Abstract
Membranproteiner (MPs) är viktiga komponenter i cellmembran och primära läkemedelsmål. Rationell läkemedelsdesign bygger på exakt strukturinformation, vanligtvis erhålls genom kristallografi; emellertid MPs är svåra att kristallisera. Den senaste tidens framsteg i MP strukturbestämning har haft stor nytta av utvecklingen av lipida kubisk fas (LCP) kristallise metoder, som vanligtvis ger väl avböjande, men ofta små kristaller som lider av strålningsskador under traditionell kristallo datainsamling på synkrotron källor. Utvecklingen av nya generationens X-ray fritt frielektronlaser (XFEL) källor som producerar extremt ljusa femtosecond pulser har aktiverat rum temperaturdata samling från mikrokristaller med ingen eller obetydlig strålskador. Våra senaste ansträngningar att kombinera LCP-teknik med seriell femtosecond krist (LCP-SFX) har resulterat i hög upplösning strukturer i flera humana G-proteinkopplade receptorer, which representerar en notoriskt svårt mål för strukturbestämning. I LCP-SFX teknik är LCP rekryterats som en matris för både tillväxt och leverans av MP mikrokristaller till korsningen mellan injektorn strömmen med en XFEL stråle för insamling kristallografiska data. Det har visats att LCP-SFX avsevärt kan förbättra diffraktion upplösning när endast under 10 um kristaller finns, eller när användningen av mindre kristaller vid rumstemperatur kan övervinna olika problem som är förknippade med större cryocooled kristaller, såsom ackumulering av defekter, hög mosaicity och cryocooling artefakter. Framtida framsteg inom röntgenkällor och detektorteknik bör seriekrist mycket attraktiv och praktiskt för att genomföra inte bara på XFELs, men också på mer lättillgängliga synkrotron strålrör. Här presenterar vi detaljerade visuella protokoll för beredning, karakterisering och leverans av mikrokristaller i LCP för seriekrist experiment.Dessa protokoll omfattar metoder för att utföra kristallisa experiment i sprutor, upptäcka och karakterisera kristall prover optimera kristalldensitet, laddar mikrokristall lastad LCP i insprutningsanordningen och leverera provet till strålen för datainsamling.
Introduction
Röntgenkristallografi är den mest framgångsrika tekniken hittills för att lösa atom upplösning strukturer av membranproteiner (MPs). Kristallisering från lipida mesofaser, även känd som lipidisk kubisk fas (LCP), eller i meso kristallisering, utgör en av de viktigaste utvecklingen inom MP krist som har möjliggjort den högupplösta strukturbestämning av utmanande mål som G-proteinkopplade receptorer (GPCR ) 1. Nya framsteg inom LCP verktyg och teknik har gjort denna teknik tillgänglig för en stor gemenskap av strukturella biologer runt om i världen 2. Men i många fall de MP kristaller som bildas i LCP är för små för att användas även vid mest avancerade mikrofokus synkrotron strålrör, där proverna lider av allvarliga skador strålning och försämring innan tillräcklig signal med hög upplösning kan erhållas 3.
En ny metod för insamling kristallografiska dataaktiverades med driftsättning av den första röntgen fri-elektronlaser (XFEL). Metoden bygger på principen om "diffraktion innan förstörelse", som först infördes teoretiskt fyra och sedan bekräftades experimentellt på biologiska prover på Linac Coherent Light Source (LCLS) 3, världens pionjär i hårda XFELs. En XFEL genererar hög ljusstyrka röntgenpulser inom några tiotal femtosecond varaktighet som diffraktera från en orörd kristall innan proteinatomer kan röra sig som svar på strålningsskada. I de initiala experimenten, var mikrokristaller kontinuerligt till skärningspunkten med XFEL trålen i en vattenhaltig ström som produceras av en vätskeinjektor 5. Denna experimentuppställning är känd som serie femtosecond krist (SFX). Den största nackdelen med att använda flytande injektorer för SFX är deras högt flöde, vilket följaktligen kräver tiotals till hundratals milligram renat protein för insamling av en komplett datauppsättning. genom employing en speciell injektor som kan hantera gelliknande LCP prover (LCP microextrusion injektor) 6, vi framgångsrikt levererat mikrokristaller av flera olika humana GPCR odlas i ett LCP matris och fått sina högupplösta strukturer 6-9, med en kraftigt minskad protein förbrukning i 0,3 mg per dataset. Injektorn består av en behållare som rymmer upp till 20, 40 eller 100 pl kristall lastad LCP och en smal kapillär (10-50 mikrometer i diameter) genom vilken provet sprutas genom tillämpning av högtryck (upp till 10.000 psi) från en hydraulisk kolv med ett tryck förstärkt scen, som drivs av en vätska från en HPLC (HPLC) pump. Strömmen av LCP lämnar kapillär munstycket stabiliseras av en parallell ström av icke-reaktiv gas (vanligtvis helium eller kväve).
