Introduction
Biologische Forschung erfordert oft effizienter Phänotypisierung, die häufig mit irgendeiner Art von histologischen Analyse 1-3 zugeordnet ist. Dieser Bedarf wird noch deutlicher , mit den ehrgeizigen Projekten jedes Gen im Mausgenom 4 zu stören. Diese histologischen Analysen können von der Beurteilung der Zellmorphologie und / oder anatomischen Merkmale zu Abbildungs Expression spezifischer Gene oder Proteine auf einzelne Zellen liegen. In der Tat ist einer der grundlegenden Beiträge der Histologie auf das Gebiet der Genomik ist die Fähigkeit, ein spezifisches molekulares Signal auf einen bestimmten Bereich oder Zelltyp zu assoziieren.
Traditionelle Methoden der Histologie, vor allem für Muskel-Skelett-Gewebe, sind oft zeitaufwendig und mühsam und erfordert manchmal Wochen zu beheben, entkalken, Abschnitt, Fleck, und Bild die Probe dann analysieren die Bilder über die menschliche Interpretation. Analysieren von mehreren molekularen Signale, ob über Immunhistochemie, in situ hybridizatIon oder spezielle Flecken, erfordert mehrere Abschnitte und sogar mehrere Proben in geeigneter Weise durchzuführen. Darüber hinaus können diese mehreren Reaktionen auf dieselbe Zelle nicht zusammen lokalisiert und manchmal nicht auf einen bestimmten Bereich innerhalb einer gegebenen Probe co-lokalisiert werden kann. Wie die Genomik und epigenomics Feld in das digitale Zeitalter bewegt, muss die histologische Feld auch nachziehen effizient mit hohem Durchsatz und automatisierte Analyse einer Vielzahl von molekularen Signalen innerhalb eines einzigen histologischen Schnitt zu liefern.
Tatsächlich gibt es eine Nachfrage nach verbesserten histologische Techniken, die mehrfache molekulare Signale zu spezifischen Zellen innerhalb eines gegebenen Probe zuordnen können. Vor kurzem haben wir einen neuen Hochdurchsatz - cryohistological Methode zur Beurteilung mehrerer Reaktionsmaßnahmen in einem bestimmten Abschnitt von mineralisiertem Gewebe 14.05 veröffentlicht. Das Verfahren beinhaltet die Kryoschnitt mit gefrorenen cryotape Stabilisierung der verschweißte Abschnitt anhaftenden starr an einem Mikroskop-Objektträger, undDurchführung von mehreren Runden der Färbung und Bildgebung auf jedem Abschnitt. Diese Runden der Bilder werden dann manuell oder über Computerautomatisierung vor der Bildanalyse (Figur 1) ausgerichtet ist . Hier stellen wir ausführliche Protokolle dieses Verfahrens und Beispiele geben, wo diese Techniken unser Verständnis von verschiedenen biologischen Prozessen verbessert.
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Protocol
Die University of Connecticut Health Center institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt alle Tierverfahren.
1. Fixation and Embedding
- Euthanize das Tier über CO 2 Ersticken oder einem anderen zugelassenen Verfahren.
- Ernten Sie das Gewebe von Interesse (zB, des Körpers, Wirbel, etc.) und in 10% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C bis richtig befestigt. Besondere Vorsicht konsistente anatomische Platzierung zu halten vor der Fixierung. Zum Beispiel fixieren Gliedmaßen mit Gelenken bei gleichbleibender Flexion, Innenrotation und Außenrotation Winkel 11. Typischerweise fixieren ganze Maus Gliedmaßen für 1 - 3 Tage.
Achtung: Formalin ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen.
Hinweis: Der Zeitrahmen der Fixierung auf die Größe der Probe abhängt. Wenn das Experiment ermöglicht es, den Knochen Aufschneiden wird die Fixierung des Markraums zu verbessern.Einige Proben können 15 Perfusionsfixierung erfordern fluoreszierenden Hintergrund (zB schwache Fluoreszenzsignale innerhalb des Knochenmarks) zu minimieren. - Transfer Proben aus Formalin und 30% Sucrose in 1x PBS hergestellt und für 12 inkubieren - 24 h bei 4 ° C.
Hinweis: Sobald inkubiert 12-24 h Proben können dann für die Langzeitlagerung bei -80 ° C platziert werden. Diese Art der Lagerung ist für Experimente empfohlen , bei denen Forscher mehrere Proben in dem gleichen Block , aber nicht ernten all dieser Proben in der gleichen Zeit (beispielsweise Versuche mit mehreren Zeitpunkten) einzubetten beabsichtigen. - Entfernen Proben aus der Saccharose und sezieren, um überschüssiges Gewebe entfernt.
- Füllen Sie eine cryomold (Größe der Form ist abhängig von Probengröße) einen Teil des Weges mit Kryo Medium eingebettet wird. Legen Probe in Form, so dass die Schnittebene für die Region von Interesse ist parallel mit dem Boden der Form.
Hinweis: Ein Beispiel für spezifische Gewebe Anordnung und AusrichtungB - kann in 2A zu finden. - Legen Sie die cryomold auf ein Stück Trockeneis, bis eine dünne Schicht aus Kryo Medium gefriert Einbettung und anschließend fixiert die Probe an Ort und Stelle. Füllen Sie das restliche Volumen des cryomold mit Kryo Einbettungsmittel, während die cryomold auf dem Trockeneis-Pellet erhalten.
- Platzieren Sie die cryomold in einem Container mit 2-methyl-butan vorgekühltem von Trockeneis. Sobald Proben vollständig gefroren sind, cryomolds entfernen und überschüssiges 2-Methyl-Butan abzuschütteln. Wickeln Sie cryomolds in Zellophan und in einem -20 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
Hinweis: Proben im Laufe der Zeit austrocknen können, wenn in cryo Einbettmedium, insbesondere bei -20 ° C gelagert. Wir empfehlen die Lagerung von Proben für mehr als 1 - 2 Monate in cryo Einbettungsmedium bei -80 ° C oder in 30% Saccharose bei -80 ° C (siehe Schritt 1.3).
2. Band-stabilisiertes Gewebe Sectioning
- Entfernen Probenblöcke aus dem Gefrierschrank und legen in cryostat, wobei die Temperatur zwischen -20 und -25 ° C eingestellt.
- Überschuss Kryo Einbettmedium mit einer Rasierklinge Entfernen Sie den Block von der cryomold und wegschneiden.
- Legen Sie einige Kryo Einbettmediums auf die Probe Scheibe und dann richten Sie den Block, so dass die Oberfläche der Objektplatte ist parallel zur Bodenfläche des Blocks, wodurch die richtige Schnittebene für die Region von Interesse zu etablieren.
- Legen Sie die Objektplatte in den Kryostaten und ermöglichen die Kryo Einbettmediums einzufrieren.
- Platzieren Sie den Probenteller auf den Objektkopf und stellen Sie den Kopf, so dass die Klinge schneidet auf der Oberfläche des Probenblocks parallel.
- Schneiden Sie den Block nach unten auf ein Niveau im Bereich von Interesse und abbürsten alle Späne von der Oberfläche des Blocks.
- Schneiden Sie ein Stück des cryotape groß genug, um die Region von Interesse und Pre-Chill in den Kryostaten zu decken.
Hinweis: Mehrere Stücke können konsistente Größen und gespeichert innerhalb des cryost geschnitten werdenbei während des Schneidens. - Nicht ausreichend tragfähige Unterlage aus dem cryotape durch das Band Greifen durch den nicht-klebrigen Silber / Gold-Laschen nach unten Zange dann legen Sie das Band auf den Block klebrig-Seite verwenden.
- Drücken Sie auf die cryotape mit der Rolle (2C).
- Machen Sie einen Abschnitt (5 bis 8 & mgr; m) entweder die automatische Motor oder manuelle Schneidrad des Kryostaten verwendet wird.
Hinweis: Es empfiehlt sich , den Rand des cryotape zu halten , wie es auf die Bühne kommt , so dass der Abschnitt nicht aus während des Schneidens (2D) der Bühne fällt. - Platzieren Sie den Abschnitt Gewebeseite nach oben auf einem Kunststoff - Objektträger innerhalb des Kryostaten.
- Die Kunststofffolie aus dem Kryostaten und erlauben dem Kryo Einbettungsmedium, wie zu schmelzen, daß der Abschnitt an der Oberfläche des Schiebers haftet.
- Wiederholen Sie dies für Serienschnitte oder andere Bereiche von Interesse sectioning.
- Sobald Sie fertig sind, speichern Sie die Abschnitte in einer Dia-Box eint 4, -20 oder -80 ° C, abhängig von der Länge der Lagerung erforderlich, und die nachgeschaltete Reaktionsmaßnahmen. innerhalb von einem Monat bei 4 ° C gelagert - Zum Beispiel verwenden Folien, die für die enzymatische Aktivität gefärbt werden werden (5.3 5.2).
3. Die Haftung der Abschnitte auf Objektträger
- UV-härtbare Klebstoff-Methode.
- Beschriften Sie die Mikroskop-Objektträger.
Hinweis: Für eine verstärkte Automatisierung, Muster und Dias können mit Barcodes versehen werden. - Einen Tropfen von UV-aktivierten optischen Klebstoff auf zwei Glasträgern und verwenden den Rand einer Kunststoffschieber eine dünne Klebstoffschicht über die Oberfläche der Glasobjektträger zu verteilen.
- Schneiden Sie die Silber / Gold-Registerkarte aus und legen Sie die verschweißte Abschnitt Gewebeseite auf dem Klebstoff der ersten Folie nach oben. Anwenden den Abschnitt in einer Rollbewegung von einer Kante zur anderen, um die Bildung von eingeschlossenen Blasen unterhalb des Bandes zu minimieren.
HINWEIS: Die erste Folie verwendet, um die Unterseite von t vorbefeuchtendener Band vor ihm auf dem zweiten (permanent) Schieber (Schritt 3.1.4) zu platzieren. - Entfernen Sie den verklebten Abschnitt von der ersten Folie und legen Sie es auf der Klebeschicht des zweiten Schlittens (3A). Auch hier ist darauf zu achten Einschluss von Blasen zu vermeiden.
HINWEIS: Dieser Schritt Übung den Meister nimmt. - Sobald die entsprechende Anzahl von Abschnitten für die gegebene Experiment auf jedem Objektträger platziert wird, wischen den überschüssigen Klebstoff von der Umgebung ab.
- Überprüfen Sie jeden Abschnitt eng für Blasen oder Fasern unter dem Band. Führen Sie diese Inspektion unter dem Mikroskop oder Lupe. Wenn es Hindernisse sind, entfernen Sie die einzelnen Kapitel, die Hindernisse zu entfernen, und dann an den Glasobjektträger erneut anwenden.
- Sobald festgestellt wird, dass es keine Hindernisse unter den verklebten Abschnitte sind, legen Sie die Objektträger unter der UV-Schwarzlicht 5 - 10 min den Klebstoff zu vernetzen.
- Beschriften Sie die Mikroskop-Objektträger.
- Chitosan Klebeverfahren.
- bereiten Sie the 1% Chitosan Klebstoff. Bereiten Essigsäurelösung durch Lösen von 0,25 ml konzentrierter Essigsäure in 100 ml DI Wasser (0,25% v / v). Man löst 1 g Chitosanpulver in 100 ml Essigsäure-Lösung und rühre die Lösung O / N oder bis das gesamte Chitosanpulver gelöst.
HINWEIS: Die Lösung wird bei RT stabil. - Abzuscheiden einen Tropfen Chitosanlösung für jeden Abschnitt, der auf dem Objektträger platziert wird.
- Schneiden Sie die Silber / Gold - Reiter des Bandes ab und legen jedes Seitenteil Gewebe abgeklebt auf den Klebstoff (3A). Verwenden Sie große Sorgfalt Einschluss von Blasen zu vermeiden.
- Sobald alle Abschnitte auf der Folie platziert werden, kippen Sie die Folie nach oben auf einer seiner langen Kanten und übermäßige Chitosan an den unteren Rand ziehen Pinzette.
- Die Objektträger in dieser Ausrichtung auf einem Papiertuch in einer Dia-Box. Gravity wird dann bewirken, dass das überschüssige Chitosan nach unten auf das Handtuch fallen, eine flache und gleichmäßige Schicht aus Chitosan ergibt.
- Place den Schieber Box mit Deckel aufgestützt geöffnet im Kühlschrank O / N das Chitosan trocknen zu lassen.
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für einen Vergleich zwischen den beiden Klebeverfahren.
- bereiten Sie the 1% Chitosan Klebstoff. Bereiten Essigsäurelösung durch Lösen von 0,25 ml konzentrierter Essigsäure in 100 ml DI Wasser (0,25% v / v). Man löst 1 g Chitosanpulver in 100 ml Essigsäure-Lösung und rühre die Lösung O / N oder bis das gesamte Chitosanpulver gelöst.
4. Anwendung der Referenzmarken auf Folien
- Bereiten Referenzmarker Lösung von 50 ul grün gelöst und 50 ul roten Mikrokügelchen in 100 ul Wasser. Die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
- Legen Sie eine 10 ul oder 20 ul Pipettenspitze in die Mikrokügelchen Lösung. Fügen Sie einen kleinen Tropfen der Mikrokugel - Lösung zu jeder Abschnitt angrenzend an die Region von Interesse (3C). Achten Sie darauf, nicht die Mikrokugeln innerhalb der Region von Interesse zu bekommen.
- Trocknen Sie die Objektträger bei RT (lichtgeschützt) für 30 Minuten, wenn die Verarbeitung der Folien an diesem Tag. Wenn nicht, legen Sie die Folien in einer Dia-Box bei 4 ° C.
Hinweis: Solange die Mikrokügelchen-Lösung vor trocknet die Folien feuchtigkeitsspendend, die miSphären bleiben auf den Folien, die während mehrerer Runden der Färbung / Imaging geklebt.
5. Mehrere Runden von Anfärben
HINWEIS: Viele biologische Signale auf dem gleichen Gewebeabschnitt durch eine kompatible Sequenz von Abbildungs, Färbung und Wiederabbildungs Schritte der Auswahl ist es möglich, zu erkennen und zu co-lokalisieren. Jede Runde der Bildgebung / Färbung / Re-Imaging hat für die jeweilige histologische Frage entwickelt werden. Die Abbildungs / Färbungs / Wiederabbildungssequenz beinhaltet typischerweise die endogenen Fluoreszenzsignale Erfassen (zB zellulare GFP, Mineralisation Farbstoffe, in vivo Bildgebungssonden) auf der ersten Runde der Bildgebung durch Fluoreszenz gemultiplexten Immunofärbung und mehrere Runden von enzymatischer Aktivität Flecken gefolgt. Schließlich kann der Abschnitt mit chromogenen Farbstoffen gefärbt werden (zB H & E, Toluidinblau, Safranin O, etc.) , um die Gewebearchitektur hervorzuheben. Präsentiert in diesem Abschnitt sind benutzerdefinierte Methoden angepasst vonkommerziell verfügbaren Protokolle.
- Calcein - Blau - Färbung für akkumulierte Mineral
HINWEIS: Calcein-Blau-Färbung ergibt eine konsistente Mineraloberfläche, die automatisierte Bildanalyse im Gegensatz zu Dunkelfeld- oder differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Bildgebung zugänglich ist. Das Problem mit Calcein - Blau - Färbung ist , dass das Fluoreszenzspektrum überlappt mit Tetracyclin und Demeclozyklin Kennzeichnung. Deshalb, wenn die Probe auf diese Mineral Etiketten enthält, Bild die Etiketten in der ersten Runde der Bildgebung vor mit Calcein blau Färbung.- Wenn die endogene Signale innerhalb des Gewebes vor diesem Färbeschritt abgebildet werden, tauchen die Folien von der vorherigen Bildgebung Runde in einem Coplin Glas mit 1xPBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
- Herstellung von 30 mg / ml Calcein - Blau - Lösung in 2% NaHCO 3 (hergestellt durch Auflösen von 2 g NaHCO 3 in 100 ml H 2 O und justierening auf pH-Wert von 7,4 mit HCl). Aliquot und speichern die Lösung bei -20 ° C.
- Tauchen Sie die Folien in einer Coplin Gefäß mit 1x PBS für 15 Minuten in den Abschnitten zu Hydrat, wenn nicht bereits aus der vorherigen Runde mit Feuchtigkeit versorgt.
- Entfernen Sie die Folien und trocknen Sie die Rückseite und die Kanten mit einem Papiertuch.
- Bewerben 100-500 ul von Calcein-Blau-Lösung pro Folie und Inkubation für 10 min in einer feuchten Kammer bei RT.
- Spülen Sie die Folien in 1x PBS für 10 Minuten mit 3 Änderungen.
- Bewerben ~ 200 ul 50% Glycerin in 1x PBS zu jeder Folie und montieren Sie die Deckglas.
- Entfernen Sie das überschüssige Glycerin und trocknen Sie die Unterseite der Folien.
- Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) enzymatische Aktivität Färbung
HINWEIS: TRAP wird von mehreren Zelltypen in der hämatopoetischen Abstammungslinie einschließlich Osteoklasten exprimiert wird. Die TRAP - Färbung hier vorgestellten verwendet ein gelb fluoreszierendes saure Phosphatase Substrat. Bestimmte Fluoreszenzsignale werden ovERLAP mit dem benutzerdefinierten Gelbfilter-Set Tetracyclin / Demeclozyklin Mineralisierung Etiketten einschließlich, Calcein Bläue und DAPI Gegenfärbung.- Versenken Folien aus der vorhergehenden Bildgebungs Runde in einem Coplin Glas mit 1x PBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
- Bereiten Puffer 1 durch Lösen von 9,2 g Natriumacetat wasserfrei und 11,4 g Natriumtartrat zweibasigen Dihydrat in Wasser und bringt das Endvolumen auf 1000 ml. Einstellung des pH auf 4,2 mit konzentriertem Eisessig (~ 1,5-2 ml). Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 12 Monate.
- Bereiten Buffer 2 um 40 mg Natriumnitrit in Wasser gelöst und das Endvolumen auf 1 ml zu bringen. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
- Am Tag der Färbung, bereiten die Puffer Reaktion durch 7,5 ml Puffer 1 und 150 & mgr; l Puffer 2 vermischt wird.
- Übernehmen der Reaktionspuffer ohne das Substrat zu der Folies für 10 bis 15 min in das Gewebe an der unteren pH äquilibrieren.
HINWEIS: Das typische Volumen von ~ 200 & mgr; l, aber muss groß genug sein, um alle Bereiche abzudecken. - Verdünne die gelb fluoreszierendes saure Phosphatase Substrat zwischen 1:50 und 1: 100 in Reaktionspuffer.
HINWEIS: Die Verdünnung wird durch TRAP-Aktivität in der Probe bestimmt werden. - Gießen Sie die Reaktionspuffer aus der Dias und Anwendung der Reaktionspuffer mit dem gelben Fluoreszenzsubstrat auf den Folien.
- Legen Sie die Folien unter der UV-Schwarzlicht für ~ 5 min das Substrat zu aktivieren.
Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach TRAP-Aktivität in der Probe variieren. - Spülen Sie die Folien in 1x PBS für 10 Minuten mit 3 Änderungen.
- Bewerben ~ 200 ul 50% Glycerin in 1x PBS zu jeder Folie und montieren Sie die Deckglas.
- Entfernen Sie das überschüssige Glycerin und trocknen Sie die Unterseite der Folien.
HINWEIS: Die saure TRAP Puffer, um die Abschnitte entkalken wird. Der zusätzliche Vorteil der decalcification ist , dass bestimmte Farben für Downstream - Färbung (zB Mineralisierung Etiketten) wieder zur Verfügung stehen wird. Zum Beispiel wird die Calcein-Blau-Färbung während der TRAP-Färbung entfernt werden. Daher kann DAPI counterstain während einer anschließenden Runde in diesem Kanal abgebildet werden.
- Alkalische Phosphatase (AP) enzymatische Aktivitätsfärbung
HINWEIS: Mehrere Zelltypen beteiligt mit Mineralisierung Osteoblasten und mineralisiert Chondrozyten exprimieren AP einschließlich. Die Fast Red Substrat in diesem Protokoll verwendet löst eine sowohl leuchtrot und chromogenen rotes Signal. Aus diesem Grund wird das chromogene Substrat Fluoreszenzsignale in den Bereichen, in denen das Substrat abzuschrecken ausfällt. Daher ist es am besten, diese Flecken zu tun, nachdem die Fluoreszenzsignale Abbilden, die von dem AP-Substrat gequencht werden kann.- Versenken Folien aus der vorhergehenden Bildgebungs Runde in einem Coplin Glas mit 1x PBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Remove und die Deckgläser trocknen.
- Vorbereitung 1 M Tris durch Lösen von 12,1 g Tris in 100 ml Wasser. PH-Wert auf 9,5 mit 1 M NaOH.
- Vorbereitung 1 M MgCl 2 Hexahydrat von 20,33 g MgCl 2 in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst.
- Bereiten 2 M NaCl durch Auflösen von 11,68 g NaCl in 100 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
- Bereiten 100x (20 mg / ml) Stammlösung von Fast Red TR-Salz durch Auflösen von 1 g Pulver in 50 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Machen Sie 100 ul Aliquots und bei -20 ° C.
- Bereiten 100x (10 mg / ml) Naphthol AS-MX Phosphat-Stammlösung durch Lösen von 500 mg Pulver in 50 ml N, N Dimethylformamid. Machen Sie 100 ul Aliquots und bei -20 ° C.
- Am Tag der Färbung, bereiten den Puffer AP durch Zugabe von 1 ml 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl 2, 0,5 ml 2 M NaCl und das Endvolumen auf 10 ml zu bringen deionisiertem Wasser (Endkonzentrationen verwendet: 100 mM Tris, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl).
- Platzieren Sie AP bUffer auf jedem Objektträger und für 10 min bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert.
- Bereiten Sie AP-Substratpuffer von 100x Aktien von Fast Red TR Salz und Naphthol AS-MX Verdünnung in der AP-Puffer auf 1x.
- Gießen AP Puffer aus Folien und ersetzen mit AP-Substratpuffer. Inkubiere Objektträger 5 - 10 min in einer Feuchtekammer bei RT.
Hinweis: Die Inkubationszeit wird durch AP-Aktivität der Probe bestimmt werden. - Wash gleitet 3x in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
- Berg Deckgläser mit DAPI Gegenfärbelösung (1: 1000 Verdünnung von DAPI in 50% Glycerin in 1x PBS).
- Toluidinblau O (TB) chromogene Färbung
Hinweis: Da alle bisherigen Schritte im Rahmen eines temporären wässrigen Montage in 50% Glycerin / PBS-Lösung abgebildet werden, wird der chromogene Schritt auch unter wässrigen Bedingungen abgebildet. Jedoch kann die Färbelösung auszulaugen im Laufe der Zeit neigen. Daher ist es das Toluidinblau dem Bild so schnell wie möglich nach dem Färben vorgeschlagen.- Versenken Dias aus früheren Bildgebungs Runde in einem Coplin - Gefäß mit entsalztem Wasser gefüllt , bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
- Nachdem Sie die Deckgläser zu entfernen, ersetzen Sie mit frischem Wasser und brüten die Folien für mindestens 10 min, so dass Salze von PBS ausreichend aus dem Gewebe entfernt werden.
- Bereiten 0,025% TB Lösung in VE-Wasser.
- Legen Sie die Folien in der TB-Lösung für 1 - 5 min.
Hinweis: Die Inkubationszeit nach Benutzereinstellung abhängig ist, sondern sollte in allen Proben konsistent gehalten werden. - Die Objektträger in Glasküvette mit entsalztem Wasser und Wasch Dias 3x für jeweils 5 Minuten.
- Mount Abdecküberzug mit 30% Glycerin in deionisiertem Wasser gelöst (NOT PBS 1x , da dies der Fleck aus dem Gewebe auszulaugen verursachen). HINWEIS: Glycerol Eindeckmediums kann mit Fruktose-Sirup ersetzt werden, die die Diffusion des Farbstoffs aus dem Gewebe zu verhindern hilft. NachHerstellung der Fruktosesirup, lösen sich 30 g Fructose in 10 ml deionisiertem Wasser und Wärme auf 60 ° C bis gelöst.
6. Mehrere Runden von Imaging
- Legen Sie die Folien in das Mikroskop Tabletts (3D).
Hinweis: Die Tabletts sind federbelastet. - Setzen Sie die Fächer in das Fach ein Stapel des Einschub - Scanning - Mikroskop (Abbildung 3E).
- Klicken Sie auf die Profilliste ein Profil für jede Folie mit geeigneten Belichtungszeiten für jeden Fluorophor zu laden. Klicken Sie auf den Foliennamen jede Folie manuell zu benennen oder die Software haben den Barcode zu lesen auf der Folie Etikett versehen. Klicken Sie auf die Start-Vorschau-Scan-Taste ein Vorschaubild des Schlittens zu nehmen.
- Stellen Sie die Bereiche von Interesse im Gewebe Assistent zur Erkennung und speichern Sie sie für nachfolgende Runden Bildgebung. Sobald jeder Schlitten-Setup ist, starten Sie den Scanvorgang mit der Start-Scan-Taste klicken.
Hinweis: Das System kann halten bis zu 100 slides zu einer Zeit. - Sobald die Bildgebung beendet ist, exportieren Sie die Bilder von jedem einzelnen Kanal und Imaging-Runde als .tif oder .jpg-Dateien für Bildmontage und Analyse.
7. Bildmontage
- Manuelle Verfahren mit Photoshop (oder einem ähnlichen Bildbearbeitungssoftware, die geschichteten Bilder zu erzeugen).
- Öffnen Sie jeden einzelnen Kanal Bild von jeder Abbildungs Runde.
- Montieren Sie die einzelnen Bilder als Schichten innerhalb eines zusammengesetzten Bildes. Um dies zu tun, klicken Sie auf die Ebene in der Ebenenpalette von einem Bild. Ziehen Sie dann die Schicht auf ein anderes Bild. Diese Drag-and-Drop-Operation wird eine neue Ebene im Bild erstellen. Tun Sie dies für alle anderen Bilder. Alternativ können Sie ein Skript (Datei> Skripten> Laden von Dateien in Stapel ...) diesen Prozess zu automatisieren, indem Sie mehrere Bilddateien als Schichten in einem Bildstapel zu laden.
- Sobald jedes Bild als einzelne Schicht in dem zusammengesetzten Bild, klicken Sie doppelt auf den Layernamen den la umbenennen aufgeführt wirdyers wie erforderlich, um die verschiedenen Kanäle zu erkennen.
- Um durch jede Schicht zu sehen und eine wirklich zusammengesetztes Bild zu erstellen, den Mischmodus für jede Schicht von "Normal" auf "Screen" in der Ebenenpalette ändern.
Hinweis: Um diesen Schritt zu beschleunigen, eine einzelne Schicht ändern zu screenen, dann mit der rechten Maustaste auf die Ebene, wählen Sie "Ebenenstil kopieren", dann alle anderen Ebenen markieren, und wählen Sie "Ebenenstil einfügen", um den Bildschirm Stil für die andere gelten Lagen. - Falls gewünscht, kann eine Verringerung der Opazität (Änderungswert um 10 - 40%) der chromogenen Schicht (dh Toluidinblau) , um besser die Fluoreszenzsignale durch die chromogene Schicht zu visualisieren.
Hinweis: Das geflieste Rastermikroskop in diesem Protokoll hält die Folien 3 Kanten verwendet, wodurch das Ausmaß der Drehung zu minimieren, die auf dem Objektträger während jeder Runde der Abbildungs auftreten können. Daher ist es viel einfacher für den Benutzer manuell die Bilder auszurichten, ohne Bilder zu drehen, die abgeleitet sindaus verschiedenen Runden der Bildgebung.
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Representative Results
Ein Allgemeiner Workflow für die Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology
Abbildung 1 stellt die allgemeine Arbeitsablauf für diese Technik verwendet. Es umfasst mehrere Schritte, von der Fixierung durch mehrere Runden von Bildgebung und schließlich Ausrichtung / Bildanalyse. Der Prozess kann so wenig nehmen, wie in der Woche von Probe Fixierung durch 4 Runden der Bildgebung zu gehen, die weniger Zeit, als es diese Art von Proben zu entkalken nimmt. Die Reihenfolge der Bildgebung beginnt typischerweise mit den endogenen Signalen , die bereits in der Probe sind (zB GFPs, Mineralisation Etiketten, etc.), dann gemultiplext Fluoreszenzimmunfärbung gefolgt von fluoreszierenden Enzymaktivitätsassays (z. B. TRAP, AP, etc.) und Zellzyklus - Analyse - Assays (zB EDU) und schließlich mit einem chromogenen Fleck beendet (zB Toluidinblau O, hematoxylin, Safranin O, etc.).
Repräsentative Beispiel von einem Juvenile Knöchelgelenk 6
Der Zweck dieser speziellen Studie war es, die Korrelation zwischen der Expression von verschiedenen Typen von Kollagen (dh, COL1A1, COL2A1 und Col10a1) mit Mineralisation des fibrocartilage der Achillessehne-Knochen - Insertionsstelle (dh enthesis) zu demonstrieren. Daher ist ein dreifach transgene Maus fluoreszierenden Reporter einschließlich COL1A1-GFPTpz, COL2A1-CFP und Col10a1-mCherry wurde verwendet , um Zellen zu identifizieren jedes Transgen exprimieren. Die erste Runde der Abbildungs war der endogene Transgen - Expression von zwei Wochen alten Maus, die dem entspricht , wenn die enthesis mineralizes in der Achillessehne (4B). Die zweite Runde der Bildgebung wurde dann auf der LeitungMultimikroskopbilder der Kollagen Architektur über zwei Photonen Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG, 4C) zu erwerben. Dieser Schritt wurde verwendet, um Zellen an der Basis der Kollagenfasern innerhalb der enthesis zu identifizieren. Die dritte Runde der Bildgebung war ein immunostaining Schritt für Indian hedgehog (IHH), die eine der wichtigsten Signalisierungsliganden, die Mineralisierung des enthesis (4D) fördert. Die vierte Runde der Bildgebung war AP - Färbung eine blaue alkalische Phosphatase - Substrat - Kit, das sowohl Cy5 - Fluoreszenz und blauen chromogenen Signale entlockt, zu visualisieren Bereichen aktive Mineralabscheidung (4E). Schließlich war die fünfte Runde der Bildgebung TB - Färbung die anatomischen Merkmale einschließlich des Proteoglykangehalt im fibrocartilage (4F) zu visualisieren. Alle Bilder wurden von Hand in einer Bildbearbeitungssoftware ausgerichtet sind. Die fünf Runden der Bildgebung wurden über einen 4-Tage-Zeitraum durchgeführt, die 3 gefolgtTage der Probenverarbeitung und Schneiden (7 Tage insgesamt).
Repräsentative Beispiel von einem Erwachsenen Kniegelenk 11
Der Zweck dieses Experiments war es, die Mineralisierung Veränderungen zu bestimmen, die in der enthesis des medialen Seitenbandes (MCL) des Knie folgende gemeinsame Destabilisierung durch Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) auftreten. Mineralisierungs Änderungen können in der MCL enthesis bereits zwei Wochen nach der Operation in dieser 3 Monate alten Mäusen beobachtet werden. Um Mineral Apposition von fibrocartilage im enthesis, ein Mineral-Label gegeben wurde den Mäusen am Tag der Operation (Demeclozyklin) und dem Tag vor der Tötung (Calcein) in 2 Wochen nach der Operation zu überwachen. Die Mäuse enthalten auch COL1A1-CFP und Col10a1-mCherry fluoreszierenden Reporter Kollagen Expression von unmineralized und mineralisierten fibrochondrocyt zu überwachenes sind. Die erste Runde der Abbildungs war der endogene Signale, die in diesem Fall entsprach den fluoreszierenden Proteinen und fluoreszierende Mineralisation Etiketten (5A). Die zweite Runde enthalten TRAP - Färbung Expression dieses Enzyms zu zeigen , in Mineralisierungs Fibrochondrozyten im enthesis sowie Osteoklasten in dem darunter liegenden Knochenmark (5B). Die dritte Runde war AP Regionen der aktiven Mineralisierung von Fibrochondrozyten sowie Osteoblasten des darunter liegenden Knochens (5C) zu demonstrieren Färbung. Schließlich wurde TB - Färbung für die vierte Runde (5D) durchgeführt. Alle Bilder wurden von Hand in einer Bildbearbeitungssoftware ausgerichtet sind. Wieder einmal ist die Gesamtzeit von Gewebe Ernte Bildausrichtung genommen betrug 7 Tage.
Repräsentatives Beispiel für trabekulären Knochen von Distal Femur
(3B) angelegt. Dieser Prozess wurde am 8. weiblichen durchgeführt und 8 männliche Mäuse auf 3 verschiedenen Ebenen innerhalb des Knochenmarks, eine Gesamtzahl von 12 Folien ergibt. Die Referenzmarken (Mikrokügelchen) wurden innerhalb der Epiphyse und der Mitte der Diaphyse auf den trockenen Abschnitten (Abbildung 3C) angelegt. Alle 12 Folien wurden gefärbt for Calcein blau und für akkumulierte Mineral (Calcein blau) und Mineralisierung Etiketten (Calcein und Alizarin Complexon) während der ersten Runde der Bildgebung (6A) abgebildet. Die Objektträger wurden dann für TRAP - Aktivität (6B) in der zweiten Runde und AP - Aktivität (Figur 6C) in der dritten Runde der Abbildungs abgebildet. Schließlich wurden die Objektträger mit Toluidinblau in der vierten Runde (6D) gefärbt. Die Referenzmarken wurden bei jeder Abbildungs Runde abgebildet, einschließlich der chromogenen Runde und wurden unter Verwendung der kundenspezifischen Software ausgerichtet sind. Um eine Vorstellung von dem Durchsatz für dieses Verfahren, 32 Knochen (16 Oberschenkel- und 16 Wirbel) bieten wurden in 8 Blöcke eingebettet, 3 Abschnitte von jedem Block genommen wurden, wurden die Abschnitte über 12 Folien verteilt sind, und die 12 Dias wurden 4-mal abgebildet Herstellung von 96 Verbundbildstapeln. Die Gesamtzeit dieses Experiment durchzuführen, war 8 Tage.
Abbildung 1. Typische Arbeitsablauf für das Protokoll. Allgemeine Schritte umfassen 1) Gewebefixierung, 2) band stabilisiert Kryoschneiden, 3) die Einhaltung von abgeklebt Schnitte an den Glasobjektträger, 4) Anwendung von Referenzmarken, 5) mehrere Runden der Färbung und 6) Bildgebung und 7) Bildmontage, Ausrichtung und Analyse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Hochdurchsatz - Embedding und Band-stabilisiertes Kryoschneiden. Aufgrund der Stabilität der cryotape bietet, können mehrere Knochen benachbart zueinander eingebettet werden (AB) und gleichzeitig (CD) geschnitten. Ein Stück Trockeneis wird während der verwendetEinbettungsprozess zu starr , die Knochen an Ort und Stelle zu beheben , bevor die gesamte Kryo-Block (B) zum Einfrieren. Der cryotape auf den Block (C) aufgerollt wird und der Abschnitt bleibt während des Schneidens (D) auf das Band geklebt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Einhaltung von gegurtet Schnitte an den Glasobjektträger, Anwendung von Referenzmarken und Laden von Folien in Fach von Slide-Scanning - Mikroskop. Versiegelte Abschnitte sind an der Oberfläche der Glasobjektträger geklebt entweder mit UV-Härtung oder Chitosan-basierten Klebstoff (A ). Nach dem Aushärten oder Trocknen, nur eine dünne, flache Klebstoffschicht bleibt zwischen dem cryotape und Glasoberfläche (B). Referenz markers werden auf trockenen Objektträger aufgebracht (C, Pfeil von Mikrokügelchen Lösung fallen zu lassen). Die Objektträger werden dann montiert in Mikroskop Tabletts (D) und geladen in das Mikroskop (E). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Fünf Runden von Imaging der Achillessehne aus einem Zwei-Wochen alten Maus. Das zusammengesetzte Bild Stapel (A) wurde von fünf Runden der Bildgebung geschaffen. Runde 1 (B): endogene COL1A1-GFPTpz, COL2A1-CFP und Col10a1-mCherry Transgen - Expression. Runde 2 (C): Kollagen Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) auf der Zwei - Photonen - Mikroskop. Runde 3 (D): immunostaining für IHH. Runde 4(E): AP enzymatische Aktivität. Runde 5: Toluidinblau O (F). Diese Zahl wurde von Dyment et al modifiziert. 2015 6. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Vier Runden von Imaging von MCL enthesis Joint Destabilisierung Nach. Knees wurden in drei Monate alten Mäusen destabilisiert, was zu erhöhten Mineralisierung des MCL enthesis führt. Ein Demeclozyklin Mineral Label wurde der Tag der Operation und ein Calcein Mineral Etikett am Tag vor Opfer gegeben wurde. Runde 1 (A): endogene COL1A1-CFP, Col10a1-mCherry Transgen - Expression mit Demeclozyklin und Calcein Mineral Etiketten. Runde 2 (B) </ Strong>: TRAP enzymatische Aktivität. Runde 3 (C): AP enzymatische Aktivität. Runde 4 (D): Toluidinblau O. Die TRAP und AP - Signal wurde auf dem TB - Signal in Platten BC überlagert. Der gelbe Kanal kann wieder für TRAP verwendet werden, da das TRAP-Puffer das Gewebe entkalkt, das Entfernen der Demeclozyklin Label. Diese Zahl wurde von Dyment et al modifiziert. 2015 11. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Dem: Demeclozyklin, TRAP: Tartrat-resistente saure Phosphatase, AP: alkalische Phosphatase, MCL: mediale Seitenband. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Vier Runden von Imaging innerhalb distalen Femurs mit einem Gehalt Microsphere Referenzmarker. Drei Monate alte mice wurden Calcein und Alizarin Complexon Etiketten Mineral gegeben Runde 1 (AA '). endogener Calcein und alizarain Complexon Etiketten zusätzlich Blaufärbung von angesammeltem Mineral Calcein Runde 2 (BB' . ): Aktivität TRAP enzymatische Runde 3 (CC '). :. AP enzymatische Aktivität Round 4 (DD '): Toluidinblau O. die grünen Mikrokügelchen wurden während jeder Runde abgebildet (A'-D', Pfeil bezeichnet die gleiche Mikrokügelchen in allen Bildern). Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Chitosan Klebstoff | UV-härtender Klebstoff | |
| Klebemechanismus | Verdunstung | UVDie Polymerisation |
| Aushärtungszeit | > 24 h | <20 min |
| Kann Abschnitte nach Klebstoff aushärtet entfernt werden? | ja | Nein |
| Ist Klebstoff auflösbar geheilt? | Ja, in sauren Lösungen mit niedrigem pH-Wert | Nein |
| Hat Klebstoff Wärme Antigen-Retrieval standhalten? | Nein | ja |
| Klebend ist auto-fluoreszierenden? | Nein | Minimal in UV-Bereich |
Tabelle 1. Vergleich zwischen Chitosan Klebstoff und UV-härtende Klebe
| Cryotape | Band-Transfer System | |
| Mögliche Abschnitt mineralisierten Knochen mit diesem System? | ja | Ja, aber Stücke von mineralisierten Knochenkann nicht vollständig auf die Folie übertragen |
| Mögliche Abschnitt mineralisierten Gelenke mit diesem System? | ja | ja |
| Mögliche Abschnitt Gehirn mit diesem System? | Ja, aber Gewebe kann nach mehreren Runden von Imaging-off des Bandes fallen | ja |
| Mögliche mehrere Proben eingebettet in demselben Block zu schneiden? | ja | ja |
| Mögliche mehrere Runden der Bildgebung auf demselben Abschnitt zu führen? | ja | ja |
Tabelle 2. Vergleich zwischen Cryotape System und Band-Transfersystem
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Discussion
Hier haben wir ein detailliertes cryohistology Protokoll vorgestellt zusammen lokalisieren und verschiedene biologische Maßnahmen quantifizieren durch Bilder von mehreren Runden der Färbung / Bildgebung auf einem einzigen Abschnitt auszurichten. Das Verfahren den cryotape umrissenen Verwendung ist besonders nützlich , da es die Morphologie schwierig Abschnitt Gewebe (zB mineralisiertem Knochen und Knorpel) beibehält. Zusätzlich wird das geschnittene Gewebe fest mit dem Glasträger, so dass für mehrere Runden der Färbung / Bildgebung des gleichen Abschnitts haftet; im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, bei denen Serienschnitte jeweils gefärbt mit einem anderen Protokoll werden. Mit Serienschnitten kann ein Problem darstellen, wenn Sie versuchen, etwas zur Zusammenarbeit lokalisieren Signale zwischen den Abschnitten, die kein Problem mit einzelnen Abschnitten ist, die mit mehreren Runden gefärbt und abgebildet wurden.
Das erste Band-stabilisiertes Gewebe sectioning Produkt auf dem Markt war ein Bandtransportsystem 16, 17. Es verwendet Kunststoffband beschichtetmit einem kalten Temperaturklebstoff, der auf der Oberfläche des Gewebes cryoblock angeordnet ist. Wenn der Kryostat Klinge schneidet unterhalb des Bandes wird der Abschnitt intakt und anhaftend an dem Band entfernt. Anschließend wird das Band Probenseite nach unten auf Objektträger gelegt, die mit UV-härtenden Kleber beschichtet sind, so dass das Gewebe fest mit dem Schlitten befestigt wird. Sobald das Band von dem Abschnitt entfernt pealed ist, kann der Objektträger entweder Fluoreszenz oder chromogene Histologie verarbeitet werden. Die Hintergrundfluoreszenz der Klebstoffe niedrig ist, und mehrere Runden der Färbung und Bild funktioniert gut mit den meisten Weichteile. Jedoch mit Mineralisierungs Abschnitten kann es Verlust von Mineralfragmente werden, wenn das Gewebe von dem Klebeband auf den Glasträger zu übertragen. Darüber hinaus ist es ein relativ teures System im Kryostaten (> $ 8.000) und Verbrauchskosten sind hoch (> $ 2 / Folie) zu installieren.
Ein weiteres Bandstabilisierungsstrategie, entwickelt von Dr. Tadafumi Kawamoto verwendet einKlebstoff Polyvinylidenchlorid Film beschichtet, um den Gewebeschnitt zu erfassen. In ihrem Protokoll wird ein frisch gefrorenes Gewebe auf das Band geschnitten und sofort in PFA oder Ethanol 18 fixiert. Anschließend wird das Band gebeizt und montiert dann auf einem Glasträger mit der Probenseite nach unten für die mikroskopische Untersuchung. Somit ist jedes Färbeprotokoll auf einem anderen verschweißte Abschnitt durchgeführt.
Wir haben modifiziert und zu dem Kawamoto Protokoll in einer Anzahl von Weisen einschließlich Fixierung der Probe in Formalin vor dem Einbetten. Dieser Schritt ist entscheidend, um das lösliche zytoplasmatische GFP transgener Tiere innerhalb der Grenzen der Zelle zu befestigen. Wir haben die cryotape für einen weiten Bereich von Gewebetypen 5-13 verwendet. Das Laborpersonal mit begrenzter histologischen Erfahrung kann mit diesem Verfahren qualitativ hochwertige Abschnitte erzeugen. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind die relativ niedrigen Kosten (keine spezielle Instrumentierung, <$ 1,00 pro Folie), kein Verlust an Mineralfragmente,und die Fähigkeit, mehrere Runden der Färbung und Abbildung auf dem gleichen Abschnitt auszuführen.
Weil Abbilden der gleichen Bereiche von einem Schieber mehrmals in Wiederholung für eine Vielzahl von Schiebern unangemessen wäre sogar eine motorisierte Stufe ein weiterer kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung eines Schiebers Rastermikroskop Konsistenz und den Durchsatz zu erhöhen. Das Mikroskop ist eine digitale Dia-Scanner, der sowohl unter Epifluoreszenz und Durchlicht arbeitet. Es ist mit einem 10-Position motorisiert Türmchen und sowohl B & W und Farbkameras ausgestattet. Die wahre Neuheit des Systems, in unseren Händen ist, dass bestimmte Bereiche von Interesse lassen sich schnell und einfach durch den Benutzer definiert oder automatisch durch die Imaging-Software erkannt. Diese Bereiche von Interesse können dann aus der ersten Runde der Abbildungs gespeichert werden und dann schnell in den nachfolgenden Runden nachgeladen. Daher werden die gleichen interessierenden Bereiche während jeder Runde der Abbildungs abgebildet. Basierend auf User-definierten Parameter in der Software, wird das Mikroskop Autofokus und geflieste Bilder scannen, die während der Erfassung innerhalb der Regionen von Interesse genäht werden.
Die Reihenfolge, mit der der Benutzer die mehrere Runden der Färbung führt, ist wichtig. Die allgemeine Reihenfolge ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Anzahl von Fluorophoren , die ausreichend über Fluoreszenzmikroskopie getrennt werden kann der primäre begrenzende Faktor für die Anzahl von Gegenmaßnahmen, die auf einem bestimmten Abschnitt erfasst werden kann. Jedoch können fluoreszierende Kanäle in bestimmten Fällen verwendet werden. Zum Beispiel Calcein blau und Demeclozyklin beide emittieren ein starkes Signal im gelben Kanal verwendet TRAP-Aktivität zu messen. Dieser Durchbluten wird vermieden, obwohl wegen der TRAP Puffer entkalkt den Abschnitt, wodurch die Mineral entfernen, bevor die TRAP-Aktivität auf die Abbildung. Darüber hinaus wird DAPI Gegenfärbung als auch in dem gelben Kanal auszusenden. Allerdings kann der Benutzer ersetzen DAPI mit einem anderen counterstain in the rot oder dunkelroten Bereich. Zusätzlich können Antikörper mit verschiedenen Antikörpern mit den gleichen Fluoreszenzkanäle gestrippt und erneut gefärbt werden. Daher ist dieses Verfahren sehr anpassungsfähig, um die Anzahl von Gegenmaßnahmen erhöhen, die auf einem bestimmten Abschnitt aufgezeichnet werden kann.
Es gibt bestimmte Einschränkungen mit der vorgestellten Protokoll. 1) Die cryotape haften nicht ausreichend, um bestimmte Gewebe. Zum Beispiel neigen Formalin-fixierten Hirnschnitten das Band nach mehreren Runden der Färbung zu fallen. Für Gewebe, wie dies kann das Bandtransportsystem besser geeignet sein , wenn das Gewebe auf die Glasoberfläche mittels UV-aktivierten Klebstoff (siehe Tabelle 2 für den Vergleich zwischen diesen beiden Methoden) haftet. 2) Das Chitosan Klebstoff, während transparente optische Eigenschaften zu verleihen, wird nicht überleben harten Verarbeitungsschritte, die hohen Temperaturen oder starken Säuren enthalten. Daher wird die UV-aktivierten Klebstoff besser geeignet für diese Anwendungen ist (Tabelle 1 f sieheoder Vergleich zwischen diesen beiden Klebstoffe).
Die cryohistological Protokolle hier präsentierten auch selbst zu einem höheren Durchsatz und Automatisierung verleihen. Zum Beispiel erlaubt die Bandstabilisierung durch die cryotape vorgesehen relativ unerfahrene Anwender mehrere Knochen oder Gelenken auf einmal im gleichen Satz zu senken, deutlich zu erhöhen den Durchsatz. eine automatisierte Scanner erheblich reduziert Techniker Zeit und Kosten im Zusammenhang mit Bildgebung, die in der Regel das geschwindigkeitsbestimmende Schritt in unserer Erfahrung gewesen ist. Die Möglichkeit, die gleiche Region von Interesse konsistent und zuverlässig Bild mehrmals in einer kurzen Zeit eine Plattform für die automatisierte, objektive Analyse von Geweben zur Verfügung stellt. In der Tat hat unsere Gruppe eine Plattform für Computer-automatisierte Ausrichtung und Histomorphometrie von Knochen entwickelt. Zuerst richtet die Software die mehrere Runden der Bilder auf der fluoreszierenden Referenzmarkierungen basieren. Dann werden die ausgerichteten Bilder zu einem Histomorphometrie Pipeline zugeführt, wo die Computer Software definiert die Region von Interesse und misst objektiv mehrere statische und dynamische Messungen (siehe mehr unter www.bonebase.org) 13. Diese Plattform wurde möglich aufgrund der erhöhten Durchsatz und Konsistenz durch den cryotape Sektionieren, digital slide-Rastermikroskop und benutzerdefinierte Analysesoftware zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll stellt einen bedeutenden Fortschritt in hohem Durchsatz cryohistology und sollte als unerfahrene mit Gewebe Schnitte schwer Abschnitt Geweben wie Knochen als auch für diejenigen Bildgebung von Nutzen sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
