Introduction
RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) S. yaklaşık% 10'unu temsil cerevisiae proteinleri 1,2 ve memeli proteinlerinin 3-5 arasında yaklaşık% 15. Bunlar mRNA transkripsiyon sonrası işleme ve düzenleme, çeviri, ribozom biogenezinin, tRNA Aminoacylation ve modifikasyon, kromatin yeniden ve daha fazlası gibi birçok hücresel süreçlere de karışırlar. RBPS önemli bir alt grubu, mRNA bağlayıcı proteinler (mRNPs) 6,7 olan. MRNA olgunlaşma sürecinde, farklı RBPS transkript bağlamak ve nükleus, hücresel lokalizasyonu, çeviri ve bozulma 6-8 dışarı nükleer işleme, ihracat aracılık eder. Böylece, herhangi bir zaman noktasında belirli bir transkript bağlı RBPS ayrı set onun işleme ve sonuçta onun kaderi belirler.
Bir mRNA ile ilişkili RBPS belirlenmesi önemli ölçüde transkripsiyon sonrası düzenleme altında yatan süreçlerin anlayışımızı artırabilir. genetik çeşitlilikMikroskobik, biyokimyasal ve biyoinformatik yöntemleri (9-11 gözden) mRNA düzenlenmesinde rol proteinleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birkaç özel bir hedef mRNA ile ilişkili proteinlerin belirlenmesini mümkün kılmaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, maya hücreleri bir ekspresyon kolleksiyonunu taramak için yem olarak ilgili mRNA'nın kullanır maya üç hibrid sistemi (Y3H) 'dir. Pozitif klonlar genellikle büyüme seçimi ya da muhabir ifade 12-14 ile gözlenir. Bu yöntemin en önemli avantajı, hücre ortamında ve RNA-protein etkileşiminin gücünü ölçmek için yeteneği taranabilir proteinlerin büyük bir sayıdır. Dezavantajları nedeniyle spesifik olmayan yanlış pozitif sonuç, görece olarak yüksek ve füzyon proteini, av veya yem RNA yanlış katlanma kısmen hatalı negatif sonuçlar, yüksek bir potansiyel bulunmaktadır.
Genetik yaklaşım alternatif afinite purifi olanilişkili proteinler RNA katyonudur. Poli A ihtiva eden mRNA oligo dT sütun kullanılarak izole edilebilir, ve bunların ilişkili proteinler kütle spektrometrisi ile tespit edilir. RNA-protein etkileşimi, kısa menzilli kovalent bağlar yapan çapraz bağlama suretiyle, hücresel bir çerçevede, muhafaza edilir. Oligo dT sütunun kullanılması mRNA 3,5,15 A-içeren herhangi bir poli ile ilişkili tüm proteom küresel bir görünüm verir. Bununla birlikte, belirli bir mRNA ile ilişkili proteinlerin bir listesi sağlamaz. Çok az metotlar, bir kimlik gerçekleştirmek için kullanılabilir. ÇİFT yöntemi hedefe mRNA 16,17 ile tamamlayıcılık ile nükleik asidin transfeksiyon gerektirir. nükleik asit, aynı zamanda etkileşim bölgesi yakın çevresinde RBPS için çapraz bağlama sağlayan bir peptit eklenir. çapraz bağlama sonrasında RBP-peptid-nükleik asit izole edilebilir ve proteomik analizine tabi tutulmuştur. Son zamanlarda, bir aptamer tabanlı metodoloji oldubaşarılı bir şekilde, memeli hücre hatları 18 alıntılar uygulanır. streptavidin geliştirilmiş afiniteye sahip bir RNA aptamer geliştirilmiş ve (bu durumda AU zengin elemanı (ARE)) ilgi konusu bir sekansına kaynaştırılır. Aptamer RNA streptavidin boncuk bağlanmış ve hücre lizatı ile karıştırıldı. Sırasına ilişkili proteinler arıtıldı ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Bu yöntem hücresel ayarları (örneğin, in vitro) dışında meydana dernekler bulgulamışsak da, mRNA ile ilişkili proteinlerin izolasyonu genomuna aptamers vermek ve bu şekilde mümkün kılacak şekilde, gelecekte değişecektir olduğu süre hücresel ortam (yani, in vivo). Genetik manipülasyonlar iyi kurulmuş maya, olarak, (Prof. Dr. Jeff Gerst laboratuarında geliştirilen) hızlı yöntem, in vivo dernekler 19 bir görünüm sağlar. Rapid (özel ve MS2 kat proteinin bağlanma güçlü MS2- birleştirirVe) streptavidin bağlama alanı (SBP MS2 RNA dizisine CP) konjuge boncuk streptavidin. Bu streptavidin boncuk ile MS2 etiketli mRNA'ların etkili arınma sağlar. Ayrıca, MS2 döngüler 12 kopya sentezleme RNA eş zamanlı olarak bağlanan ve izolasyon verimini geliştirmek için, altı MS2-CP izin verir. Bu protokol, bu nedenle elüt örnekler kütle spektrometrisi ile proteomik analizine tabi kez yeni mRNA ilişkili proteinlerin belirlenmesini sağlamak için önerilmiştir.