Här ger vi visuella demonstrationer av de steg som krävs för att förbereda och karakterisera proverför ett LCP-SFX experimentet. Ytterligare detaljer kan hittas i de publicerade protokollen 10. Som ett exempel kommer vi att använda adenosin A2A-receptorn 11 och förbereda kristaller av detta protein i LCP för insamling röntgendata med SFX strategi. Medan våra protokoll är kompatibla med alla injektor kan strömma LCP för datainsamling genom seriekrist vid XFEL och synkrotron källor, för att illustrera, kommer vi att använda LCP injektor som beskrivs i ref. 6. Optimerade fällningsförhållanden som ger hög densitet mikrokristaller i LCP bör identifieras av hög genomströmning kristallise screening 12,13 innan du fortsätter med detta protokoll. Ett typiskt flödesschema för detta protokoll visas i figur 1.
Protocol
1. filtreringslösningar och lipider
Obs: Alla reagenser och verktyg som används i detta protokoll ska vara så ren som möjligt för att undvika införandet av partikelföroreningar i proven, som kan täppa LCP injektorn.
- Filtrera alla fällnings lösningar och smälta lipider genom 5 pm spin-down filter. Rena sprutor noggrant och applicera tryckluft för att torka. Du kan också använda en portabel renrums huven för att förhindra infångning av dammpartiklar eller fibrer under prov förberedelser.
2. Beredning av MP i LCP
Obs: Valet av de bästa LCP värd lipid för kristallisation beror på målet MP, och är normalt identifieras under värd lipid screening kristallisering prövningar 14. Monoacylglyceroler (MAGS) representerar den vanligaste klassen av lipider som används för LCP kristallisering 15. Protokollen är baserade på användning av 9,9 MAG (monoolein) somvärd lipid, eftersom detta är den mest framgångsrika lipid i meso kristallisering hittills 16. 9,9 MAG kan ersättas av andra LCP värd lipider eller lipidblandningar efter att ha tagit hänsyn till skillnader i deras fas beteende. Till exempel, i fallet med GPCR, monoolein typiskt dopad med kolesterol för receptor stabilisering. Här använder 9: 1 (vikt / vikt) 9,9 MAG: kolesterol blandningen som värd lipid.
- Mix mål MP, som renas i tvättmedel micellösning, med den lämpliga LCP värd lipid med två sprutor (# 1 och # 2) och en kopplare, som beskrivits tidigare 13.
- I korthet last spruta # 1 med smält lipid och spruta # 2 med MP lösning. Använda ett förhållande mellan lipid och vattenhaltig MP lösning som motsvarar den nivå som är precis under den maximala vätskekapacitet av motsvarande LCP värd lipid, t ex 3: 2 volym / volym lipid / MP lösning för 9,9 MAG, 1: 1 volym / volym lipid / MP lösning för de flesta andra kortare kedja MAG (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.).
- Anslut sprutorna genom en spruta kopplare och börja blanda substanserna genom nedtryckning av kolvarna för att flytta blandningen fram och tillbaka mellan sprutorna, tills provet blir homogen och genomskinlig. Förbered cirka 50 pl av LCP delmängder vid insamling av en komplett dataset av LCP-SFX. Den slutliga provvolymen typiskt att öka med ungefär en faktor två (till ~ 100 l) efter provkonsolidering och lipid titrering (§ 5).
