er påkrævet.
  2. Visualisering af Photopatterns med fluorescerende Peptider (figur 3B).
    1. Til visualisering af mønstre med højere opløsning eller i tre dimensioner, photopattern en AF488-modificeret Pep1Alloc (eller tilsvarende fluorescerende peptid) til gelerne i trin 2.2.
    2. Billede på et fluorescerende mikroskop. Et konfokalt mikroskop kan anvendes her til at tage z-stACK billeder af gelen, så mønsteret kan observeres i x-, y- og z-fly.
      BEMÆRK: Med fluorescens, skal geler beskyttes mod lys for at sikre stabiliteten i AF488 fluoroforen og maksimal fluorescens. Geler behøver ikke at være det samme afbildes da det fluorescerende peptid er forholdsvis stabil, hvis beskyttet mod lys (i beholdere indpakket i folie ved 4 ° C).

4. Cell Indkapsling i hydrogeler og Photopatterning

  1. Indsamling og Forberedelse Celler til indkapsling.
    1. Efter standard sterile pattedyr cellekultur procedurer, Trypsinisér og indsamle celler af interesse fra plader. Stands trypsin med vækstmedium uden tilknyttet forekommer (fx til en T-75 kolbe, 5 ml trypsin, stands med 5 ml medium, skylles plade med 5 ml medium til total 15 ml).
      BEMÆRK: trypsinisering gange kan variere mellem celletyper, men opstår typisk mellem 5 og 15 min. Alternative celle detachment midler (f.eks Versene) kan anvendes til at indsamle celler, hvis det ønskes.
    2. Tæl celler (minimum 100 eller pr producentens protokol) fra prøver af trypsinbehandlet cellesuspension under anvendelse af et hæmocytometer eller en anden celletælling enhed mens centrifugering af bulk-cellesuspension (90-110 xg 5 min). Resuspender cellepelleten efter centrifugering i et minimalt volumen PBS eller vækstmedium og re-count hvis den oprindelige trypsiniseret cellesuspension for fortyndet.
    3. Resuspender celler i et minimalt volumen PBS og alikvoter til hver gel tilstand i mikrocentrifugerør, således at der vil være 5.000 celler / pl, når det blandes med gelen opløsning (før polymerisering).
      BEMÆRK: Typiske celle portioner indeholder 300,000-500,000 celler og er nok til at gøre 60-100 pi gel / celle suspension, der kan anvendes til 3-5 x 20 pi geler med 5.000 celler / pl. Højere eller lavere celletætheder kan anvendes til indkapsling, afhængigt af mængden af ​​celle-cellevs celle-matrix kontakt ønsket henholdsvis og bør bestemmes for hvert program.
    4. Centrifuge celle / PBS alikvoter (90-110 xg 5 min).
    5. aspirere forsigtigt PBS fra cellepelleten i mikrocentrifugerør lige før indkapsling.
      BEMÆRK: Hvis celler er følsomme for forskydningskræfter, kan den anden centrifugeringstrin elimineres ved at tælle (f.eks hæmocytometer) og efterfølgende aliquotting den trypsineret cellesuspension (trypsin + media + celler) i portioner nødvendige for hver gel tilstand. Disse alikvoter centrifugeres en gang (90-110 xg 5 min) og trypsin + medier bortsuges, hvilket efterlader en cellepellet til indkapsling.
  2. Indkapsle Celler i ikke-mønstrede Hydrogeler.
    1. Umiddelbart efter opsugning PBS, suspendere pelleterede celler i PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ som beregnet i regnearket til en endelig koncentration på 5.000 celler / ul.
    2. Mold og polymerisere hydrogeler som descrIBED i trin 2.1.2 til 2.1.6.
      BEMÆRK: Når indkapsling celler i glas slide forme, skal der udvises forsigtighed ved at fjerne det øverste slide post-polymerisation for at forhindre forskydning af gelen, hvilket kan resultere i celledød. For at hjælpe med fjernelse af gelen fra formen, kan slide forme anbringes i sterilt PBS eller vækstmedium efter polymerisering at befugte pakningen og hydrogel, hvilket gør det lettere at fjerne det øverste lysbillede. En metode til at forhindre denne forskydning helt er gennem anvendelse af sprøjte forme.
    3. Skyl geler 3 x 10 min i vækstmedium for at fjerne uomsatte arter og overskydende LAP.
    4. Inkuber geler i vækstmedium ved 37 ° C og 5% CO2, indtil den ønskede punkt for yderligere analyse. Fyld medium hver 48 timer eller som bestemmes for anvendelsen (f.eks typisk fodring interval for specifik celletype og medium).
  3. Indkapsling Celler og Photopatterning i tilstedeværelsen af ​​celler.
    1. Umiddelbart efter aspirering PBS,suspendere pelleterede celler i PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, og PBS + PS + FZ som beregnet i regnearket til en endelig koncentration på 5.000 celler / ul. Efterlad en passende koncentration af frie thioler (f.eks 2 mm) til senere omsætning med Pep1Alloc.
    2. Mold, polymerisere og mønster hydrogeler som beskrevet i trin 2.2.2 til 2.2.8.
    3. Skyl geler 3 x 10 min i vækstmedium efter mønstring at fjerne uomsatte arter og overskydende LAP.
    4. Inkuber geler i vækstmedium ved 37 ° C og 5% CO2, indtil den ønskede punkt for yderligere analyse. Fyld medium hver 48 timer eller som bestemt for ansøgningen.