Son zamanlarda, maya PMP1 mRNA 20 ile bağlantılı yeni proteinleri belirlemek için hızlı kullanmıştır. PMP1 mRNA daha önce ER membran ile ilişkili olduğu ve 3 'çevrilmemiş bölgesi (UTR) Bu ilişki 21 önemli bir belirleyici olduğu bulunmuştur gördü. Bu nedenle, PMP1 3 'UTR bağlanan RBPS lokalizasyonu önemli bir rol oynaması olasıdır. HIZLI sıvı kromatografı ve ardındany-kütle spektrometrisi / kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) PMP1 20 ile etkileşim çok sayıda yeni protein da tespit ettik. Bu yazıda, Rapid metodoloji ayrıntılı bir protokol sağlar, gerek önemli kontroller yapılır ve verim ve özgüllüğünü artırabilir teknik ipuçları edilecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: 12 MS2 bağlayıcı siteleri kapsayan bir dizi takın (MS2 döngüler; MS2L) istenen genomik içine, genellikle, açık okuma çerçevesinin (ORF) 3 'UTR arasındadır. Bu entegrasyon için ayrıntılı bir protokol yerde 22 sağlanır. PCR, kuzey analizi veya RT-PCR 20,23 tarafından uygun ekleme ve ifade doğrulayın. Entegrasyon 3'UTR'sinden sentezi ile müdahale etmedi doğrulamak için önemlidir. Buna ek olarak, indüklenebilir bir promotör (metiyonin tükenmesi) ekspresyonu altında SKB kaynaşmış bir plazmid ifade MS2-CP da hücreler 24 içine alınmalıdır. kişiye MS12 halkalar hariç özdeş soyu, spesifik olmayan sinyallerin tespiti için bir kontrol olarak kullanılır.
1. Hızlı Arıtma
- Maya hücreleri, 500 ml (söz konusu genin ifade seviyesi ile ilgili olarak, maya hücreleri 250-1,000 ml kullanın) mRNA'nın 20 ve MS2-etiketli eksprese büyütünUygun büyüme ortamına (örneğin, Sentetik Dekstroz (SD) seçici orta) 30 o C'de 1.0 - MS2-CP-GFP-SBP füzyon proteini 24 600 0.8 OD.
- Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 3.000 xg'de ve süpernatant atın.
- Metiyonin olmayan SD, eşit hacimde (adım 1.1) de (adım 1.2), daha önce olduğu gibi tekrar süspansiyon 1X fosfat tamponlu salin hücreleri (PBS), santrifüj yıkayın ve 45 boyunca inkübe - MS2 ekspresyonunu indüklemek için 60 dakika 30 ° C'nin -CP-GFP SBP füzyon proteini.
Not: Daha uzun indüksiyon süresi GFP toplanmalarına neden olabilir. - Hücrelerin bir kenara 10 ml Set ve basit "sıcak fenol" yöntemini 25 kullanılarak bu örnekten RNA ayıklayın. Dikkat: Fenol son derece zehirli ve emniyet talimatlarına göre ele alınmalıdır.
Not: Bu RNA izole RNA (Şekil 1A) kalitesi için iyi bir referanstır. - 500 ml hücre için, bir son c 1.35 ml% 37 formaldehid ilave% 0.1 bağlı yoğunlaşma RNA-protein kompleksleri çapraz bağlanması için. 10 dakika boyunca 30 ° C de kuluçka devam edin. Dikkat: Formaldehit çok zehirlidir ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır.
- 0.125 M bir son konsantrasyona kadar 2.5 M glisin 26.5 ml ilave edilir ve çapraz bağlanmasının durdurmak için 3 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımdan, RNA bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde her şeyi koymak.
- 4 o C'de 4 dakika süreyle 3,000 xg'de Santrifüj hücreleri ve 45 ml soğuk 1x PBS ile yıkayın.
- Başlangıç hücre kültürü 100 ml başına 1 mi Rapid liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri.
- vidalı kapaklı mikrofuge'ye tüplerde 500 ul hacme bölünmüş ve her kısım (kabaca tam 0.2 ml PCR tüp) için ~ soğutulmuş cam boncuklar 400 mg ekleyin.
- Bir çemberde Hücreleri, 3 dakika boyunca çırpıcı. Hemen buz üzerinde lizat koydu.
Not: Hücre parçalama serbest bırakır RNA bozulması başlıca nedenidir hücresel RNases. Rapid liziz tamponu RNaz inhi yüksek konsantrasyonda içerirBu tür spesifik olmayan RNaz inhibitörü özellikle heparin ve spesifik inhibitörleri olarak bitors. hızla çalışan ve soğuk her şeyi tutmak da tavsiye edilir. - Yeni tüplere lizat aktarın. Pierce sıcak iğne (0.8 mm x 40 mm) ile her bir mikrofüj tüpün alt küçük bir delik ve 15 ml tüpler üzerine mikrofüj tüpleri. mikrofüj tüpleri ve 15 ml tüpler arasında bir adaptör olarak 5 ml'lik bir şırınga baş kullanın. 4 O ° C'de 1 dakika için 3000 x g'de borular düzeneği santrifüj
- Hücre artıkları temizlemek için 4 o C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de yeni bir 1.5 ml tüp ve santrifüj akış oranı 15 ml tüp transfer.
- Havuz tek 15 ml tüp içine tüm 1.5 ml tüpler süpernatantlar ve 1/50 kenara sırasıyla RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim.
Not: Bu sonraki analiz (Şekil 1) için "Giriş" örnekleri olarak görev yapacak. - i 500 ml başına avidin 300 ug eklemenitial maya kültürü ve sürekli haddeleme (10 rpm) 4 O ° C'de (bu, 10 dakika indirgenebilir), 30 dakika boyunca inkübe edin.
Not: streptavidin boncuk bağlanmasını Avidin blok biotin ve biyotinile edilmiş proteinler. - hücreleriyle inkübasyon önce streptavidin boncuk ön yıkayın.
- boncuklar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne çamur streptavidin yaklaşık 300 ul aktarın ve üst süpernatant kaldırmak. Bu boncuk 250 ul neden olur. HIZLI liziz tamponu için 1 ml ile iki kez boncuk yıkayın. Her adım arasında 4 o C'de 2 dakika süreyle 660 xg'de streptavidin boncuk santrifüj.
- 0.5 hızlı bir liziz tamponu mL içinde 10 mg, 0.5 ml / ml BSA ve 10 mg / ml maya tRNA, 10 ul 1 saat boyunca inkübe edilerek boncuk bloke eder. Boncuk O / N gerekirse rotasyon ile 4 o C'de çözüm engelleme bırakılabilir.
- Rapid lizis tamponu 1 ml ile iki kez yıkanır.
Manyetik boncuklar da zaman ve Backgr azaltmak için kullanılabilir: Notound. Ancak bunlar, sefaroz boncuklar daha düşük kapasiteye sahiptir.
- (Adım 1.14 arasında) avidin ihtiva eden lizat önceden yıkanmış streptavidin boncuk 250 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C 'de 1 saat inkübe edilir.
Not: Bu inkübasyon süresi yeterli bağlanma süresi sağlayan ve RNA bozulması şansını en aza indirmek arasında bir uzlaşmadır. - 4 o C'de 2 dakika süreyle 660 xg'de santrifüj streptavidin boncuk temizlemek ve yeni bir 15 ml tüp süpernatant aktarmak için. sırasıyla kenara 1/50 ve RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim, ayarlayın.
Not: Bu "Sınırsız" örnekleri olacaktır. - Adım 1.17 gibi hafifçe sallayın, Rapid Lizis tamponu 1 ml boncuk yıkayın yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer ve santrifüj. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- 1 Hızlı yıkama tampon maddesinin ml'si, 4 ° C'de 5 dakika boyunca bu zaman döndürmek (10 rpm) ile boncuk yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. Yukarıdaki 1 1x PBS ilave edildi ve santrifüj ile boncuk yıkayın.
- 1x PBS 120 ul tekrar boncuk yıkayın. Santrifüj yukarıdaki gibi ve "Yıkama" örnek olarak RNA ve protein ekstraksiyonu için tüm süpernatant alır.
Not: Bu son yıkama Örnek yıkama katılığını gösterir ve elüsyon örnek olarak, aynı hacimde olmalıdır. Bu daha sonraki analizlerde işleme ve yükleme basitleştirecek. - Kolondan RNA ve RNA-ilişkili proteinler elüt 1x PBS içinde 6 mM biyotin 120 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C'de 45 dakika boyunca inkübasyona.
- Santrifüj boncuklar yukarıda ve yeni bir 1.5 ml'lik tübe elüt malzemeyi aktarırlar. Tekrar edilen örnek Spin ve boncuk Resim taşınmasını sağlamak için yeni bir 1.5 ml'lik tübe Üst faz transfer.
- RNA ya da protein çıkarımı için örnekler alın.
Not: Alınan ses RNA veya protein, aşağıdaki deney ve ifade seviyesine bağlı olmalıdır. Kuzey analizi 26 için bir kılavuz olarak, Western Blot 23,27 veya RT-PCR 28 için, numunenin% 80 almak% 20 almak ve kütle spektrometresi 29 için, yeni proteinler keşfetmek tüm örnek almak için.
2. RNA Ekstraksiyon
- 2x Çapraz bağlama Ters tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve 65 ° C'de 45 dakika inkübe edilir. RNA ekstraksiyonu için doğrudan devam edin.
Not: Çapraz bağlama Ters Tampon anlamlı RNA ekstraksiyonu 20 arttırır etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva etmektedir. - Standart fenol kullanın: kloroform yöntemi 26 "giriş" ve "ilişkisiz" örneklerinde (1.13 ve 1.17 adımlar) RNA ayıklayın.
Not: Bu örnekler (ör RT-PCR), bu nedenle, LiCİ çöktürme 30 çıkarmak için tavsiye edilir daha sonra reverse transcriptase (RT) kullanılarak tahlilleri önleyebilen RNaz inhibitör heparin büyük miktarda içerir. "wash "ve" elüsyon "örnekleri (1.21 ve 1.24 adımlar) RNA düşük miktarda içeren ve aşağıdaki adımlarda çöktürülür. - "Yıkama" ve "yıkama" örnekleri 8 M Guanidinyum-HCI (GuHCl) ve% 100 etanolden iki hacmin eşit hacim. En az 2 saat boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
Not: Guanidinium verimli proteinler denatüre ve böylece numunedeki RNases ve proteazlar engelleyecektir. - 20.000 x g'de, 30 dakika süre ile 4 ° C'de santrifüj ve süpernatant atılır. 20.000 x g'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de tekrar soğuk% 80 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın.
- RNazsız su 400 ul RNA pelet çözülür ve herhangi bir artık GuHCl ya da diğer kirletici maddeleri uzaklaştırmak için yeniden çökeltilmesi. 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 etanol içinde 800 | il 40 ul ekle, en az 1 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj adım 2.4 gibi yıkayın ve bir 10 ul ucu ile tüm etanol çıkarın ve. RNA pell yeniden süspanse10 ul RNazsız su içinde ve çal. RNA pelet genellikle görünmüyorsa gibi ekstra özen gösterin.
Not: 23 (Şekil 1) 'de tarif edildiği gibi numuneler, kuzey analizi için kullanılabilir.
3. Protein Western Blot veya Kütle Spektrometre Analiz Hazırlık
- Protein örnekleri 4x Laemmli numune tamponu (LSB) 1/3 hacim ekleyin ve RNA ve protein çapraz bağlantıyı ters döndürecek 65 ° C'de 45 dakika inkübe edilir.
Not: Örnekler, -20 ° C'de saklanabilir. - Bir SDS poliakrilamid jeli (SDS-PAGE) 31 çalıştırmak proteinler. Analiz edilecek protein ölçülerine uygun jel yüzdesini ayarlamak.
Not:% 10 akrilamid jel ayırması geniş verir ve bir birinci yaklaşım olarak iyidir. - Izolasyon verimi (Şekil 1C) kontrolü için, standart bağışıklık benekleme analizi 27 gibi membran proteinleri aktarın. Coomassie Blue R ile ya Lekekütle spektrometresi analizden önce 250 veya gümüş leke.
Not: daha duyarlı ve daha iyi algılama (Şekil 1B) sağlar çünkü Gümüş leke tercih edilen bir seçimdir. Boyama elle hazırlanmış solüsyonlar ya da ticari kitler biriyle yapılabilir. Nihai boya çözeltisi içinde jel inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. Uzun inkübasyon düşük bol protein açığa çıkarabilir, ancak böyle MS2-CP-SBP-GFP olarak yüksek ifade proteinler üzerinde lekeli olması neden olabilir ve onların çevresinde çevreleyen proteinleri maskeleyebilir. Buna ek olarak, yüksek bir arka plan oluşabilir. dikkatle reaksiyonu izleyin ve uygun zamanda Dur Çözüm ekleyin. - jelden bantları kesip 1.5 ml tüpler aktarabilirsiniz. -20 ° C'de saklayın örnekleri ya da LC-MS / MS analizi 32, ardından protein ekstraksiyonu ve tripsin sindirim için örneklendi.
- Eğer jel ayrılması aşamasını hariç tutmak için alternatif bir yaklaşım olarak proteomik, bu adım 1.24 elüt edilen malzeme, özetLC-MS / MS analizi 33 tripsin ve konuyu kullanarak dökülmesinden.
Not: SDS-PAGE ayrılması atlama protokolü kolaylaştırır ve verim artar. Bununla birlikte, örnekler, kütle spektrometri analizi önleyen deterjan NP-40, izlerini içerebilir. Bu sorunu aşmak için, aşağıdaki adımları gerçekleştirin:- 15 dakika - 10 SDS-PAGE 31 protein çalıştırın.
- (Proteinler bulunduğu, yani) sokağın tüm kısmını kesip.
Not: Protein numunesi düşük bolluk protein sinyalleri gizleyebilir MS2-CP- SBP, proteinin önemli bir miktarda içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rapid ilişkili proteinler ile spesifik bir hedef RNA'nın izolasyonu sağlar. başarısı için kritik böylece proteinin yeterli miktarda elde edilmesi mümkün olduğu kadar sağlam RNA tutmak. RNA izolasyonu etkinliğini ve kalitesini saptamak için northern analizi (Şekil 1A) gerçekleştirilir. Kuzey analizi doğrudan Rapid verimliliğini ve kalitesini raporlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, tam uzunluktaki ve bozunma ürünlerinin nispi miktarları tek bir vadede belirlenebilir. Ribozomal RNA (rRNA) etidyum bromür boyama kolaylıkla tespit edilir, ve elüsyon örnek rRNA eksikliği saflaştırma katılığını ifade eder. saflaştırma sıkılığı ve özgüllüğü, bundan başka elüsyon örneklerinde etiketlenmemiş bir mRNA'nın bir sinyal olmaması (ACT1 alt panel) ile gösterilmektedir. ACT1 büyüklüğü değil FPR1 şeritte, belirgin sinyal, ön bir artık olanMS2L probu ile geçirilmifl hibridizasyon. kuzey analizi de giriş RNA sıcak fenol protokolü ile saflaştırılarak RNA oranla biraz daha bozulmuş olduğunu ortaya koymaktadır (/ ACT1 o sonda paneline c). Bu uzun zaman alır ve daha karmaşık bir hızlı bir protokol ilişkilendirilir. Bununla birlikte, tam uzunlukta bir önemli miktarda elüsyon fraksiyonu (MS2L prob) 'de güçlü bir sinyal ortaya gibi RNA, özellikle izole edilir etiketli.
Protein Numuneler proteomik analizi (Şekil 1B), SDS-PAGE üzerinde işlenmiş ve gümüş boya ile boyanmış olabilir. kontrol izole bir numune, etiketsiz hücreleri (-MS2L) RNA'ya bağlı olanlar ayırt spesifik olmayan dernekler yararlıdır. Bu nedenle, etiketli örnek (+ MS2L) güçlü sadece bantlar jel kesilmiş ve LC-MS / MS alınmaktadır. Genel RBPS ile Western analizi, protein eş saflaştırma etkinliğini göstermek için tavsiye edilir (Şekil1C). Burada, izolasyon verimini ve özgüllüğünü gösterir PMP1 20 veya GFP ile etkileştiği bilinmektedir Yef3 kullanılır. İlginçtir, Yef3 izolasyon verimi PMP1 ve FPR1 arasında farklılık göstermektedir ve GFP ile karşılaştırıldığında çok daha düşüktür.
Rapid (PMP1 ve FPR1) tabi tutuldu MS2L-etiketli RNA'lar ve İlişkili Proteinlerin Tanımlanması. İki farklı RNA'ların Sonuçlarının Şekil 1. Belirli İzolasyon. Sunulan hızlı deney saflaştırılmış RNA örnekleri (A) Northern blot analizi vardır. RNA, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür ve etidyum bromid (üst panel) ile boyandı. Jel naylon zara şişelendi ve belirtilen problar (alt paneller) ile hibridizasyona tabi tutuldu. analiz örnekleri şunlardır: hızlı hücre erimesi (sıcak fenol [adım 1.4]), RaPID hücre erimesi (giriş [adım 1.13]) ve biotin ile elüsyon sonra (elüsyon [adım 1.24]). MS2 etiketli ve etiketsiz hücrelerden Rapid proteinlerin (B) Gümüş leke. MS2-etiketli PMP1 (+ MS2L) veya etiketlenmemiş (-MS2L) kontrol elüsyon fraksiyonları Protein numuneleri lekeli SDS-PAGE ve gümüş çalıştırılmıştır. (Yıldız ile gösterilen) diferansiyel yoğunluk ile bantlar jel kesilmiş ve kütle spektrometrisi analizi ile belirlenmiştir. Ok, eşit bir protein yükleme gösterir MS2-CP-GFP SBP füzyon proteinini belirtir. Alakasız şerit. Açıklık için dışarı kırpılmış pozitif kontrollerin (C) Batı analiz edildi. MS2-CP kaynaşma proteini Yef3 veya GFP kısmı tanıyan antikorlar ile Western blot yürütülmüştür. Alakasız şerit netlik için dışarı kesilmiş bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli yöntemler ilişkili proteinleri 11,34 35 tanımlamak için belirli bir mRNA izolasyonunu kullanımı. Bu yöntemler, bir RNA-protein etkileşimlerini incelemek için in vitro ve in vivo stratejileri geçerlidir. In vitro yöntemler, dışsal RBPS yakalamak ve RNP kompleksleri 36,37 izole etmek için hücre lizatı ile RNA transkripsiyonu inkübe edin. Bu tip bir etkili bir yaklaşım, bir düzenleyici RNA motifi 18 bağlanan yeni proteinlerin tanımlanmasına olanak sağladı, en son verildi. Dernek Hücresel çevrenin dışında gerçekleştiğinden bu yöntemlerin bir dezavantajı spesifik olmayan RBPS bağlanmasını olduğunu. Kendi doğal ortamlarında, RNA-protein dernek daha iyi bir görünüm sağlayabilir iken proteinler çapraz olduğu in vivo yöntemler. Bundan başka, çapraz bağlanma izolasyonu sırasında daha yüksek sıkılığını ve bu nedenle daha yüksek bir özgüllük sağlar. ÇİFT yaklaşım 17 antisens transfeksiyon kullanırRBPS yakın bir peptid parçasını yönlendirmek için hedef RNA'ya dizisi. peptid-RBPS daha sonra çapraz bağlanmış ve antisens sekansına tamamlayıcı olan bir sekansa bağlı boncuklar ile izole edilebilir. ÇİFT yöntemi nedeniyle karmaşık genom manipülasyonlar için gerek kalmadan bir çok hücre tipinde olan basit bir uygulama çok avantajlıdır. Ancak, transfeksiyon verimliliğine bağlıdır, ve hücrelerin düşük bir yüzde antisens kabul olguda düşük etkiye sahip olacaktır. Ayrıca, RBP peptit-antisens dizisinin izolasyonu antisens nükleik aside tamamlayıcı bir biyotinlenmiş oligonükleotid ile bağlanan manyetik streptavidin boncuk ile elde edilir. etkileşimler (manyetik boncuk, streptavidin biotin ve baz eşleşmesi) çokluğu izolasyon darlığı ve verimliliğini sınırlandırabilir. Burada açıklanan hızlı yöntem 24 çeşitli yönleriyle bu sınırlamalara bir alternatif sağlar. İlk olarak, tgenomik loci böylece veriminin arttırılması, tüm hücrelerin bunu ifade sağlar içine MS2 ve o entegrasyonu döngüler. İkincisi, bu oniki MS2 döngü dizilerine MS2-CP-GFP-SBP yüksek afinite etkileşim kullanır ve onları in vivo bağlamak sağlar. Üçüncü olarak, RNA-protein etkileşimi sabitleme daha sıkı yıkama sağlar ve spesifik olmayan şekilde bağlanmış proteinin tanımlanmasını azaltır. Son olarak, SKB alan yüksek afiniteli streptavidin boncuk bağlar ve kolayca serbest biotin ile akıtılır.
RNA'ya MS2 döngüsünün yerleştirilmesi için pertürbasyon en aza indirmek için ve ilmeklerin ekspresyonunu sağlamak için ORF 3 'UTR ile tavsiye edilir. Altı MS2 24 döngü tekrarlar mRNA lokalizasyonu 38-40 görselleştirme için daha önce kullanılmıştır. Ancak, MS2 uzun bir dizinin ekleme işleme ve RNA'nın yapısında değişikliklere neden olabilir döngüler; , bağlı RBPS repertuar transkript istikrarsızlaştırmak ya da değişebilirbuna. Bizim tecrübelerimize göre, 12 döngüler MS2 etiketli RNA 20 etkili bir elüsyon almak için yeterlidir. Bu bağlamda, biz genellikle bizim kuzey döllemeler ek kısa transkriptleri gözlenen unutmayın. Kuzey farklı prob bu kısa formları erken transkripsiyon sonlandırma göstergesidir MS2L ve 3 'UTR 20 parçası dahil ortaya analizler. Bu gibi durumlarda 3 'UTR ile bağlantılı proteinlerin izolasyonu etkinliğini azaltmak olasıdır. Bu nedenle, RNA içine sokulur döngü sayısı ve konumu yüksek verim pull ve transkript istikrar arasında dengeli olmalıdır.
RNA bağlı proteinlerin maksimum dizinin verimli yalıtım ve algılamayı etkinleştirmek için protokol boyunca bozulmadan kalmasını vardır. Dış RNaz kirlenme şansı temiz bir çalışma alanı sağlamak, eldiven giyen RNaz içermeyen su ile çözeltisinin hazırlanması ve kısaca çalışarak azaltılabilirve verimli protokol süresini azaltmak için. Bununla birlikte, RNA bozulması en büyük katkıyı hücre erimesi üzerine lizat hücresel RNases salınımı olduğunu gördük. Bu geliştirilmiş RNA saflaştırma 41 mekanik değirmen sonuçları ile maya hücrelerinin bu kriyojenik taşlama önerilmiştir. Bu önemli bozulma bu protokol ile gözlenen durumlarda denenebilir.
Açılan testlerin ortak dezavantajı kolona nonspesifik bağlayan sayısız proteinlerin izolasyonu olduğunu. Bu nedenle, etiketsiz RNA ile bir maya suşu kullanımı önemli kontrolüdür. Bu soy daha füzyon proteini olup hedef RNA bağlanan proteinler hariç tutmak için MS2-CP-GFP SBP füzyon proteinini ifade eder. Biz bu MS2 döngü kendini bağlamak olabilir proteinleri dışlamaz unutmayın ve bu protein açılan testi ile daha doğrulama gerekir. Şekil 1B biz bağlayan birkaç proteinleri tespit etmek mümkün olduğunu gösteriyorözellikle PMP1 mRNA'ya ve bazı daha sonra eş-IP tahlilinde 20 tarafından doğrulanmıştır.
HIZLI yöntem şu anda iyi bilinen sahaya özel entegrasyon yöntemleri kullanılarak, maya sistemleri ile sınırlıdır. Sahaya özel entegrasyon protokolleri şu CRISPR-Cas sistemi 42,43 kullanan diğer sistemlerde genler için geliştirilmektedir. Bu ek sistemlerin Rapid kullanımını genişleterek büyük önem taşıyacaktır. Rapid başka gelecekteki uygulama ilgilendiren bir mRNA ile ilişkili RNA'lar izolasyonu içindir. Bu kolayca RNA DİZ yerine LC-MS / MS izole malzemenin tabi tutulması ile elde edilebilir. mRNA ekspresyonunu düzenleyen küçük RNA'ların önemli roller göz önüne alındığında, bu uygulama, büyük önem olması muhtemeldir. Son olarak, kütle spektrometrisi gelişmeler (MS) analizi ve SILAC gibi nicel MS yöntemlerin kullanılması mRNA bağlı protein, kantitatif ölçüm ile sonuçlanacaktırFarklı koşullar altında ns. HIZLI maya ağır izotoplar ile zenginleştirilmiş bir ortam içinde büyütüldü ve etiketlenmemiş ortam 44,45 ilişkili durumlarda (örneğin, stres) altında yetişen hücreler ile karşılaştırıldığında kullanılabilir. kantitatif MS analizi ile birlikte hızlı yöntemi uygulayarak belli bir mRNA ile ilişkili RBP repertuarında değişikliklerin doğru önlemleri verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz hızlı protokol kurma ve gerekli plazmitleri sağlayarak onların yararlı tavsiyeler Prof. Jeff Gerst ve Boris Slobodin teşekkür ederiz. Biz de LC-MS / MS analizi ile ona yardım için Smoler Proteomiks Merkezi'nden bu protokolü Dr. Tamar Ziv kurulması ona yardım için Dr. Avigail Atir-Lande teşekkür ederim. Biz YEF3 antikor Prof. TG Kinzy (Rutgers) teşekkür ederim. Bu çalışma Binational Bilim Vakfı hibe 2011013 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