3. Ställa in kristallisering i sprutor
- Efter ett öppet och homogent LCP bildas, flytta hela provet i sprutan # 2. Lösgöra sprutan # 1, under det att kopplaren ansluten till spruta # 2.
- Anslut en löstagbar nål (gauge 26s) till en annan 100 pl ren spruta (spruta # 3) och aspirera ca 70 pl av fällningslösning i det. Sammansättningen av det fällningslösning som utlöser fFörnyelsen av hög densitet mikrokristaller är unik för varje mål MP och bör bestämmas innan man går vidare till dessa protokoll. Här använder en optimerad fällningslösning sammansättning som ger skurar av mikrokristaller av A2A-receptorn (40 mM natriumtiocyanat, 100 mM natriumcitrat pH 5, 26-28% PEG400).
- Koppla nålen från sprutan # 3 samtidigt som Teflon hylsan inne i sprutan.
- Anslut sprutor # 2 och # 3 genom kopplingen, att se till att Teflon hylsor är korrekt på plats i båda sprutorna. Skruva kopplingen ordentligt på plats.
- Orient de kopplade sprutor vertikalt med sprutan # 2 på botten och injicera protein lastad LCP prov från spruta # 2 i sprutan # 3 långsamt och stadigt tills LCP strängen vidrör kolven sprut 3 #. Den injicerade LCP volymen kommer att uppgå till omkring 1/10 av den ursprungliga fällningsvolymen i sprutan # 3 (~ 7 | il). Kontrollera att volymen av skalan läsning på båda Syringes (båda kolvarna ska flytta med cirka 7 l).
- Koppla spruta # 2. Kopplingen nu ansluts till sprut # 3 som innehåller provet nedsänkt i fällningslösning.
- Använd Parafilm för att fullständigt försegla sprutan # 3, inklusive kolven sprutgränssnittet, öppningsänden av kopplingen och nålen muttern. Ofullständig tätning under detta steg kan orsaka fällnings villkor för att ändra och provet att torka.
- Upprepa steg från 3,3 till 3,7 för att ställa in kristallisering i 6 ytterligare sprutor (# 4 # 9) utnyttjar totalt ~ 50 pl av LCP prov (~ 7 pl LCP för varje spruta).
- Store förseglade sprutor i en plast förseglingsbar påse med en eller två fiberfria rengörings vävnader förblötta med vatten för att skydda mot prov uttorkning. Förslut påsen och lagra sprutor i en 20 ° C inkubator under kristalltillväxt.
4. Crystal Detection
- Ta sprutorna från inkubatorn till bilden LCP prover direkt inuti sprutor (# 3 # 9) var 12-24 timmar under ett stereomikroskop med tvär polariserat ljus. Identifiera kristaller som tätt packade blanka partiklar eller, i fallet med mindre kristallstorlek som en enhetlig glöd från LCP filament.
- Returnera de förseglade sprutorna till påsen, och förvara vid 20 ° C för framtida användning.
5. Prov Konsolidering och titrering med 7,9 MAG
Obs! Lipid titrering steg som beskrivs här tjänar två syften: a) att absorbera överskottet fällningslösningen och b) för att förhindra lipid frysning vid injektion i XFEL trålen. När ett prov LCP sammansatt av 9,9 MAG insprutas i en vakuumkammare för datainsamling, kan intensiv avdunstning får provet svalna ner till temperaturer under jämvikts fasövergångstemperatur (~ 18 ° C), omvandling av delar av provet i en lamellär kristallin fas (Lc). Dessa fläckar av Lc fas, när det träffas av strålen, producerar intensiv pulver diffraktions ringar som kan skada en känslig detektor 6, såsom Cornell-SLAC pixel-array-detektor (CSPAD). Titrering av 9,9 MAG provet med en kortare kedja lipid (9,7 MAG eller 7,9 MAG) minskar detta problem, eftersom sådana blandningar har lägre fas övergångstemperaturer. Här beskriver vi titrering av en LCP bestående av 9,9 MAG med en 7,9 MAG. När kortare kedja MAG (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) används för kristallisering eller när seriekrist data samlas in vid omgivningstryck titreringen i steg 5,11 fortfarande krävs, men det kan utföras med den ursprungliga LCP värd lipid som används för kristallisation.
