Introduction
البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) تمثل حوالي 10٪ من س. بروتينات خميرة 1،2 وحوالي 15٪ من البروتينات الثدييات 3-5. كانوا متورطين في العديد من العمليات الخلوية مثل معالجة مرنا بعد النسخي والتنظيم، الترجمة، نشوء حيوي الريبوسوم، الحمض الريبي النووي النقال aminoacylation وتعديل، وإعادة عرض لونين، وأكثر من ذلك. فريق فرعي هامة من الممارسات التجارية التقييدية هي بروتينات ملزمة مرنا (mRNPs) 6،7. في سياق نضوج مرنا، الممارسات التجارية التقييدية مختلفة تربط نص وتوسط معالجة النووي والتصدير من النواة، توطين الخلوية والترجمة وتدهور 6-8. وهكذا، فإن مجموعة متميزة من الممارسات التجارية التقييدية منضم إلى نص معين في أي نقطة زمنية يحدد التجهيز لها، وفي نهاية المطاف مصيرها.
تحديد الممارسات التجارية التقييدية المرتبطة مرنا يمكن أن تحسن بشكل كبير من فهمنا للعمليات التي يقوم تنظيمها بعد النسخي. تنوعا الوراثية، وقد استخدمت أساليب المجهرية، والكيمياء الحيوية والمعلوماتية الحيوية لتحديد البروتينات المشاركة في التنظيم مرنا (إعادة النظر في 11/9). ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه الأساليب تمكن من التعرف على البروتينات المرتبطة مرنا هدف معين. من المذكرة هو الخميرة ثلاثة نظام الهجين (Y3H)، الذي يستخدم مرنا من الفائدة كطعم لفحص مكتبة التعبير في خلايا الخميرة. وعادة ما تكون لاحظت الحيوانات المستنسخة إيجابية من خلال مجموعة مختارة النمو أو مراسل التعبير 12-14. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو وجود عدد كبير من البروتينات التي يمكن مسحها في بيئة الخلوية والقدرة على قياس قوة التفاعل الحمض النووي الريبي البروتين. وتشمل النواحي العدد الكبير نسبيا من نتائج إيجابية كاذبة بسبب غير محددة وملزمة، وقدرة عالية على النتائج السلبية الكاذبة الواجبة، في جزء منه، إلى misfolding فريسة البروتين الانصهار أو الحمض النووي الريبي الطعم.
بديل للنهج الوراثي purifi تقاربالموجبة من الحمض النووي الريبي مع البروتينات المرتبطة بها. بولي والتي تحتوي على من mRNAs يمكن عزلها من خلال استخدام جزئية الأعمدة دينارا، والكشف عن البروتينات المرتبطة بها عن طريق قياس الطيف الكتلي. يتم حفظها تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين في سياق الخلوي من قبل يشابك، الأمر الذي يجعل الرابطة التساهمية قصيرة المدى. استخدام العمود DT بنسبة ضئيلة غلة نظرة عالمية للبروتيوم بأكمله الذي يرتبط مع أي بولي والتي تحتوي على مرنا 3،5،15. ومع ذلك، هذا لا يوفر قائمة من البروتينات التي ترتبط مع مرنا بشكل خاص. جدا متاحة لإنجاز مثل هذا تحديد عدد قليل من الطرق. يستتبع طريقة زوج ترنسفكأيشن من الحمض النووي مع التكامل إلى الهدف مرنا 16،17. ويرد الحمض النووي أيضا إلى الببتيد، والذي يسمح يشابك إلى الممارسات التجارية التقييدية في المناطق المجاورة القريبة من موقع التفاعل. بعد يشابك، وحامض الممارسات التجارية التقييدية-الببتيد النووي يمكن عزل ويتعرضون لتحليل البروتينات. في الآونة الأخيرة، وكانت منهجية القائم على أبتمرطبقت بنجاح لمقتطفات من خطوط الخلايا الثديية 18. تم وضع أبتمر RNA مع تحسين التقارب إلى streptavidin وتنصهر لسلسلة من الفائدة (عنصر والاتحاد الافريقي الغني (ARE) في هذه الحالة). كان يعلق على أبتمر-ARE RNA لحبات streptavidin ومختلطة مع المحللة الخلية. وتنقيته البروتينات التي ترتبط مع تسلسل ARE وتحديد الطيف الكتلي (MS). على الرغم من أن هذه الطريقة الكشف عن الجمعيات التي تحدث خارج الإعدادات الخلوية (أي في المختبر)، فإنه من المرجح أن يتم تعديل في المستقبل وذلك لتقديم الأبتامرات في الجينوم وتمكين وبالتالي عزل البروتينات المرتبطة مرنا أثناء وجوده في الوسط الخلوي (أي في الجسم الحي). في الخميرة، حيث يتم وضع التلاعب الجيني جيدا، وطريقة سريعة (وضعت في مختبر البروفيسور جيف Gerst) تقدم وجهة نظر في الجسم الحي الجمعيات 19. السريع يجمع بين MS2- محددة وملزمة من البروتين معطف MS2 قوي (CP) إلى تسلسل الحمض النووي الريبي MS2، والمجال ملزم streptavidin (متوسط ضغط الدم الانقباضي) لstreptavidin الخرز مترافق. وهذا يمكن تنقية فعالة لمن mRNAs الموسومة MS2 من خلال حبات streptavidin. وعلاوة على ذلك، والتعبير من 12 نسخ من حلقات MS2 يسمح ما يصل الى ستة MS2-البرامج القطرية لربط في الوقت نفسه إلى الحمض النووي الريبي وزيادة كفاءة عزلتها. ولذلك اقترح هذا البروتوكول لتمكين تحديد البروتينات المرتبطة مرنا رواية أخرى يتعرضون عينات مزال لتحليل البروتينات التي مطياف الكتلة.
نحن استخدمت مؤخرا السريع لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة الخميرة PMP1 مرنا 20 تم إظهار PMP1 مرنا سابقا لتترافق مع غشاء ER وعثر 3 'المنطقة غير مترجمة لها (UTR) أن يكون محددا رئيسيا في هذه الجمعية 21. وهكذا، الممارسات التجارية التقييدية التي تربط PMP1 3 'UTR من المرجح أن يلعب دورا هاما في توطين لها. يتبع السريع من قبل الكروماتوجرافي السائلأدى ذ الكتلة الطيفي / قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) في تحديد العديد من البروتينات الجديدة التي تتفاعل مع PMP1 20. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لمنهجية سريعة، والضوابط الهامة التي تحتاج إلى القيام به، ونصائح تقنية قد تحسين المحصول وخصوصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: إدراج تسلسل يتكون من 12 موقعا ملزم MS2 (MS2 حلقات، MS2L) في موضع الجيني المطلوب، عادة بين الإطار القراءة المفتوحة (ORF) و "UTR 3. ويرد بروتوكول مفصلة لهذا التكامل في أماكن أخرى 22. تحقق الإدراج الصحيح والتعبير PCR، وتحليل الشمالي أو RT-PCR 20،23. فمن المهم للتحقق من أن التكامل لم تتدخل مع توليف من 3'UTR. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا أدخلت MS2-CP، معربا عن البلازميد تنصهر إلى متوسط ضغط الدم الانقباضي تحت تعبير عن المروج محرض (نضوب ميثيونين) إلى خلايا 24. سلالة متطابقة، باستثناء الحلقات MS12 قدم، ينبغي أن تستخدم كوسيلة لمراقبة للكشف عن الإشارات غير محددة.
1. سريع تنقية
- تنمو 500 مل من خلايا الخميرة (استخدام 250-1،000 مل من خلايا الخميرة تبعا لمستوى التعبير عن الجينات في المصالح) معربا عن MS2 الموسومة مرنا 20 وMS2-CP-GFP-SBP انصهار بروتين 24 إلى OD 600 0،8-1،0 في 30 درجة مئوية في المتوسط النمو المناسب (على سبيل المثال، الاصطناعية سكر العنب (SD) متوسطة انتقائية).
- خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 4 دقائق على RT وتجاهل طاف.
- غسل الخلايا في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الطرد المركزي كما كان من قبل (الخطوة 1.2)، resuspend في حجم مساو (الخطوة 1.1) من SD دون ميثيونين، واحتضان لمدة 45 - 60 دقيقة في 30 درجة مئوية للحث على التعبير عن MS2 -CP-GFP-متوسط ضغط الدم الانقباضي البروتين الانصهار.
