Introduction
生物学的研究は、多くの場合、頻繁に組織学的分析1-3のいくつかの並べ替えに関連付けられている効率的な表現型を、必要とします。この必要性は、マウスゲノム4における各遺伝子を破壊し、さらに明らかに野心的なプロジェクトです。これらの組織学的分析は、個々の細胞に特異的な遺伝子またはタンパク質のマッピング式に細胞形態および/または解剖学的特徴を評価するの範囲であり得ます。実際には、ゲノミクスのフィールドに組織学の基本的な貢献の一つは、特定の領域または細胞型に特異的な分子シグナルを関連付ける機能です。
特に筋骨格組織のための組織学の伝統的な方法、脱灰、修正するために数週間、時には必要、多くの場合、時間がかかり、面倒であり、セクション、汚れ、および画像標本は、その後、人間の解釈を経由して画像を解析。 その場 hybridizat に 、かどうかを免疫組織化学を介して、複数の分子シグナルの分析イオン、または特別な汚れは、適切に実行するために複数のセクション、さらには、複数の検体を必要とします。また、これらの複数の応答は、同じ細胞に同時局在することはできません、時には与えられた試料内の特定の領域に同時局在することはできません。ゲノミクス及びエピゲノミクス分野はデジタル時代に移動すると、組織学的フィールドはまた、効率的、高スループット、および単一の組織切片内の分子の各種信号の自動分析を提供するために、スーツに従わなければなりません。
確かに、与えられた試料内の特定のセルに複数の分子シグナルを関連付けることができる改良組織学的技術が求められています。最近、我々は鉱化組織5-14から与えられたセクション内のいくつかの対応策を評価するための新しい高スループットcryohistological方法を公開しています。プロセスは、顕微鏡スライドに固定的にテープで留め部分を接着し、冷凍cryotapeとの凍結切片を安定化させることを含む、および各セクションの染色およびイメージングのいくつかのラウンドを行います。画像のこのラウンドは、手動または画像解析の前に、コンピュータの自動化（ 図1）を介して位置合わせされます。ここでは、このプロセスの詳細なプロトコルを提示し、これらの技術は、異なる生物学的プロセスの理解を改善している例を提供します。
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Protocol
コネチカット大学医学センターの制度的動物のケアと使用委員会は、すべての動物の手順を承認しました。
1.固定と埋め込み
- CO 2窒息または他の承認された方法を介して動物を安楽死させます。
- 適切に固定されるまで、4℃で10％中性緩衝ホルマリン中で目的の組織（ 例えば、四肢、脊椎など）と場所を収穫。固定前に一貫性のある解剖学的な配置を維持するために特別な注意を払ってください。たとえば、一貫性の屈曲、内旋、および外旋11を角度で関節を有する手足を固定してください。 3日 - 一般的に、1のためのマウス全体の手足を固定します。
注意：ホルマリンは毒性があり、適切な個人用保護具を着用したままドラフト内で処理する必要があります。
注：固定の時間枠は、標本の大きさに依存します。実験が許可されている場合、骨を切開する骨髄コンパートメントの固定を改善します。いくつかの標本は（骨髄内の例えば 、微弱な蛍光シグナル）の蛍光バックグラウンドを最小限にするために灌流固定15が必要な場合があります。 - 4℃で24時間 - 転送は、30％スクロース、1×PBS中で作製し、12インキュベートしホルマリンの標本。
注：12インキュベーション後 - 24時間、試験片は、次いで、長期保存のために-80℃に配置することができます。ストレージのこの方法は、研究者が同じブロックに複数のサンプルを埋め込 むしようとするが、同時にこれらのサンプルの全てを収穫いない可能性のある実験のために推奨されている（ 例えば 、複数の時点での実験）。 - スクロースからの標本を取り出して、余分な組織を離れて解剖。
- メディアを埋め込むクライオとの双方向の一部（金型の大きさは、試料のサイズに依存します）cryomoldを入力します。関心領域のための切断面は、金型の底部と平行になるように、金型内のサンプルを配置します。
注：特定の組織の配置の一例と向きB -図2Aに見つけることができます。 - クライオ包埋媒体フリーズの薄い層までドライアイスの作品へcryomoldを置き、その後、所定の位置に試料を固定します。ドライアイスペレットにcryomoldを維持しながら、クライオ媒体を埋め込んでcryomoldの残りの容量を入力します。
- 2-メチルブタンドライアイスによって事前に冷やしを含む容器にcryomoldを置きます。試験片が完全に凍結したら、cryomoldsを除去し、過剰の2-メチルブタンを振り払います。ストレージのためのCの冷凍庫-20°Cにセロファン、所定の位置にcryomoldsをラップまたは-80。
注：凍結包埋媒体に格納されているときサンプルは、特に-20℃で、時間をかけて乾燥させることができます。 （ステップ1.3参照）を-80℃で、または-80℃で30％スクロース培地を埋め込むクライオで2ヶ月 - 私たちは、より長い1のためのサンプルの保管をお勧めします。
2.テープ安定化組織セクショニング
- 冷凍庫から試料ブロックを取り外し、cryostaに置きます-20℃と-25の間に設定した温度とトン。