5. Bestemmelse af Levedygtighed og metaboliske aktivitet indkapslede celler

  1. Udfør live / Dead Cytotoksicitet Assay til bestemmelse Encapsulated Cell Levedygtighed (figur 4A).
    1. Fjern vækstmedium fra geler og skyl 3 x 15 min med PBS for at tillade diffusion af medium fra gels.
    2. Optø levende / døde cytotoksicitet assayopløsninger (ethidiumhomodimer-1 og calcein AM).
    3. Tilsæt 2 pi af 2 mM ethidiumhomodimer-1 og 0,5 pi af 4 mM calcein AM løsninger til 1 ml steril PBS. Vortex for at sikre fuldstændig blanding.
    4. Tilsæt 300 pi farvningsopløsning til hver sprøjte skimmel gel i 48-brønds plader, eller nok til at dække overfladen af ​​gelen på en glasplade i en steril skål og inkuberes i 45 minutter.
    5. Fjern overskydende farvningsopløsning og skyl for at fjerne overskydende farvestof fra gelerne (3 x 15 min med PBS).
    6. Billede på en konfokal mikroskop (z-stack billeder) eller på en epi-fluorescens mikroskop med z-stack kapacitet på 10X og 488/525 nm Ex / Em. Kvantificer antallet af levedygtige celler ved at projicere z-stakke og tælle antallet af levende (grøn hele celle kroppen) og døde (røde kerner) celler med imaging software.
  2. Udføre metaboliske aktivitet assay til bestemmelse celleaktivitet post-indkapsling (Figure 4B).
    1. 24 timer inden assay, foder indkapslede celler med frisk vækstmedium.
      BEMÆRK: Læg medium til et par ekstra brønde (der ikke indeholder geler eller geler uden celler) som kontrol (baggrund aflæsninger).
    2. På det tidspunkt af interesse, tø MTS reagens løsning.
      BEMÆRK: For at bestemme metabolisk aktivitet over tid, er en indledende tidspunkt (12-24 timer efter indkapsling) anbefales som en reference til sammenligning med senere tidspunkter.
    3. Tilføj MTS-reagens til hver brønd (20 pi per 100 pi vækstmedium).
    4. Inkuber prøver til 1-4 timer ved 37 ° C og 5% CO2, i henhold til producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Inkubationstider bør være tilstrækkeligt for celler til at reducere MTS og tillade diffusion af det formazanprodukt ud af gelen. Derfor kan tykkere geler såsom sprøjte tip geler kræver længere inkubationstid (~ 4 t) for tilstrækkelig reduktion og diffusion MTS.
    5. Tilsæt 100 pi reduceret MTS / Mediumi rene brønde i en plade med 96 brønde og optage absorbans ved 490 nm på en pladelæser.
    6. Fratræk baggrunden absorbans for brønde uden celler fra prøven absorbansværdier at generere baselined absorbansværdier.

Representative Results

Opsætningen og procedure til at photoencapsulate celler og efterfølgende photopattern geler indeholdende indkapslede celler er afbildet i figur 1, og et eksempel til fremstilling af stamopløsninger til dannelse af en 10 vægt% gel er tilvejebragt i tabel 1. Under anvendelse tabel 1, mængden af monomerer (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) og fotoinitiator (LAP), der kræves for at polymerisere hydrogeler beregnes. Baseret på disse beregninger, er stamopløsninger af PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, og LAP forberedt og blandes med og uden Pep1Alloc for formgivning og photopatterning geler, henholdsvis (figur 1A). Efterfølgende opsamles celler fra plader, talt, og centrifugeret i passende mængder til indkapsling (figur 1B). Cellepelleten resuspenderes i geldannende opløsning (peptid / polymer / LAP i PBS), og celle / monomerblandinger overføres til glas eller sprøjte molds. Celler indkapslet i hydrogelen efter påføring af lys (1-5 minutter af 10 mW / cm2 ved 365 nm) (figur 1C). For photopatterning (figur 1 D), er geler gennemvædet med Pep1Alloc og LAP i 30 min til 1 time og 30 min, hvilket tillader diffusion af peptid og initiator ind den polymeriserede matrix. Disse peptid-laden geler er dækket med fotomasker med ønskede mønstre og udsat for en anden dosis af lys (1 min) for at konjugere peptider til frie thioler i matrixen. Vedhæng tøjr kun kovalent bundet til gelen i regioner der udsættes for lys, lette passende celle-matrix-interaktioner og efterligne vigtige mekaniske og biokemiske egenskaber af den native celle mikromiljø mod sondering cellefunktion og skæbne in vitro.

Ellmans assay tilvejebringer en let og billig metode til at kvantificere gel modifikation og peptid indarbejdelse inden photopatterned substrater. Mønstret og ikke-mønstrede geler (dvs. geler med eller uden peptid modifikation) gennemvædes i Ellmans reaktionspuffer post-polymerisation. Dernæst cystein standarder og gelerne dyppet i puffer anbragt i 48-brønds plader og inkuberet med Ellmans reagens (figur 2A, venstre). Efter 1 time og 30 minutter, er alikvoter af prøverne anbragt i individuelle brønde i en 96-brønds plade, og absorbansen registreret ved 405 nm. En kalibreringskurve (figur 2A, højre) fra cystein standarder er plottet (absorbans vs koncentration, lineær tilpasning), og mængden af frie thioler i geler kan bestemmes på grundlag af deres fortyndingsfaktor. Disse frie thiol koncentrationer for forskellige polymerisations- og photopatterning betingelser af en 10 vægt% gel er vist i figur 2B. Geler polymeriserede for 1 eller 5 min uden Pep1Alloc (blå bjælker, I = 1 min og II = 5 min) har statistisk lignende gratis thiol koncentrationer, hvilket indikerer that en hurtig reaktion sker, og gelering er fuldstændig inden for 1 min (to-halet t-test, p> 0,05). Således ikke yderligere udsættelse for lys (2-5 minutter) ikke medføre yderligere omdannelse af funktionelle grupper. Geler polymeriserede i 1 min uden Pep1Alloc blev gennemvædet med Pep1Alloc (3 mg / ml) og LAP (2,2 mM) i 30 og 90 min (grønne søjler, II = 30 min og IV = 90 min) og udsat for en anden dosis af lys i 1 min. Faldet i frie thioler (60-80% i forhold til 1 min betingelse) indikerer effektiv modificering af geler med vedhæng tidskoder under disse betingelser. Hvis der ønskes højere modifikation, kan forhøjede koncentrationer af Pep1Alloc løsning bruges som adgang til Pep1Alloc til gratis thioler i mere fortyndede peptid løsninger kan begrænse konvertering; for eksempel har vi fundet, at koncentrationer op til 20 mg / ml Pep1Alloc producere> 90% omdannelse af frie thioler.

Unikt, mønstre af peptider sættes til hydrogelen kanhurtigt afbildes med Ellmans reagens (figur 3A, under 5 min). Imidlertid er visualisering af det mønster tabt over tid (mere end 5 min) som følge af diffusion af den gule TNB 2- dianionen gennem gelen. At forbedre billeddannelse opløsning og observere mønstre i tre dimensioner (x-, y- og z-fly) og i nærvær af celler, kan fluorescerende peptid tilsætning (AF488Pep1Alloc) anvendes. I figur 3B x-, y- og z-fremskrivninger af billedstakke taget med et konfokalt mikroskop vises, viser mønster opløsning (um skala).

Ca. (94 ± 2)% og (94 ± 1)% af hMSC'er indkapslet i nedbrydelige geler (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) forbliver levedygtige (grønne cellelegemer) 1 og 6 dage efter indkapsling henholdsvis med få døde celler (røde cellekerner ) observeret (figur 4A). Endvidere hMSC spredning observeres ved 6 dage efter indkapslingsprocedurer ( Rong> Figur 4A, indsat), hvilket indikerer, at cellerne kan omforme og interagere med disse MMP-nedbrydelige matricer modificeret med integrin-bindende RGDS. Metaboliske aktivitet analyser udført på celler indkapslet i ikke-nedbrydelige geler (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 og 3 dage efter indkapsling (figur 4B) giver en anden foranstaltning af cellelevedygtighed og demonstrere, at cellerne forbliver aktive for testet med de forskellige photoencapsulation og photopatterning betingelser Ellmans assay (figur 2B). Især er der ingen signifikant forskel i metaboliske aktivitet mellem 30 min og 90 min inkubationer med Pep1Alloc + LAP (betingelser III og IV) og den indledende indkapsling (betingelser I og II), hvilket indikerer, at proceduren er passende for anvendelser af photopatterning i tilstedeværelsen af ​​indkapslede celler (to-halet t-test, p> 0,05).

2fig1.jpg "/>
Figur 1:. Opsætning til at indkapsle celler i hydrogeler og efterfølgende photopatterning med biokemisk cue (A) Stamopløsninger af makromere og fotoinitiator er forberedt og blandet (PEG4SH = rygrad, Pep2Alloc = krydsbinding, Pep1Alloc = vedhæng klæbende del (RGDS), LAP = fotoinitiator ). (B) Celler opsamles til indkapsling. (C) Celler blandes med makromer opløsninger uden eller med integrin-bindende peptider (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP eller PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, henholdsvis) og er indkapslet ved udsættelse for lys. (D) geler indeholdende overskydende thiolgrupper under geldannelsen (her, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, udformet med 2 mM overskydende thiol) kan mønstret med biokemiske signaler ved efterfølgende tilsætning af peptider funktionaliseret med en enkelt alloc gruppe (Pep1Alloc fx RGDS, IKVAV, etc.) til at fremme celleadhæsioninden for specifikke regioner af gelen. Her mønster af geler med fluorescensmærkede RGDS vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Kvantitativ Ellmans assay setup og resultater for at evaluere modifikation af mønstrede hydrogeler (A) Gels og cystein standarder inkuberes i 48-brønds plader med Ellmans reagens. En lineær standardkurve afbildes at bestemme cystein koncentration i gelprøver. (B) Overskydende frie thioler er inkorporeret i hydrogeler under geldannelse og forbruges ved mønsterdannelse med et vedhæng alloc-peptid (I = 1 min polymerisation; II = 5 min polymerisation; III = 30 min inkubation med Pep1Alloc IV = 90 min inkubation wi th Pep1Alloc; både III og IV polymeriseres og mønstret med lys i 1 min). De viste data illustrerer middelværdien (n = 3) med fejlsøjler viser standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Ellmans assay og fluorescerende billeder for at visualisere photopatterned hydrogeler (A) Ellmans reagens kan anvendes til hurtigt at detektere mønstre (linjer) i x- og y-planer (gul = unpatterned region, Scale bar = 1 mm). (B) Fluorescerende peptider kan anvendes til at observere mønstre i x-, y- og z-planer (grøn = mønstrede region; 200 um skala bar; 10X vand-dypning mål; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
. Figur 4: Levedygtighed og metaboliske aktivitet af celler i ikke-nedbrydelige photopatterned hydrogeler (A) Eksempel konfokal z-stack (z-projektion; 10X vand-dypning mål) af levedygtige (grøn; Ex / Em 488/525 nm) og døde hMSC'er (rød, Ex / Em 543/580 nm) indkapslet i hydrogeler 24 timers post-indkapsling (Scale bar = 200 um). Celler spredt inden for disse hydrogeler 6 dage efter indkapsling (indsat billede, Scale bar = 50 um). (B) Celler er metabolisk aktive 1 og 3 dage (mørke og lyse søjler, henholdsvis) efter indkapsling for de forskellige polymerisation (I = 1 min polymerisation; II = 5 min polymerisation) og mønsterdannende betingelser (III = 30 min inkubation med Pep1Alloc IV = 90 min incubation med Pep1Alloc; både polymeriseret og mønstret med lys i 1 min). De viste data illustrerer middelværdien (n = 3) med fejlsøjler viser standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Eksempel setup til at beregne mængder stamopløsninger for at gøre hydrogeler Celler i regnearket, der er fremhævet blåt angiver brugerdefinerede parametre. de andre mængder er beregnet på baggrund af disse indstillinger. De endelige mængder for hver stamopløsning at gøre en gel er fremhævet orange. De hvide celler indeholder formler anvendes til at beregne de endelige mængder baseret på brugerdefinerede parametre. Bemærk, at en koncentration på 2,2 mM LAP svarer til 0,067 vægt%.

Discussion

Proceduren præsenteres her demonstrerer teknikker til at photoencapsulate celler inden hydrogeler dannet ved thiol-en click-kemi-og efterfølgende photopattern gelerne med biokemiske signaler. Anvendelsen af ​​lys til at begynde med danner hydrogeler muliggør homogen blanding og suspendering af cellerne inden før polymerisering polymeropløsningen. Hurtig polymerisation "låser" gelen i form af den definerede mug og rumme suspenderes celler i hydrogel netværket. Geler kan også formes til talrige forskellige former (f.eks objektglas eller en sprøjte tips) afhængigt af den endelige ønskede anvendelse. For eksempel celler indkapslet i 3D kultur i hydrogeler bundet til objektglas er særligt anvendelige til billedbehandlingsapplikationer som lysdæmpning er begrænset inden en tynd prøve. Sprøjte forme kan anvendes til hurtig indkapsling af celler, hvilket tillader et større antal prøver, der skal fremstilles på kort tid (sammenlignet med objektglass), der kan anvendes til eksperimenter, der kræver et stort antal celler, såsom flowcytometri eller qPCR. Efterfølgende disse geler kan derefter mønstret med biokemiske signaler for at fremkalde de ønskede cellulære reaktioner såsom differentiering eller invasion. 30,31

