Summary
Vi rapporterar en raffinerad förfarandet för järnklorid (FeCl3) -inducerade modeller trombos på hals och mesenterica liksom ven, kännetecknad effektivt med intravital mikroskopi för att övervaka tid att ocklusiv trombbildning.
Introduction
Arteriell trombos (blodpropp) är en vanlig komplikation vid många systemiska sjukdomar associerade med kronisk inflammation, inklusive ateroskleros, diabetes, fetma, cancer och kroniska autoimmuna reumatologiska sjukdomar. Tromber som förekommer i den arteriella cirkulationen stammen från olämpligt trombocytaktivering, aggregering och efterföljande koagulativa mekanismer, och är inblandade i hjärtinfarkt, stroke och extremiteter förlust. Kärlväggen är ett komplext system som omfattar flera celltyper och påverkas av en mängd yttre faktorer inklusive skjuvspänning, cirkulerande blodceller, hormoner och cytokiner, såväl som uttryck av antioxidant proteiner i kärlväggen. In vitro-försök kan inte replikera denna komplexa miljö och därför in vivo-studier med hjälp av djurmodeller är avgörande för att möjliggöra bättre förståelse för de mekanismer som är involverade i trombotiska störningar.
Möss har visats ha simnande mekanismer för människor i form av trombos, åderförkalkning, inflammation och diabetes 1,2. Vidare kan transgena och knockoutmöss att skapas för att testa funktionen av specifika genprodukter i en komplex fysiologisk eller patologisk miljö. Sådana studier efterlikna mänsklig patologi och kan ge viktig mekanistisk information relaterad till upptäckten av nya vägar och terapier, samt ge viktiga detaljer i karakterisera läkemedelseffekter på trombos.
Patologiska arteriella tromber uppstå på grund av endotelskiktet skada eller dysfunktion och exponering av blodströmmen till den subendoteliala matrisen 3,4. Olika trombos modeller har utvecklats för att inducera denna endotelskada såsom mekanisk skada, fotoreaktiva föreningen Rose Bengal-baserade oxidativ skada och laser skada 5. I detta spektrum, Järnklorid (FeCls 3) -inducerad kärlskada är en allmänt använd modell av trombos. Detta reagens närappliceras på den yttre aspekten av fartyg inducerar oxidativ skada på vaskulära celler 6-8, med förlust av endotel cellskyddet från cirkulerande blodplättar och komponenter i koagulationskaskaden. Den FeCl3 Modellen är enkel och känslig för både antikoagulerande och anti-trombocyter droger, och har utförts på halspulsådern och lårbensartärerna, hals vener och mesenteriska och cremasteric arterioler och venoler hos möss, råttor, marsvin och kaniner 6-15.
En mätbar parameter i denna modell är den tid som förflutit från skada för att slutföra kärlocklusion, mätt som blodflödet upphör med en Doppler flödesmätare eller under direkt observation med intravital mikroskopi 6,7,9. Ett intervall av tider mellan 5 till 30 min har rapporterats i olika studier i C57BL6-möss 7-10,16, vilket antyder att FeCl 3 koncentrationer, typer av anestesi, kirurgiska tekniker, mus ålder, genomisk bakgrund, metoden för mätning av bLood flöde, och andra miljövariabler har betydande effekter i den här modellen. Denna breda variationen gör det svårt att jämföra studier från olika forskargrupper och kan göra detektion av subtila skillnader svårt.
Med en vision att minimera sådana variabilitet och etablera ett likformigt reproducerbar in vivo modellsystem har vi förfinat FeCl3-inducerad halspulsådern modell som gör data mycket reproducerbara med minimal variation 6-10,16-19. I detta dokument beskriver vi och dela kunskaper och rapportera flera representativa experimentella exempel som kan dra nytta av denna modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden och manipulationer av djur har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer (IACUC) The Cleveland Clinic i enlighet med United States Public Health Service politik om human vård och användning av djur, och NIH Guide för vård och användningen av försöksdjur.
1. Förberedelser:
- Fluorescerande färgämne för Märkning Trombocyter
- Förbereda rodamin 6G-lösning, 0,5 mg / ml, i saltlösning och sterilisera lösningen med 0,22 pm filter.
- FeCl3 lösning
- Göra en ny stamlösning av 30% FeCl3 (vattenfri, är lika med 1,85 M) i rent vatten, och filtret med 0,45 pm filter. Förbereda 5 ml färskt FeCl3-lösning vid den önskade koncentrationen [t ex 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) och 12,5% (0,771 M)] av späda 30% FeCl3 lösning med vatten ina 6 cm vävnadsodlingsskål och hålla locket stängt.
OBS: Genom att använda odlingsskålen gör det lättare att plocka upp filterpapper mättat med FeCl3 lösning än att ta upp från en smal behållare, såsom ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. FeCl3 är extremt farligt och att försiktighetsåtgärder, såsom handskar och labbrock etc., personlig skyddsutrustning, alltid bör vidtas.
- Göra en ny stamlösning av 30% FeCl3 (vattenfri, är lika med 1,85 M) i rent vatten, och filtret med 0,45 pm filter. Förbereda 5 ml färskt FeCl3-lösning vid den önskade koncentrationen [t ex 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) och 12,5% (0,771 M)] av späda 30% FeCl3 lösning med vatten ina 6 cm vävnadsodlingsskål och hålla locket stängt.
- filter~~POS=TRUNC
- Skära filterpapperet till en mm x 2 mm storlek. Blötlägg tillräckligt bitar av snittet filterpapper i FeCl3 lösning i samma skålen.
- Papaverinhydroklorid Lösning
- Förbereda papaverin hydrokloridlösning (25 mg / ml) i vatten och sterilisera lösningen med 0,22 pm filter.
- Agarose Gel
- Förbereda 2% agarosgel i PBS eller saltlösning i 6-brunnars vävnadsodlingsplatta, ~ 1 cm tjocklek, och cut det till halvcirkel med ~ 3 cm diameter.
2. FeCl3 Induced Carotid arteriell skada trombosmodell
- Kirurgiska ingrepp för trombosmodell
- Använd 8 - 12 veckor gamla C57BL6 möss (eller andra stammar som är nödvändiga). Söva möss med blandningen av ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Bekräfta djupet av anestesi genom tå nypa.
OBS: Denna mängd ketamin / xylazin är tillräcklig för att hålla djuret i stabil anestesi och ingen smärta (svar på tå nypa) under minst en timme. - Ta päls på halsen och övre bröstet med ett litet djur elektrisk klippare. Hårborttagningskräm är inte nödvändigt. Applicera neutral petroleum ögonsalva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Säkra musen i ryggläge på locket till 15 cm vävnadsodlingsplatta. Använd ett långt band (~ 10 cm) för att säkra hind ben och underkropp, och två bitar av små band (2 cm x 0,5 cm) för att säkra frambenen. Använd en 4-0 sutur att linda runt framtänderna, tejpa de två ändarna av suturen på locket för att hålla musen halsen rak (Figur 2).
- Placera plattan med musen huvudet mot operatören i en kirurgisk ljuskälla.
- Sterilisera kirurgiska stället med våtservetten. Använda Micro-Adson pincett för att hålla huden och använda en kirurgisk sax för att göra ett litet snitt (2-3 mm).
- Håll huden av snittet med pincett och sätt kirurgisk sax med backarna stängda i snittet. Tryck saxen subkutant mot manubrium eller haka, och sedan öppna sax för att befria huden från den subkutana vävnaden.
- Skära in i huden med de kirurgiska sax för att göra ett mittlinje snitt från manubrium till nivån av tungbenet (Figur 3A och 3B). Rakt på sak dissekera den tunna fascia (streckad linje, i
OBS: manubrium (svart pil i figur 3C) och luftstrupen (T i figur 3C) kommer att ses efter detta steg. - Håll den mjuka vävnaden och huden sett till höger om manubrium med Graefe pincett, sätta in hemostat under fascia mot klockan två positionen (gul streckad linje i figur 3C), öppna käftar hemostat för att befria halsvenen från omgivande vävnad.
- Skär fascia, mjukdelar och hud mot klockan två positionen (Figur 3C) med de kirurgiska sax för att exponera rätt halsvenen (Figur 3D, pil).
- Rita om 200-300 pl rodamin 6G lösningen med en 1 ml spruta med 22 G nål, och sedan förändringden till 30 G-nål.
OBS: Detta skyddar 30 G-nål från skador av sin fin spets. Direkt dra rodamin 6G lösning med 30 G nål skadar inte spetsen; dock röra behållarväggen misstag kommer att orsaka skador, vilket kan göra injektion svårt. - Spola 30 G-nål genom att långsamt trycka ut rodamin 6G lösning, se till att inga luftbubblor finns kvar i sprutan eller nålen. Håll 100 pl rodamin 6G lösning för injektion.
- Böj 2-3 mm nålspetsen till en 90 ° vinkel med nålhållaren, som kommer att förhindra att föra in nålen alltför djupt för att halsvenen och gör injektionen lättare att kontrollera (Figur 3D).
- Injicera rodamin 6G lösningen i högra halsvenen för att märka blodplättar. För att stabilisera sprutan och hålla nålen på plats, håll sprutan med ena handen och nålen med Graefe pincett med en annan hand under injection.After injektion, klämma injektionsstället med Graefe pincett för att undvika blödning.
- Öppna käftar hemostat och sätt in den under Graefe pincett för att klämma kärlväggen av injektionsstället, och sedan ligera injektionsstället med en 6-0 sutur.
OBS: Som ett alternativ till steg 2.1.15, applicering av tryck på injektionsstället med ett finger i 2 minuter kommer stoppa blödningen, emellertid har denna metod en risk för att orsaka ytterligare blödning om koaglet vid injektionsstället avlägsnas av misstag. - Rakt på sak dissekera den mjuka vävnaden och fascia runt vänster mandibularlymfknutorna körtel med hemostat och Graefe pincett och dra körtel mot klockan 7 positionen (figur 3E) att exponera vänster sternocleidomastoideus (blå pil i figur 3E).
- Rakt på sak dissekera fascia (Figur 3E, prickad linje) mellan den vänstra sternocleidomastoideus och omohyoid muskel eller sternohyoid muskel (figur 3E, grön pil) till vänster sida av luftstrupen med hemostat.
- Passera en nål med 6-0 siden sutur (ca 15 cm lång) under mitten av sternocleidomastoideus (blå pil i figur 3E), sätta de två ändarna av suturen tillsammans och dra suturen i sidled mot klockan 10 positionen .
OBS: Denna procedur bör utföras noggrant för att undvika skada på den vänstra halsvenen, som ligger utanför sternocleidomastoideus. - Rakt på sak separera tunna sternohyoideus och / eller omohyoid muskler att exponera halspulsådern (CA) (Figur 3F pil) efter att dra bort sternocleidomastoideus. Skär sternohyoideus och / eller omohyoid muskler som behövs. Använd hemostat för att separera den mjuka vävnaden från CA utan att vidröra CA.
OBS: CA åtföljs av vagusnerven, den vita strukturen ses i - Använd en fin spets pincett för att plocka upp den laterala fascia runt CA samtidigt undvika vagusnerven och CA. Använd en annan fin spets pincett för att slå ett hål på ramp mellan CA och vagusnerven.
- Passera kroken genom hålet och försiktigt lyfta CA, och sedan placera fin spets pincett under CA. Flytta kroken och pincett i motsatta riktningar längs CA att strippa adventitial mjukvävnad. Gratis åtminstone ~ 5 mm längd CA (figur 3H, blå pil) från omgivande vävnad.
- Att blockera bakgrundsfluorescens trycker slutet av en svart plast kaffe omrörare platt, kapas kaffe omrörare i en 3 mm bit, och sedan klippa i längdriktningen längs vecket kanter för att få två stycken "U" -form plast (Figur 3H, grön pil).
- Använd 8 - 12 veckor gamla C57BL6 möss (eller andra stammar som är nödvändiga). Söva möss med blandningen av ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Bekräfta djupet av anestesi genom tå nypa.
- Överför locket musen och platta tillsammans mikroskop scenen och placera i en lämplig position under 10X vatten objektiv. Fylla utrymmet mellan 10X objektiv och CA med saltlösning.
- Starta digital videoinspelning program, och starta en ny fil och namnge det därefter. Spela normala fartygsbilder och skriva ner ramnumret när videoinspelningen stoppas.
OBS: Referens programvaran videoinspelning i datorn för inspelning. Vi använder digital videoinspelning programvara och följande beskrivningar är baserade på denna ansökan.
OBS: Eftersom mekanisk trauma kan skada endotelet och leda till bildande av tromber 20, är det nödvändigt att bekräfta att det inte finns någon kirurgisk skada på kärlväggen före FeCl3 skada. Det är också nödvändigt att bekräfta att det inte finns någon kvarvarande vävnaden runt CA, som kan bilda en barriär och dämpar effekten av FeCl3-inducerad skada. Skriv ner ramnumret av posterna kommer att göra det lätt att analysera filmerna enligt förflutna tider senare. - Flytta musen med platta lock av 10X objektivet. Vik ett hörn av en pappershandduk för att göra en tunn och fin spets och använda den för att försiktigt blot saltlösning runt CA (Undvik att röra CA) liksom på andra ställen i det kirurgiska området. Detta är viktigt för att undvika spädning av FeCl3 lösning som används.
- Använd en fin spets pincett och plocka upp en bit filterpapper mättat med FeCl3 lösning och placera den direkt på CA och hålla den på plats under 1 minut.
OBS: To stöd visualisering av blodomloppet och skörd korrekta uppgifter, placera filterpappret nära den distala änden av den exponerade CA (Fig 3I) och lämna ett kort segment vid den proximala stället (grön pil i fig 3I) för att observera blodflödet på sena fas (se nedan). - Ta bort filterpapper (denna tidpunkt definieras som början på "efter skada") och skölj CA med koksaltlösning (minst 2 ml).
- Sätt musen med plattan tillbaka locket till 10X objektiv; observera fartyget och börja spela in videobilder. Skriv ner video ramnumret i slutet av den första minuten av inspelningen.
OBS: Trombosbildning identifieras genom ackumulering av de fluorescerande trombocyterna, som kan observeras i realtid videobilder på datorskärmen eller under mikroskop. Spela in bilder direkt efter att sätta musen tillbaka under mikroskop. Håll inspelningen till slutet av den första minuten efter att ta bort fIlter papper. Observera hela kärlet från den distala till den proximala sajter för att erhålla information om den skada, och sedan fokusera på området av intresse (vanligen är centrum för det skadade området) för ytterligare avbildning. - Spela in videobilder för 10 sek varje minut under den första 10 min (t.ex., från 2:55 till 03:05) och därefter 10 sek varannan minut tills slutet av experimentet. Skriv ner de ramnummer när varje inspelning stoppas.
OBS: Ändpunkt i modellen är: 1) när blodflödet har upphört för> 30 sek; eller 2) om ocklusion inte syns i 30 min efter skada. I så fall 30 minuter för statistisk analys. Ställ in exponeringstiden för videoinspelning som 10 ms i början, så det blir lätt att observera blodflödet över tromber. När de tromber blir stora och fluorescensen mättar kamerans sensor, blir det svårt att identifiera den blodflödet över tromber. För att lösa det här problemet genom att flytta bild center till den proximala oskadda plats (Figur 3I, grön pil) där blodflödet kan fortfarande tydligt observeras. Vi ökar också Exponera Tid till 15 eller 20 ms när man fokuserar på den proximala un-skadade stället, så att blodflödet kan observeras tydligare. När blodflödet kommer att upphöra, många större celler (leukocyter) börja rulla på kärlväggen vid den proximala platsen för tromben. Flow stannar vanligtvis inom 2-3 minuter efter publiceringen av de stora celler. Skriv ner Exponera tid på registreringsarket om den ändras. Det tar vanligtvis omkring 30 min från anestesi till slutet av försöket, om de normala vild typ C57BL6 möss användes.
VARNING OBS: Använd inte den vita aggregerade trombocyter koagulera som ett tecken på blodflödet upphörande, som inte kommer att ge en korrekt data och påverkas av exponeringstiden. Den vita koagel täckte kärllumen betyder inte blodflödet upphört (se den representativa video 1).
3. FeCl3 Induced mesenterica / ventrombos Modell
- Söva 8-12 veckor gamla C57BL6 möss som nämns i avsnitt 2.1.1. Applicera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Injicera Papaverine lösning (totalt 0,4 mg / mus) intraperitonealt för att hämma tarm peristaltiken.
- Ta bort päls på halsen och buken med ett djur elektrisk klippmaskin. Hårborttagningskräm är inte nödvändigt.
- Säkra musen i ryggläge på locket till 15 cm vävnadsodlingsplatta. Använd fyra stycken små band (2 cm x 0,5 cm) för att säkra alla ben. Använd en 4 -0 sutur att linda runt framtänderna, tejpa de två ändarna av suturen på locket för att hålla nacken rak (Figur 2).
- Följ förfaranden 2.1.4 -2.1.15 att exponera halsvenen för injicering av rodamin 6G att märka blodplättar.
- Utföra en mittlinje snitt genom huden från xifoid till nedre delen av buken med hjälp av kirurgiska saxar (Figur 4A). Plocka upp mitt bukhinnan (även kallad linea alba, figur 4A, pil) med Graefe pincett, som är klar och har inga blodkärl, lyft ca 2-3 mm hög, bekräfta ingen tarm under klipplinjen och skär bukhinnan öppen längdled med fina sax (Figur 4B).
- Åter säkra möss till höger sidoläge. Placera halvcirkel agarosgel nära buken, och försiktigt exteriorize tarmarna och sprida det på toppen av gelén med Graefe pincett (Figur 4C). Använd den andra grenar för trombos experiment (figur 4C, pil).
OBS: Använd hemostat eller Micro-Adson pincett för att hjälpa till att exteriorize tarmarna. Undvik att skadatarm och kärlet. - Placera 5-6 droppar saltlösning för att hålla fukten i tarmen och kärl. Överför musen med lockplattan tillsammans mikroskop scenen och placera i rätt läge under 10X torr lins.
OBS: Använd en torr lins eftersom jejunoileal membran inte kan hålla saltlösning. Se till att släppa saltlösning på de exponerade vävnaderna att hålla dem fuktiga. - Blot saltlösning runt mesenteriala artären och venen före behandling.
- Använda en fin spets pincett för att plocka upp en bit filterpapper mättad med 12,5% FeCl3 lösning och placera den direkt på mesenteriala artären och venen under 1 minut (Figur 4D). Ta bort filterpapper (denna tidpunkt definieras som i början av "efter skada") och skölj den skadade mesenterica artär och ven med koksaltlösning (minst 2 ml).
- Sätt musen med plattan tillbaka locket under 10X torr lins; observera fartygen och börja recOrd videobilder som nämns i 2.2).
OBS! Ändpunkter av detta experiment är: 1) när blodflödet har upphört för> 30 sek; eller 2) om ocklusion inte syns i 30 min efter skada, och i detta fall använda 30 minuter för statistisk analys. - Vid slutet av experimentet, avliva de möss med användning av överdosering ketamin / xylazin (200/20 mg / kg), följt av cervikal dislokation efter ingen andning och hjärtslag bekräftas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Halspulsådern trombosmodell
Hos möss med C57BL6 bakgrund rekommenderar vi att du använder 7,5% FeCl3 att behandla fartyget under 1 minut som utgångspunkt. Under behandling av 7,5% FeCl3, är gränserna för skadade området och normal kärlväggen lätt identifieras under mikroskop (se online video 1), vilket tyder på att endotelskiktet skadades betydligt. Tromb bildades omedelbart vid FeCl3 behandling, och observeras i alla WT C57BL6 möss en minut efter skada. De initialt bildade tromber är instabila och delar av dem är vanligen tvättas bort av blodet, så de bildade tromber blir mindre vid 2-3 minuter efter skada. Tromber börjar att förstora 3-4 minuter efter avlägsnande av filterpapper och dessa senare bildade tromber är stabila och vanligtvis inte tvättas bort. Den genomsnittliga ocklusiv tid är 11,3 ± 3,16 min i C57BL6 möss (n = 14) när 7,5% FeCl 3 används 6,7,19 (figur 5A och online video 1). I tidigare studier har vi visat att både minska och öka av FeCl 3 koncentrationer minskar skillnaden mellan en anti-trombotisk musstam och WT-möss 6; Från vår erfarenhet, är tillräcklig för att tillfredsställa alla våra syften behandling av halsartären med 7,5% FeCl3 under 1 min. Förutom att testa funktionen av specifika gener med hjälp av knockoutmöss 7,8,16,19,21, efter fyra representativa experiment som använder denna modell:
Intravenös Perfusion av vävnad-plasminogenaktivator medierad Trombolys
Vävnadstyp (tPA) är ett av de FDA-godkända läkemedel för trombolysbehandling i USA 22. Vi observerade därmed tPA-förmedlad trombolys i halspulsådern trombosmodell. trombos varinitieras med 7,5% FeCl3 och fick bildas under 5 min innan tPA (1 mg / kg kroppsvikt) perfunderades via en halsvenen kateter (22GA). Som visas i figur 5B och online video 2, tromben kontinuerligt förstoras och ockuperade cirka 50% av lumen 5 min efter skada. Tromb fortsatte att förstora efter tPA perfusion tyder på att tPA inte påverkar trombocytaktivering och aggregering. Trombolys började ungefär fyra minuter efter tPA injektionen. Den bildade tromber befanns undergå storleksvariationer upprepade gånger under 30 min observationsperioden och ingen kärlocklusion hänt i det här fallet. Dessa data visade tydligt att tPA inte helt kan hämma blodplättförmedlad blodproppsbildning, även om det leder till trombolys. Därför föreställer vi oss att framtida experiment som utnyttjar FeCl3-inducerad arteriell trombosmodell kan användas för att utvärdera trombolytisk och andra kompletterande terapier som kan ha en framträdande föregåendedare effekt på trombbildning.
Perfusion av PAR4 antikropp mot möss hämmar Trombos
Proteas aktiverad receptor 4 (PAR4) är en G-proteinkopplade receptorer (GPCR) på trombocyter som aktiveras genom proteolytisk klyvning av dess N-terminal exodomain 23 och därefter leder till steg i trombocytaktivering. Den Nieman lab har genererat en get polyklonal PAR4 antikropp (CAN12) som riktar det anjoniska kluster av PAR4, och fördröjer PAR4 klyvning, vilket påverkar ett kritiskt steg för PAR4 medierad trombocytaktivering 24. Genom perfusion av 1 mg / kg av denna antikropp till C57BL6 möss, fann vi att hämning av PAR4 klyvning signifikant förlängd tid till ocklusiv trombbildning i 7,5% FeCl3-inducerad halspulsådern trombosmodell (Figur 5C och online video 3). Detta visar att FeCl3 -inducerad trombosmodell cen utnyttjas för att utvärdera effekterna av trombocythämmande medel och karakterisera potentiella terapeutiska strategier.
Nanopartikel-medierad Tromber specifika inriktning
Snabb koagel-borttagning för att återupprätta blodflödet är avgörande vid behandling av ocklusiva kärlsjukdomar inklusive ischemisk stroke och hjärtinfarkt. Systemisk tillförsel av trombolytiska läkemedel, såsom tPA visade ovan kan lysera den bildade tromber, men kan inte helt förhindra trombocytaktivering och åter aggregering / ocklusion. Dessutom kan system direkt leverans av sådana serinproteas medel leda till urskillningslösa off-target åtgärder, vilket leder till stora biverkningar inklusive blödning. Den Sen Gupta lab har konstruerat blodplätt inspirerad nanopartiklar-syntetisk leveransfordon som kan binda till blodpropp tillhörande aktiverade blodplättar och proteiner under hemodynamiska skjuvflöde 25-27. Vi undersökte därför om dessa nanopartiklar kanbinder till aktivt bildar tromber i en artär.
Såsom nämns i experiment för tPA perfusion genomfördes en kateter i jugularvenen och ansluten till ett insprutningspump för insprutning av nanopartiklar med jämn flödeshastighet. I detta experiment, var ingen fluorescens färgämne sprutas in i mus för att märka blodplättar. I stället var de nanopartiklar märks med Rohdamine B; Därför var de kunna observeras under intravital mikroskop. Den trombos initierades med 7,5% FeCl3 behandling under 1 min såsom tidigare nämnts. Sedan i WT möss, var en betydande mängd tromber funnit att bilda 5 min efter skada, valde vi denna tidpunkt för injektion av nanopartiklar för att upptäcka om nanopartiklar binder effektivt till aktivt bildar tromber. Som visas i figur 5D och online video 4, efter injektion av fluorescerande nanopartiklar, kunde vi identifiera en berg-formadtromb som successivt fick omfattas av fluorescerande partiklar. Dessa studier visar användbarheten av FeCl3-inducerad trombosmodell för att utvärdera inriktning kapacitet (och efterföljande terapeutisk effektivitet) av blodpropp riktad partikel läkemedelsavgivningssystem.
Roll Red andra än blodplättar i blodproppsbildning blodkroppar.
Nyligen genomförda studier har antytt att röda blodkroppar (RBC) spelar en viktig roll i FeCl3-inducerad trombosmodell 28 och de är de första vidhäftande blodkomponenten till den skadade kärlväggen 29,30. För att utforska detta fenomen, märkta vi RBCs med 1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 ^ M slutlig koncentration). De Dil-märkta röda blodkropparna tvättades två gånger med PBS och återsuspenderades i saltlösning med 35% hematokrit. Dil-märkta RBC suspension (100 pl per mus) var injiceraed i trombocytopeni möss som har dödligt bestrålade 5 dagar innan försöket 19. Dessa trombocytopeni möss har signifikant minskat antal blodplättar, vilket ökar risken för RBC bidar till kärlväggen, om de gör det. I motsats till de experiment med användning av fluorescensmärkta blodplättar (figur 5), var ingen uppenbar ansamling av fluorescerande celler hittas på kärlväggen efter kärlskada (Figur 6A, online-v ideo 5). Men tillsammans med bildningen av den blodplättsrika tromber, RBCs började ackumuleras i tromben, som illustrerar formen på koaglet (figur 6A). Immunofluorescensfärgning av den skadade halspulsådern visade att de större cellerna vidhäftade till kärlväggen är trombocyter (CD41 positiv, grön), medan de Dil-märkta röda blodkroppar är huvudsakligen infångas i tromber (Figur 6B & C). Dessa studier visar attFeCl3-inducerad trombosmodell kan användas i få mekanistisk insikt om cellulära och molekylära komponenter och spatio-temporala händelserna i blodproppsbildning.
Mesenteriala trombosmodell
För mesenteriska trombosmodell, en hög koncentration av FeCl3 - är (10 12,5%) rekommenderas som fartygen vanligen omgivna av fettvävnad, vilket kan hindra FeCl3 diffusion mot kärlväggen och förhindrar därmed fartyg från FeCl3-inducerad skada 7. Denna modell är mer lämplig för venös trombos studien. Som visas i online video 6, trombos sett runt ~ 15 sek i tarmkäxvenen efter topisk applicering av filterpapper mättat med 12,5% FeCl3 lösning, men blodproppsbildning dramatiskt fördröjs i mesenterica artär. Den genomsnittliga tiden för ocklusiv trombbildning är ~ 17 ± 7,2 minuter (n = 11) im esenteric ven och ca 23 ± 9,9 minuter (n = 10) i mesenterica när 12,5% FeCl3 används 7.
Figur 1. Kirurgi Verktyg. De minimala nödvändiga verktyg för mus operation visas. Se Material listan för mer detaljerad information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mouse Fixering för kirurgi. Fäst musen på 15 cm lock odlingsplatta för halspulsådern trombosmodell eller för insprutning av rodamin 6G färgämne för mesenteriska trombosmodell.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Carotid Artery Thrombosis Model. Förfaranden för att exponera jugularvenen, injektion av rodamin 6G fluorescerande färgämne in i systemet och exponering av vänstra halspulsådern blod är visade. I (A), varvid linjen indikerar snitt från manubrium till nivån av tungbenet; i (B), blå pilar indikerar Mandibular körtlar, och gula streckade linjerna representerar fascian mellan mandibularlymfknutorna körtlar; i (C), blå pilar indikerar Mandibular körtlar, svart pil indikerar manubrium, och prickade gula linjen indikerar läget för att skära att exponera halsvenen; i (D), blå pil indikerar halsvenen; i (E), gul pil indikerar vänstra submaxillärt körtel, blå pil indicates vänster sternocleidomastoideus, prickade gula linjen indikerar fascia, och grön pil anger omohyoid muskel eller sternohyoideus; i (F), blå pil indikerar karotidartären, de gula streckade linjerna visar den tunna sternohyoideus och / eller omohyoid muskeln; i (G), den blå pilen indikerar halspulsådern och grön pil anger vagusnerven; i (H), den blå pilen indikerar halspulsådern och den gröna pilen indikerar plast "U-form" kaffe omrörare; och i (I), anger den blå pilen filterpapperet belägen med FeCl3-lösning, och grön pil anger karotidartären. T indikerar luftstrupen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. mesenterica och ventrombos Model. Exponering av mesenteriala kärl samt FeCl3 behandling visas. I (A), den blå pilen indikerar linea alba, vit fibrös vävnad utan kärl; I (B), skär ett snitt ensam linea alba visades; i (C), de blå pilarna indikerar den andra bågen av mesenteriska artärer och vener; i (D), anger den blå pilen filterpapper belägen med FeCl3 lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa Experiment med användning av den Carotid Artery Thrombosis Model. (A). Trombbildning i theC57Bl / 6-mus behandlad med 70,5% FeCl3. (B). TPA-förmedlad trombolytisk effekt. (C). Injektion av antikroppmåls mus trombinreceptor PAR4 på trombos visades. (D). Tromb-webbplatsinriktade nanovehicles specifikt binda till aktivt bildar tromber visades . Inj. P anger injektion av partikeln; och Peak B indikerar topp banding av partiklar till tromber. Alla bilder togs i samma förstoring. Skalstreck = 300 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Rollen av RBC på trombbildning. (A) trombocytopenisk möss som erhöll perfusion av Dil-märkta röda blodkropparna utsattes för halspulsådern trombosmodell och bilder efter 7,5% FeCl
Video 1: representant video av halspulsådern trombosmodell i vildtyp (WT) möss. (Högerklicka för att ladda ner.) Denna video visar den representativa blodproppsbildning i halspulsådern i WT möss induceras genom topisk applicering filterpapper belägenmed 7,5% FeCl3-lösning. Trombocyter märktes genom intravenös injektion av rodamin 6G, och video togs i monokromt läge. Den vita massan är koagulerade blodplättar.
Video 2: vävnadsplasminogenaktivator (tPA) förmedlad trombolytisk effekt detekteras av karotidartären trombosmodell. (Högerklicka för att ladda ner.) Blodplättar märkning och trombbildning inleddes som nämns i video 1 och tPA injicerades intravenöst 5 minuter efter 7,5% FeCl3 skada.
Video 3: trombocythämmande läkemedel, na Mely anti-proteas aktiverad receptor 4 (PAR4) antikropp, förmedlad antitrombotisk effekt detekteras av halspulsådern trombosmodell. (Högerklicka för att ladda ner.) I detta experiment fick möss PAR4 antikropp och rodamin 6G injektion 10 min före blodproppsbildning initierades genom topisk applicering filterpapper ligger med 7,5% FeCl3.
Video 4: nanopartiklar-medierad tromber specifik inriktning. (Högerklicka för att ladda ner.) I detta experiment halspulsådern trombbildning initieras med 7,5% FeCl3 utan märkning av blodplättar. Nanopartiklar märktes med rodamin B och injicerades intravenöst i musen 5 minuter efter skada.
Video 5 "src =" / filer / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Video 5: Bindning av de röda blodkropparna som detekteras av karotidartären trombosmodell. (Högerklicka för att ladda ner.) Röda blodkroppar (RBC) märktes med 1,1-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 ^ M slutkoncentration) och 100 pl av Dil-märkta RBC (35% hematokrit) injicerades in i de trombocytopeniska möss. Ingen trombocyt märkning utfördes i detta experiment. Tromb inleddes som nämnts ovan with7.5% FeCl3.
Video 6: representant video av mesenterica artär och ventrombos modell på WT möss. (Höger click att ladda ner.) Trombocyter märktes genom intravenös injektion av rodamin 6G, och blodpropp inleddes lokalt efter applicering en bit filterpapper med 12,5% FeCl3 lösning under 1 min. Fartyget observerades under 10X torr lins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den FeCl3-inducerad modell är en av de mest använda trombos modeller, som inte bara kan ge värdefull information om genetiska modifieringar på trombocytfunktion och trombos 7,8,16,19,31-33, men kan också vara ett värdefullt verktyg för utvärdering av terapeutiska föreningar och strategier för behandling och prevention av aterotrombotiska sjukdomar 11,17,34-37. Här har vi visat våra ändringar och förbättringar av denna modell och visade ytterligare bevis för nyttan av denna teknik, som är tillräckligt känslig för att bestämma effekterna av antikoagulantia (tPA) och trombocythämmande läkemedel (PAR4 antikropp). Förutom den mekanistiska studier av trombos kan modellen även användas för att studera nanobaserade, tromber riktad läkemedelsavgivning. Den kan också användas för detektion av kärlväggen reaktiva syrespecies (ROS) bildning genom injektion av fluorescerande ROS indikator 21.
Noggranntekniker är nödvändiga för att utföra dessa modeller. Operatören bör ha tillräckliga kirurgisk kompetens samt en djup förståelse av vaskulär och blodet cellbiologi. Flera viktiga punkter i FeCl3-inducerad halspulsådern trombos modell är 6: (1) utsätta tillräckligt lång halspulsådern (~ 5 mm) för att möjliggöra tillämpning av filterpapper och lämna ett utrymme för att observera blodflödet i intravital mikroskopi på sena fasen ; (2) tydligt skala adventitial mjuka vävnaden runt halspulsådern för att låta filterpapper för att kontakta kärlväggen direkt och en jämn skada; (3) bekräfta någon mekanisk skada på kärlväggen och ingen trombbildning före applicering av FeCl 3 -saturated filterpapper; (4) ligger bakom karotidartären med en bit av "U" -formade svart plast för att separera artären från omgivande vävnad, för att blockera bakgrundsfluorescens, och för att förhindra FeCl3 diffusion. Genom dessa strategier, har vi genererat starktreproducerbara data med vildtyp C57BL / 6-möss, och i denna musstam 7,5% FeCl3-inducerad trombos tid är 11,3 ± 3,16 minuter (n = 14) 6,7,19. Halsvenen injektion av rodamin 6G att märka cirkulerande celler kan vara utmanande. Som ett alternativ, kan en injektion i svansvenen utföras före fastsättning av musen på 15 cm locket plattan. Vid jämförelse till karotidartären modellen, är den mesenteriala artären och venen modell lättare och mindre kirurgiskt intensiv. Men som nämnts i resultatsektionen på grund av täckning av kärlen från fettvävnad, är det mesenteriska trombosmodell bättre för att studera venös trombos men kräver en större provstorlek för att minimera felet mellan olika möss.
Begränsningen av denna modell är att mekanismen är inte klar och fortfarande kontroversiell. Inledningsvis var mekanismen för denna modell tros vara att FeCl3 genereras ROS-inducerad denudation av endotelceller, och SUbsequently ledde till exponering av blodkomponenter till protrombotisk subendotelet, att göra trombocytadhesion, aggregering och blodproppsbildning 6,11. Genom beredning av trombocyter förbehandlade med GPVI-antikropp till trombocytopeni möss, har vi visat att FeCl3 modellen beror på plätt GPVI, och blockering av blodplättar GPVI dramatiskt inhiberade FeCl3-inducerad trombbildning 19. Denna slutsats är i linje med tidigare rapporter 38 och föreslår att FeCl3 modellen kan vara mer benägna att härma patofysiologin av mänsklig aterosklerotisk plackbristning medierad trombos 6. Däremot har flera nya studier föreslagit nya mekanismer, inklusive vidhäftning av röda blodkroppar till kärlväggen samt fysikalisk effekt av FeCl3-inducerad aggregation av plasmaproteiner och blodceller 29,30. Dessa nya insikter föreslår de potentiella mekanismerna för denna modell kan vara mer komplicerad.
Genom perfusion av Dil-märkta RBC i trombocytopeni möss och sedan framkalla FeCl3 -triggered skada på halspulsådern med 7,5% FeCl3, fann vi att de stora celler som ansluter sig till de skadade kärlväggar är plättar (Figur 6 och online video 5 ). Vi hittade inte uppenbara RBC vidhäftning och ansamling av röda blodkroppar i tromber verkade mest sannolikt att vara ett resultat av fångst. Våra resultat stämmer begreppen primär och sekundär hemostas 39. Skillnaden mellan vår observation från tidigare rapporter kan vara från hypoxi och hemodynamiska förändring som i studien av Barr och kollegor 30, där FeCl3 skadade halspulsåder för svepelektronmikroskop undersökning framställdes i möss som hade den vänstra kammaren tidigare exponerats utan hjälp av en mekanisk ventillation. Blod syrehalt och hemodynamik kommer att minska drastiskt både lung- ochhjärtfunktionen kommer att påverkas omedelbart efter det att bröstkorgen öppnas utan mekanisk ventilation. Syrebrist har länge förknippats med triggning av prokoagulant vägen och trombos 40 och även kan öka RBC vidhäftning. En annan nyare publikation har visat att behandling av halspulsådern med en mycket hög koncentration av FeCl 3 (20%) under 5 eller 10 min leder till en steady-state-koncentrationen av FeCl 3 vid ~ 50 mM i lumen i den skadade kärlet 29 . De således direkt infusion 50 mM FeCl3 i olika blodkomponenter och undersökte effekten av FeCl3 om sammanläggning ex vivo, vilket fick dem att föreslå en ny, två-fas mekanism för verkan av FeCl3 i blodproppsbildning 29. Trots ganska intressant, resultaten från denna studie måste tolkas med försiktighet eftersom det inte representerar FeCl3 modell som används allmänt. I motsats till den höga koncentrationen av FECl 3 (20%, 1 M enligt vad som anges i uppsatsen) och lång behandling (5 eller 10 min), våra tidigare studier samt Barr et al. har visat att 10% FeCl3 behandling under 1 min är tillräckligt för att inducera snabb ocklusiv trombbildning i halspulsådern inom 7 min 6,30. Dessutom, i de flesta experimenten med användning av FeCl3-modellen, en ytterligare låg koncentration av FeCl 3 (5-7,5%) används.
En annan begränsning av denna modell är att på grund av den svåra oxidativ skada på endotelet liksom endotel denudation efter FeCl3 behandling, kan denna modell inte vara ett lämpligt verktyg för att studera endotel inflammation i samband trombos. Men genom att använda dessa metoder för att förbereda halspulsådern i kombination med perfusion av fluorescensmärkta leukocyter, kan vi testa vidhäftningen och rullning av leukocyter på den inflammatoriska endotel 41.
i summary, vi har förfinats och standardiserat FeCl3-inducerad kärlskada modell för att producera en mycket reproducerbar skada på halspulsådern och kvantifiera blodflödet tid upphörande exakt genom intravital mikroskopi. Denna modell är tillräcklig och känslig för att testa antikoagulantia och trombocythämmande läkemedel, och är även lämplig för studier av tromber inriktade nanomedicin. I kombination med benmärgstransplantation, blodplätts infusion i trombocytopeni möss eller direkt intravaskulär injektion av läkemedelskandidater, har vi visat att detta är ett bekvämt, enkelt och känsligt verktyg för att studera trombos in vivo 7-10,16,19,42,43 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
- Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
- Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
- Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
- Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
- Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
- Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
- Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
- Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
- Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
- Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
- Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
- Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
- Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
- Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
- Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
- Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
- Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
- Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
- Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
- Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
- Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
- Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
- Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
- Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
- Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