- cryomoldからブロックを削除し、かみそりの刃でメディアを埋め込む過剰クライオを切り落とします。
- 試料ディスク上にいくつかの凍結包埋媒体を配置し、試料ディスクの表面は、それによって関心領域のための適切な切断面を確立するブロックの底面と平行になるようブロックを揃えます。
- クライオスタットに試料ディスクを置き、凍結するメディアを埋め込むクライオを可能にします。
- 試料ヘッド上に試料ディスクを置き、ブレードカットは試料ブロックの表面に平行になるようにヘッドを調整します。
- 関心領域内のレベルにブロックをダウントリムとブロックの表面から任意の削りくずを払い落とします。
- クライオスタットへの関心とプリ寒さの領域をカバーするのに十分な大きcryotapeの部分をカットします。
注：複数のピースが一貫したサイズでカットし、cryost内に格納することができます切片中で。 - ダウンブロックスティッキー側にテープを配置し、その後、鉗子を使用して、非粘着性の銀/金のタブでテープを掴んでcryotapeから非接着性バッキングを削除します。
- ローラー（ 図2C）を使用してcryotapeに圧力を適用します。
- 自動モータやクライオスタットの手動切断ホイールのいずれかを使用して - （8〜5μm程度）のセクションを作成します。
注：セクションが（ 図2D）を切片中にステージから落ちないようにステージ上に来るようcryotapeのエッジを保持することをお勧めします。 - クライオスタット内のプラスチック製顕微鏡スライド上のセクションの組織側を上に置きます。
- クライオスタットからプラスチック製のスライドを削除し、クライオ包埋媒体は、セクションでは、スライドの表面に付着するように溶融することができます。
- 連続切片または関心のある他の地域のために切片を繰り返します。
- 完成したら、スライドボックスaでセクションを保存トン4、Cは、ストレージの長さ必要と下流の対応策に応じて、-20℃または-80。 4℃で保存した場合ヶ月以内に - 例えば、酵素活性のために染色されようとしているスライドを使用する（5.3 5.2を参照）。
顕微鏡スライドへのセクションの3接着
- UV硬化型の接着方法。
- 顕微鏡スライドにラベルを付けます。
注意：増加した自動化のために、試料スライドをバーコードで標識することができます。 - 2枚のスライドガラスにUV活性化光学接着剤のドロップを適用し、ガラススライドの表面全体に接着剤の薄い層を広げるためにプラスチック製のスライドの端を使用しています。
- 銀/金のタブを遮断し、最初のスライドの接着剤にテーピングセクション組織側のレイアップ。テープの下に閉じ込められた気泡の形成を最小化するために一方の端から他方のロール運動セクションを適用します。
注：最初のスライドは、トンのプリウェット下面に使用されています第二の（永久）スライド（ステップ3.1.4）の上に配置する前に、彼のテープ。 - 最初のスライドからテーピング部分を削除し、第2のスライド（ 図3A）の接着剤層の上に置きます。この場合も、気泡の捕捉を避けるように注意してください。
注：この手順は、マスターに練習が必要です。 - 所定の実験のためのセクションの適切な数は、各スライド上に配置されると、周囲から余分な接着剤を拭き取ってください。
- テープの下に気泡や繊維のために密接に各セクションを点検します。顕微鏡やルーペの下でこの検査を実行します。障害物がある場合は、個々のセクションを削除する障害物を削除してから、スライドガラスにそれを再適用します。
- 接着剤を架橋するために10分 - テーピングのセクションの下に障害物がないと判断されたら、5のためにUVブラックライトの下で顕微鏡スライドを配置します。
- 顕微鏡スライドにラベルを付けます。
- キトサン接着方法。
- 目を準備電子1％キトサン接着剤。 100mLのDI水中に濃酢酸0.25 mlで溶解することにより酢酸溶液を調製し（0.25％v / v）でした。酢酸溶液100mlにキトサン粉末1gを溶解し、溶液を攪拌O / Nまたはすべてのキトサン粉末が溶解するまで。
注：溶液を、室温で安定です。 - スライド上に配置される各セクションのキトサン溶液の液滴を付着させます。
- テープの銀/金のタブを切断し、接着剤（ 図3A）上にアップし 、各テーピングセクション組織側に配置します。気泡の捕捉を避けるために、細心の注意を使用してください。
- 一旦、全てのセクションがスライド上に配置され、その長辺の一つのスライドアップを傾け、鉗子を使用して、下縁部に過大なキトサンをドラッグします。
- スライドボックス内のペーパータオルの上にこの向きにスライドを置きます。重力はその後、キトサンの平坦かつ均一な層を得、過剰キトサンはタオルの上に落下するようになります。
- プラCEその蓋をスライドボックスは、キトサンを乾燥させるために冷蔵庫のO / Nでオープン支え。
注：2つの接着方法の比較については、 表1を参照してください。
- 目を準備電子1％キトサン接着剤。 100mLのDI水中に濃酢酸0.25 mlで溶解することにより酢酸溶液を調製し（0.25％v / v）でした。酢酸溶液100mlにキトサン粉末1gを溶解し、溶液を攪拌O / Nまたはすべてのキトサン粉末が溶解するまで。
スライドへの参照マーカーの4応用
- 100μlの水に緑を50μlと赤のマイクロスフェア50μlのを溶解させることにより、基準マーカー溶液を調製します。 4℃の暗所でのソリューションを保管してください。
- ミクロスフェア溶液に10μlあるいは20μlのピペットチップを置きます。関心のある領域（ 図3C）に隣接する各セクションへのマイクロスフェア液の小滴を追加します。関心領域内の微小球を取得しないように注意してください。
- その日のスライドを処理する場合は30分間（光から保護）RTでスライドを乾燥させます。ない場合は、4℃でスライドボックスにスライドを配置します。
注：マイクロスフェアのソリューションは、スライドを水和する前に乾燥する限り、マイルcrospheresは染色/イメージングの複数ラウンドの間、スライドに付着したままになります。
染色の5.複数のラウンド
注記：画像化、染色、および再イメージングステップの互換性のある配列を選択することにより、同一の組織切片上で多くの生体信号を検出し、共局在することが可能です。イメージング/染色/イメージ再作成の各ラウンドは、特定の組織学的質問のために開発されなければなりません。イメージング/染色/再イメージシーケンスは、典型的には、蛍光多重免疫染色および酵素活性の汚れの複数のラウンドに続いてイメージングの最初のラウンドでの内因性の蛍光シグナル（ 例えば 、携帯GFP、鉱化染料、in vivoイメージングプローブ）を取得することを含みます。最後に、セクションは、組織構造を強調するために発色色素（Oサフラニン例えば 、H＆E、トルイジンブルー、 等）を用いて染色することができます。このセクションで提示から適応したカスタムメソッドです市販されているプロトコル。
- 蓄積された鉱物のためのカルセインブルー染色
注：カルセインブルー染色は、暗視野や微分干渉コントラスト（DIC）画像とは異なり、自動画像解析に適している一貫性のある鉱物表面が得られます。カルセインブルー染色での問題は、 サンプルは、これらのミネラルラベル、画像カルセインブルーで染色する前にイメージングの最初のラウンドでのラベルが含まれている場合 、蛍光スペクトルは、そのため 。テトラサイクリンとデメクロサイクリンラベリングと重なっていることです。- 組織内の内因性の信号は、この染色工程の前に撮像された場合はカバーガラスが離れてスライドから秋まで、を1×PBSで満たされたコプリンジャーの前のイメージングラウンドからスライドを沈めます。カバーガラスを取り外し、乾燥させます。
- 100ミリリットルのH 2 Oで2グラムのNaHCO 3を溶解することによって作られた2％のNaHCO 3でカルセインブルー溶液を30mg / mlのを（準備と調整）HClで7.4のpHにる。小分けして-20℃で溶液を保存します。
- すでに前のラウンドからの水和されていない場合は、セクションを水和する15分間、1×PBSを含むコプリンジャーにスライドを浸し。
- スライドを削除し、紙タオルで背中やエッジを乾燥させます。
- スライドあたりカルセインブルー溶液500μl、室温で湿度室で10分間インキュベートする - 100を適用します。
- 3変更で10分間、1×PBS中でスライドを洗浄します。
- 1×PBS中50％グリセロールの〜200μlを各スライドに適用し、カバースリップをマウントします。
- 過剰グリセロールを取り外し、スライドの底部を乾燥させます。
- 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）の酵素活性染色
注：TRAPは、破骨細胞を含む造血系における複数の細胞型で表現されます。ここで提示TRAP染色は、黄色蛍光酸性ホスファターゼ基質を使用しています。 特定の蛍光信号がOVますテトラサイクリン/デメクロサイクリン鉱化ラベル、カルセインブルー染色、およびDAPIの対比など、カスタムイエローフィルターがセットされたerlap。- カバースリップが離れてスライドから秋まで、1×PBSで満たされたコプリンジャーの前のイメージングラウンドからスライドを水没。カバーガラスを取り外し、乾燥させます。
- 無水酢酸ナトリウムと水で酒石酸ナトリウム二塩基二水和物の11.4グラムの9.2グラムを溶解し、千ミリリットルに最終的なボリュームをもたらすことによってバッファ1を準備します。 （ - 2ミリリットル〜1.5）濃氷酢酸で4.2にpHを調整します。 4で溶液を保存 最大12ヶ月間Cを°。
- 水に亜硝酸ナトリウムを40mgを溶解し、1ミリリットルに最終的なボリュームをもたらすことによってバッファ2を準備します。 1週間まで4℃で溶液を保管してください。
- 染色の日に、バッファ1の7.5ミリリットルとバッファ2の150μLを混合することにより、反応バッファーを準備します。
- スライドに基板ずに反応緩衝液を適用します低いpHで組織を平衡化するために15分 - 10秒。
注：典型的な量は、〜200μlのですが、すべてのセクションをカバーするのに十分な大きさである必要があります。 - 1:50 1の間の黄色蛍光酸性ホスファターゼ基質を希釈：反応緩衝液中で100。
注：希釈は、試料内のTRAP活性によって決定されます。 - スライドのオフ反応緩衝液を注ぎ、スライドに黄色蛍光基質と反応バッファーを適用します。
- 基板を活性化するために〜5分間のUVブラックライトの下でスライドを置きます。
注：インキュベーション時間は、試料中のTRAP活性に依存して変化し得ます。 - 3変更で10分間、1×PBS中でスライドを洗浄します。
- 1×PBS中50％グリセロールの〜200μlを各スライドに適用し、カバースリップをマウントします。
- 過剰グリセロールを取り外し、スライドの底部を乾燥させます。
注：酸性TRAPバッファは、セクションを脱灰します。 decalcificaの追加の利点ションは、特定の色が下流染色（ 例えば、石灰化ラベル）のために再度利用可能になることです。例えば、カルセインブルー染色は、TRAP染色の際に削除されます。したがって、DAPIの対比は、その後のラウンド中に、このチャンネルで撮像することができます。
- アルカリホスファターゼ（AP）酵素活性染色
注：骨芽細胞および鉱化軟骨細胞特急APを含む石灰化に関与する複数の細胞型。このプロトコルで使用されるファストレッド基質は、蛍光赤と発色性赤色信号の両方を誘発します。このため、発色基質は、基質が沈殿領域に蛍光シグナルをクエンチします。したがって、AP基質によってクエンチすることができる蛍光シグナルを画像化した後、この染色を行うことをお勧めします。- カバースリップが離れてスライドから秋まで、1×PBSで満たされたコプリンジャーの前のイメージングラウンドからスライドを水没。レモVEのとカバーガラスを乾燥させます。
- 100mlの水にトリスの12.1グラムを溶解することにより、1Mトリスを準備します。 1 M NaOHでpHを9.5に調整します。
- 100mlの脱イオン水でのMgCl 2の20.33グラムを溶解することにより、1 MのMgCl 2水和物を準備します。
- 100mlの脱イオン水に11.68グラムのNaClを溶解させることによって、2MのNaClを準備します。
- 脱イオン水50mlで1グラムの粉末を溶解することにより、ファストレッドTR塩の100倍（20 mg / mlで）のストック溶液を準備します。 -20℃で100μlのアリコートとストアを行います。
- N、N-ジメチルホルムアミド50mlに500mgの粉末を溶解することにより100×（10 mg / mlで）、ナフトールAS-MXリン酸ストック溶液を調製します。 -20℃で100μlのアリコートとストアを行います。
- 染色の当日に、2 MのNaCl、1MのMgCl 2を0.5mlの1Mトリスを0.5mlを1ml添加することにより、APのバッファを用意し、脱イオン水（最終濃度を用いて10 mlに、最終体積を100 mMのトリス、50mMのMgCl 2を、100mMのNaCl）。
- AP Bを配置各スライド上のufferし、室温で10分間加湿チャンバー内でインキュベートします。
- APのバッファに1XにファストレッドTR塩とナフトールAS-MXの100倍の株式を希釈することにより、AP基質緩衝液を準備します。
- スライドのオフAPのバッファを注ぎ、AP基質緩衝液と交換してください。室温で湿度室に10分 - 5のためのスライドをインキュベートします。
注：インキュベーション時間は、試料のAP活性によって決定されるであろう。 - 洗浄は5分ごとに、1×PBSで3回スライドします。
- （：1×PBS中50％グリセロール中でDAPIの千希釈1）マウントカバーがDAPIの対比溶液でスリップ。
- トルイジンブルーO（TB）、発色染色
注：以前のすべてのステップは、50％グリセロール/ PBS溶液中で一時的水性取付下結像されるので、発色工程は、水性条件下で撮像されます。しかしながら、染色溶液は、経時的に浸出する傾向があります。したがって、それはできるだけ早く染色後の画像にトルイジンブルーを示唆されています。- カバーガラスがスライドから離れて落下するまで脱イオン水で満たされたコプリンジャーの前のイメージングラウンドからスライドを水没。カバーガラスを取り外し、乾燥させます。
- カバースリップを除去した後、新鮮な水と交換し、PBSから塩が十分に組織から削除されるように、少なくとも10分間、スライドをインキュベートします。
- 脱イオン水中の0.025％のTB溶液を調製します。
- 5分 - 1のためのTB溶液中にスライドを置きます。
注：インキュベーション時間は、ユーザーの好みに依存しているが、すべてのサンプル全体で一貫性が保たれるべきです。 - 場所は、脱イオン水でコプリンジャーにスライドすると、スライドを5分間ずつ3倍洗います。
- 脱イオン水に溶解し 、30％グリセロールでマウントカバースリップ（このよう1X NOT PBSは、汚れが組織から浸出する原因になります）。注：グリセロールマウンティング培地は、組織からの汚れの拡散を防ぐのに役立ちフルクトースシロップで置換することができます。にフルクトースシロップを調製し、溶解するまで60℃の脱イオン水と熱10mlに果糖を30g溶解します。
イメージングの6.複数回
- 顕微鏡用トレイ（ 図3D）にスライドをロードします。
注記：トレイがバネ仕掛けです。 - スライド走査型顕微鏡（ 図3E）のトレイスタックにトレイを挿入します。
- 各蛍光団のための適切な露出時間でスライドごとにプロファイルをロードするプロファイルリストをクリックします。手動で各スライドに名前を付けたり、ソフトウェアがスライドラベル上に設けられたバーコードを読み取る持つようにスライドの名前をクリックしてください。スライドのプレビュー画像を取るために開始プレビュースキャン]ボタンをクリックします。
- 組織の検出ウィザードに関心領域を設定し、イメージングのその後のラウンドのためにそれらを保存します。各スライドが設定されたら、スタートスキャンボタンをクリックすることで、スキャンプロセスを開始します。
注：システムが100 SLIまで保持できます当時のデス。 - イメージングが終了したら、画像アセンブリおよび分析のための.tifや.jpgファイルとして各チャンネルと撮像ラウンドから画像をエクスポートします。
7.イメージアセンブリ
- フォトショップ（または層状の画像を生成することができる類似画像編集ソフト）を用いて手動による方法。
- 各撮像ラウンドから各チャンネルの画像を開きます。
- 1合成画像内の層として個々の画像を組み立てます。これを行うには、一つの画像からレイヤーパレット内のレイヤーをクリックしてください。その後、別の画像にレイヤーをドラッグします。このドラッグ＆ドロップ操作は、画像に新しいレイヤーを作成します。他のすべての画像のためにこれを行います。また、画像スタック内の層として複数の画像ファイルをロードすることによって、このプロセスを自動化するために（...スタックにファイル>スクリプト>ロードファイル）スクリプトを使用します。
- 各画像は合成画像内の個々の層としてリストされたら、ダブルラの名前を変更するレイヤ名をクリックしてください異なるチャネルを識別するために必要に応じてyers。
- それぞれの層を通して見ると、本当に合成画像を作成し、レイヤーパレット内の「画面」を「ノーマル」から各レイヤーのブレンドモードを変更するために。
注：この手順をスピードアップスクリーニングする単層を変更し、その後、層を右クリックし、「コピーレイヤースタイル」を選択し、他のすべてのレイヤをハイライト表示して、他に画面スタイルを適用するには、「ペースト層のスタイル "を選択するには層。 - 優れた発色性層を介して蛍光シグナルを可視化するために、発色層（ すなわち 、トルイジンブルー）の-希望の場合は、不透明度（40％〜10変更値）を減少させます。
注：このプロトコルで使用されるタイル状の走査型顕微鏡によりイメージングの各ラウンド中のスライドに発生する可能性が回転量を最小限に抑え、3辺のスライドを保持しています。したがって、手動で派生画像を回転させることなく、画像を位置合わせするために、ユーザのためにはるかに容易になりますイメージングの異なるラウンドから。
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Representative Results
高スループット、マルチイメージCryohistologyのための一般的なワークフロー
図1は、この技術に使用される一般的なワークフローを示します。これは、イメージング、最終的には画像の位置合わせ/分析のいくつかのラウンドを経て固定からいくつかのステップを含みます。プロセスは、サンプルのこれらのタイプを脱灰するのにかかるよりも短い時間であるイメージングの4ラウンドを通る試料固定から行くために一週間ほど少しを取ることができます。イメージングの順序は、典型的には、（ 例えば 。 など 、TRAP、AP、）蛍光酵素活性アッセイに続いて多重蛍光免疫染色その後、試料（ 例えば 、GFPを、鉱化のラベルなど ）に既に存在する内因性のシグナルで始まりますおよび細胞周期分析アッセイ（ 例えば 、EDU）、最後に発色性染色（ 例えば 、トルイジンブルーO、裾で終了）、Oサフラニンなど atoxylin。
少年足関節 6 からの代表的な例
この特定の研究の目的は、アキレス腱ツー骨挿入部位（ すなわち 、腱・靱帯付着部）の線維軟骨の石灰化とコラーゲン（ すなわち 、COL1A1、COL2A1、およびCol10a1）の異なる種類の発現との相関関係を実証することでした。したがって、COL1A1、GFPTpz、COL2A1-CFPおよびCol10a1-mCherryを含むトリプルトランスジェニック蛍光レポーターマウスは各導入遺伝子を発現する細胞を同定するために使用しました。イメージングの最初のラウンドは、アキレス腱（ 図4B）で時腱・靱帯付着部のmineralizesに対応する2週齢のマウスから、内因性の導入遺伝子発現でした。イメージングの第二ラウンドは、その後に行われました2光子第二高調波発生（SHG、 図4C）を介して、コラーゲン構造の画像を取得するために多光子顕微鏡。このステップは、腱・靱帯付着部内のコラーゲン繊維のベースで細胞を同定するために使用しました。イメージングの第三ラウンドは、腱・靱帯付着部（ 図4D）の石灰化を促進する主要なシグナル伝達リガンドのうちの1つであるインディアンヘッジホッグ（IHH）、のための免疫染色ステップでした。イメージングの第4ラウンドのアクティブミネラル沈着（ 図4E）の領域を可視化するために、Cy5の蛍光と青色発色信号の両方を誘発する青色アルカリホスファターゼ基質キットを用いて、AP染色しました。最後に、イメージングの第五ラウンドは線維軟骨（ 図4F）内のプロテオグリカン含量を含む解剖学的特徴を視覚化するために、TB染色しました。全ての画像を手動で画像編集ソフトウェア内で整列させました。イメージングの5回を3に続く4日間にわたって行われましたサンプル処理の日と切片（合計7日間）。
共同大人の膝 11 からの代表的な例
この実験の目的は、前十字靱帯（ACL）の切断を介して関節不安定化を以下の膝の内側側副靱帯（MCL）の腱・靱帯付着部で起こる石灰化の変化を決定することでした。鉱化作用の変化は、これらの3ヶ月齢のマウスではMCL腱・靱帯付着部早ければ2週間後の手術で見ることができます。腱・靱帯付着部内の線維軟骨の石灰を監視するには、ミネラルラベルは術後2週目に手術日（デメクロサイクリン）および屠殺前日（カルセイン）のマウスに与えました。マウスはまたunmineralizedと鉱化fibrochondrocytのコラーゲン発現をモニターするためにCOL1A1-CFPとCol10a1-mCherryを蛍光レポーターを含まエス、それぞれ。イメージングの最初のラウンドは、この場合、蛍光タンパク質および蛍光鉱化ラベル（ 図5A）に相当し、内在性のシグナルでした。第二ラウンドは、基礎となる骨髄（ 図5B）に腱・靱帯付着部における鉱化線維軟骨細胞におけるこの酵素の発現、ならびに破骨細胞を実証するためのTRAP染色が含まれていました。第三ラウンドは、APがアクティブな線維軟骨細胞の石灰化だけでなく、下にある骨（ 図5C）の骨芽細胞の領域を示すために染色しました。最後に、TB染色は第4ラウンド（ 図5D）を行いました。全ての画像を手動で画像編集ソフトウェア内で整列させました。もう一度画像の位置合わせに組織の収穫から採取された合計時間は7日でした。
遠位大腿骨からの骨梁の代表的な例
図3B）に適用しました。このプロセスは、12スライドの総数を得、骨髄内の3つの異なるレベルで8女性8雄マウスで行いました。基準マーカ（マイクロスフェア）は、骨端と乾燥セクション（ 図3C）に半ば骨幹内に適用しました。すべての12のスライドをfoを染色しましたRブルーカルセインおよびイメージングの最初のラウンド（ 図6A）の間に蓄積されたミネラル（カルセイン青）と石灰化ラベル（カルセインとアリザリンコンプレクソン）のために撮像しました。次いで、スライドをイメージングの第三ラウンドで第二ラウンドとAP活性（ 図6C）にTRAP活性（ 図6B）のために画像化しました。最後に、スライドを4回目（ 図6D）中のトルイジンブルーで染色しました。参照マーカーは、発色ラウンドを含め、すべてのイメージングラウンド中に画像化し、そしてカスタムソフトウェアを使用して整列させました。 、3セクションでは、各ブロックから採取した8ブロックに包埋したこの手順、32骨（16大腿骨および16椎骨）のスループットのアイデアを提供するために、切片は12スライド全体に分布していた、と12のスライドは4回撮像しました96合成画像スタックを生成します。この実験を実行するための合計時間は8日でした。
図1.プロトコルのための一般的なワークフローに。一般的な手順は、1）組織固定、2）テープ安定化凍結切片、ガラススライドへのテーピングのセクションの3）密着性、基準マーカの4）アプリケーション、染色および6の5）複数回）が含まれますイメージング、および7）画像アセンブリ、アライメント、および分析。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. ハイスループット埋め込 みとテープ安定化凍結切片化。cryotapeが提供する安定性のため、複数の骨は（AB）互いに隣接埋め込 まれ、同時に区分することができます（CD）。ドライアイスの作品は、中に使用されます厳格に先立って全体クライオブロック（B）を凍結する場所で骨を固定するためのプロセスを埋め込 みます。 cryotapeがブロック（C）上に巻かれ、セクションでは、（D）を切片中のテープに残ったまま。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
スライド走査型顕微鏡のトレイに 図3. スライドガラス、リファレンスマーカーの応用にテーピングセクションの順守、スライドの読み込み中に。テーピングのセクションでは、UV硬化又はキトサン系接着剤のいずれかでガラススライドの表面に接着されています（ ）。硬化または乾燥させた後、接着剤の唯一の薄い、平坦な層がcryotapeやガラス面（B）の間に残ります。参考傷KERSは（マイクロスフェア溶液をドロップするようにC、矢印点）ドライスライドに適用されます。次にスライドを顕微鏡用トレイ（D）に取り付けられ、顕微鏡（E）にロードされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.二週齢のマウスからアキレス腱のイメージングの5回は。合成画像スタック（A）は、イメージングの5回から作成されました。ラウンド1（B）：内因性のCOL1A1-GFPTpz、COL2A1-CFP、およびCol10a1-mCherryを導入遺伝子発現。 2光子顕微鏡のコラーゲン第二高調波発生（SHG）：ラウンド2（C）。ラウンド3（D）：IHHの免疫染色。ラウンド4（E）：AP酵素活性。ラウンド5：トルイジンブルーO（F）。この図は、Dyment らから変更されている。2015年6。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. 共同不安定化に続いてMCL腱・靱帯付着部のイメージングの4ラウンド。膝は、MCLの腱・靱帯付着部の増加鉱化作用につながる、3ヶ月齢のマウスでは不安定化しました。犠牲前日に与えられたデメクロサイクリンミネラルラベルは、手術とカルセインミネラルラベルの日を与えられました。ラウンド1（A）：内因性のCOL1A1-CFP、デメクロサイクリンおよびカルセインミネラルラベル付きCol10a1-mCherryを導入遺伝子発現。ラウンド2（B）</ strong>の：TRAP酵素活性。ラウンド3（C）：AP酵素活性。ラウンド4（D）：トルイジンブルーO. TRAPとAP信号がパネルBCでTB信号の上に重ねました。 TRAPバッファはデメクロサイクリンラベルを除去し、組織をdecalcifiesので黄色チャネルトラップのために再び使用することができます。この図は、Dyment らから変更されている。2015年11。スケールバー=200μmです。デム：デメクロサイクリン、TRAP：酒石酸耐性酸性ホスファターゼ、AP：アルカリホスファターゼ、MCL：内側側副靱帯。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6. マイクロスフェアリファレンスマーカーを含む遠位大腿骨内イメージングの4ラウンド。3ヶ月、古いマイクeはカルセインとアリザリンコンプレクソンミネラルラベルを与えられた第1ラウンド（AA '）：。加えて、内因性のカルセインとalizarainのコンプレラベルが蓄積鉱物のブルー染色をカルセインするラウンド2（BB'）：TRAP酵素活性ラウンド3（CC '）。 ：AP酵素活性は、 ラウンド4（DD '）：緑のマイクロスフェアは、各ラウンドの間に撮像したトルイジンブルーO.（A'-D'、矢印は、すべての画像に同じマイクロスフェアを表します）。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| キトサン接着剤 | UV硬化型接着剤 | |
| 接着機構 | 蒸発 | 紫外重合 |
| 硬化時間 | > 24時間 | <20分 |
| セクションは、接着剤が硬化した後に除去することはできますか？ | はい | いいえ |
| 接着剤の溶解を硬化させていますか？ | はい、pHの低い酸性溶液中 | いいえ |
| 接着剤は、熱抗原回復に耐えていますか？ | いいえ | はい |
| 接着剤自家蛍光はありますか？ | いいえ | UV範囲において最小 |
キトサン接着剤とUV硬化接着剤との間の表1の比較
| Cryotape | テープ搬送システム | |
| このシステムを使用してセクション石灰化した骨への可能性？ | はい | はい、しかし、作品石灰化した骨のスライドに完全に譲渡することはできません |
| このシステムを使用してセクション鉱化関節への可能性？ | はい | はい |
| このシステムを使用したセクションの脳への可能性？ | はい、しかし、組織は、イメージングの複数のラウンド後のテープのオフに落ちる可能性があり | はい |
| 同じブロックに埋め込まれた複数のサンプルをカットすることが可能？ | はい | はい |
| 同じセクションのイメージングの複数ラウンドを行うことができますか？ | はい | はい |
Cryotapeシステムとテープ転送システムとの間で、表2の比較
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Discussion
ここでは、共局在し、単一のセクションに染色/イメージングの複数回の画像を位置合わせすることによっていくつかの生物学的措置を定量化するための詳細なcryohistologyプロトコルを提示しています。それはセクションの組織（ 例えば 、石灰化した骨および軟骨）に難しいの形態を維持するようcryotapeを使用して概説した方法は、特に便利です。また、切片組織は、同じセクションの染色/イメージングの複数のラウンドを可能にする、スライドガラスにしっかりと接着されています。シリアルセクションでは、各異なるプロトコルを用いて染色されている伝統的な方法とは異なり。セクション間の共局在信号しようとしたときに、連続切片を使用すると、複数のラウンドで染色し、画像化された単一のセクションの問題ではありません何かを問題を提起することができます。
市場に最初のテープで安定化した組織切片の製品は、テープ搬送システム16、17であった。それは、コーティングされたプラスチックテープを使用しています組織cryoblockの表面上に配置された低温接着剤です。テープの下クライオスタットブレードカットは、セクションでは、テープにそのまま、付着除去されたとき。その後テープを組織が堅くスライドに付着するように、UV硬化型接着剤でコーティングされたスライド上にダウンサンプル側に配置されます。テープが離れセクションから剥がされると、スライドは、蛍光または発色組織学のいずれかのために処理することができます。接着剤のバックグラウンド蛍光が低く、染色およびイメージングの複数のラウンドは、ほとんどの軟組織に適しています。ガラススライドに接着テープで組織を転送する場合が鉱化セクションと、鉱物断片の損失が存在し得ます。また、クライオスタット（> $ 8,000）と消耗品コストをインストールするには、比較的高価なシステムが（> $ 2 /スライド）高されています。
博士忠史川本によって開発された別のテープの安定化戦略が使用しています接着剤コーティングされたポリ塩化ビニリデンフィルムは、組織切片を捕捉します。そのプロトコルでは、新鮮凍結組織は、テープに区分され、すぐにPFAまたはエタノール18で固定しました。その後、テープが染色され、その後、顕微鏡検査のためにダウンサンプル側でスライドガラス上にマウントしました。したがって、各染色プロトコルは、異なるテープ部で実行されます。
私たちは、修正されたと埋め込みの前にホルマリンでサンプルを固定を含むいくつかの方法で川本プロトコルに追加しました。この工程は、細胞の限度内で、トランスジェニック動物の可溶性細胞質GFPを修正することが重要です。我々は、組織の種類5-13の幅広いcryotapeを利用しています。限られた組織学的経験を持つ研究室の担当者は、この方法では、高品質のセクションを生成することができます。このプロトコルの主な利点は、比較的低コスト（特別な計装、<スライドにつき$ 1.00）、鉱物断片の損失なしであり、そして、同じセクションに染色およびイメージングの複数のラウンドを実行する能力。
繰り返しにスライド複数回の同じ領域を画像化することはあっても電動ステージを使用してスライドの多数のために不合理であろうので、このプロトコルの別の重要なステップは、一貫性とスループットを向上させるスライド走査顕微鏡の利用です。顕微鏡は、落射蛍光および透過光の両方で動作するデジタルスライドスキャナです。これは、10位電動タレットとB＆Wの両方とカラーカメラが装備されています。システムの真の新規性は、我々の手で、関心の特定の領域を迅速かつ容易にユーザによって定義されたまたはイメージングソフトウェアによって自動的に検出することができることです。関心のこれらの領域は、その後、イメージングの最初のラウンドから救われると、その後のラウンド中に迅速にリロードすることができます。したがって、関心の同じ領域がイメージングの各ラウンド中に撮像されます。 USER-に基づき、ソフトウェアで定義されたパラメータは、顕微鏡は、オートフォーカス、関心領域内の取得中に縫合されているタイル状の画像をスキャンします。
ユーザーは染色の複数のラウンドを実行することにより、順序が重要です。一般的な順序は、 図1に概説されている。十分に蛍光顕微鏡を介して分離することができる蛍光体の数が指定したセクションに取得することができる対応策の数に主要な制限要因です。しかし、蛍光チャネルがある場合には再利用することができます。例えば、カルセイン青色及びデメクロサイクリンの両方がTRAP活性を測定するために使用される黄色のチャネルで強いシグナルを発します。このブリードスルーはTRAPバッファは、それによってTRAP活性を画像化する前にミネラルを除去し、セクションをdecalcifiesのでかかわらず、回避されます。また、DAPIの対比は、同様に黄色のチャンネルで発光します。ただし、ユーザーが目で別の対比でDAPIを置き換えることができます電子赤色または遠赤色の範囲。さらに、抗体は、剥離することができ、同一の蛍光チャネルを用いて異なる抗体で再染色しました。したがって、この方法は、所定の部分に記録することができる対応策の数の増加に非常に適合可能です。
提示されたプロトコルとの一定の制限があります。 1）cryotapeは、特定の組織に十分に接着しない場合があります。例えば、ホルマリン固定脳切片を染色の複数のラウンド後のテープから脱落する傾向があります。組織は、UV活性化接着剤（これらの2つの方法の間の比較については表2を参照）を介してガラス表面に付着されているようなこのような組織は、テープ移送システムがより適切であり得ます。 2）キトサン接着剤は、透明な光学特性を提供しながら、高温や強酸を含む過酷な処理工程を生存しないであろう。したがって、UV活性化接着剤は、これらの用途に適している（表1 F参照またはこれらの2の接着剤との比較）。
ここで提示cryohistologicalプロトコルはまた、より高いスループットおよび自動化に適しています。例えば、cryotapeが提供するテープの安定化は、スループットを大幅に増加させる、同じブロックに一度に複数の骨や関節を切断する比較的初心者ユーザーを可能にします。自動化されたスキャナを使用すると、大幅に一般的に私たちの経験の律速段階となっているイメージングに関連する技術者の時間とコストを削減します。短期間で一貫して確実画像関心の同じ領域を複数回にできることは、組織の自動化、客観的な分析のためのプラットフォームを提供します。実際には、私たちのグループは、コンピュータで自動化されたアライメントと骨の組織形態計測のためのプラットフォームを開発しました。まず、ソフトウェアは、蛍光基準マーカに基づいて画像の複数のラウンドを整列させます。そして、整列イメージはどこcomput組織形態計測パイプラインに供給され、ERソフトウェアは、関心領域を定義し、客観的に、いくつかの静的および動的な測定値を測定（で詳細を参照してください。 www.bonebase.org）13。このプラットフォームは、理由cryotapeの切片、デジタルスライド走査型顕微鏡、およびカスタム解析ソフトウェアが提供するスループットの向上と一貫性を実現しました。このプロトコルは、高スループットcryohistologyに大きな進展を示し、骨のようなだけでなく、組織切片を持つ経験の浅いもののようなセクションの組織への困難なものを撮影に使用のものでなければなりません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
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