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Genetics

उपन्यास आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अलगाव तेजी पद्धति द्वारा

Published: September 30, 2016 doi: 10.3791/54467
Automatic Translation
1,2, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

Introduction

शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) एस के बारे में 10% का प्रतिनिधित्व cerevisiae प्रोटीन 1,2 और स्तनधारी प्रोटीन 3-5 के बारे में 15%। वे इस तरह के mRNA के बाद ट्रांसक्रिप्शनल प्रसंस्करण और विनियमन, अनुवाद, राइबोसोम जीवजनन, tRNA Aminoacylation और संशोधन, क्रोमेटिन remodeling, और अधिक के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं में फंसा रहे हैं। RBPs का एक महत्वपूर्ण उपसमूह mRNA बाध्यकारी प्रोटीन (mRNPs) 6.7 है। MRNA परिपक्वता के पाठ्यक्रम में, अलग-अलग RBPs प्रतिलेख बाँध और नाभिक, सेलुलर स्थानीयकरण, अनुवाद और गिरावट 6-8 से बाहर अपने परमाणु प्रसंस्करण, निर्यात मध्यस्थता। इस प्रकार, किसी भी समय बिंदु पर एक विशेष प्रतिलिपि के लिए बाध्य RBPs के अलग सेट इसके प्रसंस्करण और अंत में अपने भाग्य का निर्धारण करता है।

एक mRNA के साथ जुड़े RBPs की पहचान काफी उनके बाद के transcriptional विनियमन अंतर्निहित प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को सुधार सकता है। विविध आनुवंशिकसूक्ष्म, जैव रासायनिक और जैव सूचना विज्ञान के तरीकों mRNA विनियमन (9-11 में समीक्षा) में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, केवल एक इन तरीकों में से कुछ एक विशेष लक्ष्य mRNA के साथ जुड़े प्रोटीन की पहचान सकें। नोट के खमीर तीन संकर प्रणाली (Y3H) है, जो खमीर कोशिकाओं में एक अभिव्यक्ति पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए प्रलोभन के रूप में ब्याज की mRNA का इस्तेमाल करता है। सकारात्मक क्लोन आमतौर पर एक विकास चयन या संवाददाता अभिव्यक्ति 12-14 के माध्यम से मनाया जाता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह प्रोटीन है कि एक सेलुलर पर्यावरण और आरएनए प्रोटीन बातचीत की ताकत को मापने की क्षमता में स्कैन किया जा सकता की बड़ी संख्या है। कमियां गैर विशिष्ट बंधन के कारण झूठी सकारात्मक परिणाम की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या है, और कारण भाग में झूठी नकारात्मक परिणाम, संलयन प्रोटीन शिकार या चारा शाही सेना के misfolding करने के लिए, के लिए उच्च क्षमता शामिल हैं।

आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए एक वैकल्पिक समानता purifi हैउसके संबंधित प्रोटीन के साथ शाही सेना के केशन। पाली ए-युक्त mRNAs oligo डीटी स्तंभों के उपयोग के माध्यम से अलग किया जा सकता है, और उनके जुड़े प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता चला रहे हैं। आरएनए प्रोटीन बातचीत crosslinking द्वारा अपने सेलुलर संदर्भ है, जो कम दूरी के सहसंयोजक बांड बनाता में संरक्षित है। Oligo डीटी स्तंभ का उपयोग करें कि एक-युक्त mRNA 3,5,15 किसी भी पाली साथ जुड़ा हुआ है पूरे proteome के एक वैश्विक दृष्टि अर्जित करता है। बहरहाल, यह है कि एक विशेष mRNA के साथ जुड़े रहे हैं प्रोटीन की एक सूची प्रदान नहीं करता है। बहुत कुछ तरीकों जैसे एक पहचान हासिल करने के लिए उपलब्ध हैं। जोड़ी विधि लक्ष्य mRNA 16,17 को पूरकता के साथ न्यूक्लिक एसिड की अभिकर्मक पर जोर देता। न्यूक्लिक एसिड भी एक पेप्टाइड, जो बातचीत साइट के लिए पास के इलाके में RBPs करने की अनुमति देता है crosslinking से जुड़ा हुआ है। crosslinking के बाद, RBP पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड पृथक और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। हाल ही में, एक aptamer आधारित कार्यप्रणाली थासफलतापूर्वक स्तनधारी सेल लाइनों 18 से अर्क के लिए आवेदन किया। streptavidin में सुधार आत्मीयता के साथ एक शाही सेना aptamer विकसित की है और इस मामले में (एयू-अमीर तत्व (हैं)) ब्याज के एक दृश्य के लिए जुड़े हुए किया गया था। aptamer A- हैं आरएनए streptavidin मोतियों से जुड़ी है और सेल lysate के साथ मिलाया गया था। प्रोटीन है कि अनुक्रम के साथ जुड़े शुद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा की पहचान की गई। इस विधि का पता चला हालांकि संघों कि सेलुलर सेटिंग्स (यानी, इन विट्रो) के बाहर होते हैं, यह भविष्य में संशोधित किया जा करने के लिए इतनी के रूप में जीनोम में aptamers लागू करने के लिए और इस तरह सक्षम mRNA के साथ जुड़े प्रोटीन के अलगाव की संभावना है, जबकि सेलुलर परिवेश (यानी, इन विवो)। खमीर, जहां आनुवंशिक जोड़तोड़ अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, तेजी से विधि (प्रो जेफ Gerst प्रयोगशाला में विकसित) विवो संघों 19 के एक दृश्य प्रदान करता है। तेजी से विशिष्ट और मजबूत MS2 कोट प्रोटीन के बंधन (MS2- को जोड़ती हैसीपी) MS2 आरएनए अनुक्रम, और streptavidin बाध्यकारी डोमेन (एसबीपी) के संयुग्मित मोती streptavidin करने के लिए। इस streptavidin मोती के माध्यम से MS2 टैग mRNAs का कुशल शुद्धि सक्षम बनाता है। इसके अलावा, MS2 छोरों की 12 प्रतियों की अभिव्यक्ति आरएनए को एक साथ बाँध और अपने अलगाव की दक्षता बढ़ाने के लिए छह MS2-सीपीएस अप करने के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल इसलिए एक बार eluted नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के अधीन हैं उपन्यास mRNA जुड़े प्रोटीन की पहचान सकें सुझाव दिया गया था।

हमने हाल ही में खमीर PMP1 mRNA 20 के साथ जुड़े उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के लिए तेजी से उपयोग किया। PMP1 mRNA पहले ईआर झिल्ली के साथ जुड़े होने के लिए और अपनी 3 'untranslated क्षेत्र (UTR) इस संघ 21 में एक प्रमुख निर्धारक हो पाया था दिखाया गया था। इस प्रकार, RBPs कि PMP1 3 'UTR बाँध अपने स्थानीयकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका अदा की संभावना है। तेजी से तरल chromatograph के द्वारा पीछाY-मास स्पेक्ट्रोमेट्री / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) कई नए प्रोटीन है कि PMP1 20 के साथ बातचीत की पहचान में हुई। इस के साथ साथ, हम तेजी से कार्यप्रणाली का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, महत्वपूर्ण नियंत्रण की जरूरत है कि कुछ किया जाना है, और तकनीकी सुझाव है कि उपज और विशिष्टता सुधार हो सकता है।

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Protocol

नोट: 12 MS2 बाध्यकारी साइटों से मिलकर एक दृश्य डालें (MS2 छोरों; MS2L) वांछित जीनोमिक ठिकाना में, आमतौर पर खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) और 3 'UTR के बीच। इस एकीकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और 22 प्रदान की जाती है। उचित प्रविष्टि और पीसीआर, उत्तरी विश्लेषण या आरटी पीसीआर 20,23 से अभिव्यक्ति की जाँच करें। यह सत्यापित करने के लिए कि एकीकरण 3'UTR के संश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं किया महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक प्लाज्मिड व्यक्त MS2-CP एक inducible प्रमोटर (methionine कमी) की अभिव्यक्ति के तहत स्टेट बैंक ऑफ पटियाला से जुड़े हुए भी कोशिकाओं 24 में पेश किया जाना चाहिए। एक समान तनाव, शुरू की MS12 छोरों को छोड़कर, गैर विशिष्ट संकेतों का पता लगाने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

1. तेजी से शोधन

  1. खमीर कोशिकाओं की 500 मिलीलीटर (ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है खमीर कोशिकाओं के 250-1,000 मिलीलीटर का उपयोग करें) MS2 टैग व्यक्त mRNA 20 और आगे बढ़ेंउचित मध्यम विकास (जैसे, सिंथेटिक Dextrose (एसडी) चयनात्मक मध्यम) में 30 ओ सी में 1.0 - MS2-CP-GFP-एसबीपी संलयन प्रोटीन 24 600 0.8 ओवर ड्राफ्ट के लिए।
  2. आरटी पर 4 मिनट के लिए 3,000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला त्यागें अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  3. पहले methionine बिना एसडी एक बराबर मात्रा (1.1 कदम) में (1.2 चरण), resuspend के रूप में (पीबीएस) 1x फॉस्फेट बफर खारा में कोशिकाओं, सेंट्रीफ्यूज धो लें, और 45 के लिए सेते हैं - MS2 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के 30 से 60 मिनट में ओ सी -CP-GFP-एसबीपी संलयन प्रोटीन।
    नोट: लंबे समय तक प्रेरण समय GFP के एकत्रीकरण का कारण बन सकता है।
  4. कोशिकाओं की तरफ 10 मिलीलीटर सेट और सरल 'हॉट फिनोल "विधि का उपयोग कर 25 इस नमूने से शाही सेना निकाल सकते हैं। सावधानी: फिनोल बेहद जहरीला है और अपनी सुरक्षा के निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    नोट: यह आरएनए पृथक शाही सेना (चित्रा 1 ए) की गुणवत्ता के लिए एक अच्छा संदर्भ है।
  5. 500 मिलीलीटर कोशिकाओं के लिए, एक अंतिम ग के लिए 1.35 मिलीलीटर 37% formaldehyde जोड़ने0.1% की oncentration आरएनए प्रोटीन परिसरों crosslink करने के लिए। 10 मिनट के लिए 30 ओ सी में ऊष्मायन जारी रखें। सावधानी: संक्रामक बेहद जहरीला है और अपनी सुरक्षा के निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  6. 0.125 एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2.5 एम ग्लाइसिन की 26.5 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए सेते crosslinking को रोकने के लिए। पर इस कदम से, आरएनए गिरावट को कम करने के लिए बर्फ पर सब कुछ डाल दिया।
  7. 4 ओ सी में 4 मिनट के लिए 3,000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और 45 मिलीलीटर ठंड 1x पीबीएस से धो लें।
  8. प्रारंभिक सेल संस्कृति की 100 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर तेजी lysis बफर में Resuspend कोशिकाओं।
  9. पेंच से ढकी microfuge ट्यूबों में 500 μl की aliquots में विभाजित है और प्रत्येक ~ विभाज्य (मोटे तौर पर एक पूर्ण 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूब) को जोड़ने के लिए ठंडा कांच के मोती की 400 मिग्रा।
  10. एक मनका में कोशिकाओं lyse 3 मिनट के लिए डिब्बा। तुरंत बर्फ पर lysate डाल दिया।
    नोट: सेल विज्ञप्ति सेलुलर RNases, जो आरएनए गिरावट का प्रमुख कारण हैं। रैपिड lysis बफर RNase inhi के एक उच्च एकाग्रता शामिलऐसे अविशिष्ट RNase अवरोध हेपरिन और विशिष्ट inhibitors के रूप में bitors। जल्दी से काम कर रहा है और सब कुछ ठंडा रखने की भी सिफारिश की है।
  11. नई ट्यूबों के लिए lysate स्थानांतरण। पियर्स एक गर्म सुई (0.8 मिमी x 40 मिमी) के साथ प्रत्येक microfuge ट्यूब के तल में एक छोटा सा छेद और 15 मिलीलीटर ट्यूबों के शीर्ष पर microfuge ट्यूबों जगह है। microfuge ट्यूब और 15 मिलीलीटर ट्यूब के बीच एक एडाप्टर के रूप में एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के सिर का उपयोग करें। 4 ओ सी पर 1 मिनट के लिए 3,000 XG पर नलियों विधानसभा अपकेंद्रित्र
  12. प्रवाह के माध्यम से 15 मिलीलीटर ट्यूब से एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए सेल मलबा हटाने के लिए 4 ओ सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर स्थानांतरण।
  13. एक एकल 15 मिलीलीटर ट्यूब में सभी 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से पूल supernatants, और अलग निर्धारित 1/50 और आरएनए और प्रोटीन अलगाव के लिए क्रमश: lysate के 1/100 मात्रा।
    नोट: ये बाद के विश्लेषण (चित्रा 1) के लिए "इनपुट" नमूने के रूप में काम करेगा।
  14. avidin के 300 माइक्रोग्राम मैं की 500 मिलीलीटर प्रति जोड़ेnitial खमीर संस्कृति और 30 मिनट के लिए सेते निरंतर रोलिंग (10 आरपीएम) के तहत 4 ओ सी में (इस 10 मिनट के लिए कम किया जा सकता है)।
    नोट: Avidin ब्लॉकों बायोटिन और streptavidin मोतियों के लिए बाध्य से biotinylated प्रोटीन।
  15. सेल lysate साथ ऊष्मायन से पहले streptavidin मोतियों पूर्व धोने।
    1. streptavidin मोतियों एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब घोल के बारे में 300 μl स्थानांतरण और ऊपरी सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इस मोतियों की 250 μl में परिणाम होगा। मोती तेजी lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक चरण के बीच 4 ओ सी में 2 मिनट के लिए 660 XG पर streptavidin मोती अपकेंद्रित्र।
    2. 0.5 बीएसए तेजी lysis बफर के मिलीलीटर, 10 मिलीग्राम की 0.5 मिलीग्राम / एमएल और 10 मिलीग्राम / एमएल खमीर tRNA के 10 μl के साथ 1 घंटे के लिए incubating द्वारा मोती ब्लॉक। मोती छोड़ा जा सकता हे / एन रोटेशन के साथ 4 ओ सी पर अवरुद्ध समाधान यदि आवश्यक में।
    3. रैपिड lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।
      नोट: चुंबकीय मोती भी समय और backgr कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताound। इन बहरहाल, sepharose मोती की तुलना में कम क्षमता है।
  16. avidin युक्त lysate (कदम 1.14 से) के लिए पूर्व धोया streptavidin मोतियों की 250 μl जोड़ें और निरंतर रोटेशन (10 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
    नोट: इस ऊष्मायन समय पर्याप्त बाध्यकारी समय प्रदान करने और आरएनए गिरावट के लिए संभावना कम से कम के बीच एक समझौता है।
  17. 4 ओ सी में 2 मिनट के लिए 660 XG पर अपकेंद्रित्र streptavidin मोतियों को साफ करने और एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए। एक तरफ 1/50 और आरएनए और प्रोटीन अलगाव के लिए lysate के 1/100 मात्रा क्रमश: निर्धारित करें।
    नोट: ये "अनबाउंड" नमूने होगा।
  18. मोती, सेंट्रीफ्यूज कदम 1.17 के रूप में तेजी से lysis बफर के 1 मिलीलीटर से धो धीरे से मिलाने के लिए एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण, और। इस कदम के तीन बार दोहराएँ।
  19. तेजी से धो बफर के 1 मिलीलीटर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इस बार घुमाएँ (10 आरपीएम) के साथ मोती धो लें। इस कदम दो बार दोहराएँ। जैसा कि ऊपर 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज के साथ मोती धो लें।
  20. 1x पीबीएस के 120 μl के साथ फिर से मोती धो लें। अपकेंद्रित्र ऊपर के रूप में, और "धो" नमूना के रूप में शाही सेना और प्रोटीन निकासी के लिए पूरी सतह पर तैरनेवाला ले।
    नोट: यह पिछले धोने नमूना washes की तंगी का संकेत होगा और क्षालन नमूने के रूप में एक ही मात्रा का होना चाहिए। यह बाद में assays में प्रसंस्करण और लदान सरल होगा।
  21. स्तंभ से शाही सेना और आरएनए जुड़े प्रोटीन elute, 1x पीबीएस में 6 मिमी बायोटिन के 120 μl जोड़ें और निरंतर रोटेशन (10 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  22. अपकेंद्रित्र ऊपर के रूप में माला और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब eluted सामग्री हस्तांतरण। eluted नमूना फिर से स्पिन और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ऊपरी चरण हस्तांतरण मोतियों की कोई भार सुनिश्चित करने के लिए।
  23. शाही सेना या प्रोटीन निकासी के लिए नमूने ले लो।
    नोट: मात्रा लिया शाही सेना या ब्याज की प्रोटीन के निम्नलिखित परख और अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर होना चाहिए। एक दिशानिर्देश, उत्तरी विश्लेषण 26 के लिए के रूप में, पश्चिमी धब्बा 23,27 या आरटी पीसीआर 28 के लिए, नमूना के 80% ले 20% ले, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 29 के लिए नए प्रोटीन की खोज करने के लिए, पूरे नमूना ले।

2. शाही सेना निकालना

  1. 2x Crosslinking उलटा बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं। आरएनए निकासी के लिए सीधे आगे बढ़ें।
    नोट: Crosslinking उलटा बफर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) है, जो काफी आरएनए निष्कर्षण 20 में सुधार होता है।
  2. मानक फिनोल का उपयोग करें: क्लोरोफॉर्म विधि 26 "इनपुट" और "अनबाउंड" नमूने (कदम 1.13 और 1.17) से शाही सेना को निकालने के लिए।
    नोट: ये नमूने RNase अवरोध हेपरिन की एक बड़ी राशि है, जो बाद में रिवर्स Transcriptase- (आरटी) का उपयोग assays बाधित कर सकते हैं (जैसे, आरटी पीसीआर), इसलिए, LiCl वर्षा 30 इसे दूर करने की सलाह दी है होते हैं। वाश 'और' क्षालन "नमूने (कदम 1.21 और 1.24) शाही सेना के कम मात्रा में होते हैं और निम्न चरणों के माध्यम से उपजी हैं।
  3. 8M guanidinium एचसीएल (GuHCl) और 100% इथेनॉल के दो संस्करणों के एक बराबर मात्रा "धोने" और "क्षालन" नमूने में जोड़े। कम से कम 2 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: guanidinium कुशलता प्रोटीन denature जाएगा और इस तरह के नमूने में RNases और proteases रोकना।
  4. 20,000 XG, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ठंड 80% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के साथ गोली 20,000 XG, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से धो लें।
  5. RNase मुक्त पानी के 400 μl में शाही सेना गोली भंग करने और फिर वेग किसी भी बचे हुए GuHCl या अन्य contaminants को दूर करने के लिए। 3 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.2 और 100% इथेनॉल के 800 μl के 40 μl जोड़ें, कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. अपकेंद्रित्र और 2.4 चरण में के रूप में धोने के लिए और एक 10 μl टिप के साथ सभी इथेनॉल को हटा दें। आरएनए तितर Resuspend10 μl RNase मुक्त पानी में एट। अतिरिक्त ध्यान रखना के रूप में शाही सेना गोली आमतौर पर दिखाई नहीं है।
    नोट: नमूने 23 (चित्रा 1) में वर्णित के रूप में उत्तरी विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

3. प्रोटीन वेस्टर्न ब्लाट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयारी

  1. 4x Laemmli नमूना बफर (LSB) की 1/3 मात्रा प्रोटीन के नमूने में जोड़ें और शाही सेना और प्रोटीन की crosslinking रिवर्स करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट सेते हैं।
    नोट: नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. एक एसडीएस polyacrylamide जेल (एसडीएस पृष्ठ), 31 पर चलाने के लिए प्रोटीन। प्रोटीन के आकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए के अनुसार जेल के प्रतिशत को समायोजित करें।
    नोट: 10% acrylamide जेल जुदाई की एक विस्तृत श्रृंखला देता है और एक पहली सन्निकटन के रूप में अच्छा है।
  3. अलगाव दक्षता (चित्रा 1 सी) के नियंत्रण के लिए मानक immunoblot विश्लेषण 27 में के रूप में झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरण। या तो Coomassie ब्लू आर के साथ दागमास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले 250 या चांदी दाग।
    नोट: रजत दाग पसंदीदा विकल्प है क्योंकि यह अधिक संवेदनशील है और बेहतर पता लगाने (चित्रा 1 बी) की अनुमति देता है। धुंधला या तो स्वयं तैयार समाधान या वाणिज्यिक किट के साथ किया जा सकता है। अंतिम डाई समाधान में जेल की ऊष्मायन समय प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए। लंबी ऊष्मायन कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन प्रकट हो सकता है, लेकिन इस तरह के कारण MS2-CP-एसबीपी-GFP के रूप में अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन के ऊपर दाग हो सकता है और अपने आसपास के क्षेत्र में आसपास के प्रोटीन मुखौटा हो सकता है। इसके अतिरिक्त, एक उच्च पृष्ठभूमि उत्पन्न हो सकती है। प्रतिक्रिया सावधानी से पालन करें, और उचित समय पर रोकने के समाधान जोड़ें।
  4. जेल से बाहर बैंड कट और उन्हें 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने, या प्रोटीन निष्कर्षण और trypsin पाचन नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण 32 के द्वारा पीछा के लिए भेज देते हैं।
  5. एक विकल्प के प्रोटिओमिक दृष्टिकोण जेल जुदाई कदम बाहर करने के लिए है, तो में कदम 1.24 से eluted सामग्री को पचानेlution नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण करने के लिए 33 trypsin और विषय का उपयोग कर।
    नोट: एसडीएस पृष्ठ जुदाई छोड़ना प्रोटोकॉल को सरल और पैदावार बढ़ जाती है। हालांकि, नमूने डिटर्जेंट एनपी 40 है, जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण रोकता के निशान होते हैं हो सकता है। इस समस्या को दूर करने के लिए निम्न चरणों का पालन:
    1. 15 मिनट - 10 के लिए एसडीएस पृष्ठ 31 पर चलाने के लिए प्रोटीन।
    2. लेन (यानी, जहां प्रोटीन स्थित हैं) के पूरे हिस्से में कटौती।
      नोट: प्रोटीन नमूना MS2-CP-एसबीपी प्रोटीन है कि कम बहुतायत प्रोटीन के संकेतों को अस्पष्ट कर सकते हैं की एक महत्वपूर्ण राशि शामिल हो सकता है।

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Representative Results

रैपिड उसके संबंधित प्रोटीन के साथ एक विशेष लक्ष्य शाही सेना के अलगाव सक्षम बनाता है। इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण आरएनए बरकरार रखे हुए है जितना संभव हो, जिससे प्रोटीन के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के। अलगाव दक्षता और आरएनए की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, उत्तरी विश्लेषण (चित्रा 1 ए) किया जाता है। उत्तरी विश्लेषण सीधे दक्षता और तेजी की गुणवत्ता रिपोर्टिंग का लाभ दिया है। इस प्रकार, पूरी लंबाई और गिरावट उत्पादों के रिश्तेदार मात्रा एक ही समय में निर्धारित किया जा सकता है। Ribosomal आरएनए (rRNAs) ethidium ब्रोमाइड धुंधला में आसानी से पता लगाया जाता है, और क्षालन नमूने में rRNAs की कमी शुद्धि की तंगी इंगित करता है। तंगी और शुद्धि की विशिष्टता आगे क्षालन नमूनों में एक untagged mRNA की एक संकेत के अभाव (Act1 नीचे पैनल) द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं। FPR1 लेन, जो Act1 के आकार का नहीं है में स्पष्ट संकेत, पूर्व से बचे हुए हैMS2L जांच के साथ संकरण vious। उत्तरी विश्लेषण भी पता चलता है कि इनपुट शाही सेना आरएनए कि गर्म फिनोल प्रोटोकॉल द्वारा शुद्ध किया गया था की तुलना में कुछ अधिक अपमानित है (सी / ओ Act1 जांच पैनल)। यह लंबी और अधिक जटिल तेजी प्रोटोकॉल के लिए जिम्मेदार ठहराया है। फिर भी, पूर्ण लंबाई का एक महत्वपूर्ण राशि, टैग आरएनए विशेष रूप से अलग है, के रूप में क्षालन अंश (MS2L जांच) में मजबूत संकेत से पता चला।

प्रोटीन के नमूने एसडीएस पृष्ठ पर चलाया जा सकता है और चांदी के दाग से सना हुआ प्रोटिओमिक्स विश्लेषण (चित्रा 1 बी) के लिए पहले। एक नमूना नियंत्रण से अलग, untagged कोशिकाओं (-MS2L) शाही सेना पर निर्भर लोगों से विशिष्ठ गैर विशिष्ट संघों में सहायक है। इसलिए, केवल बैंड है कि टैग किए गए नमूना (+ MS2L) में मजबूत कर रहे हैं जेल से बाहर कटौती और नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस के लिए लिया जाता है। सामान्य RBPs के साथ पश्चिमी विश्लेषण भी प्रोटीन सह-शुद्धि की दक्षता में इंगित करने के लिए सिफारिश की है (चित्रा1 सी)। इस के साथ साथ, हम Yef3, जो PMP1 20, या GFP, जो समग्र दक्षता और अलगाव की विशिष्टता को इंगित करता है के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है इस्तेमाल किया। दिलचस्प बात यह है Yef3 अलगाव की दक्षता PMP1 और FPR1 के बीच अलग प्रतीत होता है, और GFP की तुलना में काफी कम है।

आकृति 1
चित्रा 1. MS2L टैग RNAs और जुड़े प्रोटीन की पहचान। दो अलग RNAs के परिणामों की विशिष्ट अलगाव है कि तेजी से (PMP1 और FPR1) के अधीन थे प्रस्तुत कर रहे हैं। (ए) एक तेजी से प्रयोग से शुद्ध शाही सेना के नमूने के उत्तरी धब्बा विश्लेषण। आरएनए एक agarose जेल पर चलाने के लिए और ethidium ब्रोमाइड (ऊपरी पैनल) के साथ सना हुआ था। जेल नायलॉन झिल्ली को मिटाया और संकेत दिया जांच (कम पैनल) के साथ संकरण के अधीन था। नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं: तेजी से सेल (गर्म फिनोल [1.4 कदम]), रापीआईडी सेल (इनपुट [कदम 1.13]) और बायोटिन के साथ क्षालन के बाद (क्षालन [कदम 1.24])। (बी) MS2 टैग और untagged कोशिकाओं के साथ तेजी से प्रोटीन के रजत दाग। MS2 टैग PMP1 (+ MS2L) या untagged (-MS2L) नियंत्रण की क्षालन भिन्न से प्रोटीन के नमूने एसडीएस पृष्ठ और चांदी दाग ​​में चलाए जा रहे थे। (तारक ने संकेत दिया) अंतर तीव्रता के साथ बैंड जेल से बाहर कटौती और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है। तीर MS2-CP-GFP-एसबीपी संलयन प्रोटीन है, जो बराबर प्रोटीन लोड हो रहा है यह दर्शाता है इंगित करता है। अप्रासंगिक गलियों स्पष्टता के लिए बाहर खड़ी कर रहे थे। (सी) सकारात्मक नियंत्रण के पश्चिमी विश्लेषण। एंटीबॉडी कि MS2-सीपी संलयन प्रोटीन की Yef3 या GFP आधा भाग को पहचान के साथ पश्चिमी धब्बा आयोजित किया गया। अप्रासंगिक गलियों स्पष्टता के लिए बाहर खड़ी कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विभिन्न तरीकों विशिष्ट mRNAs का अलगाव का उपयोग अपने जुड़े प्रोटीन 11,34 35 की पहचान करने के लिए। इन तरीकों में इन विट्रो और इन विवो रणनीतियों में लागू आरएनए प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए। इन विट्रो तरीकों exogenously सेल lysate के साथ लिखित सेते आरएनए RBPs पर कब्जा करने और RNP परिसरों 36,37 को अलग-थलग करने के लिए। इस प्रकार का एक प्रभावी तरीका हाल ही में प्रस्तुत किया गया था, जो उपन्यास प्रोटीन है कि एक नियामक आरएनए मूल भाव 18 बाँध की पहचान के सक्षम होना चाहिए। इन तरीकों में से एक दोष है, क्योंकि संघ सेलुलर वातावरण के बाहर होता है में विवो तरीकों, जिसमें प्रोटीन, जबकि उनके प्राकृतिक स्थितियों में, आरएनए प्रोटीन एसोसिएशन का एक बेहतर विचार प्रदान कर सकता है Crosslinked हैं गैर विशिष्ट RBPs के बंधन है।। इसके अलावा, तिर्यक अलगाव के दौरान उच्च तंगी और इसलिए उच्च विशिष्टता की अनुमति देता है। जोड़ी दृष्टिकोण 17 antisense के अभिकर्मक का इस्तेमालRBPs के आसपास के क्षेत्र के लिए एक पेप्टाइड आधा भाग को निर्देशित करने के क्रम में लक्ष्य शाही सेना के अनुक्रम। पेप्टाइड RBPs तो Crosslinked और मोती है कि एक दृश्य है कि antisense अनुक्रम के लिए पूरक है से जुड़े होते हैं के माध्यम से अलग किया जा सकता है। जोड़ी कार्यप्रणाली जटिल जीनोमिक जोड़तोड़ के लिए आवश्यकता के बिना कई प्रकार की कोशिकाओं को अपनी सरल आवेदन के कारण बहुत ही लाभदायक है। यह है, तथापि, अभिकर्मक की क्षमता पर निर्भर है, और मामलों में जहां कोशिकाओं के कम प्रतिशत antisense स्वीकार कम प्रभावकारिता होगा। इसके अलावा, RBP पेप्टाइड-antisense अनुक्रम के अलगाव के चुंबकीय streptavidin मोतियों कि biotinylated oligonucleotide antisense न्यूक्लिक एसिड के पूरक के साथ मिलकर कर रहे हैं के माध्यम से प्राप्त की है। बातचीत (चुंबकीय मोती, streptavidin बायोटिन और आधार बाँधना) की बहुलता तंगी और अलगाव की दक्षता में सीमित कर सकता है। तेजी से विधि 24 यहाँ वर्णित कई पहलुओं में इन सीमाओं के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। सबसे पहले, टीवह MS2 के एकीकरण के छोरों में जीनोमिक loci सुनिश्चित करता है कि सभी कोशिकाओं यह एक्सप्रेस, इस तरह अपनी उपज बढ़ रही है। दूसरा, यह बारह MS2 पाश दृश्यों के लिए MS2-CP-GFP-एसबीपी के उच्च आत्मीयता बातचीत उपयोग करता है और उन्हें विवो में बाँध के लिए अनुमति देता है। तीसरा, आरएनए प्रोटीन बातचीत का निर्धारण और अधिक कठोर washes के लिए सक्षम बनाता है और गैर-विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन की पहचान कम कर देता है। अंत में, एसबीपी डोमेन उच्च आत्मीयता के साथ streptavidin मोतियों बांधता है और आसानी से मुक्त बायोटिन के साथ eluted है।

आरएनए में MS2 पाश की प्रविष्टि अनुवाद गड़बड़ी को कम करने के लिए और सभी छोरों की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए ओआरएफ और 3 'UTR के बीच सलाह दी जाती है। छह से 24 MS2 करने के लिए लूप को दोहराता mRNA स्थानीयकरण 38-40 के दृश्य के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया। हालांकि, MS2 की एक लंबी अनुक्रम की प्रविष्टि प्रसंस्करण और शाही सेना की संरचना में परिवर्तन हो सकती है छोरों; यह प्रतिलेख को अस्थिर या बाध्य RBPs के प्रदर्शनों की सूची को बदल सकता हैयह करने के लिए। हमारे अनुभव में, 12 छोरों MS2 टैग आरएनए 20 के एक कुशल क्षालन पाने के लिए पर्याप्त हैं। इस संबंध में, हम ध्यान दें कि हम आम तौर पर हमारे उत्तरी hybridizations में अतिरिक्त छोटे टेप मनाया। उत्तरी विश्लेषण विभिन्न जांच से पता चला है कि इन छोटे रूपों MS2L और 3 'UTR 20 का हिस्सा है, समय से पहले प्रतिलेखन समाप्ति का संकेत भी शामिल थे। इस तरह के मामलों 3 'UTR के साथ जुड़े प्रोटीन के अलगाव की क्षमता को कम करने की संभावना है। इसलिए, आरएनए के भीतर डाला छोरों की संख्या और उनके स्थान उच्च दक्षता पुल से नीचे और प्रतिलेख स्थिरता के बीच संतुलित किया जाना चाहिए।

आरएनए कुशल अलगाव और बाध्य प्रोटीन की अधिक से अधिक सरणी का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए प्रोटोकॉल भर में बरकरार रहने के लिए है। बाहरी RNase संदूषण के लिए मौके दस्ताने पहने हुए, एक साफ कार्य क्षेत्र सुनिश्चित करने, RNase मुक्त पानी के साथ समाधान की तैयारी, और संक्षेप में काम करके कम किया जा सकताऔर कुशलता प्रोटोकॉल के समय को कम करने के लिए। फिर भी, हमने पाया कि आरएनए गिरावट के लिए सबसे बड़ा योगदानकर्ता सेल पर lysate के लिए सेलुलर RNases की रिहाई है। यह सुधार आरएनए शुद्धि 41 में एक यांत्रिक चक्की परिणामों के साथ खमीर कोशिकाओं की है कि क्रायोजेनिक पीस प्रस्तावित किया गया था। इस मामले हैं, जहां महत्वपूर्ण गिरावट इस प्रोटोकॉल के साथ मनाया जाता है में करने की कोशिश की जा सकती है।

पुल से नीचे assays के एक आम दोष कई प्रोटीन है कि स्तंभ के लिए nonspecifically बाँध के अलगाव है। इसलिए, untagged शाही सेना के साथ एक खमीर तनाव के उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है। इस तनाव MS2-CP-GFP-एसबीपी संलयन प्रोटीन आगे प्रोटीन है कि संलयन प्रोटीन और न लक्ष्य शाही सेना के लिए बाध्य बाहर करने के लिए व्यक्त करता है। हम ध्यान दें कि इस प्रोटीन है कि MS2 पाश ही बाँध सकता है बाहर नहीं है, और इन प्रोटीन पुल से नीचे परख के साथ आगे की मान्यता की जरूरत है। चित्रा 1 बी से पता चलता है कि हम कई प्रोटीन है कि बाँध की पहचान करने में सक्षम थेPMP1 mRNA के लिए विशेष रूप से, और कुछ बाद में एक सह-आईपी परख 20 द्वारा मान्य किया गया।

रैपिड कार्यप्रणाली वर्तमान में खमीर सिस्टम तक सीमित है, इसकी अच्छी तरह से स्थापित साइट विशेष एकीकरण के तरीके का उपयोग। साइट विशेष एकीकरण प्रोटोकॉल वर्तमान में CRISPR कैस प्रणाली 42,43 का उपयोग अन्य प्रणालियों में जीनों के लिए विकसित किया जा रहा है। इन अतिरिक्त व्यवस्था करने के लिए तेजी के उपयोग के विस्तार में बहुत महत्व का हो जाएगा। तेजी की एक और भविष्य के आवेदन है कि ब्याज की एक mRNA के साथ जुड़े रहे आरएनए के अलगाव के लिए है। यह आसानी से शाही सेना seq के बजाय नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस के लिए अलग सामग्री को subjecting द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। mRNA अभिव्यक्ति को विनियमित करने में छोटे RNAs की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, इस आवेदन बहुत महत्व का होने की संभावना है। अंत में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री में सुधार (एमएस) विश्लेषण और ऐसे SILAC के रूप में मात्रात्मक एमएस तरीकों का उपयोग mRNA बाध्य protei की मात्रात्मक उपाय में परिणाम होगाअलग अलग परिस्थितियों में एन एस। रैपिड खमीर भारी आइसोटोप के साथ समृद्ध मीडिया में हो गई है और लेबल हटाया गया मीडिया 44,45 के साथ अलग अलग परिस्थितियों में (जैसे, तनाव) के तहत विकसित कोशिकाओं की तुलना के साथ प्रयोग किया जा सकता है। मात्रात्मक एमएस विश्लेषण के साथ मिलकर तेजी से विधि को लागू करने RBP प्रदर्शनों की सूची में परिवर्तन है कि एक विशेष mRNA के साथ जुड़े रहे हैं की सटीक उपाय निकलेगा।

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Acknowledgments

हम तेजी से प्रोटोकॉल स्थापित करने और आवश्यक plasmids प्रदान करने में उनकी मददगार सलाह के लिए प्रो जेफ Gerst और बोरिस Slobodin धन्यवाद। हम यह भी नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए इस प्रोटोकॉल और Smoler प्रोटिओमिक्स केंद्र से डॉ तामार Ziv स्थापित करने में उसकी मदद के लिए डॉ Avigail Atir-Lande धन्यवाद। हम YEF3 एंटीबॉडी के लिए प्रो टीजी Kinzy (रटगर्स) धन्यवाद। इस काम Binational विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान 2011013 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris sigma T1503
SDS bio-lab 1981232300
DTT sigma D9779
Acidic Phenol (pH 4.3) sigma P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) sigma P1944
Chloroform bio-lab 3080521
Formaldehyde Frutarom 5551820
Glycine sigma G7126
NP-40 Calbiochem 492016
Heparin Sigma H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) Sigma P7626
Leupeptin Sigma L2884
Aprotinin Sigma A1153
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T9003
Pepstatin Sigma P5318
DNase I Promega M610A
Ribonuclease  Inhibitor Takara 2313A
Glass Beads Sartorius BBI-8541701 0.4-0.6mm diameter 
Mini BeadBeater BioSpec Mini BeadBeater 16
Guanidinium Sigma G4505
Avidin Sigma A9275
Streptavidin Beads GE Healthcare  17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Yeast tRNA Sigma R8508
Biotin Sigma B4501
Yeast extract Bacto 288620
peptone Bacto 211677
Glucose Sigma G8270
1x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4x Laemmli Sample Buffer (LSB) 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad  161-0449 For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium  1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) 1:5,000
Anti GFP antibody Santa Cruz sc-8334 1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated SIGMA A9169 1:10,000

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References

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Samra, N., Arava, Y. Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology. J. Vis. Exp. (115), e54467, doi:10.3791/54467 (2016).

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