- Ca 1 timme före början av datainsamling, ta sprutor med prover från 20 ° C inkubator.
- Välj 2-4 sprutor för provkonsolidering baserad på en liknande kristall utseende och likheten mellan kristallisationsbetingelser.
- Försiktigt bort Parafilm tätning från de valda sprutor.
- Avlägsnasprutkopplingen och bifoga en ren avtagbar nål (gauge 26s) till den första valda sprutan. Försiktigt och långsamt driva kolven framåt för att pressa fällnings ut genom nålen in i ett mikrocentrifugrör. Iakttag försiktighet i detta steg, eftersom applicering av ett högt tryck på kolven i detta steg skulle kunna mata ut en del av kristallen lastat LCP tillsammans med fällningslösningen, vilket leder till en partiell eller fullständig förlust av provet.
- Stoppa kolven när det mesta av fällningsmedel har avlägsnats och LCP har ackumulerats fram till nålen ingången.
- Upprepa steg 5,4-5,5 med andra utvalda sprutor.
- Att konsolidera de resulterande LCP prover ansluta två sprutor tillsammans genom en ren kopplare.
- Tryck in kolven på en spruta för att överföra hela provet från en av sprutorna till en annan.
- Koppla den tomma sprutan.
- Upprepa steg från 5,7 till 5,9 för att konsolidera alla de kristall lastat LCP material från 03:58 pre-utvalda sprutor i en spruta. Ta bort så mycket fällningsmedel som möjligt.
- Lägg ~ 5 pl 7,9 MAG eller den ursprungliga kortare kedja MAG värd lipid till en tom spruta. Anslut denna spruta på sprutan med den konsoliderade provet genom en spruta kopplare och blanda genom att alternativt trycka sprutkolvama. Upprepa tills alla kvarvarande lösningen absorberas och en homogen och transparent LCP bildas. Det slutliga beloppet av LCP efter titrering kan variera från 20 till 35 l beroende på volymen av den överskjutande fällnings och dess sammansättning.
- Flytta hela blandade LCP provet i en spruta och koppla den tomma sprutan.
6. Karakterisering av mikrokristaller
- Fäst en LCP-injektor last nål (punkt stil 3, mätare 22, en tum i längd) till sprutan med konsoliderade prov.
- Noggrant mata ~ 1 pl av LCP prov på ett objektglas och täck den med en glaskupa halka. Tryck försiktigt påtäckglas för att placera provet.
- Ta bilder av LCP prov under ett stereomikroskop med högsta möjliga förstoring (typiskt 100X) med en ljus fältsbelysning och korspolarise. Om möjligt, ta ytterligare bilder med hjälp av en UV-fluorescensmikroskop och en SONICC (andra ordningen Nonlinear Imaging av kirala kristaller) 17 kameran för att bekräfta förekomsten av proteinmikrokristaller i provet.
- Uppskatta kristallstorlek och densitet 10. Den idealiska kristalltäthet för ett datainsamlings experiment kommer att bero på kristallstorleken, diametern hos röntgenstrålen och diametern hos LCP strömmen, och bör resultera i en kristall träffhastighet av ca 10-40%.
7. Justering av kristalldensiteten
Obs: Om kristalldensiteten finns i steg 6,4 är alltför hög, vilket resulterar i en stor andel av flera kristall träffar bör kristallerna spädas följa stegen nedan för att optimeraprov för datainsamling. Om kristalldensiteten är alltför låg för effektiv insamling av data i alla förberedda prover, då villkoren kristalltillväxt bör återoptimerade, eftersom det inte finns någon tillförlitlig metod för att koncentrera MP kristaller i LCP.
- Bered erforderlig mängd ren LCP som ska användas för spädning genom att härma LCP sammansättning (samma lipid och fällningsmedel) av det ursprungliga provet med kristaller som måste spädas.
- Flytta alla snyggt LCP i en spruta. Drag av tomma sprutan men lämna kopplaren ansluten.
- Ta bort nålen från sprutan som innehåller LCP provet med mikrokristaller. Anslut provsprutan till sprutan innehållande snyggt LCP genom kopplingen.
- Blanda innehållet i sprutorna genom att trycka det fram och tillbaka genom kopplaren tills homogenitet uppnås.
- Upprepa 6 § att omvärdera den mikrotätheten i den justerade provet.
8. LCP Injector Laddar ennd LCP-SFX datainsamling
- Koppla kopplingen från sprutan med provet och bifoga en en "belastning nålen på sprutan.
- Överföra 20-40 pl av provet i reservoaren av en LCP injektor.
- Sätt LCP injektorn in i provkammaren 18, starta injektorn, justera flödet och samla LCP-SFX data.
9. Införande av lösliga proteinkristaller i LCP
Obs: Med hjälp av mycket trögflytande medier, såsom LCP, för leverans av kristaller av lösliga proteiner gör att man kan dramatiskt minska proteinkonsumtion i en seriekrist experiment. I dessa steg beskriver vi hur man kan införliva kristaller av lösliga proteiner i LCP. Kristaller kan erhållas genom vilken som helst teknik, konsolideras tillsammans i form av en kristallsuspension och filtreras om så är nödvändigt.
- Justera kristalldensitet i suspension som ger kristallträffhastigheter på ungefär 10 till 40%.
- Test förenlighet fällningslösning med LCP med hjälp av 7,9 MAG, 9,7 MAG eller en 1: 1 blandning av 7,9 MAG och 9,9 MAG som värd lipid.
- Blanda ~ 25 pl av kristall suspension med ~ 25 ^ i värd lipid hjälp av en spruta blandare tills en homogen LCP former.
- Utvärdera kristallstorlek och täthet som beskrivs i avsnitt 6. Placera provet i LCP injektorn och samla in data som beskrivs i avsnitt 8.
Representative Results
Nedan beskriver vi representativa resultat som erhållits med prover framställda genom att följa ovanstående protokoll, som tillät oss att samla SFX uppgifter och lösa högupplösta strukturer av fem humana GPCR: serotoninreceptorn 5-HT 2B i komplex med en agonist ergotamin 8 (PDB ID 4NC3 ), jämnas receptor (SMO) i komplex med en antagonist cyklop 6 (PDB ID 4O9R), δ-opioidreceptor i komplex med en bi-funktionell peptidliganden DIPP-NH2 7 (PDB ID 4RWD), angiotensinreceptor i komplex med en blockerare ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), och ett komplex mellan rhodopsin och arrestin 19 (PDB ID 4ZWJ); och två prov lösliga proteiner: lysozym (PDB ID 4ZIX) och phycocyanin (PDB ID 4ZIZ).
5-HT 2B förmedlar olika centrala och perifera fysiologiska funktioner av signalsubstansen serotonin. denna receptoranvändes för att fastställa och validera LCP-SFX-metoden, genom att jämföra rumstemperatur struktur erhålls vid LCLS med cryocooled struktur lösas genom traditionella microcrystallography vid Advanced Photon Source (APS). Totalt ~ 100 ^ LCP provet med proteinmikrokristaller (medelstorlek omkring 5 um) framställdes och användes för SFX datainsamling och LCP-SFX struktur 5HT 2B uppklarade vid 2,8 Å (Figur 2) 8. Ytterligare användbara uppgifter om provberedning och datainsamling anges i tabell 1.
Smoothened receptor (SMO) är en medlem av klass F GPCR och det molekylära målet för teratogen cyklop, med väl visat funktioner i embryonal utveckling och tumörtillväxt. Inledningsvis var relativt stora kristaller av SMO / cyklopamin med en genomsnittlig storlek på 120 x 10 x 5 ^ m erhålles och sedan användas för data collectipå vid en synkrotron källa med konventionell goniometer baserade kristallografi. Men dessa stora kristaller som produceras dålig diffraktion på en mikro fokus strålröret (10 mikrometer i diameter) som lider av stor mosaicity (över 2-3 grader), förmodligen på grund av ansamling av kristalltillväxtrubbningar, eller från effekter relaterade till cryocooling. LCP-SFX dock möjligt för oss att samla kvalitet diffraktion data LCLS från 5 pm stora kristaller vid rumstemperatur. Strukturen löstes genom molekylär ersättning vid en anisotropisk 3,4, 3,2 och 4,0 Å upplösning längs de tre huvudaxlarna, tydligt identifiera placeringen av cyklopamin i bindningsfickan 6 (Figur 3).
Alkaloid opiater, såsom morfin, riktar μ-opioid receptor (μ-OR) används i stor utsträckning vid svår smärta. Men leder deras omfattande användning förvärvad tolerans och missbruk. Samtidig administrering av morfinmed δ-opioida receptor (δ-OR) antagonister har visat sig förhindra de ovan nämnda biverkningarna, vilket främjar sökandet efter föreningar med en blandad δ-OR-antagonist och μ-OR-agonist funktion. Vi erhöll de initiala diffraktionsdata på δ-OR i ett komplex med en bi-funktionell tetra-peptid DIPP-NH 2 med användning cryocooled kristaller som diffrakterade till 3,3 A vid en synkrotron röntgenkälla som utnyttjar konventionella datainsamlingsstrategi goniometer-baserade. Dessa data visade en delvis tvetydigt elektrondensitet för peptidliganden. Därefter tillsattes XFEL diffraktionsdata vid rumstemperatur erhålles och strukturen bestämdes vid 2,7 Å upplösning som visar en tydlig täthet för liganden och receptorn 7. Denna struktur erbjuds en möjlighet till ytterligare förståelse opioid receptorfunktionen och selektivitet och gav värdefulla insikter för utveckling av nya smärtstillande medel.
1 R) är en GPCR som tjänstgör som en primär regulator av blodtrycket. Vi kristalliseras vid en R i komplex med en antagonist ZD7155 i LCP. Optimerade kristaller nådde en maximal storlek på 40 × 4 × 4 pm 3 med den bästa diffraktion når endast ~ 4 A vid en synkrotron källa. Genom att ändra kristallisationsbetingelserna, vi fått duschar av mindre kristaller (10 x 2 x 2 pm 3), som användes för att erhålla temperatur struktur rummet på 2,9 Å upplösning med XFEL strålning. Totalt 2,764,739 detektor bilder uppsamlades för att göra en komplett uppsättning data från ca 65 pl av kristall-lastad LCP motsvarande cirka 0,29 mg protein 9. Av det totala antalet ramar, var 457.275 identifierades som kristall träffar, vilket motsvarar en träffsäkerhet på 17%, varav 73,130 ramar (16% av träffar) styrde indexeras och integreras.
GPCR signalerar genom två huvudvägar som förmedlas av antingen G-proteiner eller arrestiner. Strukturen av β 2 adrenoceptor bunden till ett heterotrimert G s-protein var löst för några år sedan 20, under det att strukturen hos en GPCR i komplex med arrestin hade förblivit gäckande. Vi fick små kristaller av en rhodopsin-arrestin-fusionsprotein i LCP som nådde 25-30 um i den längsta dimensionen, men trots omfattande optimering, diffrakteras endast till ~ 7 en upplösning på synkrotron källor. Genom att använda LCP-SFX-metoden, inom 12 timmar efter XFEL stråltiden, vi samlat 22,262 kristall träffar, varav 18,874 mönstren framgångsrikt indexeras och integreras för att anisotropisk upplösning gränser 3,8 Å / 3,8 Å / 3,3 Å 19. Rhodopsin-arrestin är en mycket utmanande proteinkomplex som motstod strukturbestämning med hjälp av traditionella metoder. Den framgångsrika bestämningen av denna struktur har visat den enorma potential somLCP-SFX metod för att ta itu med svåra problem och som en unik möjlighet att undersöka mekanismen för arrestin-partisk signalering i GPCR.
Slutligen, förutom att membranproteinkristaller odlas i lipida fasen, vår provberedning och leveransmetod lyckades anpassad för lösliga proteinkristaller, där LCP används som ett bärarmedium för leverans av kristaller, vilket tillåter oss att dramatiskt minska protein konsumtion krävs för strukturbestämning. Strukturer av två modellproteiner, lysozym och fykocyanin, löstes vid 1,89 Å och 1,75 Å upplösning respektive genom denna metod, med användning av mindre än 0,1 mg av varje protein 21.
| Serotoninreceptor 2B | smoothened receptor | | Angiotensin II-receptor typ 1 | Rhodopsin-arrestin | lysozym | fykocyanin | | |
| PDB ID | 4NC3 | 4O9R | 4RWD | 4YAY | 4ZWJ | 4ZIX | 4ZIZ |
| Totalt prov används * l | 100 | 83 | 50 | 65 | 75 | 10 | 10 |
| Totalt protein används, | ig | 300 | 500 | 300 | 290 | 340 | 100 | 100 |
| Genomsnittlig kristallstorlek, um | 5 x 5 x 5 | <5 | 5 x 2 x 2 | 10 x 2 x 2 | 5-10 | 5 x 2 x 2 | 10 x 10 x 5 |
| Träffhastighet, % | 3,6 | 7,8 | 5,9 | 17 | 0,45 | 40 | 6,5 |
| Total datainsamling tid, h | 10 | 8 | 4,6 | 6,4 | 12 | 0,75 | 0,67 |
| Antal indexerade mönster | 32819 | 61964 | 36083 | 73130 | 18874 | 54544 | 6629 |
| rymdgrupp | C 2 2 2 1 | P 2 1 | C 2 | C 2 | P 2 1 2 1 2 1 | P 4 3 2 1 2 | H 3 2 |
| Upplösning, | 2,8 | 3,2 / 3,4 / 4,0 | 2,7 | 2,9 | 3,3 / 3,8 / 3,8 | 1,89 | 1,75 |
Tabell 1. Sammanfattning av provberedning och datainsamling statistik för representativa strukturer lösas med LCP-SFX-metoden.
Mängden prov som krävs för en LCP-SFX experiment beror på kristall diffraktion kvalitet, kristalldensitet, diametern på insprutningsmunstycket, liksom den XFEL strålstorlek, intensitet och pulsrepetitionshastighet.
Figur 1. Flödesschema för en typisk provberedning förfarande för beredning av prov LCP-SFX. Inleds med LCP kristallisation av målproteinet i gastäta glassprutor. Efter kristaller erhålls, är kristall lastad LCP konsolideras i en spruta och titreras med ytterligare lipid, att absorb överskottet fällningslösningen. Kristaller karakteriseras sedan med hjälp av olika mikroskopimetoder före XFEL datainsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Ett representativt resultat, strukturen för 5-HT2B- i komplex med ergotamin. (a) mikrokristaller av 5-HT 2B / ergotamin avbildas med en ljus-fält mikroskop läge 8. Denna siffra har återanvänts från referens 8 med upphovsrätts tillstånd från Science. (B) mikrokristaller av 5-HT 2B / ergotamin avbildas med en tvär polariserad mikroskop läge 8. Denna siffra har återanvänts från referens 8 med upphovsrätttillåtelse från Science. (c) En tecknad representation av 5-HT 2B / ergotamin struktur som erhållits genom LCP-SFX strategi. Lipider som byggdes i modellen visas i stick representation. Liganden ergotamin visas i områden representation. Heldragna linjer visar de ungefärliga membran gränser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Ett representativt resultat, struktur SMO i komplex med cyklopamin. Vänstra panelen, mikrokristaller av SMO / cyklop avbildas med en tvär polariserad mikroskop läge 6. Denna siffra har återanvänts från referens 6 med upphovsrätts tillstånd från Nature Communications. Höger panel, en tecknad representatipå den SMO / cyklopstruktur som erhållits genom LCP-SFX strategi. Ligand cyklop visas i områden representation. Heldragna linjer visar de ungefärliga membran gränser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De protokoll som beskrivs här ger en allmän beskrivning av provberedningsförfarande för en standard LCP-SFX experiment med en LCP injektor. Baserat på vår erfarenhet, är den totala mängden av den slutliga mikrokristall-lastad LCP prov som krävs för att samla in en hel dataset typiskt 50-100 pl (Tabell 1, 25-50 pl inledande protein-lastad LCP prov), beroende på mikrokristallstorleken , kvalitet och densitet. Eftersom varje 100 | il spruta gastät glas kan rymma omkring 7 | il av LCP i form av en helt utsträckt sträng för att säkerställa korrekt och även diffusion av fällningslösningen i LCP, bör åtminstone fyra till sju prover i sprutor förberedas för varje LCP-SFX experiment.
Eftersom provet pressas genom en smal 20-50 mikrometer i kapillär diameter, är det viktigt att undvika främmande partiklar material i provet. Damm och fibrer som skulle kunna ibland införda i LCPprov eller fällningslösningar kan täppa till injektom kapillären och ökar stilleståndstiden under experimentet. Därför är det viktigt att filtrera lipiden och alla lösningar genom ett 5 | im por-filter innan de tillagas prover. Eventuellt kan ett rent rum eller en bärbar renrum huven användas för provberedning.
Dessa protokoll bygger på att använda 9,9 MAG (monoolein) som värd lipid för MP kristallisation. De har dock inte begränsade till 9,9 MAG och kan lätt anpassas till andra LCP värd lipider eller lipidblandningar efter att ha tagit hänsyn till skillnaderna i lipidfasen beteende. De flesta av de strukturer av MPs kristalliseras i LCP erhölls genom att använda en av de MAG-molekyler, med 9,9 MAG vara den mest framgångsrika representativa hittills 15. Den huvudsakliga nackdelen med att använda 9,9 MAG för SFX är dess övergång till lamellär kristallfas vid kylning under 18 ° C, vilket ofta inträffar när datainsamling utförs i vakuum. den titratipå med 7,9 MAG beskrivs i avsnitt 5 i detta protokoll ger en bra lösning på detta problem. I vår erfarenhet, kristaller motstå en sådan titrering utan några negativa effekter. Om emellertid inte är önskvärt tillsats av 7,9 MAG eller någon annan kortkedjade MAG, kan titreringen utföras med 9,9 MAG. I detta fall bör stängas gasen som stabiliserar flödet av LCP under injektion i vakuum från helium till kväve, vilket kan förhindra bildandet av en kristallin lipidfas i de flesta prover, på bekostnad av att ha en mindre stabil provflödet.
Den geléliknande konsistens av LCP har en stor fördel för användning som en kristall bärarmedium, eftersom den tillåter justering av flödeshastigheten kristallen inom ett brett spektrum, som lämpar sig för insamling seriekrist uppgifter på moderna XFEL och synkrotron källor. Matcha kristallen flödet med XFEL pulsrepetitionshastigheten resulterar i dramatisk minskning i kristallförbrukningen med tiopotenser compared till vätskeinsprutning. LCP är ett lämpligt bärarmedium för leverans inte bara MP kristaller odlas i det, men även för kristaller av lösliga proteiner 21. Flera alternativa viskösa kristall bärarmedier har nyligen införts 22-24, utvidga arsenal av verktyg och reagens för att utföra seriekrist experiment. Dessutom har seriekrist med LCP som en kristall frisättningsmediet visats vid konventionella synkrotron källor, åtminstone för väl avböjande kristaller 24,25. Framtida uppgraderingar av synkrotron källor som ökar röntgenintensiteten med tiopotenser, liksom förbättringar i detektorteknik, kommer att göra seriekrist en ännu mer tillgänglig och attraktiv metod för strukturbestämning.
LCP-SFX har visat sin styrka för MP strukturbestämning. För utmanande biologiska system (t.ex. GPCR eller makromolekylära komplex) där Large, diffraktion kvalitet kristaller är svårt att växa, kan LCP-SFX ett attraktivt, om inte den enda, hållbara alternativet för att lösa en atomär upplösning struktur. Med alla dess fördelar, det vill säga med hjälp av LCP som matris för MP kristallisering och kristall leverans, låg protein konsumtion, frånvaro av strålskador, rumstemperatur datainsamling, möjligheter till tidsupplösta studier 26,27 och ingen kristall skörd krav, LCP- SFX ska spela en viktig roll i den framtida strukturbiologi.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 GM108635 och U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award och NSF STC award 1231306. Vi tackar A. Walker för att få hjälp med manuskriptet förberedelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Formulatrix | SKU 209526 | For LCP preparation |
| LCP-injector loading needle | Hamilton | 7804-01 point style 3, length 1 inch | For LCP dispensing and injector loading |
| Removable needle | Hamilton | 7768-01 | For removing precipitant solution |
| Parafilm M | Parafilm | PM992 | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
