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Genetics

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Published: September 30, 2016 doi: 10.3791/54467

Introduction

RNA-bindende Proteine (RBPs) stellen etwa 10% der S. cerevisiae Proteine 1,2 und etwa 15% von Säugetierproteinen 3-5. Sie sind in vielen zellulären Prozessen wie mRNA posttranskriptionales Verarbeitung und Regulation, Übersetzung, Ribosomenbiogenese, tRNA-Aminoacylierung und Modifikation, Chromatin-Remodeling beteiligt, und vieles mehr. Eine wichtige Untergruppe von RBPs ist die mRNA-bindende Proteine (mRNPs) 6,7. Im Zuge der mRNA Reifung, binden verschiedene RBPs das Transkript und vermitteln ihre Kern Verarbeitung, Export aus dem Zellkern, zelluläre Lokalisation, Übersetzung und Abbau 6-8. Somit bestimmt die unterschiedliche Menge von RBPs auf ein bestimmtes Transkript zu jedem Zeitpunkt verpflichtet, ihre Verarbeitung und letztlich sein Schicksal.

Die Identifizierung von RBPs mit einer mRNA verbunden sind, könnten unser Verständnis der Prozesse zugrunde liegen, ihre Post-Transkriptionsregulation verbessern. Diverse genetischeWurden in mRNA Regulation beteiligten Proteine zu identifizieren (in 9-11 prüft), mikroskopische, biochemische und bioinformatische Methoden verwendet. Jedoch nur wenige dieser Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Proteinen mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert. Bemerkenswert ist die Hefe-Drei-Hybrid-System (Y3H), die die mRNA von Interesse als Köder verwendet eine Expressionsbibliothek in Hefezellen zu screenen. Positive Klone werden in der Regel durch eine Wachstumsselektion oder Reporterexpression 12-14 beobachtet. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die große Anzahl von Proteinen, die in einer zellulären Umgebung und die Fähigkeit, abgetastet werden kann, die Festigkeit des RNA-Protein-Wechselwirkung zu messen. Nachteile sind die relativ große Anzahl an falsch positiven Ergebnissen aufgrund der unspezifischen Bindung, und das hohe Potenzial für falsch negative Ergebnisse darauf zurückzuführen, zum Teil auf Fehlfaltungen des Fusionsproteins Beute oder der Köder-RNA.

Eine Alternative zur genetischen Ansatz ist Affinität purifiKation RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Poly A enthaltenden mRNAs kann durch die Verwendung von Oligo-dT-Säulen isoliert werden, und deren assoziierte Proteine ​​durch Massenspektrometrie detektiert werden. Die RNA-Protein-Wechselwirkung in seinem zellulären Kontext durch Vernetzung erhalten, die Kurzstrecken-kovalente Bindungen macht. Die Verwendung der Oligo - dT - Säule ergibt eine globale Sicht auf die gesamte Proteom , die mit jeder Poly - A-haltige mRNA 3,5,15 zugeordnet ist. Allerdings bedeutet dies nicht eine Liste von Proteinen bereitzustellen, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind. Nur sehr wenige Methoden zur Verfügung, eine solche Identifikation zu erreichen. Das Paar Verfahren beinhaltet die Transfektion von Nukleinsäure mit Komplementarität zum Ziel - mRNA 16,17. Die Nukleinsäure wird auch an ein Peptid gebunden, das in der Nähe des Interaktionsstelle zu RBPs Vernetzung ermöglicht. Nach der Vernetzung kann das RBP-Peptid-Nukleinsäure isoliert und Proteomik-Analyse unterzogen werden. Vor kurzem wurde ein Aptamer-basierte Methodikerfolgreich angewendet 18 aus Säugerzelllinien extrahiert. Ein RNA-Aptamer mit verbesserter Affinität an Streptavidin wurde auf eine Sequenz von Interesse (AU-rich Element (ARE) in diesem Fall) entwickelt und aufgeschmolzen. Das Aptamer-ARE-RNA wurde an Streptavidin-Kügelchen und gemischt mit Zelllysat angebracht. Proteine, die mit der ARE-Sequenz zugeordnet wurden gereinigt und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Obwohl dieses Verfahren Verbände detektiert , die außerhalb der zellulären Einstellungen auftreten (dh in vitro), ist es wahrscheinlich in der Zukunft modifiziert werden , um die Aptamere in das Genom einzuführen und somit die Isolierung von Proteinen mit der mRNA , während in der zugeordneten Freigabe Zellmilieu (dh in vivo). In Hefe, wo genetische Manipulationen gut etabliert sind, bietet die schnelle Methode (entwickelt von Prof. Jeff Gerst Labor) eine Ansicht der in vivo - Vereinigungen 19. RaPID kombiniert die spezifische und starke Bindung des MS2-Hüllprotein (MS2-CP) an die MS2-RNA-Sequenz und der Streptavidin-Bindungsdomäne (SBP) konjugierte Kügelchen an Streptavidin. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von MS2-markierten mRNAs durch Streptavidinkügelchen. Darüber hinaus wird die Expression von 12 Kopien von MS2-Schleifen können bis zu sechs MS2-CPs bis gleichzeitig an die RNA binden und die Effizienz seiner Isolation zu erhöhen. Dieses Protokoll wurde daher vorgeschlagen, die Identifizierung neuer mRNA-assoziierten Proteinen zu ermöglichen, sobald die eluierten Proben Proteomik-Analyse durch Massenspektrometrie unterzogen werden.

