Introduction
RNA-binding proteins (RBPs) rappresentano circa il 10% di S. proteine cerevisiae 1,2 e circa il 15% delle proteine di mammiferi 3-5. Essi sono implicati in molti processi cellulari, come l'elaborazione di mRNA post-trascrizionale e la regolamentazione, la traduzione, biogenesi dei ribosomi, tRNA aminoacilazione e la modifica, il rimodellamento della cromatina, e altro ancora. Un importante sottogruppo di RBPs è proteine mRNA-binding (mRNPs) 6,7. Nel corso di mRNA maturazione diversi RBPs legano la trascrizione e mediare la sua lavorazione nucleare, l'esportazione fuori dal nucleo, localizzazione cellulare, la traduzione e la degradazione 6-8. Così, la serie distinta di RBPs legati ad una particolare trascrizione in qualsiasi punto nel tempo determina la sua lavorazione e, infine, il suo destino.
L'identificazione di RBPs associati ad un mRNA potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione dei processi sottostanti la loro regolazione post-trascrizionale. Diverse genetica, Microscopiche metodi biochimici e bioinformatica sono stati utilizzati per identificare le proteine coinvolte nella regolazione di mRNA (rivisto in 9-11). Tuttavia, solo alcuni di questi metodi consentono l'identificazione di proteine associate con un particolare mRNA bersaglio. Da segnalare è l'ibrido sistema di lievito Three (Y3H), che utilizza l'mRNA di interesse come esca per lo screening di una libreria di espressione in cellule di lievito. Cloni positivi si osservano di solito attraverso una selezione di crescita o giornalista espressione 12-14. Il vantaggio principale di questo metodo è il gran numero di proteine che possono essere scansionate in un ambiente cellulare e la capacità di misurare la forza dell'interazione RNA-proteina. Svantaggi includono il numero relativamente elevato di falsi positivi a causa di legame non specifico, e l'elevato potenziale di risultati falsi negativi dovuti, in parte, al ripiegamento della preda proteina di fusione o l'RNA esca.
Un'alternativa all'approccio genetico è purifi affinitàcazione di RNA con le sue proteine associate. Poly A contenente mRNA può essere isolato mediante l'uso di oligo dT colonne, e le loro proteine associate vengono rilevati mediante spettrometria di massa. L'interazione RNA-proteina è conservata nel suo contesto cellulare da reticolazione, che rende legami covalenti a corto raggio. L'uso della colonna dT oligo produce una visione globale dell'intero proteoma che è associato con qualsiasi poli A contenente mRNA 3,5,15. Tuttavia, questo non fornisce un elenco di proteine che sono associati a un particolare mRNA. Molto pochi metodi sono disponibili per realizzare una tale identificazione. Il metodo COPPIA comporta la transfezione di acido nucleico con complementarità al bersaglio mRNA 16,17. L'acido nucleico è anche collegato ad un peptide, che consente di reticolazione RBPs nelle immediate vicinanze del sito di interazione. Dopo la reticolazione, l'acido RBP-peptide-nucleico può essere isolato e sottoposto ad analisi proteomica. Di recente, una metodologia basata su aptamero eraefficacemente applicato ad estratti da linee cellulari di mammiferi 18. Un aptamero RNA con una maggiore affinità con streptavidina è stato sviluppato e fusa ad una sequenza di interesse (elemento ricco di AU (ARE) in questo caso). Il aptameri-ARE RNA è stata allegata al perline streptavidina e mescolato con lisato cellulare. Le proteine che associate con la sequenza ARE sono stati purificati e identificati mediante spettrometria di massa (MS). Anche se questo metodo rilevato associazioni che si verificano all'esterno le impostazioni cellulari (cioè, in vitro), è probabile essere modificato in futuro in modo da introdurre aptameri nel genoma e consentire così l'isolamento di proteine associate con il mRNA mentre nel ambiente cellulare (cioè, in vivo). In lievito, in cui le manipolazioni genetiche sono ben stabiliti, il metodo rapido (sviluppato nel laboratorio del Prof. Jeff Gerst) fornisce una visualizzazione di vivo associazioni in 19. RaPID combina la specifica e forte legame della proteina di rivestimento MS2 (MS2-CP) alla sequenza RNA MS2, e del dominio di legame streptavidina-(SBP) di streptavidina microsfere coniugate. In questo modo efficiente purificazione di mRNA MS2-taggate con perline streptavidina. Inoltre, l'espressione di 12 copie MS2 loop consente fino a sei MS2-CP di impegnare contemporaneamente al RNA e aumentare l'efficienza del suo isolamento. Questo protocollo è stato quindi suggerito di consentire l'identificazione di nuove proteine mRNA associate una volta che i campioni eluiti vengono sottoposti ad analisi proteomica mediante spettrometria di massa.
Recentemente abbiamo utilizzato rapide per identificare nuovi proteine associate con il lievito PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA è stato precedentemente dimostrato di essere associato con la membrana ER e la sua regione 3 'non tradotta (UTR) è stato trovato per essere un elemento determinante in questa associazione 21. Così, RBPs che legano PMP1 3 'UTR sono suscettibili di svolgere un ruolo importante nella sua localizzazione. RaPID seguito da cromatografo liquidoy-spettrometria di massa / spettrometria di massa (LC-MS / MS) ha portato all'identificazione di numerose nuove proteine che interagiscono con PMP1 20. Qui, forniamo un protocollo dettagliato della metodologia rapida e controlli importanti che devono essere fatte, e suggerimenti tecnici che possono migliorare il rendimento e la specificità.
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Protocol
Nota: inserire una sequenza composta da 12 siti MS2-assorbente (MS2 loop; MS2L) nel locus genomico desiderato, di solito tra la griglia di lettura aperta (ORF) e il 3 'UTR. Un protocollo dettagliato per questa integrazione è fornito altrove 22. Verificare il corretto inserimento e di espressione mediante PCR, analisi Northern o RT-PCR 20,23. È importante verificare che l'integrazione non è intervenuto con la sintesi del 3'UTR. Inoltre, un plasmide esprimente MS2-CP fuso SBP sotto l'espressione di un promotore inducibile (esaurimento metionina) dovrebbe essere introdotto nelle cellule 24. Un ceppo identico, escluse le anse MS12 introdotte, dovrebbe essere usato come un controllo per il rilevamento di segnali non specifici.
1. purificazione rapida
- Grow 500 ml di cellule di lievito (usare 250-1,000 ml di cellule di lievito a seconda del livello di espressione del gene di interesse) esprimenti MS2-etichettato mRNA 20 eMS2-CP-GFP-SBP proteina di fusione da 24 a 600 OD 0,8-1,0 a 30 ° C in terreno di coltura appropriato (ad esempio, sintetico destrosio (SD) terreno selettivo).
- cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Lavare le cellule in 1x tampone fosfato (PBS), centrifuga come prima (passo 1,2), risospendere in un volume uguale (passo 1.1) di SD senza metionina, e incubare per 45 - 60 minuti a 30 ° C per indurre l'espressione del MS2 -CP-GFP-SBP proteina di fusione.
Nota: tempo di induzione più lungo può causare aggregazione di GFP. - Mettere da parte 10 ml di cellule e di estrarre l'RNA da questo campione con il metodo semplice "fenolo caldo" 25. Attenzione: fenolo è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza.
Nota: Questo RNA è un buon riferimento per la qualità dell'RNA isolato (Figura 1A). - Per 500 ml cellule, aggiungere 1,35 ml 37% di formaldeide al c finaleoncentration del 0,1% per reticolare i complessi RNA-proteina. Continua incubazione a 30 ° C per 10 min. Attenzione: La formaldeide è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza.
- Aggiungere 26,5 ml di 2,5 M glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M e incubare per 3 minuti per fermare reticolazione. Da questo punto in poi, mettere tutto in ghiaccio per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.
- Cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a 4 ° C e lavare con 45 ml di freddo 1x PBS.
- Risospendere le cellule in 1 ml rapida lisi tampone per 100 ml di coltura cellulare iniziali.
- Suddiviso in aliquote di 500 microlitri in tubi microcentrifuga con tappo a vite e aggiungere ~ 400 mg di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota (circa un pieno 0,2 ml provetta PCR).
- Lisare le cellule in una perlina battitore per 3 min. Subito mettere il lisato in ghiaccio.
Nota: La lisi cellulare rilasci RNasi cellulari, che sono la principale causa di degradazione dell'RNA. tampone rapida lisi contiene un'alta concentrazione di RNAsi INHIcura dell'Espositore, quali l'eparina non specifico inibitore RNasi e inibitori specifici. Si raccomanda anche di lavoro rapidamente e tenere tutto freddo. - Trasferire il lisato di nuovi tubi. Pierce un piccolo foro nella parte inferiore di ciascuna provetta da microcentrifuga con un ago caldo (0,8 mm x 40 mm) e posizionare i tubi microcentrifuga sopra dei tubi 15 ml. Utilizzare la testa di una siringa da 5 ml da adattatore fra i tubi microcentrifuga e le provette da 15 ml. Centrifugare il gruppo tubi a 3.000 xg per 1 min a 4 ° C.
- Trasferire il flow-through dal tubo 15 ml in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per eliminare i detriti cellulari.
- surnatanti piscina da tutte le provette da 1,5 ml in un unico tubo da 15 ml, e mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato per l'RNA e l'isolamento delle proteine, rispettivamente.
Nota: Questi serviranno da campioni "input" per successiva analisi (Figura 1). - Aggiungere 300 mg di avidina per 500 ml di icoltura di lieviti nitial e incubare per 30 min (questo può essere ridotto a 10 min) a 4 ° C sotto laminazione costante (10 rpm).
Nota: i blocchi avidina biotina e proteine biotinilati di legarsi ai talloni streptavidina. - Pre-lavare le perline streptavidina prima dell'incubazione con lisato cellulare.
- Trasferire circa 300 ml di streptavidina perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere il surnatante superiore. Questo si tradurrà in 250 pl di perline. Lavare le perle due volte con 1 ml di tampone di lisi RaPID. Centrifugare le perline streptavidina a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C tra ogni passo.
- Bloccare le perle incubando per 1 ora con 0,5 ml di tampone di lisi RaPID, 0,5 ml di 10 mg / ml BSA e 10 ml di 10 mg / ml tRNA lievito. Beads possono essere lasciati O / N in soluzione bloccante a 4 ° C con rotazione se necessario.
- Lavare due volte con 1 ml di rapida lisi buffer.
Nota: perline magnetici possono essere utilizzati anche per ridurre i tempi e Prioritàound. Questi, tuttavia, avere una capacità inferiore a perline sefarosio.
- Aggiungere 250 pl di perline streptavidina pre-lavati al lisato avidina contenente (dal punto 1.14) e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm).
Nota: Questo tempo di incubazione è un compromesso tra fornire tempo sufficiente vincolante e riducendo al minimo le possibilità per la degradazione dell'RNA. - Centrifugare a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C per cancellare le perline streptavidina e trasferire il surnatante in un nuovo tubo 15 ml. Mettere da parte 1/50 e 1/100 volume del lisato per RNA e proteine isolamento, rispettivamente.
Nota: Questi saranno i campioni "Unbound". - Lavare le perline con 1 ml di tampone rapida lisi, agitare delicatamente, trasferire in una nuova provetta da 1,5 ml, e centrifugare come al punto 1.17. Ripetere questa operazione tre volte.
- Lavare le perline con 1 ml di tampone Rapid Wash, e questa volta la rotazione (10 rpm) per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere questa operazione due volte. Lavare le perline con 1 ml di PBS 1x e centrifugare come sopra.
- Lavare le perline di nuovo con 120 ml di PBS 1x. Centrifuga come sopra, e prendere l'intero surnatante per l'RNA e l'estrazione di proteine come il campione "Wash".
Nota: Questo ultimo campione di lavaggio indicherà la severità dei lavaggi e dovrebbe essere dello stesso volume del campione di eluizione. Questo semplificherà trasformazione e caricamento in saggi successivi. - Per eluire RNA e proteine RNA associate dalla colonna, aggiungere 120 ml di 6 mM biotina in 1x PBS e incubare per 45 min a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm).
- Centrifugare le perline come sopra e trasferire il materiale eluito in una nuova provetta da 1,5 ml. Spin nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in una nuova provetta da 1,5 ml per garantire che non riporto di perline.
- Prelevare campioni per RNA o estrazione di proteine.
Nota: Il volume taken dovrebbe dipendere dal seguente livello di dosaggio ed espressione del RNA o proteina di interesse. Come linea guida, per l'analisi del nord 26, prendere l'80% del campione, per il Western Blot 23,27 o RT-PCR 28, prendere il 20%, e per la spettrometria di massa 29 alla scoperta di nuove proteine, prendere l'intero campione.
2. RNA Estrazione
- Aggiungere un volume uguale di 2x reticolazione Reversal Buffer e incubare per 45 min a 65 ° C. Continuare direttamente per estrazione di RNA.
Nota: L'inversione reticolazione tampone contiene acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), che migliora in modo significativo l'estrazione di RNA 20. - Utilizzare il fenolo di serie: il metodo cloroformio 26 per estrarre l'RNA dal "ingresso" e campioni "non legati" (passi 1.13 e 1.17).
Nota: Questi campioni contengono una grande quantità di eparina inibitore RNasi, che può inibire successive Reverse Transcriptase- (RT) saggi che utilizzano (ad esempio, RT-PCR), di conseguenza, LiCl precipitazioni 30 si consiglia di rimuoverlo. Il "wash "e" campioni di eluizione "(passi 1.21 e 1.24) contengono piccole quantità di RNA e sono precipitati attraverso le seguenti fasi. - Aggiungere un volume uguale di 8M Guanidinium-HCl (GuHCl) e due volumi di etanolo 100% al "lavaggio" e "campioni eluizione". Incubare a -80 ° C per almeno 2 ore.
Nota: Guanidinium in modo efficiente denaturare le proteine e quindi inibire RNasi e proteasi nel campione. - Centrifugare a 20.000 xg, a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet con fredda 80% etanolo e centrifugare nuovamente a 20.000 xg, a 4 ° C per 15 min.
- Sciogliere il pellet di RNA in 400 ml di RNasi acqua libera e precipitare di nuovo per eliminare ogni residuo GuHCl o altri contaminanti. Aggiungere 40 ml di acetato di 3 M di sodio, pH 5,2 e 800 ml di etanolo al 100%, incubare a -20 ° C per almeno 1 ora.
- Centrifuga e lavare come al punto 2.4 e rimuovere tutti etanolo con una punta di 10 microlitri. Risospendere il pell RNAet in 10 microlitri acqua priva di RNasi. Fate particolare attenzione come il pellet di RNA di solito non è visibile.
Nota: I campioni possono essere utilizzati per l'analisi Northern come descritto in 23 (figura 1).
3. preparazione proteina per Western Blot o Analysis spettrometria di massa
- Aggiungere 1/3 volume di 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) per campioni di proteine e incubare 45 min a 65 ° C per invertire la reticolazione di RNA e proteine.
Nota: I campioni possono essere conservati a -20 ° C. - Proteine eseguito su un gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) 31. Regolare la percentuale del gel in base alle dimensioni delle proteine da analizzare.
Nota: gel di acrilammide 10% dà una vasta gamma di separazione ed è buono come prima approssimazione. - Trasferire proteine alla membrana come nell'analisi immunoblot standard di 27 per il controllo dell'efficienza di isolamento (Figura 1C). Macchia sia con Coomassie Blu R250 o argento macchia prima analisi di spettrometria di massa.
Nota: macchia d'argento è la scelta preferita perché è più sensibile e permette una migliore rilevazione (Figura 1B). La colorazione può essere fatto sia con soluzioni preparate manualmente o kit commerciali. Il tempo di incubazione del gel nella soluzione finale di colorante deve essere determinato sperimentalmente. incubazione può rivelare basse proteine abbondanti, ma può causare proteine altamente espresse, come MS2-CP-SBP-GFP essere finita macchiata e può mascherare le proteine che circondano nelle loro vicinanze. Inoltre, si potrebbe verificare un fondo elevato. Seguire la reazione con cura, e aggiungere soluzione di arresto al momento opportuno. - Tagliare le bande dal gel e trasferirli in provette da 1,5 ml. Conservare i campioni a -20 ° C, o inviare per l'estrazione di proteine e tripsina digestione seguita da analisi LC-MS / MS 32.
- Come un approccio di proteomica alternativo per escludere la fase di separazione del gel, digerire materiale eluito dal punto 1.24 in modo daluzione utilizzando tripsina e oggetto di analisi LC-MS / MS 33.
Nota: Omettere la separazione SDS-PAGE semplifica il protocollo e ne aumenta la resa. Tuttavia, i campioni possono contenere tracce di detergente NP-40, che inibisce l'analisi di spettrometria di massa. Per superare questo problema, effettuare le seguenti operazioni:- Eseguire proteine su SDS-PAGE 31 per 10 - 15 minuti.
- Tagliare l'intera porzione della corsia (cioè, dove si trovano le proteine).
Nota: Il campione proteico potrebbe includere una quantità significativa della proteina MS2-CP-SBP che possono oscurare i segnali di proteine poco abbondanti.
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Representative Results
RaPID consente l'isolamento di uno specifico RNA bersaglio con le sue proteine associate. Critico per il successo è mantenere l'RNA intatto il più possibile, ottenendo una quantità sufficiente di proteine. Per determinare l'efficienza di isolamento e la qualità dell'RNA, analisi Northern viene eseguita (Figura 1A). analisi Northern ha il vantaggio di segnalazione direttamente l'efficienza e la qualità della RaPID. Così, le quantità relative di lunghezza e di prodotti di degradazione completa possono essere determinati in un unico passaggio. RNA ribosomiale (rRNA) vengono rilevati facilmente nella colorazione etidio bromuro, e la mancanza di rRNA nel campione eluizione indica la severità della purificazione. La severità e la specificità della purificazione sono ulteriormente dimostrato dalla mancanza di un segnale di un mRNA untagged nei campioni di eluizione (ACT1 pannello inferiore). Il segnale apparente nella corsia FPR1, che non è della dimensione di ACT1, è un residuo preibridazione cedente con la sonda MS2L. L'analisi Northern rivela anche che l'RNA ingresso è un po 'più degradata rispetto a RNA che è stato purificato dal protocollo di fenolo caldo (c / o ACT1 pannello sonda). Questo è attribuito al protocollo RaPID lunghe e complicate. Tuttavia, una quantità significativa di lunghezza intera, etichettato RNA viene isolato specificamente, come rivelato dal segnale forte nella frazione di eluizione (sonda MS2L).
Campioni proteici possono essere eseguiti su SDS-PAGE e colorate con macchia d'argento prima dell'analisi proteomica (Figura 1B). Un campione isolata dal controllo, le cellule senza tag (-MS2L) è utile per le associazioni non-specifici distinguere da quelli RNA-dipendente. Pertanto, solo i gruppi che sono più forti nel campione tag (+ MS2L) sono tagliati fuori dal gel e prese per LC-MS / MS. Analisi Western con RBPs generali è consigliato anche per indicare l'efficienza della proteina co-purificazione (Figura1C). Qui, abbiamo usato Yef3, che è noto per interagire con PMP1 20 o GFP, che indica l'efficienza complessiva e specificità dell'isolamento. È interessante notare, l'efficienza dell'isolamento Yef3 sembra differire tra PMP1 e FPR1, ed è molto più basso rispetto al GFP.
Figura 1. Isolamento specifico di RNA MS2L marcatura ed identificazione di proteine associate. I risultati di due RNA diversi che sono stati sottoposti ad una rapida (e PMP1 FPR1) sono presentati. (A) Le analisi Northern blot di campioni di RNA purificati da un esperimento RAPID. RNA è stato eseguito su un gel di agarosio e colorati con bromuro di etidio (pannello superiore). Il gel è stato cancellato a membrana di nylon e sottoposta ad ibridazione con sonde indicate (pannelli inferiori). I campioni analizzati sono: lisi rapida delle cellule (fenolo caldo [punto 1.4]), RaLisi delle cellule PID (ingresso [step 1.13]) e dopo eluizione con biotina (eluizione [passo 1.24]). (B) Silver macchia di proteine da Rapid con celle MS2-targhette e senza tag. campioni di proteine da frazioni di eluizione di PMP1 MS2-tag (+ MS2L) o il controllo senza tag (-MS2L) sono stati eseguiti in SDS-PAGE e argento macchiato. Bande con intensità differenziale (contraddistinte da un asterisco) sono stati tagliati fuori dal gel e determinate da analisi di spettrometria di massa. La freccia indica la proteina di fusione MS2-CP-GFP-SBP, che dimostra la parità di carico di proteine. Corsie irrilevanti sono state tagliate fuori per chiarezza. (C) analisi Western di controlli positivi. Western blot con anticorpi che riconoscono la porzione Yef3 o GFP della proteina di fusione MS2-CP è stato condotto. Corsie irrilevanti sono state tagliate fuori per chiarezza. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vari metodi utilizzano l'isolamento di mRNA specifici per identificare le loro proteine associate 11,34 35. Questi metodi si applicano in vitro e in vivo strategie per sondare le interazioni RNA-proteina. Metodi in vitro incubare esogena trascritti di RNA con lisato cellulare per catturare RBPs e isolare complessi RNP 36,37. Un approccio efficace di questo tipo è stato presentato di recente, che ha permesso l'identificazione di nuove proteine che legano un motivo regolamentare RNA 18. Un inconveniente di questi metodi è il legame di RBPs non specifici perché l'associazione si verifica al di fuori dell'ambiente cellulare. In vivo metodi, in cui le proteine sono reticolati mentre nei loro ambienti naturali, può fornire una visione migliore di associazione RNA-proteina. Inoltre, reticolazione consente maggiore stringenza durante l'isolamento e quindi maggiore specificità. L'approccio COPPIA 17 utilizza la trasfezione del antisensosequenza RNA bersaglio per dirigere un residuo peptide pressi RBPs. Il peptide-RBPs possono poi essere reticolato e isolato tramite perline che sono collegati a una sequenza che è complementare alla sequenza antisenso. La metodologia coppia è molto vantaggioso per la sua semplice applicazione per molti tipi di cellule senza la necessità di manipolazioni genomici complessi. E ', tuttavia, dall'efficienza di trasfezione e casi in cui una bassa percentuale di cellule accetta l'antisenso avrà scarsa efficacia. Inoltre, l'isolamento della sequenza RBP-peptide-antisenso è ottenuta attraverso perline streptavidina magnetici che sono accoppiati con oligonucleotide biotinilato complementare all'acido nucleico antisenso. La molteplicità di interazioni (biglie magnetiche, streptavidina-biotina e accoppiamento di base) può limitare la severità e l'efficienza dell'isolamento. Il metodo RaPID 24 qui descritto fornisce un'alternativa a queste limitazioni in diversi aspetti. Primo, tha integrazione del MS2 loop in loci genomico assicura che tutte le cellule esprimono, aumentando così la resa. In secondo luogo, si utilizza l'interazione ad alta affinità del MS2-CP-GFP-SBP a dodici MS2 sequenze di loop e permette loro di legarsi in vivo. In terzo luogo, la fissazione delle interazioni RNA-proteina consente lavaggi più stringenti e riduce l'identificazione di proteine non specificamente legati. Infine, il dominio SBP si lega perline streptavidina con alta affinità ed è facilmente eluito con biotina libera.
Inserimento del ciclo MS2 nel RNA è consigliabile tra l'ORF e 3 'UTR per minimizzare traduzione perturbazione e garantire espressione di tutti i cicli. Da sei a 24 MS2 ripetizione del ciclo sono stati usati in precedenza per la visualizzazione di mRNA localizzazione 38-40. Tuttavia, l'inserimento di una lunga sequenza di MS2 loop può causare cambiamenti nella trasformazione e struttura del RNA; potrebbe destabilizzare la trascrizione o cambiare il repertorio di RBPs vincolatiad esso. Nella nostra esperienza, 12 cicli sono sufficienti per ottenere una eluizione efficiente di MS2-RNA tag 20. A questo proposito, notiamo che di solito osservato trascrizioni aggiuntivi più brevi nelle nostre ibridazioni settentrionali. Northern analizza con diverse sonde hanno rivelato che queste forme più brevi inclusi la MS2L e parte del 3 'UTR 20, indicativa di risoluzione anticipata trascrizione. Tali casi sono in grado di ridurre l'efficienza dell'isolamento di proteine associate con UTR 3 '. Pertanto, il numero di cicli inseriti e la loro posizione all'interno del RNA deve essere equilibrato tra l'alta efficienza di pull-down e stabilità trascrizione.
L'RNA deve rimanere intatto in tutto il protocollo per consentire l'isolamento efficiente e la rilevazione della matrice massima di proteine legate. Le probabilità di contaminazione RNasi esterno possono essere ridotti indossando i guanti, garantendo un area di lavoro pulita, la preparazione della soluzione con acqua priva di RNasi, e lavorando in modo concisoe in modo efficiente per ridurre i tempi di protocollo. Tuttavia, abbiamo scoperto che il più grande contributore alla degradazione dell'RNA è il rilascio di RNasi cellulari al lisato su lisi cellulare. E 'stato proposto che macinazione criogenica di cellule di lievito con un meccanico risultati mulino a migliorare la purificazione dell'RNA 41. Questo può essere provato nel caso in cui si osserva il degrado significativo con questo protocollo.
Un inconveniente comune di saggi di pull-down è l'isolamento di numerose proteine che si legano non specifico alla colonna. Pertanto, l'uso di un ceppo di lievito con RNA non etichettato è un controllo importante. Questo ceppo esprime la proteina di fusione MS2-CP-GFP-SBP escludere ulteriori proteine che si legano alla proteina di fusione e non RNA bersaglio. Notiamo che ciò non esclude le proteine che potrebbero legare il ciclo MS2 in sé, e questi bisogno di un'ulteriore conferma con il test di pull-down di proteine. Figura 1B mostra che siamo stati in grado di identificare diverse proteine che si leganospecificamente per PMP1 mRNA, e alcuni sono stati successivamente convalidati da un test di co-IP 20.
La metodologia rapida è attualmente limitata ai sistemi di lievito, utilizzando le sue metodologie di integrazione sito-specifica ben consolidati. Protocolli di integrazione sito-specifica sono attualmente in fase di sviluppo per i geni in altri sistemi che utilizzano il sistema CRISPR-Cas 42,43. Questi saranno di grande importanza per ampliare l'utilizzo di Rapid a sistemi aggiuntivi. Un'altra applicazione futura RaPID è per l'isolamento di RNA che sono associati con un mRNA di interesse. Ciò può essere facilmente ottenuto, sottoponendo il materiale isolato RNA-seq anziché LC-MS / MS. Considerando i ruoli importanti di piccoli RNA nella regolazione dell'espressione dell'mRNA, questa applicazione è probabile che sia di grande importanza. Infine, i miglioramenti in spettrometria di massa (MS) analisi e l'uso di metodi MS quantitativi come SILAC comporterà la misura quantitativa di Protei mRNA-boundNS in condizioni diverse. Rapid può essere usato con il lievito coltivato in terreno arricchito con isotopi pesanti e rispetto a cellule cresciute in diverse condizioni (ad esempio, stress) con i media senza etichetta 44,45. Applicando il metodo RaPID insieme all'analisi quantitativa MS produrrà misure accurate di variazioni del repertorio RBP che sono associati con un particolare mRNA.
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Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin per la loro consigli utili nella creazione del protocollo di rapida e fornire i plasmidi necessari. Ringraziamo anche il Dott Avigail Atir-Lande per il suo aiuto nella creazione di questo protocollo e il dottor Tamar Ziv dalla Smoler Proteomica Centro per il suo aiuto con l'analisi LC-MS / MS. Ringraziamo il Prof. TG Kinzy (Rutgers) per l'anticorpo YEF3. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 2.011.013 dalla Science Foundation binazionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
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