Assays for levedygtighed og metabolisk aktivitet indikerer overlevelse af celler til materialet systemet og mønsterdannende betingelser præsenteret. Bemærk, at metabolisk aktivitet blev overvåget indtil dag 3 i ikke-nedbrydelige geler (RGKGRK peptid krydsbinding) at vurdere de første virkninger af polymerisering og mønsterdannende betingelser på celle funktion. Derudover en membran integritet assay (levende / død levedygtighed / cytotoksicitet farvning) af hMSC'er på 1 og 6 dage efter indkapsling i geler formuleret med et nedbrydeligt peptid krydsbinding (GPQGIWGQ) støtter, at cellerne forbliver levedygtige og spredes på en uge i kultur. Levedygtighed yderligere cellelinier er blevet rapporteret for photopatterning betingelser 32 svarende til dem,anvendes her og kan vurderes for den beskrevne hydrogel-system med anvendelse af levende / døde farvning og metaboliske aktivitetsassays. Mens vi ikke har observeret problemer med cellelevedygtighed ved hjælp af dette materiale, og beslægtede procedurer (4.2 og 4.3), kan nogle celletyper være følsomme over for frie radikaler og / eller lyseksponering. I dette tilfælde kan brugere overveje at bruge ikke-photoinitiated materialer, såsom azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserede hydrogel dannelse kemier. 33

Overfladiske teknikker til at detektere og kvantificere mønster af biokemiske signaler inden geler også præsenteres (3.1 og 3.2). Ellmans assay er af særlig interesse, fordi reagenserne er kommercielt tilgængelige, og der kræves ingen ekstra syntetisk behandlingstrin eller dyrere reagenser (fx fluorescens-mærkede peptid). Ellmans assay kan anvendes til præcist at bestemme ændringen af ​​frie thioler med biokemiske signaler under Forskelnt photopatterning betingelser, samt til hurtigt visualisere mønstre. Til kvantificering peptid inkorporering, thiol funktionelle koncentration gruppe før og efter mønsterdannelse, som et kvantitativt mål for peptid inkorporering, er direkte vurderes med Ellmans assay. Mens denne type kvantificering kan gøres med fluorescensmærkede peptider, 34 imaging-baserede kvantificering kræver flere tidskrævende trin håndtering og analyse (fx syntese af en fluorescens-mærket peptid og generering af en kalibreringskurve at relatere fluorescens til peptidkoncentration anvendelse af billedanalyse). For imaging peptid inkorporering kan Ellman reagens anvendes direkte på prøver og straks visualiseret. Mens begrænset til x- og y-planer for mønster visualisering kan teknikken anvendes som en enkel, rutinemæssig metode til at bestemme, om matricer indeholdende frie thiolgrupper er blevet mønstret. Det er vigtigt at bemærke, at Ellmans assay ikke Considered cytocompatible, så mens det kan anvendes til at observere og kvantificere photopatterns, det kan ikke ske i nærvær af celler. Til billeddannelse af mønsterdannelse i tre dimensioner og i nærvær af celler, konjugeringen af ​​fluorescerende peptider inden hydrogelmatricer fortsat er en stærk og udbredt fremgangsmåde. Opløsning af mønstre kan evalueres i x-, y- og z-planer ved hjælp konfokal mikroskopi, og denne metode er cytocompatible således at der kan identificeres celler inden mønstrede regioner eller ikke-mønstrede regioner. Tilsammen Ellmans assay og billedbehandling teknikker er komplementære redskaber for forskere til at vurdere både kvantitativt og kvalitativt photopatterning af biokemiske signaler inden for materialer systemet.

PhotoClick, eller mere bredt photoinitiated, kemier til dannelse og modifikation af hydrogeler i nærvær af celler er talrige. Støbning, indkapsling, og mønsterdannende teknikker præsenteres her er ikke limgrænset til den beskrevne materiale systemet og kan anvendes til alternative lysbaserede kemier, såsom thiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 og andre thiol-en kemier (f.eks thiol-norbornen), 10,13 samt med forskellige fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959, Eosin Y, og campherquinon. Bemærk, kan det være nødvendigt at justere proceduren parametre (f.eks, inkubationstider, polymerisationstiderne, celle tæthed) for at sikre, at betingelserne er cytocompatible for disse andre systemer. Da mønsterdannelsesprocessen kræver diffusion af det alloc-modificerede peptid (er) i hydrogelen (2.2.3-2.2.5), kan denne proces være mest brugbar for tilsætning af integrin-bindende dele (f.eks peptider eller ekstracellulære matrix-protein fragmenter) til hydrogelen, hvor binding af liganden til netværket er påkrævet til generering af trækkræfter ved aktivering af cellen og fuld integrin. 36 Note, for biomolekyler, der kanvære tilsvarende aktive i opløsning eller ved immobilisering (fx, vækstfaktorer eller cytokiner), kunne inkubationstrinet til delen diffusion (~ 1 time) i hydrogelen føre til signalering begivenheder, sammenfoldede mønsterdannende resultater. Der er etableret andre fremgangsmåder til vækstfaktor immobilisering eller lokal binding til deres mønsterdannelse. 37-39 Derudover er mønster beslutning dikteret af kontrol over lyseksponering. Her, fotomasker tillader design af mønstre gennem gelen dybde og i x- og y-planer; imidlertid kan der opnås større rumlig kontrol over mønsterdannelse af biokemiske signaler inden geler med alternative bestråling såsom anvendelse af et to-foton konfokalt mikroskop for at generere mønstre i x-, y-, og Z fly. 34,40 Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens materialesystemet anvendelse i den pågældende procedure er kun indledningsvis modificeret med biokemiske signaler, kunne ortogonale PhotoClick kemier anvendes til at tillade alterationer i matrix egenskaber over tid. 12 Proceduren og teknikker der præsenteres her tilføje mangfoldighed til de nuværende tilgange til at skabe syntetiske matricer med veldefinerede og spatiotemporally-kontrollerede egenskaber. Især vil den kommercielle tilgængelighed af reagenser og materialer, der anvendes inden for denne procedure være nyttige for en bred vifte af forskere interesseret i at bruge hydrogel-baserede biomaterialer til applikationer i kontrolleret cellekultur.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Delaware Cobre programmer i Drug Discovery og i Advanced Biomaterialer finansieret af institutionsudvikling Awards fra National Institute of Generals Medical Sciences på National Institutes of Health (P20GM104316 og P30 GM110758-01 henholdsvis), den Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Career Award (DMR-1.253.906), Burroughs Wellcome Fund (1.006.787), og National Science Foundation IGERT SBE2 program på University of Delaware (stipendium til L. Sawicki). Forfatterne takker Delaware Biotechnology Institute Bioimaging Center ved University of Delaware til uddannelse og adgang til konfokal mikroskopi, Ms Katherine Wiley for assistance under videooptagelse, Mr. Matthew Rehmann for generøst giver hMSC'er isoleret fra knoglemarv, Prof. Christopher J . Kloxin og Mr. Stephen Ma for generøst leverer fotomasker, og Prof. Wilfred Chen til anvendelse af den automatiserede pladelæser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Peptides Various Vendors ---- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 ml Chemglass CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors ----
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors ----
Vacuum Dessicator Various Vendors ----
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors ---- 1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation ---- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors ---- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors ---- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors ---- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies ---- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss ---- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH ---- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  2. Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
  3. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
  4. Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
  5. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
  6. Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
  7. Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
  8. Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
  9. Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
  10. Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
  11. Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
  12. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
  13. Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
  14. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
  15. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
  16. Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
  17. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  18. Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
  19. Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
  20. Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
  21. Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
  22. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  23. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  24. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
  25. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
  26. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
  27. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
  28. Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
  29. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
  30. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
  31. Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
  32. Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
  33. Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
  36. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  37. Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  38. Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
  39. Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
  40. Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).

Tags

Bioengineering Biomaterials photoencapsulation photopatterning cellekultur stillads hydrogel ekstracellulær matrix mimic peptider
Light-medieret dannelse og mønsterdannelse af hydrogeler til celledyrkningsapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sawicki, L. A., Kloxin, A. M.… More

Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter