Introduction
Proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) representan aproximadamente el 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 y aproximadamente el 15% de las proteínas de mamíferos 3-5. Ellos están implicados en muchos procesos celulares, tales como el procesamiento del mRNA post-transcripcional y regulación, la traducción, la biogénesis de ribosomas, ARNt y aminoacilación modificación, remodelación de la cromatina, y mucho más. Un subgrupo importante de las prácticas comerciales restrictivas son las proteínas de unión a ARNm (6,7 mRNPs). En el curso de la maduración del ARNm, diferentes prácticas comerciales restrictivas se unen la transcripción y median su procesamiento nuclear, la exportación fuera del núcleo, localización celular, la traducción y la degradación de 6-8. Por lo tanto, el conjunto distinto de las prácticas comerciales restrictivas unidos a una transcripción en particular en cualquier punto de tiempo determina su procesamiento y en última instancia su destino.
La identificación de las prácticas comerciales restrictivas asociadas con un ARNm podría mejorar significativamente nuestra comprensión de los procesos que subyacen a su regulación post-transcripcional. diversa genética, Métodos microscópicos, bioquímicos y bioinformática se han utilizado para identificar proteínas implicadas en la regulación del mRNA (revisado en 9-11). Sin embargo, sólo unos pocos de estos métodos permiten la identificación de proteínas asociadas con un ARNm diana particular. Es de destacar el sistema híbrido de levadura Tres (Y3H), que utiliza el ARNm de interés como cebo para cribar una biblioteca de expresión en células de levadura. Los clones positivos se observan generalmente a través de una expresión de selección de crecimiento o reportero 12-14. La ventaja clave de este método es el gran número de proteínas que se pueden escanear en un ambiente celular y la capacidad de medir la fuerza de la interacción de ARN-proteína. Las desventajas incluyen la relativamente gran número de resultados falsos positivos debido a la unión no específica, y el alto potencial de resultados falsos negativos debido, en parte, a un mal plegamiento de la proteína de fusión de la presa o el ARN cebo.
Una alternativa al enfoque genético es purifi afinidadcación de ARN con sus proteínas asociadas. Poli A que contiene ARNm se puede aislar mediante el uso de oligo dT columnas, y sus proteínas asociadas son detectados por espectrometría de masas. La interacción ARN-proteína se conserva en su contexto celular mediante reticulación, lo que hace que los enlaces covalentes de corto alcance. El uso de la columna de oligo dT da una visión global de todo el proteoma que está asociado con cualquier poli A que contiene ARNm 3,5,15. Sin embargo, esto no proporciona una lista de proteínas que están asociadas con un ARNm particular. Muy pocos métodos disponibles para llevar a cabo tal identificación. El método PAIR implica la transfección de ácido nucleico con la complementariedad con el ARNm diana 16,17. El ácido nucleico también se une a un péptido, que permite la reticulación de las prácticas comerciales restrictivas en las cercanías de la sitio de interacción. Después de la reticulación, el ácido RBP-péptido-nucleico puede ser aislado y sometido a análisis de la proteómica. Recientemente, una metodología basada en el aptámero estabaaplicado con éxito a extractos de líneas celulares de mamíferos 18. Un aptámero de ARN con afinidad mejorada a la estreptavidina se desarrolló y se fusiona a una secuencia de interés (elemento AU-rico (ARE) en este caso). El ARN aptamer-ARE se une a perlas de estreptavidina y se mezcla con lisado de células. Las proteínas que asocian con la secuencia ARE se purificaron y se identifican por espectrometría de masas (MS). Aunque este método detecta asociaciones que se producen fuera de los ajustes celulares (es decir, in vitro), es probable que ser modificado en el futuro con el fin de introducir los aptámeros en el genoma y por lo tanto permitir el aislamiento de proteínas asociadas con el ARNm mientras que en el medio celular (es decir, in vivo). En la levadura, donde las manipulaciones genéticas están bien establecidos, el método rápido (desarrollado en el laboratorio del Prof. Jeff Gerst) proporciona una visión de las asociaciones in vivo 19. RaPID combina la MS2- específico y fuerte unión de la proteína de cubierta de MS2 (CP) a la secuencia de ARN MS2, y del dominio de unión a estreptavidina (SBP) a la estreptavidina perlas conjugadas. Esto permite la purificación eficiente de mRNAs etiquetados-MS2 a través de perlas de estreptavidina. Además, la expresión de 12 copias de bucles de MS2 permite que hasta seis MS2 CPs de unirse simultáneamente a la ARN y aumentar la eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, este protocolo se sugirió que permita la identificación de nuevas proteínas de ARNm-asociado una vez que las muestras eluidas se sometieron a análisis por espectrometría de masas proteómica.
Recientemente hemos utilizado RaPID para identificar nuevas proteínas asociadas con la levadura ARNm pMP1 20. PMP1 ARNm se había demostrado que se asocia con la membrana del RE y fue encontrado su región 3 'no traducida (UTR) ser un determinante importante en esta asociación 21. Por lo tanto, las prácticas comerciales restrictivas que se unen pMP1 3 'UTR es probable que desempeñen un papel importante en su localización. Rápida seguida de cromatógrafo de líquidosy-espectrometría de masas / espectrometría de masas (LC-MS / MS) dio lugar a la identificación de muchos nuevas proteínas que interactúan con pMP1 20. En esto, proporcionamos un protocolo detallado de la metodología RaPID, controles importantes que hay que hacer, y sugerencias técnicas que pueden mejorar el rendimiento y la especificidad.
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Protocol
Nota: Inserte una secuencia que consiste en 12 sitios de unión a MS2 (bucles de MS2; MS2L) en el locus genómico deseado, por lo general entre el marco de lectura abierto (ORF) y la 3 'UTR. Un protocolo detallado para esta integración se proporciona en otro lugar 22. Verificar la inserción apropiada y la expresión por PCR, análisis Northern o RT-PCR 20,23. Es importante verificar que la integración no interviene en la síntesis de la 3'UTR. Además, un MS2-CP plásmido que expresa fusionada a SBP bajo la expresión de un promotor inducible (el agotamiento de la metionina) también debe ser introducido en las células 24. Una cepa idéntica, con exclusión de los bucles MS12 introducidos, se debe utilizar como un control para la detección de señales no específicas.
1. purificación rápida
- Grow 500 ml de células de levadura (utilizar 250-1.000 ml de células de levadura según el nivel de expresión del gen de interés) que expresan MS2 etiquetado-mRNA y 20Proteína de fusión MS2-CP-GFP-PAS 24 a OD 600 0,8 - 1,0 a 30 ° C en el medio de crecimiento apropiado (por ejemplo, dextrosa sintética (SD) medio selectivo).
- centrifugar las células a 3.000 xg durante 4 minutos a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
- Lavar las células en 1x tampón fosfato salino (PBS), centrífuga como antes (paso 1.2), se resuspenden en un volumen igual (paso 1.1) de SD sin metionina, y se incuba durante 45 - 60 min a 30 ° C para inducir la expresión de la MS2 -CP-GFP-PAS proteína de fusión.
Nota: El tiempo de inducción más largo puede causar la agregación de GFP. - Destinará 10 ml de células y extraer ARN a partir de esta muestra utilizando el sencillo método de "fenol caliente" 25. Precaución: El fenol es altamente tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad.
Nota: Este ARN es una buena referencia para la calidad del ARN aislado (Figura 1A). - Por 500 ml células, añadir 1,35 ml de formaldehído al 37% a una final concentración de 0,1% para reticular los complejos de ARN-proteína. Continuar la incubación a 30 ° C durante 10 min. Precaución: El formaldehído es altamente tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad.
- Añadir 26,5 ml de 2,5 M de glicina a una concentración final de 0,125 M y se incuba durante 3 min para detener la reticulación. A partir de este paso adelante, poner todo en hielo para minimizar la degradación del ARN.
- Centrifugar las células a 3.000 g durante 4 min a 4 ° C y se lavan con 45 ml de PBS frío 1x.
- Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis rápida por 100 ml de cultivo celular inicial.
- Dividir en alícuotas de 500 l en tubos de microcentrífuga con tapón de rosca y añadir ~ 400 mg de perlas de vidrio refrigeradas a cada alícuota (aproximadamente un total de 0,2 ml tubo de PCR).
- lisar las células en una perla batidora durante 3 min. Inmediatamente después, poner el lisado en hielo.
Nota: Los comunicados de lisis celular ARNasas celulares, que son la principal causa de la degradación del ARN. tampón de lisis rápida contiene una alta concentración de RNasa INHIbidores, tales como la heparina inhibidor de RNasa no específica y los inhibidores específicos. También se recomienda trabajar con rapidez y mantener todo frío. - Transferir el lisado a tubos nuevos. Pierce un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo de microcentrífuga con una aguja caliente (0,8 mm x 40 mm) y coloque los tubos de microcentrífuga en la parte superior de los tubos de 15 ml. Utilice la cabeza de una jeringa de 5 ml como un adaptador entre los tubos de microcentrífuga y los tubos de 15 ml. Se centrifuga el conjunto de tubos a 3000 xg durante 1 min a 4 ° C.
- Transferir el flujo a través del tubo 15 ml a un tubo nuevo 1,5 ml y centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares.
- sobrenadantes de la piscina desde todas tubos de 1,5 ml en un solo tubo de 15 ml, y dejar de lado 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el ARN y el aislamiento de proteínas, respectivamente.
Nota: Estos servirán como las muestras "de entrada" para su posterior análisis (Figura 1). - Añadir 300 g de avidina por cada 500 ml de icultivo de levadura nitial e incubar durante 30 min (esta puede reducirse a 10 min) a 4 ° C bajo constante de rodadura (10 rpm).
Nota: Los bloques de avidina biotina y proteínas biotiniladas de la unión a las perlas de estreptavidina. - Pre-lavar las perlas de estreptavidina antes de la incubación con el lisado celular.
- Transferir unos 300 l de la estreptavidina perlas de suspensión a un tubo de 1.5 ml y eliminar el sobrenadante superior. Esto resultará en 250 l de perlas. Lavar las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lisis rápida. Centrifugar las perlas de estreptavidina a 660 xg durante 2 min a 4 ° C entre cada paso.
- Bloquear las perlas mediante la incubación durante 1 hora con 0,5 ml de tampón de lisis RaPID, 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA y 10 l de 10 mg / ml de ARNt de levadura. Los granos se pueden dejar O / N en solución de bloqueo a 4 ° C con rotación, si es necesario.
- Lavar dos veces con 1 ml de tampón de lisis rápida.
Nota: Las perlas magnéticas se pueden utilizar también para reducir el tiempo y background. Estos, sin embargo, tienen menor capacidad de perlas de sefarosa.
- Añadir 250 l de las perlas de estreptavidina pre-lavado para el lisado que contiene avidina-(del paso 1,14) y se incuba 1 hora a 4 ° C con rotación constante (10 rpm).
Nota: Este tiempo de incubación es un compromiso entre proporcionar suficiente tiempo de unión y reducir al mínimo las posibilidades de la degradación del ARN. - Centrifugar a 660 xg durante 2 min a 4 ° C para eliminar las perlas de estreptavidina y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml. Aparte 1/50 y 1/100 volumen del lisado para el ARN y la proteína de aislamiento, respectivamente.
Nota: Estas serán las muestras "sin consolidar". - Lavar las perlas con 1 ml de tampón de lisis rápida, agitar suavemente, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se centrifuga como en el paso 1.17. Repita este paso tres veces.
- Lavar las perlas con 1 ml de tampón de lavado rápido, y esta rotación de tiempo (10 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces. Lavar las perlas con 1 ml de 1x PBS y centrifugar como anteriormente.
- Lavar las perlas de nuevo con 120 l de 1x PBS. Centrifugadora que el anterior, y tomar todo el sobrenadante de ARN y la extracción de proteínas como la muestra "Lavado".
Nota: Esta última muestra de lavado indicará la rigurosidad de los lavados y debe ser del mismo volumen que la muestra de elución. Esto simplificará el procesamiento y la carga en los ensayos posteriores. - Para eluir el ARN y ARN-proteínas asociado de la columna, añadir 120 l de biotina 6 mM en 1 x PBS y se incuba durante 45 min a 4 ° C con rotación constante (10 rpm).
- Centrifugar las perlas como anteriormente y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Girar la muestra eluida de nuevo y transferir la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 ml para asegurar que no arrastre de perlas.
- Tomar muestras de ARN o extracción de proteínas.
Nota: El volumen ocupado debe depender del siguiente nivel de análisis y expresión del ARN o proteína de interés. A modo de orientación, por el norte de análisis 26, tomar el 80% de la muestra, por Western blot 23,27 o RT-PCR de 28 años, tener un 20%, y por espectrometría de masas de 29 a descubrir nuevas proteínas, tomar la muestra completa.
2. La extracción de RNA
- Añadir un volumen igual de 2x La reticulación Reversión del búfer y se incuba durante 45 minutos a 65 ° C. Continuar directamente para la extracción de RNA.
Nota: El Reversión reticulación Buffer contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), lo que mejora significativamente la extracción de RNA 20. - Utilizar el estándar de fenol: cloroformo método 26 para extraer el ARN de las muestras "sin consolidar" (pasos 1.13 y 1.17) "entrada" y.
Nota: Estas muestras contienen una gran cantidad de la heparina inhibidor de RNasa, que puede inhibir subsiguientes ensayos que utilizan inversa Transcriptase- (RT) (por ejemplo, RT-PCR), por lo tanto, la precipitación LiCl 30 se recomienda para eliminarlo. El wash "y" "muestras de elución (pasos 1.21 y 1.24) contienen bajas cantidades de ARN y se precipitan a través de los siguientes pasos. - Añadir un volumen igual de guanidinio 8M-HCl (GuHCl) y dos volúmenes de etanol al 100% de las muestras de elución "" "lavado" y. Se incuba a -80 ° C durante al menos 2 hr.
Nota: guanidinio se desnaturalizar proteínas de manera eficiente y por lo tanto inhibir RNasas y proteasas en la muestra. - Centrifugar a 20.000 xg, 4 ° C durante 30 min y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con etanol frío al 80% y se centrifuga de nuevo a 20.000 xg, 4 ° C durante 15 min.
- Se disuelve el pellet de ARN en 400 l de RNasa libre de agua y precipitar de nuevo para eliminar cualquier GuHCl restos u otros contaminantes. Añadir 40 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y 800 l de etanol al 100%, se incuba a -20 ° C durante al menos 1 hr.
- Centrifugar y lavar como en el paso 2.4 y eliminar todo el etanol con una punta de 10 l. Resuspender el ARN pelly en 10 l de agua libre de RNasa. Tener un cuidado especial como el sedimento de ARN no suele ser visible.
Nota: Las muestras se pueden utilizar para el análisis de Northern como se describe en 23 (Figura 1).
3. Preparación para la proteína de transferencia Western o análisis de espectrometría de masas
- Añadir 1/3 volumen de tampón de muestra Laemmli 4x (LSB) de las muestras de proteína y se incuba 45 min a 65 ° C para invertir la reticulación de ARN y proteínas.
Nota: Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C. - Proteínas en un gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 31. Ajuste el porcentaje del gel de acuerdo con el tamaño de las proteínas a analizar.
Nota: 10% de gel de acrilamida da una amplia gama de separación y es bueno como una primera aproximación. - Transferencia de las proteínas a la membrana como en el análisis de inmunotransferencia estándar 27 para el control de la eficiencia de aislamiento (Figura 1C). Manchar con Coomassie Blue R250 o tinción de plata antes del análisis de espectrometría de masas.
Nota: tinción de plata es la opción preferida ya que es más sensible y permite una mejor detección (Figura 1B). La tinción se puede hacer ya sea con soluciones preparadas manualmente o kits comerciales. El tiempo de incubación del gel en la solución de colorante final se debe determinar experimentalmente. De incubación prolongado puede revelar las proteínas de baja abundancia, pero puede causar proteínas altamente expresadas como MS2-CP-SBP-GFP sean excesivamente manchada y puede enmascarar las proteínas que rodean en sus proximidades. Además, se puede producir un alto fondo. Siga cuidadosamente la reacción, y añadir la solución de parada en el momento apropiado. - Cortar las bandas del gel y transferirlas a tubos de 1,5 ml. Conservar las muestras a -20 ° C, o envían para la extracción de proteínas y la digestión con tripsina seguido de análisis por LC-MS / MS 32.
- Como un enfoque proteómico alternativa para excluir la etapa de separación de gel, digerir material eluido de la etapa 1.24 en lalución utilizando tripsina y sujeto a análisis por LC-MS / MS 33.
Nota: La omisión de la SDS-PAGE separación simplifica el protocolo y aumenta el rendimiento. Sin embargo, las muestras pueden contener trazas de detergente NP-40, que inhibe el análisis de espectrometría de masas. Para superar este problema, realice los siguientes pasos:- Ejecutar la proteína en SDS-PAGE al 31 durante 10 - 15 min.
- Cortar la parte entera del carril (es decir, donde se encuentran las proteínas).
Nota: La muestra de proteína puede incluir una cantidad significativa de la proteína MS2-CP-SBP que pueden oscurecer las señales de las proteínas de baja abundancia.
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Representative Results
RaPID permite el aislamiento de un ARN diana específico con sus proteínas asociadas. Crítica para su éxito es mantener el ARN intacto tanto como sea posible, obteniendo de esta manera una cantidad suficiente de proteínas. Para determinar la eficacia y la calidad de aislamiento de ARN, el norte de análisis se lleva a cabo (Figura 1A). el análisis del Norte tiene la ventaja de que depende directamente de la eficiencia y la calidad de la rápida. Por lo tanto, las cantidades relativas de los productos de degradación de longitud y completos pueden ser determinados en una sola carrera. ARN ribosómico (ARNr) se detectan fácilmente en la tinción con bromuro de etidio, y la falta de rRNAs en la muestra de elución indica la rigurosidad de la purificación. La rigurosidad y la especificidad de la purificación se demuestra adicionalmente por la falta de una señal de un ARNm sin etiquetar en las muestras de elución (panel inferior ACT1). La señal aparente en el carril FPR1, que no es del tamaño de ACT1, es un residuo de prela hibridación con la sonda ante- MS2L. El análisis Northern revela también que el ARN de entrada es algo más degradada en comparación con ARN que se purificó mediante el protocolo de fenol caliente (c / o ACT1 panel de sonda). Esto se atribuye al protocolo RaPID más largo y más complicado. Sin embargo, una cantidad significativa de longitud completa, marcado RNA se aísla específicamente, como se revela por la fuerte señal en la fracción de elución (sonda MS2L).
Las muestras de proteína se pueden ejecutar en SDS-PAGE y se tiñeron por tinción de plata antes de su análisis proteómica (Figura 1B). Una muestra aislada de control, las células no marcadas (-MS2L) es útil en asociaciones no específicas distintivas de los dependientes de ARN. Por lo tanto, solo las bandas que son más fuertes en la muestra etiquetado (+ MS2L) se cortan del gel y se da por LC-MS / MS. También se recomienda el análisis de Western con las prácticas comerciales restrictivas generales para indicar la eficiencia de la proteína co-purificación (Figura1C). En este documento, hemos utilizado Yef3, que se sabe que interactúan con pMP1 20, o GFP, lo que indica la eficiencia global y la especificidad del aislamiento. Curiosamente, la eficiencia de aislamiento Yef3 parece diferir entre pMP1 y FPR1, y es mucho más baja en comparación con GFP.
Se presentan Figura 1. Aislamiento de los ARN específico de etiquetado MS2L e Identificación de proteínas asociadas. Los resultados de dos ARN diferentes que fueron sometidos a una rápida (pMP1 y FPR1). (A) análisis de transferencia Northern de muestras de ARN purificado a partir de un experimento de RAPID. El ARN se ejecuta en un gel de agarosa y se tiñó con bromuro de etidio (panel superior). El gel se transfirió a una membrana de nylon y se sometió a hibridación con las sondas indicadas (paneles inferiores). Las muestras analizadas son: la lisis de las células rápido (fenol caliente [etapa 1.4]), RaLisis celular PID (entrada [etapa 1,13]) y después de la elución con biotina (elución [etapa 1,24]). (B) tinción con plata de proteínas de rápida con células MS2-etiqueta y sin etiqueta. Las muestras de proteína de las fracciones de elución de pMP1 MS2-etiquetados (+ MS2L) o control sin etiquetar (-MS2L) se corrieron en SDS-PAGE y tinción de plata. Las bandas con intensidad diferencial (indicado por asteriscos) se cortaron del gel y se determinó por análisis de espectrometría de masas. La flecha indica la proteína de fusión MS2-CP-GFP-PAS, lo que demuestra la igualdad de carga de proteínas. Carriles irrelevantes se recortan para mayor claridad. (C) El análisis de Western de los controles positivos. se llevó a cabo transferencia de Western con anticuerpos que reconocen la fracción Yef3 o GFP de la proteína de fusión MS2-CP. Carriles irrelevantes se recortan para mayor claridad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios métodos utilizan el aislamiento de ARNm específicos para identificar sus proteínas asociadas 11,34 35. Estos métodos se aplican in vitro y in vivo en estrategias para sondear las interacciones ARN-proteína. Los procedimientos in vitro Incubar exógenamente transcritos de ARN con lisado celular para capturar las prácticas comerciales restrictivas y aislar los complejos de RNP 36,37. Un enfoque eficaz de este tipo fue presentado recientemente, lo que permitió la identificación de nuevas proteínas que se unen a un motivo de ARN regulador 18. Un inconveniente de estos métodos es la unión de las prácticas comerciales restrictivas no específicos porque la asociación se produce fuera del entorno celular. Métodos in vivo, en el que las proteínas se reticulan mientras que en su entorno natural, puede proporcionar una mejor vista de la asociación de ARN-proteína. Además, la reticulación permite una mayor rigurosidad durante el aislamiento y por lo tanto una mayor especificidad. El enfoque PAIR 17 utiliza la transfección de la antisentidosecuencia con el ARN diana a fin de dirigir un resto peptídico a la vecindad de las prácticas comerciales restrictivas. El péptido-prácticas comerciales restrictivas a continuación, puede estar reticulado y aislado a través de los granos que están vinculados a una secuencia que es complementaria a la secuencia antisentido. La metodología de PAR es muy ventajoso debido a su sencilla aplicación para muchos tipos de células sin la necesidad de manipulaciones genómicas complejas. Es, sin embargo, depende de la eficacia de la transfección, y casos en los que un bajo porcentaje de células aceptan la antisentido tendrá baja eficacia. Además, el aislamiento de la secuencia RBP-péptido-antisentido se obtiene a través de perlas de estreptavidina magnéticas que se acoplan con el oligonucleótido biotinilado complementario al ácido nucleico antisentido. La multiplicidad de interacciones (perlas magnéticas, estreptavidina-biotina y el apareamiento de bases) puede limitar la rigurosidad y la eficiencia del aislamiento. El método rápido 24 se describe aquí proporciona una alternativa a estas limitaciones en varios aspectos. En primer lugar, tque la integración de la MS2 bucles en el loci genómico se asegura de que todas las células expresan, aumentando así su rendimiento. En segundo lugar, se utiliza la interacción de alta afinidad de la MS2-CP-GFP-PAS a doce MS2 secuencias de bucle y permite que se unen in vivo. En tercer lugar, la fijación de la interacción proteína-ARN permite lavados más estrictas y reduce la identificación de las proteínas unidas no específicamente. Por último, el dominio PAS une perlas de estreptavidina con alta afinidad y es fácilmente eluyó con biotina libre.
La inserción del bucle de MS2 en el ARN es aconsejable entre el ORF y la 3 'UTR para reducir al mínimo la perturbación de traducción y para asegurar la expresión de todos los bucles. De seis a 24 MS2 repite el bucle se utilizaron anteriormente para la visualización de mRNA localización 38-40. Sin embargo, la inserción de una secuencia larga de MS2 bucles pueden causar cambios en el procesamiento y la estructura del ARN; que podría desestabilizar la transcripción o cambiar el repertorio de las prácticas comerciales restrictivas con destinolo. En nuestra experiencia, los bucles 12 son suficientes para obtener una elución eficiente de etiquetado-MS2 ARN 20. A este respecto, observamos que por lo general observamos transcripciones más cortos adicionales en nuestros norte de hibridaciones. Norte de los análisis con diferentes sondas revelaron que estas formas más cortas incluyen la MS2L y parte de la 3 'UTR 20, indicativo de la terminación prematura de la transcripción. Tales casos es probable que reduzcan la eficacia del aislamiento de proteínas asociadas con la UTR 3 '. Por lo tanto, el número de bucles insertados y su ubicación dentro del ARN deben ser equilibradas entre la alta eficiencia desplegable y estabilidad transcripción.
El ARN tiene que permanecer intacto durante todo el protocolo para permitir el aislamiento eficiente y detección de la matriz máxima de las proteínas unidas. Las posibilidades de contaminación externa RNasa se pueden reducir mediante el uso de guantes, asegurando un área de trabajo limpia, la solución con agua libre de RNasa preparación, y trabajando de forma concisay eficaz para reducir el tiempo de protocolo. Sin embargo, encontramos que el mayor contribuyente a la degradación del ARN es la liberación de ARNasas celulares al lisado tras la lisis celular. Se propuso que la molienda criogénica de células de levadura con unas mecánicas resultados de molino en la mejora de la purificación del ARN 41. Esto puede ser juzgado en los casos en que se observa una degradación significativa con este protocolo.
Un inconveniente común de pull-down ensayos es el aislamiento de numerosas proteínas que se unen de forma no específica a la columna. Por lo tanto, el uso de una cepa de levadura con ARN sin etiqueta es un control importante. Esta cepa expresa la proteína de fusión MS2-CP-GFP-SBP para excluir además proteínas que se unen a la proteína de fusión y no el ARN diana. Observamos que esto no excluye las proteínas que pueden unirse al bucle MS2 en sí, y que se requiere una validación adicional con el desplegable ensayo de proteínas. La Figura 1B muestra que hemos sido capaces de identificar varias proteínas que se unenespecíficamente a pMP1 mRNA, y algunos fueron validados posteriormente mediante un ensayo de co-IP 20.
La metodología rápida es actualmente limitada a sistemas de levadura, utilizando sus métodos de integración específica de sitio bien establecidos. Protocolos de integración específica de sitio Actualmente se están desarrollando para los genes en otros sistemas que utilizan el sistema CRISPR-cas 42,43. Estos serán de gran importancia en la expansión de la utilización de rápido a los sistemas adicionales. Otra aplicación futuro de rápida es para el aislamiento de ARN que están asociados con un ARNm de interés. Esto se puede lograr fácilmente, sometiendo el material aislado de RNA-seq en lugar de LC-MS / MS. Teniendo en cuenta el importante papel de los pequeños RNAs en la regulación de la expresión del ARNm, esta aplicación es probable que sea de gran importancia. Finalmente, las mejoras en la espectrometría de masas (MS) análisis y el uso de métodos cuantitativos MS como SILAC dará lugar a la medida cuantitativa de protei unido a mRNAns bajo diferentes condiciones. RaPID se puede utilizar con la levadura crecer en medios enriquecidos con isótopos pesados y en comparación con las células cultivadas bajo diferentes condiciones (por ejemplo, estrés) con los medios de comunicación no marcados 44,45. Aplicando el método rápido junto con el análisis MS cuantitativa producirá medidas precisas de los cambios en el repertorio RBP que están asociados con un ARNm particular.
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Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Jeff Gerst y Boris Slobodin por sus útiles consejos para configurar el protocolo rápido y proporcionando los plásmidos necesarios. También agradecemos al Dr. Abigail Atir-Lande por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y el Dr. Tamar Ziv del Centro de Proteómica Smoler por su ayuda en el análisis LC-MS / MS. Agradecemos al Prof. TG Kinzy (Rutgers) para el anticuerpo YEF3. Este trabajo fue apoyado por el subsidio 2011013 de la Fundación Binacional de Ciencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
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