Wir RaPID kürzlich verwendet , um neue Proteine zu identifizieren mit der Hefe assoziiert PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA wurde zuvor gezeigt , mit der ER - Membran und dessen 3' - untranslatierten Region (UTR) wurde 21 in diesem Verband eine wichtige Determinante erwiesen assoziiert. So RBPs die PMP1 3 'UTR binden , sind wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Lokalisierung zu spielen. RaPID gefolgt von Flüssigkeitschromatographeny-Massenspektrometrie / Massenspektrometrie (LC-MS / MS) führte zur Identifizierung vieler neuer Proteine , die mit PMP1 20 interagieren. Wir berichten hier über ein detailliertes Protokoll der Methodik RaPID bieten, wichtige Kontrollen, die getan werden müssen, und technische Tipps, die Ausbeute und Spezifität verbessern kann.

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Protocol

Hinweis: eine Sequenz einfügen, bestehend aus 12 MS2-Bindungsstellen (MS2 Schleifen; MS2L) in den genomischen Locus gewünschten, in der Regel zwischen dem offenen Leserahmen (ORF) und der 3'-UTR. Ein detailliertes Protokoll für diese Integration wird an anderer Stelle 22 vorgesehen. Stellen Sie sicher , die richtige Insertion und Expression durch PCR, Northern - Analyse oder RT-PCR 20,23. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die Integration nicht mit der Synthese des 3'-UTR nicht beigetreten sind. Zusätzlich kann ein Plasmid-exprimierenden MS2-CP zu SBP unter der Expression eines induzierbaren Promotors (Methionin Depletion) fusioniert sollte auch in die Zellen 24 eingeführt werden. Ein identischer Stamm, mit Ausnahme der eingeführten MS12 Schleifen sollte als Kontrolle für den Nachweis von nicht-spezifischen Signalen verwendet werden.

1. schnelle Reinigung

  1. Wachsen 500 ml Hefezellen (verwenden 250-1,000 ml Hefezellen in Abhängigkeit von dem Expressionsniveau des Gens von Interesse) Exprimieren MS2-markierten mRNA 20 undMS2-CP-GFP-Fusionsprotein SBP 24 bis OD600 von 0,8 bis 1,0 bei 30 o C in dem geeigneten Wachstumsmedium (zB synthetische Dextrose (SD) selektives Medium).
  2. Centrifuge Zellen bei 3000 × g für 4 min bei RT und den Überstand verwerfen.
  3. Waschen Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zentrifugieren wie zuvor (Schritt 1.2), Resuspendieren in einem gleichen Volumen (Schritt 1.1) von SD ohne Methionin und Inkubation für 45 - 60 min bei 30 o C Expression der MS2 zu induzieren -CP-GFP-SBP-Fusionsprotein.
    Hinweis: Längere Induktionszeit-Aggregation von GFP führen kann.
  4. Nehmen Sie sich 10 ml Zellen und Extrahieren von RNA aus dieser Probe 25 das einfache "hot Phenol" Methode. Achtung: Phenol ist sehr giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden.
    Hinweis: Diese RNA für die Qualität der isolierten RNA (1A) eine gute Referenz.
  5. Für 500 ml Zellen, fügen 1,35 ml 37% Formaldehyd zu einem endgültigen cONZENTRATION von 0,1%, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Weiterhin Inkubation bei 30 o C für 10 min. Vorsicht: Formaldehyd ist hochgiftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitsanweisungen gehandhabt werden.
  6. Hinzufügen 26,5 ml 2,5 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M und Inkubation für 3 min Vernetzung zu stoppen. Von diesem Schritt auf, alles auf Eis gelegt RNA-Abbau zu minimieren.
  7. Zentrifugen Zellen bei 3.000 × g für 4 min bei 4 ° C und Waschen mit 45 ml kaltem 1x PBS.
  8. Die Zellen in 1 ml Lysis-Puffer RaPID pro 100 ml der ursprünglichen Zellkultur.
  9. Geteilt in Aliquots von 500 ul in Schraubdeckelröhrchen Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ~ 400 mg gekühlten Glasperlen zu jedem aliquoten Teil (etwa eine volle 0,2 ml PCR-Röhrchen).
  10. Lyse-Zellen in einem Wulst 3 min Beater. Sofort legte das Lysat auf Eis.
    Hinweis: Die Zelllyse Releases zelluläre RNasen, die die Hauptursache für RNA-Abbau sind. RaPID Lysis-Puffer enthält eine hohe Konzentration von RNase INHIsteller, wie die unspezifische RNase Inhibitor Heparin und spezifische Inhibitoren. Arbeiten schnell und halten alles kalt wird auch empfohlen.
  11. Übertragen Sie das Lysat in neue Röhrchen. Pierce ein kleines Loch in der Unterseite jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer heißen Nadel (0,8 mm x 40 mm) und legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf der 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie den Kopf einer 5-ml-Spritze als Adapter zwischen den Mikrozentrifugenröhrchen und den 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen Montage bei 3000 × g für 1 min bei 4 o C
  12. Übertragung der Durchfluss von der 15 - ml - Röhrchen in ein neues 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 10.000 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen.
  13. Pool Stände aus allen 1,5-ml-Röhrchen in einem einzigen 15-ml-Röhrchen und beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Protein Isolation bzw. eingestellt.
    Hinweis: Diese als "Input" Proben für die nachfolgende Analyse dienen wird (Abbildung 1).
  14. In 300 ug Avidin pro 500 ml initial Hefekultur und inkubiere für 30 min (dies auf 10 min reduziert werden können) bei 4 ° C unter konstantem Walzen (10 rpm).
    Hinweis: Avidin- Blöcke Biotin und biotinylierte Proteine ​​aus den Streptavidin-Kügelchen binden.
  15. Vorwäsche die Streptavidin-Kügelchen vor der Inkubation mit dem Zelllysat.
    1. Übertragen etwa 300 ul der Streptavidin-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Gülle und die obere Überstand zu entfernen. Dies wird in 250 & mgr; l der Kügelchen führen. Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml Lysepuffer RaPID. Zentrifugieren Sie die Streptavidin - Kügelchen bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C zwischen jedem Schritt.
    2. Blockieren die Perlen durch Inkubation für 1 h mit 0,5 ml RaPID Lysispuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA und 10 ul 10 mg / ml Hefe-tRNA. Perlen können O / N in Blockierungslösung bei 4 ° C unter Rotation bei Bedarf gelassen werden.
    3. Wasche zweimal mit 1 ml Lysis-Puffer RaPID.
      Hinweis: Die Magnetkügelchen können auch zur Verringerung der Zeit und backgr verwendet werdenound. Diese haben jedoch geringere Kapazität als Sepharosebeads.
  16. Nach Eintragen von 250 ul der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen mit dem Avidin enthaltenden Lysat (aus Schritt 1.14) und inkubiere 1 h bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm).
    Anmerkung: Diese Inkubationszeit ist ein Kompromiß zwischen einer ausreichenden Bindungszeit Bereitstellung und minimiert die Chancen für die RNA-Abbau.
  17. Zentrifuge bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C die Streptavidin - Kügelchen zu löschen und den Überstand in ein neues 15 - ml - Röhrchen übertragen. Beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Proteinisolierung sind.
    Hinweis: Diese werden die "Unbound" Proben sein.
  18. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Lysepuffer, leicht schütteln, Transfer in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  19. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Waschpuffer, und dieser Zeit drehen (10 Umdrehungen pro Minute) für 5 min bei 4 ° C. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Waschen der Kügelchen mit 1 ml 1x PBS und zentrifugiert wie oben beschrieben.
  20. Waschen Sie die Perlen wieder mit 120 ul 1x PBS. Zentrifuge nach oben, und nehmen Sie die gesamte Überstand für die RNA-und Proteinextraktion als "Wash" Probe.
    Hinweis: Diese letzte Waschprobe die Stringenz der Wäschen zeigen werden und sollte als die Elution Probe des gleichen Volumens sein. Dies wird die Verarbeitung und das Laden in den nachfolgenden Tests vereinfachen.
  21. Zu eluieren, RNA und RNA-assoziierten Proteine ​​aus der Säule, Zugabe von 120 ul 6 mM Biotin in 1x PBS und Inkubation für 45 min bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm).
  22. Zentrifugieren Sie die wie oben Perlen und übertragen das eluierte Material in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Drehen Sie die eluierten Probe erneut und übertragen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen keine Verschleppung von Perlen zu gewährleisten.
  23. Nehmen Sie Proben für die RNA oder Proteinextraktion.
    Hinweis: genommen Das Volumen auf dem folgenden Assay und Expressionsniveau des RNA oder Protein von Interesse abhängen. Als Richtwert für die Northern - Analyse 26, nehmen 80% der Probe für Western - Blot 23,27 oder RT-PCR 28, 20% nehmen, und für 29 Massenspektrometrie neue Proteine zu entdecken, die gesamte Probe nehmen.

2. RNA-Extraktion

  1. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Crosslinking Reversal Puffer und Inkubation für 45 min bei 65 ° C. Fahren Sie direkt zur RNA-Extraktion.
    Hinweis: Das Crosslinking Reversal Puffer enthält Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die deutlich RNA - Extraktion 20 verbessert.
  2. Verwenden Sie die Standard - Phenol: Chloroform - Methode 26 bis RNA aus dem "Input" zu extrahieren und "ungebunden" Proben (Schritte 1.13 und 1.17).
    Anmerkung: Diese Proben enthalten eine große Menge des RNase - Inhibitors Heparin, das nachfolgende Rück Transcriptase- (RT) unter Verwendung von Assays inhibieren können (zB RT-PCR), also 30 LiCl Fällung empfohlen wird , sie zu entfernen. Die "wash "und" Elution "Proben (Schritte 1.21 und 1.24) enthalten geringe Mengen an RNA und werden durch die folgenden Schritte gefällt.
  3. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) und zwei Volumina 100% Ethanol zum "Waschen" und "Elution" Proben. Inkubieren bei -80 ° C für mindestens 2 Std.
    Hinweis: Guanidinium effizient Proteine ​​denaturieren und dadurch hemmen RNasen und Proteasen, die in der Probe.
  4. Zentrifuge bei 20.000 × g, 4 ° C für 30 min und den Überstand verwerfen. Waschen des Pellets mit kaltem 80% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 × g, 4 ° C für 15 min.
  5. Man löst das RNA-Pellet in 400 ul RNase freies Wasser und fallen wieder alle übrig gebliebenen GuHCl oder andere Verunreinigungen zu entfernen. Werden 40 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 800 ul 100% Ethanol, Inkubation bei -20 ° C für mindestens 1 Std.
  6. Zentrifuge und waschen, wie in Schritt 2.4 und alle Ethanol mit einer 10 & mgr; l Spitze zu entfernen. Resuspendieren RNA Pellet in 10 & mgr; l RNase-freiem Wasser. Seien Sie besonders vorsichtig, wie das RNA-Pellet in der Regel nicht sichtbar ist.
    Hinweis: Die Proben können für Northern - Analyse verwendet werden , wie in 23 (Abbildung 1) beschrieben.

3. Proteinpräparat für Western Blot oder Massenspektrometrie-Analyse

  1. Hinzufügen 1/3 Volumen von 4x Laemmli Probenpuffer (LSB) auf Proteinproben und inkubiere 45 min bei 65 ° C die Vernetzung von RNA und Proteine ​​umzukehren.
    Anmerkung: Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden.
  2. Führen Proteine auf einem SDS - Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Den Prozent des Gels entsprechend der Größe der Proteine ​​analysiert werden.
    Anmerkung: 10% Acrylamid-Gel gibt eine breite Palette von Trennung und ist gut als erste Näherung.
  3. Transferproteine an die Membran , wie in dem Standard - Immunoblot - Analyse 27 zur Steuerung der Isolationswirkungsgrad (1C). Fleck mit entweder Coomassie Blau R250 oder Silberfärbung vor der Massenspektrometrie-Analyse.
    Anmerkung: Silberfärbung die bevorzugte Wahl, da sie empfindlicher ist , und ermöglicht eine bessere Erkennung (1B). Die Färbung kann entweder mit manuell hergestellten Lösungen oder kommerziellen Kits durchgeführt werden. Die Inkubationszeit des Gels in der endgültigen Färbelösung sollte experimentell bestimmt werden. Lange Inkubation kann niedrig reichlich Proteine ​​zeigen, kann aber stark exprimierten Proteine ​​wie MS2-CP-SBP-GFP führen über gefärbt sein und kann rund um Proteine ​​in ihrer Umgebung verschleiern. Darüber hinaus könnte ein hoher Hintergrund auftreten. Folgen Sie der Reaktion sorgfältig und fügen Stopplösung zu gegebener Zeit.
  4. Schneiden Sie Banden aus dem Gel und sie auf 1,5-ml-Röhrchen. Proben bei -20 ° C, oder zur Proteinextraktion und Trypsin - Verdau durch LC-MS / MS - Analyse 32 gefolgt senden.
  5. Als Alternative Proteom-Ansatz, um die Gel-Trennungsschritt auszuschließen, verdauen eluierte Material aus Schritt 1.24 in solution unter Verwendung von Trypsin und vorbehaltlich der LC-MS / MS - Analyse 33.
    Hinweis: Das Weglassen des SDS-PAGE-Trennung das Protokoll vereinfacht und erhöht die Ausbeute. Jedoch könnten Proben Spuren des Detergens enthalten, NP-40, der Massenspektrometrieanalyse hemmt. Um dieses Problem zu lösen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Führen Protein auf SDS-PAGE 31 10 - 15 min.
    2. Schneiden Sie den gesamten Abschnitt der Spur aus (dh wo die Proteine befinden).
      Hinweis: Die Proteinprobe kann eine erhebliche Menge des MS2-CP-SBP-Protein umfassen, die Signale mit niedriger Abundanz Proteine ​​verdunkeln kann.

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Representative Results

RaPID ermöglicht die Isolierung einer spezifischen Ziel-RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Kritisch für den Erfolg hält die RNA intakt, so viel wie möglich, wodurch eine ausreichende Menge der Proteine ​​zu erhalten. Um die Isolation Effizienz und Qualität der RNA, Northern - Analyse durchgeführt (Abbildung 1A) bestimmen. Die Northern-Analyse hat den Vorteil, unmittelbar auf die Effizienz und die Qualität der raschen Meldung. Somit können die relativen Mengen von in voller Länge und Abbauprodukte in einem einzigen Durchlauf bestimmt werden. Ribosomalen RNAs (rRNAs) werden leicht in der Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen, und das Fehlen von rRNAs in der Elution Probe zeigt die Stringenz der Reinigung. Die Stringenz und Spezifität der Reinigung werden durch das Fehlen eines Signals eines unmarkierte mRNA in der Elution Proben (ACT1 unteres Feld) gezeigt. Die scheinbare Signal in der FPR1 Spur, die nicht von der Größe des ACT1 ist, ist ein Überbleibsel aus preherigen Hybridisierung mit der Sonde MS2L. Die Northern-Analyse zeigt auch, dass die Eingangs RNA etwas verschlechtert im Vergleich zu RNA, die von dem heißen Phenol-Protokoll (c / o ACT1 Sondenplatte) gereinigt wurde. Dies ist auf die längere und kompliziertere RaPID Protokoll zugeschrieben. Dennoch ist eine erhebliche Menge an in voller Länge, markierte RNA spezifisch isoliert ist, wie durch das starke Signal in der Elutionsfraktion (MS2L Sonde) offenbart.

Proteinproben auf SDS-PAGE laufen und gefärbt durch Silberfärbung vor der Proteomik - Analyse (1B). Eine Probe isoliert von der Kontrolle, nicht markierte Zellen (-MS2L) ist hilfreich bei der Unterscheidung zwischen nicht-spezifischen Assoziationen von RNA-Abhängigen. Daher ist nur Bands, die stärker in die markierte Probe sind (+ MS2L) aus dem Gel ausgeschnitten und für die LC-MS / MS genommen. Western - Analyse mit der allgemeinen RBPs wird auch die Effizienz der Protein Co-Reinigung , um anzuzeigen , empfohlen (Fig1C). Hierin verwendeten wir Yef3, die mit PMP1 20 oder GFP Interaktion bekannt ist, was die Gesamteffizienz und Spezifität der Trennung zeigt. Interessanterweise scheint die Effizienz der Yef3 Trennung zwischen PMP1 und FPR1 zu unterscheiden, und ist wesentlich geringer im Vergleich zu GFP.

Abbildung 1
Abbildung 1. Spezifische Isolierung von MS2L-markierten RNAs und Identifizierung von assoziierte Proteine. Die Ergebnisse von zwei verschiedenen RNAs, die RaPID ausgesetzt waren (PMP1 und FPR1) vorgestellt. (A) Northern Blot - Analyse von RNA - Proben aus einem RaPID Experiment gereinigt. RNA wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen und mit Ethidiumbromid gefärbt (oberes Feld). Das Gel wurde auf eine Nylonmembran geblottet und der Hybridisierung mit den angegebenen Sonden unterworfen (untere Tafeln). Die analysierten Proben sind: Fast-Zell-Lyse (hot Phenol [Schritt 1.4]), RaPID - Zell - Lyse (Eingang [Schritt 1.13]) und nach der Elution mit Biotin (Elution [Schritt 1.24]). (B) Silberfärbung von Proteinen aus RaPID mit MS2-markierten und nicht markierten Zellen. Proteinproben aus Elutionsfraktionen von MS2-markierten PMP1 (+ MS2L) oder ohne Kennung (-MS2L) Kontrolle wurden in SDS-PAGE und Silber gefärbt laufen. Bands mit Differenzintensität (durch Sternchen) wurden durch Massenspektrometrie-Analyse aus dem Gel und bestimmt geschnitten. Der Pfeil zeigt die MS2-CP-GFP-Fusionsprotein, SBP, die gleiche Proteinbeladung zeigt. Irrelevant Bahnen wurden für Klarheit abgeschnitten werden. (C) Western - Analyse von positiven Kontrollen. Western-Blot mit Antikörpern, die die Yef3 oder GFP-Einheit des MS2-CP-Fusionsprotein erkennen durchgeführt. Irrelevant Bahnen wurden für Klarheit abgeschnitten werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Verschiedene Methoden verwenden , um die Isolierung von spezifischen mRNAs ihre zugehörigen Proteine 11,34 35 zu identifizieren. Diese Verfahren gelten in vitro und in vivo - Strategien RNA-Protein - Wechselwirkungen zu untersuchen. In - vitro - Verfahren inkubieren exogen RNA mit Zelllysat transkribiert RBPs zu erfassen und RNP - Komplexe 36,37 isolieren. Ein wirksames Konzept dieser Art wurde kürzlich vorgestellt, die die Identifizierung neuer Proteine aktiviert , die eine regulatorische RNA - Motiv 18 binden. Ein Nachteil dieser Verfahren ist die Bindung von unspezifischen RBPs weil der Verband außerhalb der zellulären Umgebung auftritt. In - vivo - Verfahren, in denen Proteine vernetzt sind , während in ihrer natürlichen Umgebung, eine bessere Sicht von RNA-Protein - Assoziation liefern. Darüber hinaus ermöglicht die Vernetzung höherer Stringenz bei der Isolierung und damit eine höhere Spezifität. Das Paar Ansatz 17 nutzt die Transfektion von AntisenseSequenz an die Ziel-RNA, um eine Peptideinheit in die Nähe RBPs zu lenken. Die Peptid-RBPs können dann vernetzt und isoliert durch Kügelchen, die mit einer Sequenz verknüpft sind, die mit dem Antisense-Sequenz komplementär ist. Das Paar Methodik ist sehr vorteilhaft wegen seiner einfachen Anwendung auf vielen Zelltypen ohne die Notwendigkeit komplexer genomischer Manipulationen. Es ist jedoch, abhängig von der Effizienz der Transfektion, und Fälle, in denen ein geringer Prozentsatz an Zellen, die Antisense-akzeptieren geringe Wirksamkeit aufweisen. Darüber hinaus ist die Isolierung des RBP-Peptid-Antisense-Sequenz durch magnetische Streptavidin-Kügelchen erhalten, die mit biotinylierten Oligonukleotid, das komplementär zu dem Antisense-Nukleinsäure gekoppelt sind. Die Vielzahl von Interaktionen (magnetische Kügelchen, Streptavidin-Biotin und Basenpaarung) kann die Stringenz und die Effizienz der Isolierung begrenzen. Die schnelle Methode 24 beschrieben hier bietet eine Alternative zu diesen Einschränkungen in mehreren Aspekten. Erstens ter Integration der MS2-Schleifen in der genomischen Loci sichergestellt, dass alle Zellen, die sie zum Ausdruck bringen, damit seine Ausbeute zu erhöhen. Zweitens verwendet es die hohe Affinität Wechselwirkung des MS2-CP-GFP-SBP bis zwölf MS2 Schleifensequenzen und ermöglicht es ihnen , in vivo zu binden. Drittens ermöglicht die Fixierung des RNA-Protein-Wechselwirkung strengerer Wäschen und reduziert die Identifizierung von nicht spezifisch gebundenen Proteinen. Schließlich bindet der SBP-Domäne Streptavidinkügelchen mit hoher Affinität und ist leicht mit freiem Biotin eluiert.

Einführen des MS2 Schleife in die RNA ist ratsam, zwischen dem ORF und die 3 'UTR Übersetzungs Perturbation zu minimieren und die Expression aller Schlaufen zu gewährleisten. Sechs bis 24 MS2 Schleife wiederholt wurden zuvor für die Visualisierung von mRNA - Lokalisierung 38-40 verwendet. Jedoch kehrt das Einführen einer langen Folge von MS2 Veränderungen in der Verarbeitung und der Struktur der RNA führen kann; es könnte das Transkript oder ändern das Repertoire der RBPs destabilisieren gebundenzu. Unserer Erfahrung nach 12 Schleifen sind ausreichend , um eine effiziente Elution von MS2-markierte RNA - 20 zu erhalten. In diesem Zusammenhang stellen wir fest, dass wir in der Regel zusätzliche kürzere Transkripte in unserem nördlichen Hybridisierungen beobachtet. Northern - Analysen mit verschiedenen Sonden ergab , dass diese kürzeren Formen der MS2L und einen Teil der 3' - UTR 20, indikativ für eine vorzeitige Transkriptionstermination enthalten. Solche Fälle sind wahrscheinlich die Effizienz der Isolierung von Proteinen mit der 3'-UTR zu reduzieren. Daher sollte die Anzahl der eingefügten Schlaufen und ihre Position innerhalb der RNA zwischen hoher Effizienz pull-down und Transkriptstabilität ausgeglichen werden.

Die RNA muss intakt bleiben während des gesamten Protokolls effiziente Isolierung und Detektion des maximalen Array von gebundenen Proteine ​​zu ermöglichen. Die Chancen für die externe RNase Kontamination kann durch das Tragen Handschuhe reduziert werden, eine saubere Arbeitsbereich gewährleistet, die Vorbereitung Lösung mit RNase-freiem Wasser, und die Arbeit prägnantund effizient Protokollzeit zu reduzieren. Dennoch haben wir festgestellt, daß der größte Faktor für RNA-Abbau ist die Freisetzung von zellulären RNAsen zu dem Lysat nach Zelllyse. Es zeigte sich, dass Kryogenvermahlung von Hefezellen mit einer mechanischen Mühle führt zu einer verbesserten RNA - Reinigung 41 vorgeschlagen. Dies kann in Fällen, in denen versucht werden signifikanter Abbau mit diesem Protokoll beobachtet wird.

Ein gemeinsamer Nachteil der Pull-down-Assays ist die Isolierung von vielen Proteinen, die nicht-spezifisch an die Säule binden. Daher ist die Verwendung eines Hefestamms mit unmarkierte RNA ein wichtiges Steuerelement. Dieser Stamm exprimiert das MS2-CP-GFP-Fusionsprotein SBP an weitere Proteine ​​auszuschließen, die an das Fusionsprotein und nicht die Ziel-RNA binden. Wir nehmen zur Kenntnis , dass dies nicht ausschließt , Proteine, die die MS2 Schleife selbst könnte binden, und diese müssen weitere Validierung mit dem Protein Pull-Down - Assay. 1B zeigt , dass wir in der Lage waren mehrere Proteine zu identifizieren , die bindenspezifisch an mRNA PMP1, und einige wurden anschließend durch ein Co-IP - Assay 20 validiert.

Die RaPID Methodik ist derzeit auf Hefe-Systeme beschränkt, seine gut etablierten ortsspezifische Integration Methoden verwendet. Ortsspezifische Integration Protokolle derzeit für Gene , die in anderen Systemen werden unter Verwendung des Systems 42,43 CRISPR-Cas entwickelt. Diese werden von großer Bedeutung sein, in der die Anwendung von schnellen, um zusätzliche Systeme erweitert. Eine weitere künftige Anwendung von RaPID ist für die Isolierung von RNAs, die mit einer mRNA von Interesse zugeordnet sind. Dies kann leicht erreicht werden, indem das isolierte Material auf RNA-seq anstatt LC-MS / MS unterzogen wird. Angesichts der wichtigen Rolle von kleinen RNAs bei der Regulation der mRNA-Expression, ist diese Anwendung wahrscheinlich von großer Bedeutung sein. Schließlich Verbesserungen in der Massenspektrometrie (MS) -Analyse und die Verwendung von quantitative MS Methoden wie SILAC wird in der quantitativen Messung der mRNA-gebundenen protei führenns unter verschiedenen Bedingungen. RaPID kann mit Hefe in Medien mit schweren Isotopen und im Vergleich zu Zellen , die unter unterschiedlichen Bedingungen (beispielsweise Stress) mit unmarkiertem Medien 44,45 angebaut angereichert gezüchtet werden. Die Anwendung der Methode RaPID zusammen mit den quantitativen MS-Analyse wird eine genaue Maßnahmen von Veränderungen des RBP Repertoire ergeben, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind.

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Acknowledgments

Wir danken Prof. Jeff Gerst und Boris Slobodin für ihre hilfreiche Ratschläge bei der schnellen Protokoll der Einrichtung und Bereitstellung der erforderlichen Plasmide. Wir danken auch Dr. Avigail Atir-Lande für ihre Hilfe dieses Protokoll und Dr. Tamar Ziv vom Smoler Proteomics Zentrum für ihre Hilfe bei der LC-MS / MS-Analyse zu etablieren. Wir danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) für den YEF3 Antikörper. Diese Arbeit wurde durch Gewährung 2011013 vom Binationale Science Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris sigma T1503
SDS bio-lab 1981232300
DTT sigma D9779
Acidic Phenol (pH 4.3) sigma P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) sigma P1944
Chloroform bio-lab 3080521
Formaldehyde Frutarom 5551820
Glycine sigma G7126
NP-40 Calbiochem 492016
Heparin Sigma H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) Sigma P7626
Leupeptin Sigma L2884
Aprotinin Sigma A1153
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T9003
Pepstatin Sigma P5318
DNase I Promega M610A
Ribonuclease  Inhibitor Takara 2313A
Glass Beads Sartorius BBI-8541701 0.4-0.6mm diameter 
Mini BeadBeater BioSpec Mini BeadBeater 16
Guanidinium Sigma G4505
Avidin Sigma A9275
Streptavidin Beads GE Healthcare  17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Yeast tRNA Sigma R8508
Biotin Sigma B4501
Yeast extract Bacto 288620
peptone Bacto 211677
Glucose Sigma G8270
1x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4x Laemmli Sample Buffer (LSB) 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad  161-0449 For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium  1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) 1:5,000
Anti GFP antibody Santa Cruz sc-8334 1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated SIGMA A9169 1:10,000

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References

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Samra, N., Arava, Y. Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology. J. Vis. Exp. (115), e54467, doi:10.3791/54467 (2016).

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