Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ferrichlorid-induceret murin Trombose Modeller

Published: September 5, 2016 doi: 10.3791/54479
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Vi rapporterer en raffineret procedure af ferrichlorid (FeCl3) -inducerede trombose modeller på carotis og mesenterisk arterie samt vene, kendetegnet effektivt med intravital mikroskopi til at overvåge tid til okklusiv tromber formation.

Introduction

Arteriel trombose (blodprop) er en almindelig komplikation ved mange systemiske sygdomme associeret med kronisk inflammation, herunder aterosklerose, diabetes, fedme, cancer og kroniske autoimmune reumatologiske sygdomme. Tromber, der forekommer i det arterielle cirkulation stammer fra uhensigtsmæssig blodpladeaktivering, aggregering og efterfølgende coagulatory mekanismer, og er impliceret i hjerteanfald, slagtilfælde og ekstremitet tab. Karvæggen er et komplekst system, der omfatter multiple celletyper og påvirkes af en lang række ydre faktorer, herunder forskydningsspænding, cirkulerende blodceller, hormoner og cytokiner, såvel som ekspression af antioxidant proteiner i karvæggen. In vitro forsøg kan ikke replikere dette komplekse miljø, og derfor in vivo-undersøgelser med dyremodeller er kritiske for at tillade bedre forståelse af mekanismer, der er involveret i trombotiske lidelser.

Mus har vist sig at have simma- mekanismer til mennesker i form af trombose, åreforkalkning, inflammation og diabetes 1,2. Endvidere kan transgene og knockout-mus være skabt til at teste funktionen af ​​specifikke genprodukter i et komplekst fysiologisk eller patologisk miljø. Sådanne undersøgelser efterligne menneskelige patologi og kan give vigtige mekanistisk information relateret til opdagelsen af ​​nye veje og behandlingsformer samt give vigtige detaljer karakterisere lægemiddelvirkninger på trombose.

Patologiske arterielle tromber forekomme på grund af endothellag skade eller dysfunktion og eksponering af blodstrømmen til subendoteliale matrix 3,4. Forskellige trombose modeller er blevet udviklet til at fremkalde denne endotel skader såsom mekanisk skade, fotoreaktiv sammensatte Rose Bengal-baserede oxidativ skade og laser skade fem. I dette spektrum, Ferrichlorid (FeCl3) -induceret vaskulær skade er en meget anvendt model for trombose. Dette reagens nårpåført på den ydre aspekt af fartøjer inducerer oxidative skader på vaskulære celler 6-8, med tab af endotel cellebeskyttelse fra cirkulerende blodplader og komponenter i koagulationskaskaden. Den FeCl3-modellen er enkel og følsom over for både antikoagulerende og anti-blodplader narkotika, og er blevet udført på carotis og femorale arterier, halsvener, og mesenteriale og cremasteric arterioler og venuler i mus, rotter, marsvin og kaniner 6-15.

En målbar parameter i denne model er den forløbne tid fra skade til at fuldføre fartøj okklusion, målt som blodgennemstrømningen ophør med en Doppler flow meter eller under direkte observation med intravital mikroskopi 6,7,9. En række gange mellem 5 til 30 min er blevet rapporteret i forskellige undersøgelser i C57BL6-mus 7-10,16, hvilket antyder, at FeCl3 koncentrationer, typer af anæstesi, kirurgiske teknikker, mus alder, genomisk baggrund, fremgangsmåde til måling Blood flow, og andre miljømæssige variabler få væsentlig indvirkning på denne model. Denne brede variation gør det vanskeligt at sammenligne undersøgelser fra forskellige forskergrupper og kan gøre påvisning af subtile forskelle vanskelig.

Med en vision om at minimere sådanne variabilitet og etablere en ensartet reproducerbar in vivo model-system, har vi forfinet FeCl3-induceret halspulsåren model, der gør data meget reproducerbare med minimal variation 6-10,16-19. I dette papir beskriver vi og dele de færdigheder og rapportere flere repræsentative eksperimentelle eksempler, der kan drage fordel af denne model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer og manipulationer af dyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC) af The Cleveland Clinic i overensstemmelse med USA Public Health Service Policy på human måde og anvendelse af dyr, og NIH Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Forberedelser:

  1. Fluorescerende farvestof til mærkning blodplader
    1. Forbered rhodamin 6G opløsning, 0,5 mg / ml, i saltvand og sterilisere opløsningen med 0,22 um filter.
  2. FeCl3 Løsning
    1. Lav en frisk stamopløsning på 30% FeCl3 (vandfri, lig 1,85 M) i rent vand, og filter med 0,45 um filter. Forbered 5 ml frisk FeCl3 opløsning i den ønskede koncentration [fx 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) og 12,5% (0,771 M)] af fortynding af 30% FeCl3 opløsning med vand ina 6 cm vævskulturskål og holde låget lukket.
      BEMÆRK: Brug af kultur fadet gør det nemmere at samle op filtrerpapiret mættet med FeCl3 løsning end at samle den op fra en smal beholder, såsom en 1,5 ml mikrocentrifugerør. FeCl3 er ekstremt farligt og at sikkerhedsforanstaltninger, såsom iført handsker og kittel mv, personlige værnemidler, skal altid tages.
  3. Filterpapir
    1. Skær filtrerpapiret til 1 mm x 2 mm størrelse. Sættetid nok stykker af cut filter papir i FeCl3-opløsning i samme skålen.
  4. Papaverin, hydrochlorid Solution
    1. Forbered papaverin, hydrochlorid-opløsning (25 mg / ml) i vand og sterilisere opløsningen med 0,22 um filter.
  5. agarose Gel
    1. Forbered 2% agarosegel i PBS eller saltopløsning i 6-brønds vævskulturplade, ~ 1 cm tykkelse, og cut det til halvcirkel med ~ 3 cm i diameter.

2. FeCl3 induceret carotis Arteriel Skade Trombose Model

  1. Kirurgiske procedurer for Trombose Model
    1. Brug 8 - 12 uger gamle C57BL6 mus (eller andre stammer som nødvendigt). Bedøver mus med blandingen af ​​ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Bekræft dybden af ​​anæstesi ved tå klemme.
      BEMÆRK: Denne mængde af ketamin / xylazin er tilstrækkelig til at holde dyret i en stabil anæstesi og ingen smerter (respons til tå klemning) i mindst 1 time.
    2. Fjern pels på hals og øvre bryst med en lille dyr elektrisk Clipper. Hårfjerningscreme er ikke nødvendig. Påfør neutral øje råolie salve på øjnene for at undgå tørhed under anæstesi.
    3. Fastgør musen i liggende stilling på låget af 15 cm vævskulturplade. Brug en lang bånd (~ 10 cm) for at sikre hind lemmer og underkrop, og to stykker af små bånd (2 cm x 0,5 cm) for at sikre forben. Brug en 4-0 sutur til wrap omkring fortænder, tape de to ender af suturen til låget til at holde musen hals lige (figur 2).
    4. Placer plade med musen hovedet mod operatøren under en kirurgisk lyskilde.
    5. Steriliser operationsstedet med alkohol pad. Brug Micro-Adson tang til at holde huden og bruge en kirurgisk saks til at lave et lille snit (2 - 3 mm).
    6. Hold huden af ​​snittet med pincet og indsætte kirurgiske sakse med kæberne lukkede i indsnittet. Skub saksen subkutant mod manubrium eller hagen, og derefter åbne en saks til at befri huden fra det subkutane lag.
    7. Skære huden med de kirurgiske sakse til at gøre en midtlinjeincision fra manubrium til niveauet af hyoidbenet (figur 3A og 3B). Ligeud dissekere den tynde fascia (stiplet linje, i (figur 3B og 3C, blå pile).
      BEMÆRK: manubrium (sort pil i figur 3C) og luftrøret (T i figur 3C) vil ses efter dette trin.
    8. Hold det bløde væv og huden ses til højre for manubrium med Graefe pincet, indsætte hæmostat under fascia mod klokken 2 positionen (gul stiplet linie i figur 3C), åbne kæber arterieklemmen at frigøre halsvene fra omgivende væv.
    9. Skær fascia, blødt væv og hud mod klokken 2 positionen (figur 3C) med de kirurgiske sakse at eksponere den højre halsvene (figur 3D, pil).
    10. Tegn omkring 200-300 pi rhodamin 6G løsning med en 1 ml sprøjte med 22 G nål, og derefter ændredet til 30 G nål.
      BEMÆRK: Dette beskytter 30 G nål fra beskadigelse af sin fine spids. Direkte tegning rhodamin 6G løsning med 30 G nål vil ikke skade spidsen; dog røre beholderens væg uheld vil forårsage skader, hvilket kan gøre injektion vanskelig.
    11. Skyl 30 G nål ved langsomt at skubbe ud rhodamin 6G løsning, sørg for ingen luftbobler tilbage i sprøjten eller kanylen. Hold 100 pi rhodamin 6G opløsning til injektion.
    12. Bend 2 - 3 i mm spidsen af nålen i en 90 ° vinkel med nåleholderen, hvilket vil forhindre nålen indføres for dybt til halsvenen og gør injektionen lettere kontrolleret (figur 3D).
    13. Injicer rhodamin 6G opløsningen i højre halsvene at mærke blodplader. For at stabilisere sprøjten og holde nålen på plads, hold sprøjten med den ene hånd og nålen med Graefe pincet med en anden hånd under injection.After injektion, klemme injektionsstedet med Graefe pincet for at undgå blødning.
    14. Åbn kæberne af arterieklemmen og indsætte det i henhold til Graefe pincet til at klemme karvæggen af ​​injektionsstedet, og derefter ligere injektionsstedet med en 6-0 sutur.
      BEMÆRK: Som et alternativ til trin 2.1.15, og pres på injektionsstedet med en finger i 2 min vil stoppe blødningen; men denne metode har en risiko for at forårsage yderligere blødning, hvis blodproppen ved injektionsstedet fjernes ved et tilfælde.
    15. Ligeud dissekere det bløde væv og fascia omkring venstre mandibulære kirtel med arterieklemmen og Graefe pincet og træk pakdåsen mod klokken 7 positionen (figur 3E) for at afdække venstre sternocleidomastoideus muskel (blå pil i figur 3E).
    16. Ligeud dissekere fascia (figur 3E, stiplet linje) mellem venstre sternocleidomastoideus muskler og omohyoid muskel eller sternohyOID muskel (figur 3E, grøn pil) placeret til venstre side af luftrøret med arterieklemmen.
    17. Pass en nål med 6-0 silke sutur (ca. 15 cm lang) under midten af musculus sternocleidomastoideus (blå pil i figur 3E), satte de to ender af suturen sammen og trække suturen sideværts mod klokken 10 positionen .
      BEMÆRK: Denne procedure skal udføres omhyggeligt for at undgå skade af den venstre halsvene, som er placeret uden for musculus sternocleidomastoideus.
    18. Ligeud adskille den tynde sternohyoid muskler og / eller omohyoid muskel til at udsætte halspulsåren (CA) (figur 3F pil) efter at trække væk musculus sternocleidomastoideus. Skær sternohyoid muskler og / eller omohyoid muskel som nødvendigt. Brug arterieklemmen at adskille det bløde væv fra CA uden at røre CA.
      BEMÆRK: CA er ledsaget af vagusnerven, den hvide struktur set i figur 3F).
    19. Bruge en fin spids pincet til at afhente den laterale fascia omkring CA samtidig undgå vagusnerven og CA. Brug en anden fin spids pincet til punch et hul på fascia mellem CA og vagus nerve.
    20. Før krogen gennem hullet og løft forsigtigt CA, og derefter placere de fine spids pincet under CA. Flyt krog og pincet i modsatte retninger langs CA at fratage adventitial blødt væv. Gratis mindst ~ 5 mm længde CA (figur 3H, blå pil) fra omgivende væv.
    21. For at blokere baggrund fluorescens, skal du trykke på enden af en sort plastik kaffe omrører til flade, går på tværs af kaffen omrører i en 3 mm stykke, og derefter klippe langs langs de fold kanter for at få to stykker "U" form plast (figur 3H, grøn pil).
      22. (figur 3H, grøn pil). gælder Umiddelbart 2-3 dråber saltvand for at undgå tørring af CA.
  2. Real time optagelse Video
    1. Overfør musen og pladen låg sammen til mikroskopet scenen og anbring dem i en stilling under den 10X vand linse. Fylde rummet mellem 10X objektiv og CA med saltvand.
    2. Start digital videooptagelse program, og starte en ny fil og navngive det i overensstemmelse hermed. Optag normale fartøj billeder og skrive ned rammen nummer, når videooptagelsen er stoppet.
      BEMÆRK: Henvisning videooptagelsen software i computeren til optagelse. Vi bruger digital videooptagelse software og de følgende beskrivelser er baseret på denne ansøgning.
      BEMÆRK: Da mekanisk trauma kan skade endothelium og føre til thrombedannelse 20, er det nødvendigt at bekræfte, at der ikke er nogen kirurgisk skade på karvæggen før FeCl3 skade. Det er også nødvendigt at bekræfte, at der ikke er nogen resterende væv omkring CA, som kan danne en barriere og formindske virkningen af FeCl3-induceret skade. Skriv ned rammen antallet af records vil gøre det nemt at analysere de videoer efter forløbne gange senere.
    3. Flyt musen med plade låg ud af 10X objektiv. Fold et hjørne af et stykke køkkenrulle til at lave en tynd og fin spids og bruge det til forsigtigt skamplet saltvand omkring CA (undgå at røre CA) samt andre steder i det kirurgiske område. Dette er vigtigt for at undgå fortynding af FeCl3 opløsning anvendes.
    4. Bruge en fin spids pincet og afhente et stykke filtrerpapir mættet med FeCl3 løsning og placere den direkte på CA og holde det på stedet i 1 min.
      BEMÆRK: To støtte visualisering af blodbanen og høst nøjagtige data, placere filtrerpapiret tæt på den distale ende af den eksponerede CA (fig 3I) og efterlade et kort segment ved den proximale sted (grøn pil i figur 3I) for observering blodgennemstrømningen sent fase (se nedenfor).
    5. Fjernes filtrerpapiret (denne gang er defineret som starten på "efter skade") og skyl CA med saltvand (mindst 2 ml).
    6. Sæt musen med pladen låg tilbage til 10X linsen; observere fartøjet og begynder at optage videobilleder. Skriv ned videorammen nummer i slutningen af ​​det første minut af optagelse.
      BEMÆRK: Trombedannelse identificeres ved akkumulering af de fluorescerende blodplader, som er observeret i realtid videobilleder på computerskærmen eller under mikroskop. Optag videobilleder umiddelbart efter at sætte musen tilbage under mikroskop. Hold optagelse til slutningen af ​​det første minut efter fjernelse af filter papir. Overhold hele fartøj fra den distale til de proksimale sider for at få oplysninger om skaden, og derefter fokusere på det område af interesse (normalt er centrum for det skadede område) for yderligere billeddannelse.
    7. Optag videobilleder i 10 sek hvert minut i de første 10 minutter (f.eks 2:55 til 03:05) og derefter 10 sek hvert andet minut indtil slutningen af eksperimentet. Skriv ned rammen numre, når hver optagelse er stoppet.
      BEMÆRK: endepunkter i modellen er: 1) når blodgennemstrømningen er ophørt for> 30 sek; eller 2) hvis okklusion ses ikke i 30 min efter skade. I dette tilfælde skal du bruge 30 min til statistisk analyse. Sæt Eksponeringstid af videooptagelse som 10 ms i begyndelsen, så det vil være let at observere blodgennemstrømningen over tromber. Når tromber bliver store og fluorescensen mætter kameraets sensor, bliver det vanskeligt at identificere blodgennemstrømningen i tromber. For at løse dette problem, skal du flytte imaging cePil til den proximale uskadt (figur 3I, grøn pil) hvor blodgennemstrømningen kan stadig tydeligt ses. Vi øger også Expose Tid til 15 eller 20 ms, når der fokuseres på den proksimale un-beskadigede sted, så kan observeres blodgennemstrømningen mere tydeligt. Når blodstrømmen vil ophøre, talrige større celler (leukocytter) begynder at rulle på karvæggen ved den proximale site af thromben. Flow stopper normalt inden 2 - 3 i min efter fremkomsten af ​​de store celler. Skriv ned Expose Time om optagelsen ark, hvis den ændres. Det tager sædvanligvis ca. 30 min fra anæstesi til slutningen af ​​eksperimentet, hvis der blev anvendt de normale vildtype C57BL6-mus.
      FORSIGTIG BEMÆRK: Brug ikke den hvide aggregeret blodplade blodprop som tegn på blodgennemstrømningen ophør, som ikke vil give en nøjagtig data, og det er påvirket af eksponeringstiden. Den hvide blodprop dækkede karhulrummet betyder ikke blodgennemstrømningen ophørt (se den repræsentative video 1).

3. FeCl3 induceret mesenterialarterie / venetrombose Model

  1. Bedøver 8-12 uger gamle C57BL6 mus som nævnt i § 2.1.1. Påfør dyrlæge salve på øjnene for at undgå tørhed under anæstesi.
  2. Injicer Papaverin opløsning (i alt 0,4 mg / mus) intraperitonealt til inhibering gut peristaltik.
  3. Fjern pels på halsen og maven med et dyr elektrisk Clipper. Hårfjerningscreme er ikke nødvendig.
  4. Fastgør musen i liggende stilling på låget af 15 cm vævskulturplade. Brug fire stykker lille bånd (2 cm x 0,5 cm) for at sikre alle ben. Brug en 4 -0 sutur til wrap omkring fortænder, tape de to ender af suturen til låget for at holde halsen lige (figur 2).
  5. Følg procedurerne 2.1.4 -2.1.15 for at eksponere halsvenen til injektion af rhodamin 6G at mærke blodplader.
  6. Udfør en midtlinjeincision gennem huden fra formet som et sværd til maven ved hjælp af de kirurgiske sakse (figur 4A). Saml den midterste bughinden (også kaldet linea alba, figur 4A, pil) med Graefe pincet, som er klar og har ingen blodkar, løft ca 2 - 3 i mm høje, bekræfter ingen tarm under skærelinjen, og klippe bughinden åben på langs med de fine sakse (figur 4B).
  7. Re-sikre mus til højre sideleje. Placer halvcirkel agarosegel tæt på maven, og forsigtigt eksteriorisere tarmene og sprede det på toppen af gelen med Graefe pincet (figur 4C). Brug anden grene for trombose eksperimentet (figur 4C, pil).
    BEMÆRK: Brug arterieklemmen eller Micro-Adson pincet til at hjælpe med at eksteriorisere tarmene. Undgå at såretarm og fartøjet.
  8. Placer 5 - 6 dråber saltvand for at holde fugten i tarmen og fartøjet. Overfør musen med pladen låg sammen til mikroskopet scenen og placere i passende position under 10X tør linse.
    BEMÆRK: Brug en tør linse fordi jejunoileal membran ikke kan holde saltvand. Sørg for at droppe saltvandsopløsning på de udsatte væv for at holde dem fugtige.
  9. Dup saltvand omkring mesenteriske arterie og vene før behandling.
  10. Bruge en fin spids pincet til at afhente et stykke filtrerpapir mættet med 12,5% FeCl3 løsning og placere den direkte på mesenteriske arterie og vene i 1 min (figur 4D). Fjern filteret papir (dette tidspunkt defineres som starten på "efter skade"), og skyl den sårede mesenterialarterie og vene med saltvand (mindst 2 ml).
  11. Sætte musen med pladen låg tilbage under 10X tørt linse; observere skibene og begynder at recOrd videobilleder som nævnt i 2.2).
    BEMÆRK: endepunkter af dette eksperiment er: 1) når blodgennemstrømningen er ophørt for> 30 sek; eller 2) hvis okklusion ikke kan ses i 30 min efter skade, og i dette tilfælde bruge 30 min til statistisk analyse.
  12. Ved slutningen af ​​forsøget, aflive mus ved hjælp af overdosis ketamin / xylazin (200/20 mg / kg), efterfulgt af cervikal dislokation efter nogen ånde og hjerte bankende bekræftes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arteria carotis Trombose Model
I mus med C57BL6 baggrund, anbefaler vi at bruge 7,5% FeCl3 at behandle skibet i 1 min som udgangspunkt. Under behandlingen på 7,5% FeCl3 er grænser skadede område og normal karvæggen let identificeres under mikroskop (se online video 1), hvilket tyder på, at endotel lag betydeligt beskadiget. Den tromber dannet umiddelbart efter FeCl3 behandling, og observeres i alle WT C57BL6 mus 1 min efter skade. Det indledningsvist dannede tromber er ustabile og dele af dem er normalt skyllet væk af blodet, så de dannede tromber bliver mindre til 2 - 3 min efter skade. Thromber begynder at forstørre 3-4 minutter efter fjernelse af filtrerpapir, og disse senere dannede tromber er stabile og normalt ikke vaskes væk. Den gennemsnitlige okklusiv tid er 11,3 ± 3.16 min i C57BL6 mus (n = 14), når 7,5% FeCl 3 anvendes 6,7,19 (figur 5A og online video 1). I de tidligere undersøgelser har vi demonstreret, at både reducere og forøgelse af FeCl3 koncentrationer mindsker forskellen mellem et anti-trombotisk musestamme og WT-mus 6; Fra vores erfaring, behandling af carotidarterien med 7,5% FeCl3 i 1 min er tilstrækkelig til at opfylde alle vores formål. Ud over at teste funktionen af specifikke gener ved hjælp knockout-mus 7,8,16,19,21, følgende er fire repræsentative forsøg med denne model:

Intravenøs Perfusion af vævstype-plasminogenaktivator Mediated Thrombolyse
Vævstype-plasminogenaktivator (tPA) er et af de FDA-godkendte lægemidler til trombolyse behandling i USA 22. Vi anførte således tPA-medieret trombolyse i carotidarterien thrombosemodel. Trombose varinitieret med 7,5% FeCl3 og fik lov at dannes i 5 min før TPA (1 mg / kg legemsvægt) blev perfunderet via en halsvene kateter (22GA). Som vist i figur 5B og online video 2, thromben kontinuerligt forstørret og besatte cirka 50% af hulrummet 5 min efter skade. Den tromber fortsatte med at udvide efter tPA perfusion tyder på, at tPA ikke påvirker trombocyt aktivering og aggregation. Trombolyse startede omkring 4 minutter efter tPA injektion. Den dannede tromber blev fundet at gennemgå størrelse variationer gentagne gange i løbet af 30 min observationsperioden og ingen fartøj okklusion skete i dette tilfælde. Disse data viste klart, at tPA ikke helt kan hæmme blodplade-medieret trombedannelse, selv om det fører til trombolyse. Derfor vi forestiller at fremtidige eksperimenter under anvendelse af FeCl3-induceret arteriel trombose-model kan anvendes til at evaluere trombolytisk og andre supplerende behandlinger, der kan have en fremtrædende prevtant effekt på thrombedannelse.

Perfusion af PAR4 antistof til mus Hæmmer Trombose
Protease aktiveret receptor 4 (PAR4) er en G-protein koblet receptor (GPCR) på trombocytter som aktiveres ved proteolytisk spaltning af N-terminalen exodomænet 23 og efterfølgende fører til trin i blodpladeaktivering. Den Nieman Lab har genereret en ged polyklonalt PAR4 antistof (CAN12), der er rettet mod den anioniske klynge af PAR4, og forsinker PAR4 spaltning og dermed påvirke et afgørende skridt for PAR4 blodpladeaktivering 24. Ved perfusion af 1 mg / kg af denne antistof til C57BL6-mus, fandt vi, at inhibering af PAR4 spaltning signifikant forlænget gange for at okklusiv thrombedannelse i 7,5% FeCl3-induceret carotidarterie thrombosemodel (figur 5C og online video 3). Dette viser, at FeCl3-induceret thrombosemodel Cen bruges til at vurdere virkningerne af trombocythæmmende midler og karakterisere potentielle terapeutiske strategier.

Nanopartikel-medieret Thromber-specifik målretning
Rapid koagel-fjernelse at genetablere blodgennemstrømningen er afgørende ved behandling okklusive vaskulære sygdomme, herunder iskæmisk slagtilfælde og myokardieinfarkt. Systemisk levering af thrombolytiske lægemidler, såsom tPA viste ovenfor, kan lysere det dannede tromber, men kan ikke fuldstændig forhindre blodpladeaktivering og re-aggregering / okklusion. Derudover kan systemisk direkte levering af sådanne serin protease agenter føre til vilkårlige off-target handling, der fører til de store bivirkninger, herunder blødning. Den Sen Gupta lab har manipuleret blodplade-inspirerede nanopartikler-baserede syntetiske levering køretøjer der kan binde til koagulere-associerede aktiverede blodplader og proteiner under hæmodynamisk shear flow 25-27. Vi derfor undersøgt, om disse nanopartikler kanbinder til aktivt danner tromber i en arterie.

Som nævnt i eksperiment for tPA perfusion blev et kateter indsat i halsvenen og forbundet til en injektionspumpe til injektion af nanopartikel på ensartet strømningshastighed. I dette eksperiment blev ingen fluorescens farvestof injiceres i musen til at mærke blodplader. I stedet blev nanopartiklerne mærket med Rohdamine B; derfor var de i stand til at blive observeret under intravital mikroskop. Den trombose blev initieret med 7,5% FeCl3 behandling i 1 min som tidligere nævnt. Da der i WT mus sås en signifikant mængde tromber sig at danne 5 min efter skade, valgte vi dette tidspunkt til injektion af nanopartikler til at opdage, hvis nanopartiklerne binder effektivt til de aktivt danner tromber. Som vist i figur 5D og online video 4, efter injektion af fluorescerende nanopartikler, var vi i stand til at identificere en mountain-formetblodprop, der fik gradvis skal dækkes af de fluorescerende partikler. Disse undersøgelser viser anvendeligheden af FeCl3 induceret trombose model til at vurdere kapacitet målretning (og efterfølgende terapeutiske virkning) af blodprop målrettet partikulære drug delivery-systemer.

Rolle Red andre end Blodplader i trombedannelse Blood Cells.
Nylige undersøgelser har antydet, at røde blodlegemer (RBC) spiller vigtig rolle i FeCl3-induceret thrombosemodel 28 og de ​​er de første klæbende blodkomponent til de sårede karvæg 29,30. For at udforske dette fænomen, vi mærkede RBC med 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchloratmateriale (Dil, 10 pM slutkoncentration). De Dil-mærkede RBC blev vasket to gange med PBS og resuspenderet i saltvand med 35% hæmatokrit. Den Dil-mærkede RBC suspension (100 pi per mus) var injicereed ind i de trombocytopeniske mus, der er blevet letalt bestrålede 5 dage før eksperimentet 19. Disse trombocytopeni mus har betydelig nedsat antal blodplader, hvilket vil øge risikoen for RBC afventende til karvæggen, hvis de gør. I modsætning til de eksperimenter med fluorescensmærkede blodplader (figur 5), blev der ingen tydelig akkumulering af fluorescerende celler fundet på karvæggen efter vaskulær læsion (figur 6A, online v IDEO 5). Dog sammen med dannelsen af blodpladerige thrombi, RBC'er begyndte, at akkumulere i tromben, der illustrerer formen af blodproppen (figur 6A). Immunofluorescens-farvning af de sårede carotidarterie vist, at de store celler adhæreret til karvæggen er blodplader (CD41 positiv, grøn), mens de Dil-mærkede RBC hovedsageligt er fanget i thrombi (figur 6B & C). Disse undersøgelser viser, atFeCl3-induceret thrombosemodel kan udnyttes ved at få mekanistisk indsigt i cellulære og molekylære komponenter og spatio-temporale begivenheder i trombedannelse.

Mesenterial Trombose Model
For mesenteriske thrombosemodel, en høj koncentration af FeCl3 - anbefales (10 12,5%) som fartøjerne normalt er omgivet af fedtvæv, som kan hindre den FeCl3 diffusion mod karvæggen og forhindrer dermed fartøj fra FeCl3-induceret skade 7. Denne model er mere egnet til venøs trombose undersøgelse. Som vist i online video 6 blev thrombe ses omkring ~ 15 sekunder i mesenteriske vene efter topisk påføring filtrerpapiret mættet med 12,5% FeCl3 opløsning, men thrombedannelse dramatisk forsinket i mesenteriske arterie. Den gennemsnitlige tid til okklusiv trombedannelse er ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) i m esenteric vene og omkring 23 ± 9,9 minutter (n = 10) i mesenterialarterie når 12,5% FeCl3 anvendes 7.

figur 1
. Er vist Figur 1. Kirurgi Tools De minimale nødvendige værktøjer til mus kirurgi. Se listen Materialer for mere detaljerede oplysninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Mus Fiksering til kirurgi. Fastgør musen på 15 cm dyrkningsskål låg til carotidarterie trombose model eller til injektion af rhodamin 6G farvestof for mesenteriske thrombosemodel.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Arteria carotis thrombosemodel. Procedurer for at eksponere halsvenen, injektion af rhodamin 6G fluorescerende farvestof i blodsystemet og eksponering af venstre carotidarterie er vist. I (A), linjen angiver snittet fra manubrium til niveauet af hyoidbenet; i (B), blå pile angiver mandibulære kirtler, og gule stiplede linjer repræsenterer fascia mellem de mandibulære kirtler; i (C), blå pile angiver mandibulære kirtler, sort pil angiver manubrium, og stiplede gule linje angiver placeringen at skære at eksponere halsvenen; i (D), blå pil viser halsvenen; i (E), gul pil viser venstre mandibulære kirtel, blå pil indicates forlod musculus sternocleidomastoideus, stiplede gule linje angiver fascia, og grøn pil angiver omohyoid muskel eller sternohyoid muskel; i (F), blå pil viser halspulsåre, de gule stiplede linier viser den tynde sternohyoid muskler og / eller omohyoid muskel; i (G), den blå pil viser halspulsåren og grøn pil angiver vagus nerve; i (H), den blå pil viser carotidarterie og den grønne pilen angiver plast "U-form" kaffe omrører; og i (I), den blå pil viser filtrerpapiret beliggende med FeCl3-opløsning og grøn pil angiver halspulsåren. T angiver luftrør. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. mesenterialarterie og venetrombose Model. Eksponering af mesenteriske fartøjer samt FeCl3 behandling er vist. I (A), den blå pil viser linea alba, hvide fibrøst væv uden fartøj; I (B), et snit skåret alene linea alba blev vist; i (C), de blå pile angiver den anden bue af mesenteriske arterier og vener; i (D), den blå pil viser filtrerpapiret beliggende med FeCl3 løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Repræsentative Forsøg med halspulsåren thrombosemodel. (A). Trombedannelse i theC57Bl / 6 mus behandlet med 7.5% FeCl3. (B). TPA medieret thrombolytisk virkning. (C). Injektion af antistofmålretning muse thrombinreceptor PAR4 på trombose blev vist. (D). Thrombe-webstedsmålrettede nanovehicles binder specifikt til aktivt at danne tromber blev vist . Inj. P angiver injektion af partikel; og Peak B angiver peak banding af partikler til tromber. Alle billeder blev taget under samme forstørrelse. Scale bar = 300 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. rolle RBC på thrombusdannelse. (A) trombocytopenisk mus, som modtog perfusion af Dil-mærkede RBC blev underkastet halspulsåren thrombosemodel og billeder efter 7,5% FeCl (B & C). De sårede halspulsårer blev høstet, og frosne sektioner blev forberedt. Blodplader blev farvet med CD41 (grøn) og RBC'er blev vist som rød (Dil). Kerner blev farvet med DAPI. Beholderne vist i (B og C) var fra to forskellige mus. Scale barer = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: Repræsentant video af halspulsåren trombose model i vildtype (WT) mus. (Højreklik for at downloade.) Denne video viser den repræsentative trombedannelse i halspulsåren af WT mus fremkaldt af topisk anvendelse af filterpapir beliggendemed 7,5% FeCl3 opløsning. Blodplader blev mærket ved intravenøs injektion af rhodamin 6G og video er taget i sort-hvid. Den hvide masse er størknet blodplader.

Video 2
Video 2: vævsplasminogenaktivator (tPA) medieret thrombolytisk virkning påvist ved carotidarterien thrombosemodel. (Højreklik for at downloade.) Trombocyt mærkning og trombedannelse blev indledt som nævnt i video 1, og tPA blev injiceret intravenøst ​​5 min efter 7,5% FeCl3 skade.

Video 3
Video 3: antiblodpladelægemiddel, na Mely anti-protease aktiveret receptor 4 (PAR4) antistof, medieret anti-trombotisk virkning påvist ved carotidarterien thrombosemodel. (Højreklik for at downloade.) I dette eksperiment, mus modtog PAR4 antistof og rhodamin 6G injektion 10 minutter før trombedannelse blev indledt ved topisk påføring filtrerpapir beliggende med 7,5% FeCl3.

Video 4
Video 4: Nanopartikel-medieret tromber-specifik målretning. (Højreklik for at downloade.) I dette eksperiment blev halspulsåren trombedannelse indledt med 7,5% FeCl3 uden mærkning blodplader. Nanopartikel blev mærket med rhodamin B og intravenøst ​​injiceret i mus 5 min efter skade.

Video 5 "src =" / files / ftp_upload / 54.479 / 54479video5.jpg "/>
Video 5: Binding af de røde blodlegemer detekteres af carotidarterien thrombosemodel. (Højreklik for at downloade.) Røde blodlegemer (RBC) blev mærket med 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchloratmateriale (Dil, 10 uM slutkoncentration), og 100 pi af Dil-mærkede RBC (35% hæmatokrit) blev injiceret i de trombocytopeniske mus. Ingen mærkning blodplade udførtes i dette forsøg. Blodprop blev indledt som nævnt ovenfor with7.5% FeCl3.

Video 6
Video 6: Repræsentativ video af mesenteriske arterie og vene trombose model på WT mus. (Højre-click til download.) Blodplader blev mærket ved intravenøs injektion af rhodamin 6G, og trombe blev indledt topisk efter påføring ét stykke filterpapir med 12,5% FeCl3 opløsning i 1 minut. Beholderen blev observeret under 10X tørt linse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den FeCl3-induceret model er en af de mest udbredte trombose modeller, som ikke alene kan give værdifulde oplysninger om genetiske modifikationer på trombocytfunktionen og trombose 7,8,16,19,31-33, men kan også være et værdifuldt redskab til vurdering af terapeutiske forbindelser og strategier for behandling og forebyggelse af aterotrombotiske sygdomme 11,17,34-37. Her har vi vist vores ændringer og forbedringer af denne model og viste yderligere bevis for anvendeligheden af ​​denne teknik, som er tilstrækkelig følsom til at bestemme virkningerne af antikoagulerende (TPA) og trombocythæmmende lægemidler (PAR4 antistof). Ud over den mekanistisk forsøg for trombose, kan modellen også anvendes til at studere nanoteknologi-baserede, tromber målrettet lægemiddeladministration. Den kan også anvendes til påvisning af karvæggen reaktive oxygenarter (ROS) dannelse ved injektion af fluorescerende ROS indikator 21.

omhyggeligteknikker er nødvendige for at udføre disse modeller. Operatøren bør have tilstrækkelige kirurgiske færdigheder samt en dyb forståelse af vaskulær og blod cellebiologi. Flere vigtige punkter i FeCl3 inducerede halspulsåren trombose model er 6: (1) udsætter nok længde halspulsåren (~ 5 mm) for at tillade anvendelsen af filtrerpapir og efterlade en plads til at observere blodgennemstrømningen under intravital mikroskopi ved sene fase ; (2) tydeligt strippe adventitiale bløde væv omkring halspulsåren for at tillade filtrerpapiret at kontakte karvæggen direkte og producere en jævn skade; (3) bekræfter ingen mekanisk skade på karvæggen og ingen trombedannelse før anvendelse af FeCl3-mættet filterpapir; (4) ligger til grund halspulsåren med et stykke "U" formet sort plast for at adskille arterien fra omgivende væv, at blokere baggrundsfluorescens, og for at forhindre FeCl3 diffusion. Af disse strategier har vi genereret stærktreproducerbare data med vildtype C57BL / 6-mus, og i denne musestamme 7,5% FeCl3-induceret trombose tid er 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. Halsvenen injektion af rhodamin 6G at mærke cirkulerende celler kan være udfordrende. Som et alternativ kan en haleveneinjektion udføres før fastgørelse musen på 15 cm plade låg. Ved sammenligningen til carotidarterien model, den mesenteriske arterie og vene model er lettere og mindre kirurgisk intensiv. Som nævnt i resultatafsnittet, på grund af dækningen af ​​de skibe fedtvæv, det mesenteriske trombose model er dog bedre til at studere venøs trombose, men kræver en større stikprøve for at minimere fejlen mellem forskellige mus.

Begrænsningen ved denne model er, at mekanismen ikke er klar og stadig kontroversiel. Indledningsvis blev den mekanisme af denne model menes at være, at FeCl3 frembragte ROS induceret blotlægning af endotelceller, og subsequently ført til udsættelse af blodkomponenter til prothrombotic subendotel, at gøre trombocytadhæsion, aggregering og trombedannelse 6,11. Ved rekonstituering af blodplader forbehandlet med GPVI antistof til de trombocytopeniske mus, har vi vist, at FeCl3-modellen afhænger blodplade GPVI, og blokering blodplade GPVI dramatisk inhiberede FeCl3-induceret tromber formation 19. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere rapporter 38 og foreslår, at FeCl3 model kan være mere tilbøjelige til at efterligne patofysiologien af menneskets aterosklerotisk plaque ruptur medieret trombose 6. Imidlertid har flere nylige undersøgelser foreslået nye mekanismer, herunder adhæsion af røde blodlegemer til karvæggen samt fysisk-kemisk effekt af FeCl3-induceret aggregering af plasmaproteiner og blodlegemer 29,30. Disse nye indsigter antyder de potentielle mekanismer af denne model kan være mere komplekse.

Ved perfusion af Dil-mærkede RBC ind i de trombocytopeniske mus og derefter inducere FeCl3 -triggered skade på halspulsåren med 7,5% FeCl3, fandt vi, at de store celler adhærerer til de sårede karvægge er blodplader (figur 6 og online video 5 ). Vi fandt ikke indlysende RBC vedhæftning, og ophobningen af ​​RBC i tromber syntes mest sandsynligt, at være et resultat af klemning. Vores resultater matcher begreberne primær og sekundær hæmostase 39. Forskellen i vores observation fra de tidligere rapporter kan være fra hypoxi og hæmodynamisk forandring som i den undersøgelse, som Barr og kolleger 30, hvor FeCl 3 sårede halspulsårer til scanning elektronmikroskopi undersøgelse udarbejdet i mus, der havde venstre hjertekammer tidligere eksponeret uden bistand fra en mekanisk ventilation. Blood koncentration og hæmodynamik ilt vil blive drastisk reduceret som både pulmonal oghjertefunktionen vil blive påvirket umiddelbart efter brystet er åbnet uden mekanisk ventilation. Oxygen deprivation har længe været forbundet med udløsning af prokoagulant pathway og trombose 40 og kan også forbedre RBC adhæsion. En anden nylig publikation har vist, at behandling af halspulsåren med en meget høj koncentration af FeCl3 (20%) i 5 eller 10 min fører til en steady state koncentration af FeCl3 ved ~ 50 mM i lumen af den beskadigede kar 29 . De således direkte infunderes 50 mM FeCl3 i forskellige blodkomponenter og undersøgte effekten af FeCl3 om sammenlægning ex vivo, hvilket førte dem til at foreslå en mekanisme roman, 2-fase for virkningen af FeCl3 i trombedannelse 29. Selvom ganske interessant, Resultaterne fra denne undersøgelse skal fortolkes med forsigtighed, da det ikke repræsenterer FeCl3 model almindeligt anvendt. I modsætning til den høje koncentration af FeCl 3 (20%, 1 M som vist i papiret) og lang behandling (5 eller 10 min), vores tidligere undersøgelser samt Barr et al. har vist, at 10% FeCl3 behandling i 1 minut er nok til at inducere hurtig okklusiv thrombedannelse i halspulsåren inden 7 min 6,30. Endvidere i de fleste af forsøgene under anvendelse af FeCl3-model, en yderligere lav koncentration af FeCl3 (5 - 7,5%) anvendes.

En anden begrænsning ved denne model er, at på grund af den alvorlige oxidativ skade på endotelet samt endotel blottelse efter FeCl3 behandling, kan denne model være ikke et passende værktøj til at studere endotel inflammation associeret trombose. Men ved brug af disse teknikker til fremstilling halspulsåren i kombination med perfusion af fluorescens-mærkede leukocytter, kan vi teste adhæsion og rulning af leukocytterne på inflammatoriske endotel 41.

I SummAry, vi har forfinet og standardiseret FeCl3-induceret vaskulær læsion model til at producere en meget reproducerbar skade på carotidarterien og kvantificere blodgennemstrømning ophør tid nøjagtigt ved intravital mikroskopi. Denne model er tilstrækkelig og følsomme til at teste antikoagulerende og antitrombotiske lægemidler, og er også velegnet til studier af tromber målrettet nanomedicin. I kombination med knoglemarvstransplantation, blodplade infusion i de trombocytopeniske mus eller direkte intravaskulær injektion af lægemiddelkandidater, har vi påvist, at det er en bekvem, enkel og følsom værktøj til at studere thrombose in vivo 7-10,16,19,42,43 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Tags

Medicin trombose carotidarterie mesenterisk arterie / vene ferrichlorid nanopartikel-medieret lægemiddeladministration thrombolyse thrombe mekanisme intravital mikroskop
Ferrichlorid-induceret murin Trombose Modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A.… More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter