Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

الحديديك كلوريد الناجم عن الفئران التخثر نماذج

doi: 10.3791/54479 Published: September 5, 2016

Summary

نفيدكم إجراء المكرر من كلوريد الحديديك (FeCl 3) نماذج تخثر -induced على الشريان السباتي والمساريقي الشريان وكذلك السياق، تتميز بكفاءة استخدام intravital المجهري لمراقبة الوقت لالكاتمة للتكوين الجلطة الدموية.

Introduction

تجلط الدم الشرياني (تجلط الدم) هو اختلاط شائع في العديد من الأمراض الجهازية المرتبطة التهاب مزمن، بما في ذلك تصلب الشرايين والسكري والسمنة والسرطان واضطرابات المناعة الذاتية الروماتيزم المزمنة. وتورط الجلطات التي تحدث في الجذعية الدموية في الشرايين من نشاط الصفائح الدموية غير مناسب، وتجميع وآليات coagulatory اللاحقة، والنوبات القلبية والسكتات الدماغية وفقدان أقصى. جدار الوعاء الدموي هو نظام معقد يتضمن أنواع خلايا متعددة ويتأثر عدد كبير من العوامل الخارجية بما في ذلك إجهاد القص، خلايا الدم، والهرمونات، والسيتوكينات، وكذلك التعبير عن البروتينات المضادة للأكسدة في جدار الوعاء الدموي. وفي التجارب المختبرية لا يمكن نسخ هذه البيئة المعقدة، وبالتالي الدراسات المجراة باستخدام نماذج حيوانية حاسمة للسماح فهم أفضل الآليات التي تشارك في اضطرابات الجلطات.

وقد أظهرت الفئران أن يكون سيمآليات ILAR للبشر من حيث تجلط الدم وتصلب الشرايين، والتهاب 1،2 السكري. وعلاوة على ذلك، المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران يمكن أن تنشأ لاختبار وظيفة من المنتجات جين معين في فيزيولوجي معقدة أو بيئة مرضية. مثل هذه الدراسات تحاكي أمراض البشر ويمكن أن توفر المعلومات الآلية هامة تتعلق اكتشاف مسارات والعلاجات، جديدة، فضلا عن توفر تفاصيل مهمة في وصف آثار المخدرات على تجلط الدم.

تحدث بسبب البطانية إصابة طبقة أو اختلال وظيفي والتعرض للتيار الدم إلى مصفوفة تحت البطانة 3،4 الجلطة الدموية في الشرايين المرضية. وقد وضعت نماذج مختلفة تخثر للحث على هذا الضرر البطانية مثل الإصابة الميكانيكية، وإصابة الأكسدة مقرها ولاية البنغال-مجمع photoreactive روز وإصابة الليزر 5. في هذا الطيف، كلوريد الحديديك (FeCl 3) -induced إصابة الأوعية الدموية هو النموذج المستخدم على نطاق واسع من تجلط الدم. هذا كاشف عندمايطبق على الجانب الخارجي من السفن يدفع الضرر التأكسدي للخلايا الأوعية الدموية 6-8، مع فقدان الحماية الخلايا البطانية من تعميم الصفائح الدموية ومكونات شلال التخثر. نموذج FeCl 3 بسيط وحساس لكلا تخثر ومعاداة الصفائح الدموية المخدرات، وقد تم تنفيذها على الشريان السباتي والشرايين الفخذية، وعروق الوريد، والمساريقي والشرايين والأوردة العضلة المشمرة في الفئران والجرذان والخنازير الغينية والأرانب 6-15.

واحد المعلمة قابلة للقياس في هذا النموذج هو الوقت المنقضي من الاصابة لاستكمال انسداد الأوعية يقاس وقف تدفق الدم مع تدفق متر دوبلر أو تحت الملاحظة المباشرة مع 6،7،9 intravital المجهري. تم الإبلاغ عن مجموعة من الأوقات ما بين 5 إلى 30 دقيقة في دراسات مختلفة في C57Bl6 الفئران 7-10،16، مما يوحي بأن FeCl 3 تركيزات، وأنواع التخدير، والتقنيات الجراحية والعمر الماوس، خلفية الجينومية، وطريقة قياس بتدفق lood، والمتغيرات البيئية الأخرى يكون لها آثار كبيرة في هذا النموذج. هذا التباين واسع يجعل من الصعب المقارنة بين الدراسات من المجموعات البحثية المختلفة وقد جعل الكشف عن الفروق الدقيقة صعوبة.

مع رؤية للحد من هذه المتغيرات، وإقامة قابلة للتكرار بشكل موحد في نظام نموذج الجسم الحي، ولقد صقل نموذج الشريان السباتي -induced FeCl 3 الذي يجعل بيانات استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من الاختلاف 6-10،16-19. في هذه الورقة وصفنا وتبادل المهارات وتقديم تقارير عدة أمثلة تجريبية التمثيلية التي يمكن أن تستفيد من هذا النموذج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات والتلاعب من الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC) من كليفلاند كلينيك وفقا لسياسة الولايات المتحدة الأمريكية خدمة الصحة العامة لرعاية الرفق بالحيوان واستخدام الحيوانات، ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية و استخدام الحيوانات المختبرية.

1. التحضير:

  1. صبغة الفلورسنت لوصفها الصفائح الدموية
    1. إعداد رودامين حل 6G، و 0.5 ملغم / لتر، في المياه المالحة وتعقيم الحل مع 0.22 ميكرون فلتر.
  2. FeCl 3 الحل
    1. جعل حل الأسهم الطازج من 30٪ FeCl 3 (اللامائية، يساوي 1.85 م) في الماء النقي، وتصفية مع 0.45 ميكرون فلتر. إعداد 5 مل FeCl الطازج 3 الحل في التركيز المطلوب [على سبيل المثال، 2.5٪ (0،154 م)، 5٪ (0،308 م)، 7.5٪ (0.463 م)، 10٪ (0،617 م) و 12.5٪ (0.771 م)] من قبل تمييع 30٪ FeCl 3 حل مع ط المياهغ 6 سم صحن زراعة الأنسجة والحفاظ على الغطاء مغلقا.
      ملاحظة: استخدام طبق ثقافة يجعل من الاسهل لالتقاط ورقة الترشيح المشبعة مع FeCl 3 الحل من لاستلامه من وعاء ضيق، مثل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. FeCl3 غير خطرة للغاية وأن الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات ومختبر معطف الخ، معدات الحماية الشخصية، وينبغي دائما أن تؤخذ.
  3. أوراق الترشيح
    1. قطع ورقة الترشيح إلى 1 ملم × 2 ملم حجم. نقع قطع ما يكفي من ورقة قطع مرشح في حل FeCl 3 في نفس الطبق.
  4. بابافيرين هيدروكلوريد الحل
    1. إعداد بابافيرين هيدروكلوريد حل (25 ملغ / مل) في المياه وتعقيم الحل مع 0.22 ميكرون فلتر.
  5. الاغاروز جل
    1. تحضير هلام الاغاروز 2٪ في برنامج تلفزيوني أو المالحة في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة، ~ 1 سم سماكة، وجحزب التحرير أن نصف دائرة مع ~ 3 سم القطر.

2. FeCl 3 المستحثة السباتي الشرياني إصابة التخثر نموذج

  1. العمليات الجراحية للتخثر نموذج
    1. استخدام 8 - الفئران C57Bl6 12 أسابيع من العمر (أو غيرها من سلالات عند الضرورة). تخدير الفئران مع خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) / زيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكيد عمق التخدير بواسطة معسر أخمص قدميه.
      ملاحظة: هذا المبلغ من الكيتامين / زيلازين كافية للحفاظ على الحيوانات في التخدير مستقر وبدون ألم (استجابة إلى أخمص القدمين معسر) لمدة 1 ساعة على الأقل.
    2. إزالة الفراء على الرقبة وأعلى الصدر مع المقص الكهربائي الحيوانات الصغيرة. كريم مزيل الشعر ليست ضرورية. تطبيق محايد مرهم العين البترول على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
    3. تأمين الماوس في موقف ضعيف على غطاء 15 سم لوحة زراعة الأنسجة. استخدام شريط طويل واحد (~ 10 سم) لتأمين هينأطرافه د والجزء السفلي من الجسم، وقطعتين من الشريط صغيرة (2 سم × 0.5 سم) لتأمين اليدين. استخدام خياطة 4-0 للالتفاف حول القواطع، الشريط طرفي الخيط إلى غطاء للحفاظ على الرقبة الماوس مباشرة (الشكل 2).
    4. وضع لوحة مع رئيس الماوس نحو المشغل تحت مصدر ضوء الجراحية.
    5. تعقيم موقع الجراحة مع لوحة الكحول. استخدام الصغرى أدسون الملقط لعقد الجلد واستخدام مقص جراحي لإجراء شق صغير (2-3 ملم).
    6. عقد الجلد من شق مع ملقط ومقص جراحي إدراج مع اغلاق فكه في شق. دفع مقص تحت الجلد نحو المقبض أو الذقن، ثم فتح المقص لتحرير الجلد من طبقة تحت الجلد.
    7. قطع الجلد مع مقص جراحي لإجراء شق خط الوسط من المقبض إلى مستوى العظم اللامي (الشكل 3A و 3B). بصراحة تشريح اللفافة رقيقة (الخط المنقط، في (الشكل 3B و 3C، الأسهم الزرقاء).
      ملاحظة: المقبض (السهم الأسود في الشكل 3C) والقصبة الهوائية (تي في الشكل 3C) سيتبين بعد هذه الخطوة.
    8. عقد الأنسجة الرخوة والجلد ينظر في حق المقبض مع ملقط غريف، إدراج مرقئ تحت اللفافة تجاه موقف 2:00 (الخط المنقط الأصفر في الشكل 3C)، فتح فكي مرقئ لتحرير حبل الوريد من الأنسجة المحيطة.
    9. قطع اللفافة والأنسجة الرخوة والجلد تجاه موقف 2:00 (الشكل 3C) مع مقص جراحي لفضح الصحيح الوريد الوداجي (الشكل 3D، السهم).
    10. رسم حول 200-300 ميكرولتر رودامين حل 6G باستخدام حقنة 1 مل مع 22 G إبرة، ثم تغييرل30 G إبرة.
      ملاحظة: هذا يحمي إبرة 30 G من الضرر من طرفها على ما يرام. رسم مباشرة على حل رودامين 6G مع إبرة 30 G لن تضر طرف. ومع ذلك لمس الجدار الحاويات عن طريق الخطأ سوف يسبب الضرر، الأمر الذي قد يجعل من الصعب الحقن.
    11. مسح إبرة 30 G عن طريق دفع ببطء خارجا 6G حل رودامين، تأكد من تبقى جود فقاعات الهواء في حقنة أو إبرة. تبقي 100 ميكرولتر رودامين 6G حل للحقن.
    12. ينحني 2-3 ملم غيض من الإبرة إلى زاوية 90 درجة مع حامل الإبرة، والتي سوف يمنع إدخال الإبرة عميقة جدا من حبل الوريد، ويجعل حقن أكثر سهولة للرقابة (الشكل 3D).
    13. حقن محلول رودامين 6G في الوريد الوداجي الحق في الصفائح الدموية التسمية. لتحقيق الاستقرار في حقنة والحفاظ على إبرة في الموقف، عقد المحاقن مع يد واحدة والإبرة مع ملقط غريف مع جهة أخرى خلال injection.Afحقن ثالثا، المشبك موقع الحقن مع ملقط غريف لتجنب النزيف.
    14. فتح فكي مرقئ وأدخلها تحت ملقط غريف لكبح جدار الوعاء الدموي من موقع الحقن، ثم ligate موقع الحقن مع خياطة 6-0.
      ملاحظة: كبديل للخطوة 2.1.15، تطبيق الضغط على موقع الحقن مع إصبع لمدة 2 دقيقة ووقف النزيف. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له على خطر التسبب في المزيد من النزيف إذا تمت إزالة جلطة في موقع الحقن عن طريق الخطأ.
    15. بصراحة تشريح الأنسجة اللينة ورباط حول الغدة تحت الفك الأيسر مع مرقئ وملقط غريف وسحب الغدة تجاه موقف 7:00 (الشكل 3E) لفضح العضلات القصية الترقوية الخشائية الأيسر (السهم الأزرق في الشكل 3E).
    16. بصراحة تشريح اللفافة (الشكل 3E، الخط المنقط) بين العضلة القصية الترقوية الخشائية اليسار والعضلة اللامية الكتفية أو sternohyالعضلات OID (الشكل 3E، السهم الأخضر) الواقعة إلى الموقع الأيسر من القصبة الهوائية مع مرقئ.
    17. تمرير إبرة مع 6-0 خياطة الحرير (حوالي 15 سم) تحت منتصف العضلة القصية الترقوية الخشائية (السهم الأزرق في الشكل 3E)، ووضع طرفي الخيط معا وسحب الخيط أفقيا نحو موقف 10:00 .
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بعناية لتجنب إصابة الوريد الوداجي الأيسر، والذي يقع خارج عضلة القصية الترقوية الخشائية.
    18. بصراحة فصل العضلات القصية اللامية رقيقة و / أو عضلة الكتفية اللامية لفضح الشريان السباتي (كاليفورنيا) (الشكل 3F السهم) بعد سحب بعيدا عضلة القصية الترقوية الخشائية. قطع عضلة القصية اللامية و / أو عضلة الكتفية اللامية عند الضرورة. استخدام مرقئ لفصل الأنسجة اللينة من CA دون لمس كاليفورنيا.
      ملاحظة: ويرافق CA بواسطة العصب المبهم، وهيكل الأبيض ينظر في الشكل 3F).
    19. استخدام ملقط غيض غرامة لالتقاط لفافة الجانبية حول CA مع تجنب العصب المبهم وكاليفورنيا. استخدام ملقط غيض غرامة أخرى لكمة ثقب في لفافة بين كاليفورنيا والعصب المبهم.
    20. تمرير هوك من خلال ثقب ورفع بلطف CA، ومن ثم وضع ملقط غيض غرامة تحت كاليفورنيا. نقل هوك وملقط في اتجاهين متعاكسين على طول CA لتجريد الأنسجة اللينة الغلالة البرانية. مجانا على الأقل ~ 5 ملم طول من CA (الشكل 3H، السهم الأزرق) من الأنسجة المحيطة.
    21. لمنع مضان الخلفية، اضغط على نهاية البلاستيك النمام القهوة السوداء إلى شقة، إقطع النمام القهوة في قطعة 3 مم، ثم قطع طولي على طول حواف أضعاف للحصول على قطعتين من "يو" شكل البلاستيك (الشكل 3H، الأخضر السهم).
    22. (الشكل 3H، السهم الأخضر). على الفور تطبيق 2-3 قطرات من المياه المالحة لتجنب تجفيف كاليفورنيا.
  2. في الوقت الحقيقي تسجيل الفيديو
    1. نقل الماوس ولوحة غطاء معا إلى المرحلة المجهر ومكان في الموقف المناسب تحت عدسة المياه 10X. ملء الفراغ بين عدسة 10X وCA مع المياه المالحة.
    2. بدء تسجيل الفيديو الرقمي تطبيق البرمجيات، وإطلاق ملف جديد وتسميته وفقا لذلك. تسجيل صور السفينة العادية وكتابة رقم الإطار عند إيقاف تسجيل الفيديو.
      ملاحظة: مرجع برنامج تسجيل الفيديو في الكمبيوتر للتسجيل. نحن نستخدم الرقمية برامج تسجيل الفيديو، وتستند أوصاف التالية على هذا الطلب.
      ملاحظة: بما هيئة تنظيم الاتصالات الميكانيكيةاتحاد المغرب العربي يمكن أن تجرح البطانة ويؤدي إلى تشكيل خثرة 20، فمن الضروري أن نؤكد أنه لا يوجد أي ضرر جراحية لجدار الوعاء الدموي قبل وقوع الضرر FeCl 3. ومن الضروري أيضا لتأكيد أنه لا يوجد الأنسجة المتبقية في جميع أنحاء كاليفورنيا، والتي قد تشكل حاجزا وتخفيف تأثير FeCl 3 إصابات -induced. كتابة رقم الإطار السجلات سوف تجعل من السهل تحليل الفيديو حسب الأوقات انقضى وقت لاحق.
    3. تحريك الماوس مع لوحة غطاء من عدسة 10X. أضعاف زاوية منشفة ورقية لجعل طرف رقيق وناعم واستخدامها لطخة بعناية المالحة في جميع أنحاء CA (تجنب لمس CA)، وكذلك في أماكن أخرى في مجال العمليات الجراحية. وهذا أمر مهم لتفادي التخفيف من الحل FeCl 3 المستخدمة.
    4. استخدام ملقط غيض الجميلة والتقاط قطعة من ورق الترشيح المشبعة مع FeCl 3 الحل ووضعه مباشرة على CA وابقائه في الموقع لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: Tس التصور المعونة من مجرى الدم وحصاد بيانات دقيقة، ووضع ورقة الترشيح على مقربة من نهاية البعيدة للتتعرض CA (الشكل 3I) وترك قطعة صغيرة في موقع الداني (السهم الأخضر في الشكل 3I) لمراقبة تدفق الدم في وقت متأخر المرحلة (أنظر أدناه).
    5. إزالة ورقة الترشيح (وتعرف هذه النقطة الوقت بداية "بعد إصابة") وشطف CA بمحلول ملحي (2 مل على الأقل).
    6. ضع الماوس مع لوحة غطاء الخلفي للعدسة 10X. مراقبة السفن والبدء في تسجيل صور الفيديو. كتابة رقم إطار الفيديو في نهاية الدقيقة الأولى من التسجيل.
      يتم تحديد تشكيل خثرة عن تراكم الصفائح الدموية الفلورسنت، والذي لوحظ في صور الفيديو في الوقت الحقيقي على شاشة الكمبيوتر أو تحت المجهر: ملاحظة. تسجيل صور فيديو مباشرة بعد وضع الماوس مرة أخرى تحت المجهر. حافظ على تسجيل للنهاية الدقيقة الأولى بعد إزالة وورقة إلتر. مراقبة السفينة بالكامل من القاصي إلى المواقع القريبة للحصول على معلومات حول وقوع الضرر، ومن ثم التركيز على مجال الاهتمام (عادة هي مركز المنطقة المصابة) لمزيد من التصوير.
    7. سجل صور الفيديو لمدة 10 ثانية في كل دقيقة ل10 دقيقة الأولى (على سبيل المثال، 2:55 حتي 03:05) ثم 10 ثانية في كل دقيقة أخرى حتى نهاية التجربة. كتابة أرقام الإطار عندما يتم إيقاف كل تسجيل.
      ملاحظة: نقطة نهاية النموذج هي: 1) عندما توقف تدفق الدم ل> 30 ثانية؛ أو 2) إذا لم ينظر إلى انسداد في 30 دقيقة بعد الإصابة. في هذه الحالة، استخدم 30 دقيقة للتحليل الإحصائي. تعيين وقت التعرض لتسجيل الفيديو تصل إلى 10 ميللي ثانية في البداية، لذلك سيكون من السهل لمراقبة تدفق الدم خلال الجلطة الدموية. عندما تصبح الجلطة الدموية الكبيرة ومضان يشبع استشعار الكاميرا، يصبح من الصعب التعرف على تدفق الدم على التجلط. لحل هذه المشكلة، قم بتحريك م التصويرnter إلى الموقع لم يصب بأذى القريبة (الشكل 3I، السهم الأخضر) حيث تدفق الدم لا يزال من الممكن لاحظت بوضوح. نحن أيضا زيادة فضح الوقت إلى 15 أو 20 مللي ثانية عند التركيز على الداني الموقع، أصيب الامم المتحدة، وبالتالي فإن تدفق الدم يمكن ملاحظتها بشكل أكثر وضوحا. عندما تدفق الدم سوف تتوقف، العديد من الخلايا الكبيرة (الكريات البيضاء) تبدأ في لفة على جدار الوعاء الدموي في الموقع القريب من الجلطة. عادة ما يتوقف تدفق غضون 2 - 3 دقائق بعد ظهور خلايا كبيرة. كتابة فضح الوقت على ورقة تسجيل إذا تم تغييره. وعادة ما يستغرق حوالي 30 دقيقة من التخدير إلى نهاية التجربة، إذا تم استخدام نوع الفئران البرية C57Bl6 العادية.
      تنبيه ملاحظة: لا تستخدم البيضاء المجمعة تجلط الصفائح الدموية كما توقع لوقف تدفق الدم، والتي لن تعطي بيانات دقيقة ويتأثر بها وقت التعرض. غطت تجلط البيضاء التجويف سفينة لا يعني توقف تدفق الدم (انظر الفيديو التمثيلي 1).

3. FeCl 3 المستحثة مساريقي الشريان / جلطة نموذج

  1. تخدير 8 - الفئران C57Bl6 12 اسبوع على النحو المذكور في القسم 2.1.1. تطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
  2. حقن محلول بابافيرين (إجمالي 0.4 ملغ / الماوس) البريتونى لمنع الأمعاء التمعج.
  3. إزالة الفراء على الرقبة والبطن مع المقص الكهربائي الحيوان. كريم مزيل الشعر ليست ضرورية.
  4. تأمين الماوس في موقف ضعيف على غطاء 15 سم لوحة زراعة الأنسجة. استخدام أربع قطع من شريط صغير (2 سم × 0.5 سم) لتأمين كل الساقين. استخدام 4 -0 خياطة للالتفاف حول القواطع، الشريط طرفي الخيط إلى غطاء للحفاظ على التوالي الرقبة (الشكل 2).
  5. اتبع الإجراءات 2.1.4 -2.1.15 لفضح حبل الوريد لحقن رودامين 6G إلى الصفائح الدموية التسمية.
  6. إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد من الخنجري إلى أسفل البطن باستخدام مقص جراحي الشكل (4A). التقاط الصفاق الأوسط (وتسمى أيضا ألبا الخط، الشكل 4A، السهم) مع ملقط غريف، الذي هو واضح وليس لديها الأوعية الدموية، ورفع حوالي 2-3 ملم عالية، تأكيد لا توجد الأمعاء تحت خط القطع، وقطع الصفاق مفتوحة طوليا مع مقص غرامة (الشكل 4B).
  7. إعادة تأمين الفئران إلى الوضع الأفقي الصحيح. وضع الجل الاغاروز نصف دائرة من مسافة قريبة في البطن، والداخل للظاهر بلطف الأمعاء ونشرها على الجزء العلوي من هلام مع ملقط غريف (الشكل 4C). استخدام فروع الثانية للتجربة تجلط الدم (الشكل 4C، السهم).
    ملاحظة: استخدام مرقئ أو ملقط الصغرى أدسون للمساعدة في الداخل للظاهر الأمعاء. تجنب إيذاءالأمعاء والأوعية.
  8. وضع 5-6 قطرات المياه المالحة للحفاظ على رطوبة الأمعاء والأوعية. نقل الماوس مع غطاء لوحة معا إلى المرحلة المجهر ووضع في المكان المناسب تحت عدسة الجافة 10X.
    ملاحظة: استخدام عدسة الجافة لأن غشاء الصائمي اللفائفي لا يمكن ان تحمل محلول ملحي. تأكد لإسقاط محلول ملحي على الأنسجة المعرضة للحفاظ على رطوبة.
  9. وصمة عار المالحة حول الشريان المساريقي والوريد قبل العلاج.
  10. استخدام ملقط غيض غرامة لالتقاط قطعة من ورق الترشيح المشبعة مع 12.5٪ FeCl 3 الحل ووضعه مباشرة على الشريان المساريقي والوريد لمدة 1 دقيقة (الشكل 4D). إزالة ورقة الترشيح (وتعرف هذه النقطة الوقت بداية "بعد إصابة") وشطف الشريان المساريقي الجرحى والوريد بمحلول ملحي (2 مل على الأقل).
  11. ضع الماوس مع لوحة الغطاء مرة أخرى تحت عدسة الجافة 10X. مراقبة السفن والبدء في تفصيلصور الفيديو أورد على النحو المذكور في 2.2).
    ملاحظة: نقطة نهاية هذه التجربة هي: 1) عندما توقف تدفق الدم ل> 30 ثانية؛ أو 2) إذا لم يتم النظر إلى انسداد في 30 دقيقة بعد الإصابة، وفي هذه الحالة استخدام 30 دقيقة للتحليل الإحصائي.
  12. في نهاية التجربة، الموت ببطء الفئران باستخدام جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (200/20 ملغ / كغ)، تليها خلع عنق الرحم بعد أن يتم تأكيد أي التنفس والقلب النابض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشريان السباتي التخثر نموذج
في الفئران مع C57BL6 الخلفية، نوصي باستخدام 7.5٪ FeCl 3 لعلاج السفينة لمدة 1 دقيقة كنقطة انطلاق. تحت العلاج من 7.5٪ FeCl يتم تحديد حدود المنطقة الجرحى وجدار الوعاء الدموي العادي بسهولة تحت المجهر (انظر الفيديو على الانترنت 1)، مما يدل على أن الطبقة البطانية تضررت بشكل كبير. والجلطة الدموية شكلت فور FeCl 3 العلاج، والتقيد في جميع WT C57BL6 الفئران 1 دقيقة بعد الإصابة. والجلطة الدموية شكلت في البداية غير مستقرة وأجزاء منها وعادة ما يتم غسلها بعيدا عن مجرى الدم، وبالتالي فإن خثرات شكلت تصبح أصغر عند 2 - 3 دقائق بعد الإصابة. خثرة البدء في تكبير 3-4 دقيقة بعد إزالة ورقة الترشيح وهذه الجلطة الدموية شكلت في وقت لاحق مستقرة وعادة لا يتم غسلها بعيدا. متوسط ​​الوقت انسداد هو 11.3 ± 3.16 دقيقة في الفئران C57BL6 (ن = 14) عند 7.5٪ Fيستخدم ECL 3 6،7،19 (الشكل 5A والفيديو على الانترنت 1). في دراسات سابقة أننا أثبتنا أن كل من انخفاض وزيادة FeCl 3 تركيزات يقلل الفرق بين سلالة الماوس مكافحة الجلطات وWT الفئران من تجربتنا، وعلاج الشريان السباتي بنسبة 7.5٪ FeCl 3 لمدة 1 دقيقة كافية لتلبية جميع أغراضنا. بالإضافة إلى اختبار وظيفة جينات معينة باستخدام الفئران بالضربة القاضية 7،8،16،19،21، فيما يلي أربع تجارب تمثيلية باستخدام هذا النموذج:

الإرواء في الوريد من الأنسجة من نوع المنشط plasminogen وساطة الجلطات
الأنسجة من نوع المنشط plasminogen (TPA) هو واحد من الأدوية وافقت عليها الهيئة للعلاج الجلطات في الولايات المتحدة (22). وبالتالي لاحظنا الجلطات بوساطة طن سنويا من صنع في نموذج تخثر الشريان السباتي. كان تجلط الدمبدأت مع 7.5٪ FeCl 3 وسمح لتشكيل لمدة 5 دقائق قبل منشط البلاسمينوجين النسيجي (1 ملغ / كغ من وزن الجسم) وperfused عن طريق قسطرة الوريد الوداجي (22GA). كما هو مبين في الشكل 5B والفيديو على الانترنت 2، وخثرة تضخيم باستمرار واحتل نحو 50٪ من التجويف 5 دقائق بعد الإصابة. استمرت الجلطة الدموية للتكبير بعد منشط البلاسمينوجين النسيجي نضح توحي بأن منشط البلاسمينوجين النسيجي لا يؤثر على تنشيط الصفائح الدموية والتجميع. التي الجلطات حوالي 4 دقائق بعد الحقن منشط البلاسمينوجين النسيجي. تم العثور على التجلط شكلت للخضوع لاختلافات حجم مرارا وتكرارا خلال فترة الملاحظة مدة 30 دقيقة وليس انسداد الأوعية حدث في هذه الحالة. وأظهرت هذه البيانات بوضوح أن منشط البلاسمينوجين النسيجي لا يمكن أن تمنع تماما تشكيل خثرة بوساطة الصفائح الدموية، حتى لو كان ذلك يؤدي إلى الجلطات. ولذلك، فإننا نتصور أن التجارب في المستقبل الاستفادة من -induced نموذج الشرايين تخثر FeCl 3 يمكن استخدامها لتقييم حال الخثرة وغيرها من العلاجات مرافقة يمكن أن يكون لها سابق بارزةتأثير entative على تشكيل خثرة.

نضح من PAR4 الأجسام المضادة لتخثر الفئران يحول دون
البروتيني تنشيط مستقبلات 4 (PAR4) هو بروتين G مستقبلات يقترن (GPCR) على الصفائح الدموية والتي يتم تفعيلها من خلال التحلل البروتيني من exodomain-N محطة لها 23 وبعد ذلك يؤدي إلى الخطوات في تنشيط صفائح الدم. وقد ولدت في مختبر نيمان الماعز بولكلونل PAR4 الأجسام المضادة (CAN12) التي تستهدف الكتلة الأيونية من PAR4، ويؤخر PAR4 الانقسام، مما يؤثر خطوة حاسمة لPAR4 تنشيط صفائح الدم التي تتوسط فيها 24. بواسطة نضح من 1 ملغ / كغ من هذه الأجسام المضادة للفئران C57BL6، وجدنا أن تثبيط PAR4 الانقسام لفترات طويلة بشكل ملحوظ مرات لالكاتمة للتشكيل خثرة في 7.5٪ FeCl 3 السباتي الناجم عن نموذج تخثر الشريان (الشكل 5C والفيديو عبر الإنترنت 3). هذا يدل على أن FeCl 3 -induced نموذج تخثر جعلى أن تستخدم لتقييم آثار العوامل المضادة للصفائح الدموية وتميز الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

، جلطات محددة تستهدف بوساطة جسيمات متناهية الصغر
السريع تجلط التنظيف لإعادة تدفق الدم أمر بالغ الأهمية في علاج أمراض الأوعية الدموية انسداد بما في ذلك السكتة الدماغية واحتشاء عضلة القلب. أظهر تسليم النظامية من الأدوية الحالة للخثرة، مثل منشط البلاسمينوجين النسيجي أعلاه، يمكن ليز الجلطة الدموية تشكيلها، ولكن لا يمكن أن يمنع تنشيط صفائح الدم تماما وإعادة التجميع / انسداد. بالإضافة إلى ذلك، والتسليم المباشر النظامية من هذه العوامل سيرين البروتيني يمكن أن يؤدي إلى العشوائي العمل بعيدا عن الهدف، مما يؤدي إلى آثار جانبية كبيرة بما في ذلك النزيف. تمت هندستها في المختبر سين غوبتا المركبات تسليم الاصطناعية القائمة على جسيمات متناهية الصغر مستوحاة من الصفائح الدموية التي يمكن أن تربط إلى الصفائح الدموية وتنشيط البروتينات المصاحبة للجلطة تحت الدورة الدموية تدفق القص 25-27. هكذا درسنا ما إذا كان يمكن لهذه الجسيمات النانويةربط الجلطات تشكيل بنشاط في الشريان.

كما ذكر في تجربة لمنشط البلاسمينوجين النسيجي التروية، وإدخال قسطرة في الوريد الوداجي وتوصيلها إلى مضخة حقن لحقن جسيمات متناهية الصغر في معدل تدفق موحد. في هذه التجربة، تم حقن أي صبغ مضان في الماوس لتسمية الصفائح الدموية. بدلا من ذلك، وصفت النانوية مع Rohdamine باء؛ ولأنهم كانوا قادرين على ملاحظتها تحت المجهر حيوي داخلي. وقد بدأ تخثر مع 7.5٪ FeCl 3 العلاج لمدة 1 دقيقة كما ذكر سابقا. منذ ذلك الحين، تم العثور في الفئران WT كمية كبيرة من الجلطة الدموية لتشكيل 5 دقائق بعد الإصابة، اخترنا هذه النقطة الوقت لحقن جزيئات النانو لاكتشاف ما إذا كان النانوية ربط كفاءة لخثرات تشكيل بنشاط. كما هو مبين في الشكل 5D والفيديو عبر الإنترنت 4، وبعد حقن النانوية الفلورسنت، وكنا قادرين على تحديد الشكل الجبالالجلطة التي حصلت على تغطيتها تدريجيا من جزيئات الفلورسنت. هذه الدراسات تثبت فائدة نموذج تخثر -induced FeCl 3 لتقييم القدرة على استهداف (والكفاءة العلاجية اللاحقة) نظم تسليم المخدرات جسيمات المستهدفة تجلط.