ملاحظة: أطول وقت الحث قد يسبب تجميع GFP. - جانبا 10 مل من الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي من هذه العينة باستخدام بسيط "الفينول الساخن" طريقة 25. تحذير: الفينول هو شديد السمية، وينبغي أن يتم التعامل معها وفقا لتعليمات السلامة بها.
ملاحظة: هذا RNA هو إشارة جيدة لنوعية من الحمض النووي الريبي معزولة (الشكل 1A). - 500 مل الخلايا، إضافة 1.35 مل 37٪ الفورمالديهايد لج النهائيةoncentration من 0.1٪ إلى تشعبي المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين. تستمر الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحذير: الفورمالديهايد عالية السمية، وينبغي التعامل وفقا لتعليمات السلامة بها.
- إضافة 26.5 مل من 2.5 M الجلايسين إلى تركيز النهائي من 0.125 م واحتضان لمدة 3 دقائق لوقف يشابك. من هذه الخطوة على، وضع كل شيء على الجليد للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.
- خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية، وأغسلها مع 45 مل الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
- Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة السريع تحلل لكل 100 مل من زراعة الخلايا الأولية.
- تنقسم إلى aliquots من 500 ميكرولتر في أنابيب microfuge المغطاة المسمار وإضافة ~ 400 ملغ من الخرز الزجاجي المبرد إلى كل قسامة (تقريبا كامل 0.2 مل PCR أنبوب).
- خلايا ليز في حبة الخافق لمدة 3 دقائق. وضع على الفور المحللة على الجليد.
ملاحظة: النشرات تحلل الخلية RNases الخلوية، والتي هي السبب الرئيسي لتدهور الحمض النووي الريبي. يحتوي عازلة السريع تحلل على نسبة عالية من ريبونوكلياز inhibitors، مثل الهيبارين غير محدد ريبونوكلياز المانع ومثبطات معينة. العمل بسرعة وحفظ كل شيء بارد ويوصى أيضا. - نقل المحللة إلى أنابيب جديدة. بيرس ثقب صغير في الجزء السفلي من كل microfuge أنبوب بإبرة الساخنة (0.8 ملم × 40 ملم) ووضع أنابيب microfuge على أعلى من 15 مل أنابيب. استخدام رئيس حقنة 5 مل كما محول بين أنابيب microfuge و15 مل أنابيب. أجهزة الطرد المركزي لجمعية أنابيب في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- نقل التدفق من خلال أنبوب 15 مل إلى أنبوب 1.5 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لازالة الانقاض الخلية.
- supernatants تجمع من جميع الأنابيب 1.5 مل في أنبوب 15 مل واحد، ويوضع جانبا 1/50 و 1/100 حجم المحللة للRNA والبروتين العزلة، على التوالي.
ملاحظة: ستكون هذه بمثابة عينات "الإدخال" لتحليلها لاحقا (الشكل 1). - إضافة 300 ميكروغرام من أفيدين لكل 500 مل من أناnitial الخميرة الثقافة واحتضان لمدة 30 دقيقة (وهذا يمكن أن تخفض إلى 10 دقيقة) في 4 درجة مئوية تحت المتداول ثابت (10 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: أفيدين كتل البيوتين والبروتينات المعقدة البيروكسيديز من ملزمة لحبات streptavidin. - قبل تغسل حبات streptavidin قبل الحضانة مع المحللة الخلية.
- نقل حوالي 300 ميكرولتر من streptavidin الخرز الطين إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإزالة طاف العلوي. وهذا سيؤدي في 250 ميكرولتر من الخرز. تغسل حبات مرتين مع 1 مل من العازلة تحلل السريع. أجهزة الطرد المركزي لحبات streptavidin في 660 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية بين كل خطوة.
- منع الخرز التي يحتضنها لمدة 1 ساعة مع 0.5 مل من العازلة تحلل السريع، 0.5 مل من 10 ملغ / مل BSA و 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال. حبات يمكن أن تترك O / N في عرقلة الحل في 4 درجة مئوية مع دوران إذا لزم الأمر.
- يغسل مرتين مع 1 مل من سرعة تحلل العازلة.
ملاحظة: الخرز المغناطيسي يمكن أن تستخدم أيضا للحد من الوقت وbackgrس اوند. هذه، ولكن، لديها قدرة أقل من الخرز سيفاروز.
- إضافة 250 ميكرولتر من الخرز streptavidin قبل غسلها إلى المحللة التي تحتوي على أفيدين (من الخطوة 1.14)، واحتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران مستمر (10 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: هذه المرة حضانة تمثل حلا وسطا بين توفير وقت كاف ملزم والتقليل من فرص تدهور الحمض النووي الريبي. - أجهزة الطرد المركزي في 660 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية لمسح حبات streptavidin ونقل طاف لأنبوب 15 مل الجديد. جانبا 1/50 و 1/100 حجم المحللة للRNA والبروتين العزلة، على التوالي.
ملاحظة: وسوف تكون هذه العينات "غير منضم". - تغسل حبات مع 1 مل من سرعة تحلل العازلة، يهز بلطف، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد، وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.17. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- تغسل حبات مع 1 مل من العازلة السريع غسل، وهذه المرة تدوير (10 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين. تغسل حبات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
- تغسل حبات مرة أخرى مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. أجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه، واتخاذ طاف كامل لRNA واستخراج البروتين كما العينة "غسل".
ملاحظة: هذه مشاركة غسل العينة تشير إلى التشدد في يغسل وينبغي أن تكون من نفس الحجم كما العينة شطف. وهذا تبسيط تجهيز وتحميل في فحوصات لاحقة. - إلى أزل RNA والبروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي من العمود، إضافة 120 ميكرولتر من البيوتين 6 مم في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية مع دوران مستمر (10 دورة في الدقيقة).
- الطرد المركزي الخرز على النحو الوارد أعلاه ونقل المواد مزال إلى أنبوب 1.5 مل جديد. تدور عينة مزال مرة أخرى ونقل المرحلة العليا لأنبوب 1.5 مل الجديد لضمان عدم المرحل من الخرز.
- أخذ عينات لRNA أو استخراج البروتين.
ملاحظة: حجم اتخذت ينبغي أن يعتمد على مستوى الفحص والتعبير التالي من الحمض النووي الريبي أو البروتينات من الفائدة. كدليل، لتحليل الشمالي 26، تأخذ 80٪ من العينة، لطخة غربية 23،27 أو RT-PCR 28، تأخذ 20٪، وقياس الطيف الكتلي 29 إلى اكتشاف بروتينات جديدة، واتخاذ عينة بأكملها.
2. استخراج الحمض النووي الريبي
- إضافة حجم مساو من 2X يشابك عكس العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 65 درجة مئوية. متابعة مباشرة لاستخراج الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: عكس يشابك العازلة يحتوي على ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، مما يحسن بشكل ملحوظ استخراج الحمض النووي الريبي 20. - استخدام الفينول القياسية: طريقة الكلوروفورم 26 لاستخراج الحمض النووي الريبي من "المدخلات" والعينات "غير منضم" (الخطوات 1.13 و 1.17).
ملاحظة: هذه العينات تحتوي على كمية كبيرة من الهيبارين المانع ريبونوكلياز، والتي يمكن أن تحول دون اللاحقة عكسي Transcriptase- (RT) باستخدام فحوصات (على سبيل المثال، RT-PCR)، وبالتالي، LiCl هطول الأمطار 30 ينصح لحذفها. و"واش "و" "عينات شطف (الخطوات 1.21 و 1.24) تحتوي على كميات قليلة من الحمض النووي الريبي، وعجلت من خلال الخطوات التالية. - إضافة حجم مساو من 8M Guanidinium، حمض الهيدروكلوريك (GuHCl) ومجلدين من 100٪ من الإيثانول إلى "غسل" والعينات "شطف". احتضان عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
ملاحظة: سوف Guanidinium تفسد كفاءة البروتينات، وبالتالي تمنع RNases والبروتياز في العينة. - أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف. غسل بيليه مع الباردة الايثانول 80٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- حل بيليه الحمض النووي الريبي في 400 ميكرولتر من ريبونوكلياز المياه مجانا ويعجل مرة أخرى لإزالة أي بقايا GuHCl أو غيرها من الملوثات. إضافة 40 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 5.2 و 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، في احتضان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي، ويغسل كما في الخطوة 2.4 وإزالة كافة الإيثانول مع طرف 10 ميكرولتر. Resuspend وبيل RNAوآخرون في 10 المياه مجانا ريبونوكلياز ميكرولتر. رعاية اضافية مثل بيليه RNA هو عادة غير مرئية.
ملاحظة: نماذج يمكن استخدامها لتحليل الشمالي كما هو موضح في 23 (الشكل 1).
3. البروتين التحضير لغرب وصمة عار أو تحليل الطيف الكتلي
- إضافة 1/3 حجم 4X Laemmli عينة العازلة (LSB) لعينات البروتين واحتضان 45 دقيقة عند 65 درجة مئوية لعكس يشابك من الحمض النووي الريبي والبروتينات.
ملاحظة: نماذج يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. - بروتينات تعمل على هلام بولي أكريلاميد SDS (SDS-PAGE) 31. ضبط نسبة من هلام وفقا لحجم من البروتينات لتحليلها.
ملاحظة: 10٪ هلام الأكريلاميد يعطي مجموعة واسعة من الانفصال وجيد كما تقريب الأول. - نقل البروتينات إلى غشاء كما في تحليل طخة مناعية معيار 27 من أجل السيطرة على كفاءة العزل (الشكل 1C). وصمة عار مع أي Coomassie الأزرق R250 أو الفضة وصمة عار قبل تحليل الطيف الكتلي.
ملاحظة: وصمة عار الفضة هو الخيار المفضل لأنه أكثر حساسية ويسمح أفضل للكشف عن (الشكل 1B). ويمكن أن يتم تلطيخ مع أي من الحلول التي يجري اعدادها يدويا أو مجموعات تجارية. وينبغي أن تحدد فترة حضانة من هلام في محلول الصبغة النهائية تجريبيا. حضانة طويلة قد تكشف عن البروتينات وفرة منخفضة، ولكن يمكن أن تسبب بروتينات أعرب غاية مثل MS2-CP-SBP-GFP لتكون ملطخة مرارا وقد تخفي البروتينات المحيطة بها في محيطها. بالإضافة إلى ذلك، قد تحدث خلفية عالية. متابعة رد فعل بعناية، وإضافة وقف الحل في الوقت المناسب. - قطع العصابات من هلام ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب. عينات في مخزن -20 درجة مئوية، أو ترسل لاستخراج البروتين والهضم التربسين تليها تحليل LC-MS / MS 32.
- كنهج البروتين البديل لاستبعاد خطوة الانفصال هلام، هضم المواد مزال من الخطوة 1.24 في ذلكlution باستخدام التربسين وتخضع لتحليل LC-MS / MS 33.
ملاحظة: حذف هذا الفصل SDS-PAGE يبسط بروتوكول ويزيد الغلة. ومع ذلك، قد تحتوي على عينات آثار المنظفات NP-40، مما يعوق تحليل الطيف الكتلي. للتغلب على هذه المشكلة، اتبع الخطوات التالية:- تشغيل البروتين في SDS-PAGE 31 ل10-15 دقيقة.
- قطع جزء كامل من الممر (أي، حيث توجد البروتينات).
ملاحظة: عينة من البروتين يمكن أن تشمل كمية كبيرة من البروتين MS2-CP-متوسط ضغط الدم الانقباضي قد تحجب الإشارات من البروتينات وفرة منخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السريع تمكن من عزل الحمض النووي الريبي هدف محدد مع البروتينات المرتبطة بها. حاسمة لنجاحها والحفاظ على الحمض النووي الريبي سليمة قدر الإمكان، وبالتالي الحصول على كمية كافية من البروتينات. لتحديد كفاءة العزل ونوعية من الحمض النووي الريبي، يتم إجراء تحليل الشمالي (الشكل 1A). تحليل الشمالي في الاستفادة من التقارير بشكل مباشر على كفاءة وجودة السريع. وهكذا، فإن الكميات النسبية للطول وتدهور كامل المنتجات يمكن أن تحدد في شوط واحد. تم الكشف عن الرنا الريباسي (rRNAs) بسهولة في تلطيخ بروميد إيثيديوم، وعدم وجود rRNAs في العينة شطف يشير إلى التشدد في تنقية. وأظهر صرامة وخصوصية تنقية أبعد من ذلك لعدم وجود إشارة مرنا علامة عليه في العينات شطف (ACT1 اللوحة السفلية). في اشارة على ما يبدو في حارة FPR1، وهي ليست من حجم ACT1، هو بقايا من قبلالتهجين vious مع لجنة التحقيق MS2L. ويكشف تحليل الشمالي أيضا أن الحمض النووي الريبي المدخلات إلى حد ما أكثر تدهورا مقارنة الحمض النووي الريبي التي تم تنقيته بواسطة بروتوكول الفينول الساخن (ج / س ACT1 لوحة التحقيق). ويعزى ذلك إلى أطول وأكثر تعقيدا بروتوكول السريع. ومع ذلك، فإن قدرا كبيرا من كامل طول، الموسومة يتم عزل الحمض النووي الريبي على وجه التحديد، كما يتضح من إشارة قوية في جزء شطف (MS2L التحقيق).
يمكن تشغيل عينات البروتين في SDS-PAGE وملطخة بواسطة وصمة عار الفضة قبل تحليل البروتينات (الشكل 1B). عينة معزولة عن السيطرة، وخلايا لازال (-MS2L) هي مفيدة في الجمعيات المميزة غير محددة من تلك التي تعتمد على الحمض النووي الريبي. لذلك، يتم قطع فقط العصابات التي هي أقوى في العينة الموسومة (+ MS2L) من هلام واتخذت لLC-MS / MS. ويوصى التحليل الغربي مع الممارسات التجارية التقييدية العامة أيضا للدلالة على كفاءة البروتين شارك في تنقية (الشكل1C). هنا، كنا Yef3، والذي يعرف على التفاعل مع PMP1 20، أو GFP، مما يدل على كفاءة وخصوصية العزلة. ومن المثير للاهتمام، تظهر كفاءة Yef3 العزلة تختلف بين PMP1 وFPR1، وأقل بكثير بالمقارنة مع GFP.
وتعرض الشكل 1. عزل محددة من الرنا الموسومة MS2L وتحديد البروتينات المرتبطة نتائج اثنين من الرنا المختلفة التي تعرضوا لالسريعة (PMP1 وFPR1). (أ) تحليل لطخة الشمالي من عينات الحمض النووي الريبي تنقيته من تجربة سريعة. تم تشغيل RNA على هلام الاغاروز وملطخة بروميد إيثيديوم (اللوحة العليا). وقد نشف هلام لغشاء النايلون ويتعرضون للتهجين مع تحقيقات أشار (لوحات أقل). العينات التي تم تحليلها هي: تحلل الخلايا بسرعة (الفينول الساخن [خطوة 1.4])، رعPID تحلل الخلية (المدخلات [خطوة 1.13])، وبعد شطف مع البيوتين (شطف [خطوة 1.24]). (ب) الفضة وصمة عار للبروتينات من خلايا السريع مع MS2 الموسومة ولازال. تم تشغيل عينات البروتين من كسور شطف من PMP1 MS2 الموسومة (+ MS2L) أو لازال التحكم (-MS2L) في SDS-PAGE والفضة الملون. قطعت العصابات مع كثافة التفاضلية (المشار إليها النجمة) من هلام ويحدده تحليل الطيف الكتلي. يشير السهم البروتين الانصهار MS2-CP-GFP-متوسط ضغط الدم الانقباضي، والذي يدل على قدم المساواة تحميل البروتين. تم اقتصاص الممرات غير ذات صلة من أجل الوضوح. (C) تحليل الغربي من الضوابط الإيجابية. وقد أجريت لطخة غربية مع الأجسام المضادة التي تعترف Yef3 أو GFP شاردة من البروتين الانصهار MS2-CP. تم اقتصاص الممرات غير ذات صلة من أجل الوضوح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أساليب مختلفة تستخدم في عزل من mRNAs محددة لتحديد البروتينات المرتبطة بها 11،34 35. وتنطبق هذه الأساليب في التجارب المختبرية واستراتيجيات الجسم الحي للتحقيق تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. في المختبر طرق احتضان نسخه خارجيا RNA مع المحللة خلية للقبض على الممارسات التجارية التقييدية وعزل المجمعات الأداء الملاحي المطلوب 36،37. تم تقديم نهج فعال من هذا النوع في الآونة الأخيرة، والتي مكنت من تحديد البروتينات الرواية التي تربط الحمض النووي الريبي عزر التنظيمي 18. ومن عيوب هذه الطرق هو الربط من الممارسات التجارية التقييدية غير محددة لأن جمعية يحدث خارج بيئة الخلوية. المجراة الأساليب، التي البروتينات هي crosslinked بينما في إعدادات الطبيعية، قد توفر رؤية أفضل من جمعية RNA البروتين. وعلاوة على ذلك، يشابك يسمح أعلى صرامة خلال العزلة وبالتالي ارتفاع خصوصية. النهج زوج 17 يستخدم ترنسفكأيشن من العقاقيرتسلسل الحمض النووي الريبي الهدف من أجل توجيه شاردة الببتيد إلى جوار الممارسات التجارية التقييدية. يمكن لل-الممارسات التجارية التقييدية الببتيد ثم تكون crosslinked وعزل من خلال الخرز التي ترتبط سلسلة مكملة لتسلسل العقاقير. منهجية زوج هو مفيد للغاية نظرا لتطبيقه بسيط لكثير من أنواع الخلايا دون الحاجة إلى التلاعب الجينومية المعقدة. غير أنه، اعتمادا على كفاءة ترنسفكأيشن، وسوف الحالات التي يكون فيها انخفاض النسبة المئوية للخلايا تقبل العقاقير لها فعالية منخفضة. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على عزل تسلسل الممارسات التجارية التقييدية الببتيد-العقاقير من خلال حبات streptavidin المغناطيسية التي تقترن مع قليل النوكليوتيد المعقدة البيروكسيديز مكملا للحمض العقاقير النووية. تعدد التفاعلات (حبات مغناطيسية، streptavidin البيوتين وقاعدة الاقتران) قد تحد من الصرامة والكفاءة من العزلة. طريقة سريعة 24 الموصوفة هنا يوفر بديلا لهذه القيود في عدة جوانب. أولا، رانه تكامل MS2 حلقات في مواضع الجيني يضمن أن جميع خلايا تعبر عن ذلك، وبالتالي زيادة العائد لها. ثانيا، فإنه يستخدم التفاعل قابلية عالية للMS2-CP-GFP-متوسط ضغط الدم الانقباضي إلى اثني عشر MS2 تسلسل حلقة ويتيح لهم ربط في الجسم الحي. ثالثا، تثبيت للتفاعل الحمض النووي الريبي البروتين يمكن يغسل أكثر صرامة، ويقلل من التعرف على البروتينات ملزمة غير وجه التحديد. وأخيرا، فإن نطاق الخطة الاستشرافية يربط حبات streptavidin مع قابلية عالية ومزال بسهولة مع البيوتين الحرة.
ادراج حلقة MS2 في الحمض النووي الريبي من المستحسن بين ORF و "UTR 3 لتقليل الترجمة اضطراب وضمان التعبير عن كل الحلقات. استخدمت ستة إلى 24 MS2 يكرر حلقة سابقا لتصور مرنا توطين 38-40. ومع ذلك، فإن إدخال سلسلة طويلة من MS2 حلقات قد تسبب تغيرات في تجهيز وبنية الحمض النووي الريبي. قد تزعزع استقرار نص أو تغيير ذخيرة من الممارسات التجارية التقييدية ملزمةلذلك. في تجربتنا، 12 حلقات كافية للحصول على شطف كفاءة المعلمة MS2 الحمض النووي الريبي 20. وفي هذا الصدد، نلاحظ أننا عادة احظ المحاضر أقصر إضافية في التهجين شمال دينا. يحلل الشمالية مع كشفت تحقيقات مختلفة أن هذه الأشكال أقصر تضمنت MS2L وجزء من 3 'UTR 20، مما يدل على إنهاء النسخ المبكرة. من المحتمل أن يقلل من كفاءة عزل البروتينات المرتبطة UTR 3 'مثل هذه الحالات. ولذلك، ينبغي أن تكون متوازنة في عدد من الحلقات إدراج ومواقعها داخل الحمض النووي الريبي بين الكفاءة العالية المنسدلة والاستقرار نسخة.
الحمض النووي الريبي أن تبقى على حالها في جميع أنحاء بروتوكول لتمكين العزلة الفعالة والكشف عن مجموعة القصوى من البروتينات ملزمة. فرص تلوث ريبونوكلياز خارجي يمكن الحد من ارتداء القفازات، وضمان وجود منطقة العمل نظيفة، وإعداد حل مع الماء ريبونوكلياز خالية، والعمل بشكل مقتضبوكفاءة للحد من الوقت البروتوكول. ومع ذلك، وجدنا أن أكبر مساهم في تدهور الحمض النووي الريبي هو إطلاق سراح RNases الخلوية إلى المحللة على تحلل الخلية. واقترح أن طحن المبردة من خلايا الخميرة مع النتائج مطحنة الميكانيكية في تحسين تنقية RNA 41. وهذا يمكن أن يحاكم في الحالات التي لوحظ تدهور كبير مع هذا البروتوكول.
والعيب المشترك لفحوصات المنسدلة هو عزل العديد من البروتينات التي تربط nonspecifically إلى العمود. ولذلك، فإن استخدام سلالة الخميرة مع الحمض النووي الريبي علامة عليه هو عنصر تحكم الهامة. هذه السلالة يعبر عن انصهار بروتين MS2-CP-GFP-متوسط ضغط الدم الانقباضي لمواصلة استبعاد البروتينات التي تربط لبروتين الانصهار وليس الحمض النووي الريبي الهدف. ونلاحظ أن هذا لا يستبعد البروتينات التي قد ربط حلقة MS2 نفسها، وهذه تحتاج إلى مزيد من التحقق من صحة مع مقايسة المنسدلة البروتين. 1B الشكل يدل على أننا تمكنا من تحديد عدد من البروتينات التي تربطخصيصا لPMP1 مرنا، وبعض تم التحقق في وقت لاحق من قبل فحص المشارك IP 20.
يقتصر منهجية السريع حاليا لأنظمة الخميرة، وذلك باستخدام منهجيات التكامل في مواقع محددة راسخة لها. ويجري حاليا إعداد بروتوكولات التكامل في الموقع المحدد لجينات في الأنظمة الأخرى باستخدام نظام كريسبر-كاس 42،43. وسوف تكون هذه ذات أهمية كبيرة في توسيع نطاق استخدام السريع لأنظمة إضافية. تطبيق آخر في المستقبل من السريع هو لعزل الرنا التي ترتبط مع مرنا من الفائدة. هذا لا يمكن أن يتحقق بسهولة، عن طريق إخضاع المواد معزولة لوما يليها-RNA بدلا من LC-MS / MS. ونظرا لأهمية دور الرنا صغيرة في تنظيم التعبير مرنا، من المرجح أن تكون ذات أهمية كبيرة هذا التطبيق. وأخيرا، وإدخال تحسينات في مطياف الكتلة (MS) تحليل واستخدام الأساليب الكمية MS مثل SILAC سيؤدي إلى مقياس كمي من protei متجهة إلى مرنانانو ثانية في ظل ظروف مختلفة. السريعة يمكن استخدامها مع الخميرة نمت في وسائل الإعلام المخصب مع النظائر الثقيلة وبالمقارنة مع الخلايا المزروعة في ظل ظروف مختلفة (على سبيل المثال، والإجهاد) مع وسائل الإعلام غير المسماة 44،45. وتطبيق طريقة سريعة جنبا إلى جنب مع تحليل MS الكمي تسفر عن مقاييس دقيقة للتغيرات في جعبته الممارسات التجارية التقييدية التي ترتبط مع مرنا بشكل خاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور جيف Gerst وبوريس Slobodin للحصول على المشورة المفيدة في إعداد بروتوكول السريع وتوفير البلازميدات اللازمة. كما نشكر الدكتور أفيغيل عتير-انديه لمساعدتها في إنشاء هذا البروتوكول والدكتور تمار زيف من مركز البروتيوميات Smoler لمساعدتها مع تحليل LC-MS / MS. نشكر الأستاذ TG Kinzy (روتجرز) للأجسام المضادة YEF3. وأيد هذا العمل من قبل منحة 2011013 من مؤسسة الثنائية للعلوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