دور خلايا الدم الحمراء غيرها من الصفائح الدموية في جلطة تشكيل.
وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) تلعب دورا هاما في يسببها نموذج FeCl 3 تخثر 28 وهم أول مكونات الدم ملتصقة على جدار الوعاء الدموي المصاب 29،30. لاستكشاف هذه الظاهرة، نحن المسمى كرات الدم الحمراء مع 1،1'-Dioctadecyl-3،3،3 "، 3'-Tetramethylindocarbocyanine البركلورات (ديل، 10 ميكرومتر تركيز النهائي). تم غسلها وكرات الدم الحمراء وصفت ديل-مرتين مع برنامج تلفزيوني ومعلق في المياه المالحة مع 35٪ الهيماتوكريت. وكان ربك تعليق المسمى ديل (100 ميكرولتر في الماوس) حقنإد في الفئران نقص الصفيحات التي تم المشع القاتلة قبل 5 أيام من تجربة 19. هذه الفئران نقص الصفيحات لديهم انخفضت أهمية الصفائح الدموية، الأمر الذي سيزيد من فرص RBC الفرصة الملائمة لجدار الوعاء الدموي، وإذا لم يفعلوا. وعلى النقيض من التجارب باستخدام الصفائح الدموية مضان المسمى (الشكل 5)، لم يتم العثور على تراكم واضح من الخلايا الفلورسنت على جدار الوعاء الدموي بعد إصابة الأوعية الدموية (الشكل 6A، على شبكة الإنترنت ضد IDEO 5). ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع تشكيل خثرات-الصفائح الدموية الغنية، التي كرات الدم الحمراء تتراكم في خثرة الذي يوضح شكل من الجلطة (الشكل 6A). أظهرت المناعي تلطيخ من الشريان السباتي المصابين أن الخلايا الرئيسية انضمت إلى جدار الوعاء الدموي هي الصفائح الدموية (CD41 إيجابي والأخضر)، في حين أن عدد كرات الدم الحمراء وصفت ديل-محاصرون أساسا داخل الجلطة الدموية (الشكل 6B & C). وتبين هذه الدراسات أنويمكن استخدام FeCl 3 نموذج تخثر -induced في اكتساب نظرة الآلية على المكونات الخلوية والجزيئية والأحداث المكانية والزمانية في تشكيل خثرة.

المساريقي التخثر نموذج
لنموذج تخثر المساريقي، على نسبة عالية من FeCl 3 - ينصح (10 12.5٪) كما هي حاصرت السفن عادة الأنسجة الدهنية، والتي يمكن أن تعيق نشر FeCl 3 نحو جدار الوعاء الدموي، وبالتالي يمنع سفينة من FeCl 3 -induced إصابة 7. هذا النموذج هو أكثر ملاءمة لدراسة الجلطة الوريدية. كما هو موضح في الفيديو على الانترنت 6، كان ينظر خثرة حول ~ 15 ثانية في الوريد المساريقي بعد تطبيق موضعيا ورقة الترشيح المشبعة مع 12.5٪ FeCl 3 الحل، ولكن تشكيل خثرة وتأخرت بشكل كبير في الشريان المساريقي. متوسط ​​الوقت لالكاتمة للتشكيل خثرة هو ~ 17 ± 7.2 دقيقة (ن = 11) في م الوريد esenteric وحوالي 23 ± 9.9 دقيقة (ن = 10) في الشريان المساريقي عند 12.5٪ يستخدم FeCl 3 7.

شكل 1
الشكل 1. أدوات جراحة. وتظهر الأدوات اللازمة الحد الأدنى لعملية جراحية الماوس. انظر قائمة المواد للحصول على معلومات أكثر تفصيلا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. ماوس التثبيت لجراحة. الآمنة الماوس على 15 سم غطاء صحن الثقافة لنموذج تخثر الشريان السباتي أو لحقن رودامين 6G صبغة لنموذج تخثر المساريقي.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الشريان السباتي التخثر النموذجي. إجراءات لفضح الوريد الوداجي، حقن رودامين 6G الفلورسنت صبغ في نظام الدم والتعرض لليسار الشريان السباتي ترد. في الفقرة (أ)، يشير إلى خط شق من المقبض إلى مستوى العظم اللامي. في (ب)، والسهام الزرقاء تشير الغدد تحت الفك، والخطوط المنقطة الصفراء تمثل اللفافة بين الغدد تحت الفك. في (C)، والسهام الزرقاء تشير الغدد تحت الفك، السهم الأسود يشير إلى المقبض، والخط الأصفر المنقط يشير إلى موقف لخفض لفضح حبل الوريد. في (D)، السهم الأزرق يشير إلى حبل الوريد. في (E)، السهم الأصفر يشير إلى الغدة تحت الفك الأيسر، الأزرق السهم indicatوفاق تركت عضلة القصية الترقوية الخشائية، يشير الخط الأصفر المنقط فآسيا، والسهم الأخضر يشير إلى عضلة الكتفية اللامية أو عضلة القصية اللامية. في (F)، السهم الأزرق يشير إلى الشريان السباتي، والخطوط المنقطة الصفراء تظهر عضلة القصية اللامية رقيقة و / أو عضلة الكتفية اللامية. في (G)، السهم الأزرق يشير إلى الشريان السباتي والسهم الأخضر يشير إلى العصب المبهم. في (H)، السهم الأزرق يشير إلى الشريان السباتي والسهم الأخضر يشير إلى البلاستيك "U-شكل" النمام القهوة. وفي (الأول)، والسهم الأزرق يشير إلى ورقة الترشيح تقع مع FeCl 3 الحل، والسهم الأخضر يشير إلى الشريان السباتي. T يدل على القصبة الهوائية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. مساريقي الشريان والوريد التخثر النموذجي. تعرض الأوعية المساريقي فضلا FeCl 3 العلاج. في الفقرة (أ)، السهم الأزرق يشير الخط الأبيض، والأنسجة الليفية البيضاء دون السفينة؛ في (ب)، وقطع شق وحده وقد تبين الخط الأبيض. في (C)، والأسهم الزرقاء تدل على قوس الثاني من الشرايين والأوردة المساريقي. في (D)، السهم الأزرق يشير إلى ورقة الترشيح تقع مع FeCl 3 الحل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. التجارب التمثيلية باستخدام الشريان السباتي التخثر نموذج (A). تشكيل خثرة في theC57Bl / 6 الماوس تعامل مع 70.5٪ FeCl 3. (B). منشط البلاسمينوجين النسيجي بوساطة أثر التخثر. (C). حقن من الأجسام المضادة التي تستهدف الماوس الثرومبين مستقبلات PAR4 على ظهر تجلط الدم. (D). جلطة استهداف الموقع-nanovehicles ربط خصيصا لتم عرض تشكيل خثرات بنشاط . حقن. P يشير إلى حقن من الجسيمات. والذروة B يشير ذروة النطاقات من الجسيمات إلى الجلطة الدموية. وقد اتخذت جميع الصور تحت نفس التكبير. مقياس شريط = 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. دور RBC على الجلطة تشكيل. (A) الفئران الصفيحات التي حصلت نضح من كرات الدم الحمراء المسمى ديل-تعرضوا للشريان السباتي نموذج تجلط الدم والصور بعد 7.5٪ FeCl (B & C) الشرايين السباتية الجرحى، وأعدت أقسام المجمدة. كانت ملطخة الصفائح الدموية مع CD41 (الأخضر) وكرات الدم الحمراء وكما هو موضح الأحمر (ديل). كانت ملطخة النوى مع دابي. وكانت السفن هو مبين في (B و C) من اثنين من الفئران مختلفة. الحانات النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1
الفيديو 1: فيديو تمثيلي من الشريان السباتي نموذج تجلط الدم في البرية من نوع (WT) الفئران. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.) ويظهر هذا الفيديو تشكيل خثرة تمثيلي في الشريان السباتي من الفئران WT الناجمة عن تطبيق موضعيا ورق الترشيح تقعمع 7.5٪ FeCl 3 الحل. وصفت الصفائح الدموية عن طريق الحقن في الوريد من رودامين 6G، ونقل الفيديو في وضع أحادية اللون. الكتلة البيضاء الصفائح الدموية يتخثر.

فيديو 2
فيديو 2: الأنسجة المنشط plasminogen (TPA) بوساطة أثر التخثر الكشف عنها بواسطة نموذج تخثر الشريان السباتي. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.) بدأت صفائح الدم ووضع العلامات وتشكيل خثرة على النحو المذكور في الفيديو 1، ومنشط البلاسمينوجين النسيجي حقن في الوريد 5 دقائق بعد 7.5٪ FeCl 3 إصابات.

فيديو 3
فيديو 3: المخدرات المضادة للصفيحات، نا ميلي مكافحة البروتيني تنشيط مستقبلات 4 (PAR4) الأجسام المضادة، بوساطة تأثير مضاد للالخثاري الكشف عنها بواسطة نموذج تخثر الشريان السباتي. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.) في هذه التجربة، تلقت الفئران PAR4 الأجسام المضادة ورودامين 6G حقن 10 دقيقة قبل بدأ تشكيل خثرة من خلال تطبيق موضعيا ورق الترشيح تقع مع 7.5٪ FeCl 3.

فيديو 4
فيديو 4: الاستهداف الجلطة الدموية محددة بوساطة جسيمات متناهية الصغر. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.) في هذه التجربة، وبدأ تشكيل خثرة الشريان السباتي بنسبة 7.5٪ FeCl 3 دون وضع العلامات الصفائح الدموية. وصفت جسيمات متناهية الصغر مع رودامين B وحقن عن طريق الوريد في الماوس 5 دقائق بعد الإصابة.

فيديو 5 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
فيديو 5: تجليد خلايا الدم الحمراء الكشف عنها بواسطة نموذج تخثر الشريان السباتي. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.) وصفت خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) مع 1،1'-Dioctadecyl-3،3،3 "، 3'-Tetramethylindocarbocyanine البركلورات (ديل، 10 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 100 ميكرولتر من تم حقن كرات الدم الحمراء وصفت ديل (35٪ الهيماتوكريت) في الفئران نقص الصفيحات. تم إجراء أي وضع العلامات الصفائح الدموية في هذه التجربة. وقد بدأ خثرة على النحو المذكور أعلاه with7.5٪ FeCl 3.

فيديو 6
فيديو 6: فيديو تمثيلي من الشريان والوريد نموذج تخثر المساريقي على الفئران WT. (بزر الماوس الأيمن المبادرة القطريةالمسيخ لتحميل.) وصفت الصفائح الدموية عن طريق الحقن في الوريد من رودامين 6G، وبدأ الجلطة موضعيا بعد تطبيق قطعة واحدة من ورق الترشيح مع 12.5٪ FeCl 3 الحل لمدة 1 دقيقة. وقد لوحظ السفينة تحت 10X عدسة الجافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3 -induced نموذج FeCl هو واحد من نماذج تجلط الدم الأكثر استخداما، والتي يمكن أن توفر معلومات قيمة حول التعديلات الجينية على وظيفة الصفائح الدموية وتخثر 7،8،16،19،31-33 فحسب، بل يمكن أيضا أن تكون أداة قيمة لتقييم المركبات والاستراتيجيات العلاجية للعلاج والوقاية من الأمراض atherothrombotic 11،17،34-37. هنا أظهرنا لدينا التعديلات والتحسينات لهذا النموذج، وأظهر دليلا إضافيا على فائدة هذه التقنية، وهي حساسة بما فيه الكفاية لتحديد الآثار المترتبة على تخثر (TPA)، والأدوية المضادة للصفائح (PAR4 الأجسام المضادة). بالإضافة إلى دراسة الميكانيكية للتخثر، ويمكن أيضا أن تستخدم نموذج للدراسة، التي تستهدف الجلطة الدموية تسليم المخدرات على أساس تكنولوجيا النانو. ويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن جدار الوعاء الدموي أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل عن طريق الحقن من الفلورسنت ROS مؤشر 21.

موسوسضرورية لأداء هذه النماذج التقنيات. يجب أن يكون المشغل المهارات الجراحية كافية فضلا عن فهم عميق لبيولوجيا الخلية الأوعية الدموية والدم. عدة نقاط رئيسية من FeCl 3 السباتي الناجم عن نموذج تخثر الشرايين هي 6: (1) فضح طول ما يكفي من الشريان السباتي (~ 5 ملم) للسماح للتطبيق ورقة الترشيح وترك مساحة لمراقبة تدفق الدم تحت intravital المجهري في مرحلة متأخرة . (2) تجريد بوضوح الأنسجة اللينة الغلالة البرانية حول الشريان السباتي للسماح ورقة الترشيح للاتصال جدار الوعاء مباشرة وتنتج إصابة حتى. (3) تأكيد عدم وجود إصابات ميكانيكية لجدار الوعاء الدموي وليس تشكيل خثرة قبل تطبيق FeCl 3 ورق الترشيح -saturated. (4) تكمن وراء الشريان السباتي مع قطعة من "U" على شكل البلاستيك الأسود لفصل الشريان من الأنسجة المحيطة، لمنع مضان الخلفية، ومنع FeCl 3 نشرها. من خلال هذه الاستراتيجيات، ونحن قد ولدت للغايةبيانات قابلة للتكرار مع النوع البري C57BL / 6 الفئران، وهذه السلالة الماوس 7.5٪ FeCl 3 يسببها وقت تجلط الدم هو 11.3 ± 3.16 دقيقة (ن = 14) 6،7،19. حقن الوريد الوداجي من رودامين 6G لتسمية تعميم الخلايا قد تكون صعبة. وكبديل لذلك، وحقن الوريد الذيل لا يمكن أن يؤديها قبل تأمين الماوس على 15 سم لوحة غطاء. في مقارنة مع نموذج الشريان السباتي، الشريان والوريد المساريقي نموذج هو أسهل وأقل كثافة جراحيا. ومع ذلك، كما هو مذكور في القسم نتيجة لذلك، ويرجع ذلك إلى تغطية هذه السفن من الأنسجة الدهنية، ونموذج تخثر المساريقي هو أفضل لدراسة الخثار الوريدي ولكن يتطلب حجم العينة أكبر لتقليل الخطأ بين الفئران مختلفة.

الحد من هذا النموذج هو أن الآلية ليست واضحة والتي لا تزال مثيرة للجدل. في البداية، كان يعتقد أن آلية هذا النموذج أن يكون ذلك من FeCl 3 المتولدة ROS يسببها تعرية الخلايا البطانية، وسوأدى bsequently التعرض لمكونات الدم إلى التخثر تحت البطانة، لتقديم التصاق الصفائح الدموية، وتجميع والجلطة تشكيل 6،11. من خلال إعادة تشكيل الصفائح الدموية قبل تعامل مع GPVI الأجسام المضادة للفئران نقص الصفيحات، لقد أثبتنا أن هذا النموذج FeCl 3 يعتمد على GPVI الصفائح الدموية، ومنع GPVI الصفائح الدموية مستعمل بشكل كبير FeCl 3 الناجم عن تشكيل خثرات 19. هذه النتيجة تتماشى مع التقارير السابقة 38 ويشير إلى أن نموذج FeCl 3 قد تكون أكثر عرضة لتقليد الفيزيولوجيا المرضية لتمزق وحة تصلب الشرايين البشرية بوساطة تخثر 6. ومع ذلك، فقد اقترح عدة دراسات حديثة آليات جديدة بما في ذلك التصاق خلايا الدم الحمراء لجدار الوعاء الدموي، وكذلك تأثير الفيزيائية من FeCl 3 تجميع الناجم عن بروتينات البلازما وخلايا الدم 29،30. وتشير هذه الأفكار الجديدة الآليات المحتملة لهذا النموذج قد تكون أكثر تعقيدا.

بواسطة نضح من كرات الدم الحمراء المسمى ديل-في الفئران نقص الصفيحات ثم حمل FeCl 3 -triggered إصابة الشريان السباتي بنسبة 7.5٪ FeCl وجدنا أن الخلايا الرئيسية في الانضمام إلى جدران الأوعية أصيب هي الصفائح الدموية (الشكل 6 و الفيديو على الانترنت 5 ). لم نجد واضحا كرات الدم الحمراء التصاق، وتراكم كرات الدم الحمراء في الجلطة الدموية يبدو من المرجح أن يكون نتيجة لمحاصرة. النتائج التي توصلنا إليها تطابق المفاهيم من الارقاء الابتدائي والثانوي 39. الفرق من ملاحظتنا من التقارير السابقة قد يكون من نقص الأكسجين والتغير الدورة الدموية كما هو الحال في الدراسة التي البر وزملاؤه 30، حيث تم إعداد FeCl 3 الشرايين السباتية المصابين للفحص المجهر الإلكتروني في الفئران التي لديها البطين الأيسر تعرض سابقا دون مساعدة من فينتيليشن الميكانيكية. سيتم انخفض تركيز الأكسجين في الدم وديناميكا الدم بشكل كبير على حد سواء الرئوية وسوف تتأثر وظيفة القلب مباشرة بعد فتح الصدر دون التهوية الميكانيكية. لطالما ارتبطت نقص الأكسجين مع اثار لمسار محفز التخثر والتجلط 40 وأيضا قد يعزز RBC التصاق. وقد أظهرت نشر حديث آخر أن معالجة الشريان السباتي مع تركيز عال جدا من FeCl 3 (20٪) لمدة 5 أو 10 يؤدي دقيقة لتركيز ثابت للدولة من FeCl 3 في ~ 50 ملم في تجويف السفينة أصيب 29 . وبالتالي فإنها غرست مباشرة 50 ملي FeCl 3 إلى مكونات الدم المختلفة ودرست تأثير FeCl 3 على تجمع خارج الجسم الحي، مما أدى بهم إلى اقتراح آلية رواية، 2-مرحلة لعمل FeCl 3 في تشكيل خثرة 29. على الرغم من اهتمام للغاية، نتائج هذه الدراسة لا بد من تفسيرها بحذر لأنها لا تمثل نموذج FeCl 3 شائعة الاستخدام. وعلى النقيض من نسبة عالية من FECل 3 (20٪، 1M كما هو مشار إليه في ورقة) وعلاج طويلة (5 أو 10 دقائق)، لدينا دراسات سابقة وكذلك البر وآخرون. وقد أظهرت أن 10٪ FeCl 3 العلاج لمدة 1 دقيقة بما فيه الكفاية للحث على تشكيل انسداد خثرة السريع في الشريان السباتي في 7 دقائق 6،30. وبالإضافة إلى ذلك، في معظم التجارب باستخدام نموذج FeCl وتركيز مزيد من انخفاض FeCl 3 - يستخدم (5 7.5٪).

الحد آخر من هذا النموذج هو أنه نظرا لإصابة الأكسدة الشديدة إلى البطانة وكذلك البطانية تعرية بعد FeCl 3 علاج، قد يكون هذا النموذج ليس أداة مناسبة لدراسة التهاب بطانة الجلطة المرتبطة بها. ومع ذلك، من خلال استخدام هذه التقنيات لإعداد الشريان السباتي في تركيبة مع نضح الكريات البيض fluorescently المسمى، يمكننا اختبار الالتصاق والمتداول من الكريات البيض على البطانة التهابات 41.

في SUMMآرى، قمنا المكرر وموحدة لل-induced نموذج إصابة الأوعية الدموية FeCl 3 لإنتاج اصابة في استنساخه للغاية على الشريان السباتي وquantitate تدفق الدم مرة وقف بدقة intravital المجهري. هذا النموذج هو كاف وحساسة لاختبار تخثر والأدوية المضادة للصفيحات، وهو أيضا مناسبة للدراسات النانوي المستهدفة الجلطة الدموية. في تركيبة مع زرع نخاع العظام، ضخ الصفائح الدموية في الفئران نقص الصفيحات أو الحقن الوريدي المباشر من المخدرات مرشح، لقد أثبتنا أن هذا هو أداة مريحة وبسيطة وحساسة لدراسة تجلط الدم في الجسم الحي 7-10،16،19،42،43 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
الحديديك كلوريد الناجم عن الفئران التخثر نماذج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter