Summary
我们报告的氯化铁（氯化铁3）颈动脉和肠系膜动脉血栓诱发款精致的程序以及静脉，其特征有效地利用活体显微镜监测的时间来闭塞血栓的形成。
Introduction
动脉血栓形成（血块）是与慢性炎症，包括动脉粥样硬化，糖尿病，肥胖症，癌症和慢性自身免疫性风湿病相关的许多全身性疾病的常见并发症。发生在不适当的血小板活化，聚集和后续机制混凝动脉循环茎，血栓有牵连的心脏发作，中风和肢体损失。血管壁是一个复杂的系统，它包括多种细胞类型和是由外在因素，包括剪切应力多种影响，循环血细胞，激素和细胞因子，以及抗氧化蛋白表达在血管壁。 体外实验不能复制这种复杂的环境，因此， 在使用动物模型的体内研究是至关重要的，以允许更好地理解涉及血栓性疾病的机制。
小鼠已经显示出具有卡ILAR机制对人类中的血栓形成，动脉粥样硬化，炎症和糖尿病1,2-条款。此外，可以创建转基因和基因敲除小鼠测试的特定基因产物的功能在一个复杂的生理或病理环境。这样的研究模仿人类病理学，并且可以提供有关的新途径和疗法，发现重要的机械信息以及在上血栓形成表征药物作用提供重要的信息。
病理动脉血栓的发生是由于内皮层损伤或功能障碍和血液流暴露于内皮下矩阵3,4。各种血栓形成模型已经发展到诱导这种内皮损伤，如机械性损伤，基于孟加拉-光反应性化合物玫瑰氧化损伤和激光损伤5。在这个频谱，氯化铁（ 氯化铁）诱导的血管损伤是血栓形成的一个广泛使用的模型。该试剂时，施加到容器的外表方面诱导对血管细胞6-8氧化损伤，与来自循环血小板和凝血级联组分内皮细胞保护的丧失。所述的FeCl 3模型简单到两个抗凝和抗血小板药物敏感，并已在颈动脉和股动脉，颈静脉和肠系膜和提睾动脉和小静脉在小鼠，大鼠，豚鼠和兔6-15进行。
在此模型中的一个可测量参数是从损伤的经过时间来完成血管闭塞，作为血流停止用多普勒血流计或根 据与活体显微镜6,7,9直接观察来测定。的5至30分钟之间倍一系列已报道在C57BL6小鼠7-10,16不同的研究，表明的FeCl 3浓度，种类麻醉，手术技术，小鼠年龄，基因组背景，测量的B法的lood流，和其他环境变量具有在该模型显著影响。这个很大的可变性使得难以研究从不同的研究小组比较，并且可以使细微的差别检测变得困难。
具有远见尽量减少这种变异，并建立一个在体内模型系统统一重复性好，我们已经完善了氯化铁诱发颈动脉模型，从而以最小的变化6-10,16-19高重现性的数据。在本文中，我们描述和分享技能和报告，可以从这个模式中受益，几个有代表性的实验例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有的过程和动物的操作都按照美国公共卫生服务政策上的人文关怀和动物的使用 ，以及NIH 指南照顾和批准了克利夫兰诊所的机构动物护理和使用委员会（IACUC） 实验动物使用 。
1.准备：
- 荧光染料用于标记血小板
- 制备罗丹明6G溶液，0.5毫克/毫升，在盐水和消毒用0.22微米的过滤器将溶液。
- 三氯化铁3溶液
- 使30％的FeCl 3新鲜原液（无水，等于1.85 M），在纯水中，并用0.45微米的过滤器进行过滤。制备5毫升的新鲜的FeCl以所需浓度3溶液[ 例如，2.5％（0.154 M），5％（0.308 M），7.5％（0.463 M），10％（0.617 M）和12.5％（0.771 M）[由用水稀释我的30％三氯化铁3溶液呐6厘米组织培养皿，保持盖子关闭。
注：使用培养皿使得它更容易拿起用三氯化铁溶液中3比把它捡起来，从一个狭窄的容器，如一个1.5 ml离心管饱和的滤纸。三氯化铁是非常危险和预防措施，如戴手套，白大褂等个人防护装备，应始终采取。
- 使30％的FeCl 3新鲜原液（无水，等于1.85 M），在纯水中，并用0.45微米的过滤器进行过滤。制备5毫升的新鲜的FeCl以所需浓度3溶液[ 例如，2.5％（0.154 M），5％（0.308 M），7.5％（0.463 M），10％（0.617 M）和12.5％（0.771 M）[由用水稀释我的30％三氯化铁3溶液呐6厘米组织培养皿，保持盖子关闭。
- 滤纸
- 切滤纸到1mm×2mm的大小。浸泡切割滤纸足够件在同一培养皿中的FeCl 3溶液。
- 盐酸罂粟碱解决方案
- 在水中制备罂粟碱盐酸盐溶液（25毫克/毫升）和消毒用0.22微米的过滤器将溶液。
- 琼脂糖凝胶
- 制备在PBS中的2％琼脂糖凝胶或盐水在6孔组织培养板，约1cm的厚度，和c它向UT斯达康半圈与〜直径3厘米。
2. 氯化铁对颈动脉动脉损伤血栓形成模型
- 对于血栓形成模型外科手术
- 使用8 - 19周龄C57BL6小鼠（或其他菌株如必要）。麻醉小鼠通过腹膜内注射氯胺酮（100毫克/千克）/赛拉嗪（10毫克/千克）的混合物中。确认麻醉由脚趾夹住的深度。
注：氯胺酮/赛拉嗪的该量是足以保持在稳定的麻醉动物并没有疼痛（响应于趾夹持）至少1小时。 - 对颈部及上胸部有小动物电推剪删除皮毛。脱毛膏是没有必要的。对眼睛应用中性石油眼药膏，以防止在麻醉过程中干燥。
- 固定鼠标在15厘米组织培养板的盖子仰卧位。使用一个长带（约10厘米），以确保欣ð四肢和下半身，和小磁带（2毫升×0.5厘米），以确保前腿的两件。使用4-0缝合线环绕的门牙，缝线的两端用胶带在盖保持小鼠颈部直（ 图2）。
- 将鼠标头部朝向操作板下手术光源。
- 消毒手术部位用酒精垫。使用微斜角肌挤压钳保持皮肤，用手术剪刀做一个小切口（2 - 3毫米），。
- 保持与镊子切口的皮肤和插入外科剪刀钳口闭合成切口。皮下推剪刀朝柄或下巴，然后打开剪刀摆脱皮下层皮肤。
- 切断与外科剪刀的皮肤，使从柄一个中线切口以舌骨水平（ 图 3A和3B）。说白了剖析薄筋膜（虚线，在
注：柄（ 图3C黑色箭头）和气管（T位于图3C）将在此步骤后可以看到。 - 持软组织，并在与格雷夫钳柄的右侧看到的皮肤，插入止血朝向2点钟位置筋膜下（图3C黄色虚线 ），打开止血钳的钳口以释放从周围组织颈静脉。
- 切筋膜，软组织和皮肤向着2点钟位置（ 图3C）用手术剪，以暴露右颈静脉（ 图3D，箭头 ）。
- 绘制大约200 - 使用1毫升注射器300微升罗丹明6G液与22克针，然后改变它至30g针。
注：此保护为30G针头从它的精尖的损坏。绘图直接与各30 g针不会破坏尖端罗丹明6G的解决方案;然而接触容器壁无意中会造成损坏，这可能使注射困难。 - 冲洗慢慢压出罗丹明6G液各30 g针，确保没有气泡留在注射器或针头。 100保持注射微升罗丹明6G的解决方案。
- 弯曲2 -针3毫米尖端90°角与针保持器，这将防止插入针太深的颈静脉，使注入更容易地控制（ 图3D）。
- 注入罗丹明6G溶液到右颈静脉，以标签血小板。以稳定注射器，并保持所述针的位置，用另一只手握住injection.Af期间用一只手将注射器和针与格雷夫钳子之三注射液，夹住注射部位与格雷夫钳，以避免出血。
- 打开止血钳的钳口，并插入它的格雷夫镊子下夹住注射部位的血管壁，然后结扎注射部位用6-0缝合线。
注：由于步骤2.1.15的另一种选择，将压力施加到注射部位2分钟将止血手指;然而，这种方法具有造成进一步的，如果在注射部位的凝块被无意中除去出血的危险。 - 直截了当地解剖软组织和筋膜与周围的止血钳和格雷夫镊子左下颌腺和拉向7点钟位置（ 图3E）以暴露左胸锁乳突肌（ 图3E蓝色箭头）的腺。
- 左胸锁乳突肌与肩胛舌骨肌或sternohy之间直言解剖筋膜（ 图3E，虚线 ）oid的肌肉（ 图3E，绿色箭头 ）位于与止血气管的左侧部位。
- 通过一个针与胸锁乳突肌（ 图3E蓝色箭头）的中间下6-0丝线缝合（约15厘米长），把缝线的两端在一起，横向拉动缝线朝10点钟位置。
注：应仔细执行此过程，以避免左颈静脉，它位于胸锁乳突肌之外的损伤。 - 直截了当地分离薄胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌抽离胸锁乳突肌后以暴露颈动脉（CA）（ 图3F箭头）。切开胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌肉是必要的。用止血钳而不触及CA.分开CA软组织
注：CA伴随迷走神经，白色组织见于 - 用细尖镊子拿起身边的CA外侧筋膜同时避免了迷走神经和CA.使用另一个精尖钳猛击对CA和迷走神经的筋膜一个洞。
- 通过孔中穿过挂钩，然后轻轻提起CA，然后将CA.下的精尖镊子移动至钩和镊子以相反的方向沿CA剥离外膜软组织。从周围组织CA（ 图3H，蓝色箭头 ）免费至少约5毫米的长度。
- 要阻止背景荧光，按下一个黑色的塑料咖啡搅拌器平年底，横切咖啡搅拌成3毫米一块，然后沿折叠边纵向切割获得的“U”形的塑料（ 图3H，绿两件箭头 ）。
- 使用8 - 19周龄C57BL6小鼠（或其他菌株如必要）。麻醉小鼠通过腹膜内注射氯胺酮（100毫克/千克）/赛拉嗪（10毫克/千克）的混合物中。确认麻醉由脚趾夹住的深度。
- 一起传送鼠标和板盖到显微镜阶段和发生在10X水透镜之下的适当位置。填充10X透镜和盐水在CA之间的空间。
- 启动数字视频录像的软件应用，并推出一个新的文件，并据此命名。记录正常血管图像，并在视频录制停止写下帧数。
注：引用的视频录制软件，在电脑记录。我们使用的数字视频记录的软件和下面的描述是基于这样的应用程序。
注：由于机械TRAUMA可以伤害内皮，导致血栓形成20，有必要确认没有手术损伤到之前的FeCl 3损伤血管壁。它也有必要确认有围绕在CA没有剩余的组织，其可以形成屏障并衰减的FeCl 3诱导的损伤的效果。写下记录的帧数会很容易地分析后，根据经过时间的视频。 - 移动钢板盖鼠标移出10X镜头。折叠纸巾的一角，使薄和精尖，并用它小心吸干周围的CA生理盐水（避免触及CA），以及在手术野等地。这是很重要的，以避免使用的FeCl 3溶液稀释。
- 用细尖镊子，拿起用三氯化铁3溶液饱和滤纸片，并直接将其放在CA，并保持它在现场1分钟。
注：tÓ血流和收获的准确数据的援助可视化，接近暴露的CA（ 图3I）的远端放置滤纸，并在近端部位离开一个短段（ 在图3I绿色箭头 ），用于在后期观察血流量阶段（见下文）。 - 取出滤纸（该时间点被定义为开始“之后伤害”）和冲洗用盐水（至少2毫升）的CA.
- 把钢板盖回镜头10X鼠标;观察船只，并开始录制视频图像。写下视频帧数在录制第一分钟结束。
注：血栓形成由荧光血小板，这是在实时视频图像观察计算机屏幕上或显微镜下的累积识别。录制视频图像把鼠标背部在显微镜下之后。保持记录到第一分钟的末尾取出的F后ILTER纸。从远端整个容器观察到近端网站以获得关于损伤的信息，然后集中在感兴趣的区域（通常为受伤区域的中心），用于进一步的成像。 - 记录的视频图像的每分钟的第10分钟（ 例如，2:55至3:05），然后10秒每隔一分钟，直到实验结束10秒。当每个记录停止写下帧数。
注：该模型的结束点是：1）时，血流量已停止为> 30秒;或者2）如果闭塞是没有看到在受伤后30分钟。在这种情况下，用于统计分析30分钟。设置视频记录作为开头10毫秒的曝光时间，所以这将是便于观察过血栓的血流量。当血栓变大，荧光饱和相机的传感器，它变得难以识别在血栓的血流量。为了解决这个问题，将成像CENTER到血流仍然可以清楚地观察到近端未受伤的部位（ 图3I，绿色箭头）。我们还增加了暴露时间15或20毫秒聚焦近侧未损伤部位上时，使血流可以更清楚地观察到。当血液流动将会停止，众多的大细胞（白细胞）开始在血栓的近端部位对血管壁滚动。大单元格的外观后3分钟 - 流量通常在2站。记下如果它改变了记录片的曝光时间。它通常需要大约30分钟从麻醉到实验结束时，如果使用正常的野生型C57BL6小鼠。
小心注：请不要使用白色聚集的血小板凝块随着血流停止，不会给出一个准确的数据的符号，它是由曝光时间的影响。白色凝块覆盖管腔并不意味着停止血流量（见代表视频1）。
3. 氯化铁诱导肠系膜动脉/静脉血栓形成模型
- 麻醉8 - 19周龄C57BL6小鼠在2.1.1节中提到。对眼睛应用兽医药膏，以防止在麻醉过程中干燥。
- 注入罂粟碱溶液（总0.4毫克/小鼠）腹膜内抑制肠道蠕动。
- 对颈部和腹部与动物电推剪删除皮毛。脱毛膏是没有必要的。
- 固定鼠标在15厘米组织培养板的盖子仰卧位。使用四件小吊带（2毫升×0.5厘米）的，以确保所有的腿。使用4 -0缝线环绕门齿，缝线的两端用胶带在盖保持颈部直（ 图2）。
- 按照程序2.1.4 -2.1.15暴露颈静脉注射罗丹明6G的标注血小板。
- 执行通过从剑突皮肤中线切开至小腹使用手术剪（ 图4A）。拿起中间腹膜（也称为白线， 图4A，箭头）与格雷夫钳，这是明确的，没有血管，解除约2 - 3mm高确认切割线下无排便，并剪开腹膜开放纵向与细剪刀（ 图4B）。
- 重新固定小鼠右侧卧位。放置半圈琼脂糖凝胶靠近腹部，并轻轻exteriorize肠子和传播它在与格雷夫镊子（ 图4C）的凝胶的顶部。用于血栓实验（ 图4C，箭头 ）的第二分支。
注：使用止血钳或微斜角肌挤压钳帮助exteriorize肠子。以免伤肠和容器中。 - 放置5 - 6滴盐水保持肠和容器中的水分。与板盖一起传送鼠标显微镜台上，在干燥的10X镜头下的适当位置放置。
注：使用干的镜头，因为空肠回肠膜不能持有生理盐水。确保在暴露的组织降盐液中保持湿润。 - 围绕吸干治疗前肠系膜动脉和静脉盐水。
- 用细尖镊子拿起12.5％三氯化铁3溶液饱和滤纸片，并直接将其放在肠系膜动脉和静脉1分钟（ 图4D）。取出滤纸（该时间点被定义为“后损伤”的开始），并用盐水冲洗受伤肠系膜动脉和静脉（至少2毫升）中。
- 把钢板盖的10X镜头干背下鼠标;观察船只，并开始录制在2.2中提到ORD视频图像）。
注意：这个实验的结束点是：1）时，血流量已停止为> 30秒;或者2）如果闭塞未在30分钟内受伤后看到的，在这种情况下使用的统计分析30分钟。 - 在实验结束时，安乐死使用过量氯胺酮/赛拉嗪（200/20毫克/千克），接着通过颈脱位无呼吸和心脏跳动被确认后的小鼠。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
颈动脉血栓形成模型
在C57BL6背景小鼠中，我们建议使用7.5％的氯化铁治疗血管1分钟为出发点。下的FeCl 3处理的7.5％，受伤的区域和正常血管壁的边界显微镜下很容易识别（参见在线视频1），这表明内皮层显著损坏。血栓形成，立即经氯化铁处理，损伤后的所有WT C57BL6小鼠1分钟观察。最初形成的血栓是不稳定的，它们的部分通常被洗掉由血液流，所以所形成的血栓成为2小 - 损伤后3分钟。血栓开始从3放大 - 4分钟取出滤纸后这些后来形成血栓是稳定的，通常不会冲走。平均闭塞时间是在C57BL6小鼠11.3±3.16分（N = 14）时7.5％FECL 3用于6,7,19（ 图5A和在线视频1）。在以前的研究中，我们已经表明，既减少和的FeCl 3浓度的增加减少抗血栓形成的小鼠品系与WT小鼠6之间的差异;从我们的经验，治疗用7.5％的FeCl 3的颈动脉，持续1分钟的是足以满足所有的用途。此外采用基因敲除小鼠7,8,16,19,21测试特定基因的功能，以下是采用这种模式四个具有代表性的实验：
组织型纤溶酶原激活剂溶栓介导静脉灌注
组织型纤溶酶原激活物（tPA）是FDA批准的药物在美国22溶栓治疗之一。因此，我们观察到在颈动脉血栓形成模型中的tPA介导的溶栓治疗。血栓形成用7.5％的FeCl 3发起并使其形成用于tPA的前5分钟（1毫克/千克体重）经颈静脉导管（22GA）灌注。 如图5B和在线视频2中所示，血栓连续放大和损伤后占领的内腔5分钟约50％。血栓持续的tPA灌注表明的tPA不影响血小板激活和聚集后放大。的tPA溶栓注射后开始约4分钟。所形成的血栓，发现在30分钟的观察期，并在这种情况下，发生了无血管闭塞反复经受尺寸的变化。这些数据清楚地表明，tPA的不能完全抑制血小板介导的血栓形成，即使它会导致溶栓治疗。因此，我们设想，利用的FeCl 3诱导的动脉血栓形成模型以后的实验可用于评估血栓溶解等辅助疗法，可以有一个突出的一个先前在血栓形成entative效果。
PAR4抗体灌注到小鼠抑制血栓形成
蛋白酶活化受体4（PAR4）是对血小板的G蛋白偶联受体（GPCR），其通过它的N-末端exodomain 23的蛋白水解切割活化，并随后导致血小板活化步骤。尼曼实验室已经产生了山羊多克隆PAR4抗体（CAN12）靶向PAR4的阴离子簇，并延迟PAR4裂解，从而影响对PAR4介导的血小板活化24的关键步骤。由1毫克灌注/此抗体与C57BL6小鼠千克，我们发现，PAR4裂解抑制显著延长次闭塞在7.5％的FeCl 3诱导的颈动脉血栓形成模型血栓形成（ 图5C和在线视频3）。这证明了的FeCl 3诱导血栓形成模型C一个被用来评价抗血小板剂的效果和表征潜在的治疗策略。
纳米粒子介导的特异性血栓，确定目标
快速血块除去以重新建立血流在治疗闭塞性血管疾病，包括缺血性中风和心肌梗塞的关键。溶栓药物，如tPA的全身递送以上表明，可裂解形成血栓，但不能完全防止血小板激活和再聚集/闭塞。另外，全身性直接递送，例如丝氨酸蛋白酶试剂可导致滥脱靶作用，从而导致严重的副作用，包括出血。森古普塔实验室已经工程改造能结合到凝块相关活化的血小板和蛋白质下血流动力学剪切流动25-27血小板启发基于纳米颗粒合成运载工具。因此，我们检查是否这些纳米粒子可结合在动脉的积极形成血栓。
如在实验的tPA灌注所提到的，一个导管插入颈静脉并连接到一个喷射泵用于注射的纳米颗粒中的均匀流动速度。在该实验中，没有荧光染料注射入小鼠标记血小板。取而代之的是，纳米颗粒标记Rohdamine B：因此，他们能够活显微镜下进行观察。的血栓形成，用7.5％的FeCl 3处理开始1分钟如前所述。因为在WT小鼠，血栓的显著量被发现以形成损伤后5分钟，我们选择了纳米颗粒的注射该时间点来检测，如果纳米颗粒有效地结合到积极形成血栓。如在图5D和在线视频4所示，荧光纳米粒子的注射后，我们能够识别的山形血栓其中得到逐步由荧光颗粒所覆盖。这些研究证明了的FeCl 3诱导血栓形成模型来评估凝块靶向颗粒药物递送系统的定位能力（以及随后的治疗效果）的效用。
比血栓形成血小板等血红 细胞的作用。
最近的研究表明，红血细胞（红细胞）中的FeCl 3诱导血栓形成模型28起到重要的作用，它们是在第一粘附血液成分到受损血管壁29,30。探索这种现象，我们标记的RBCs与1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'- Tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐（语，10μM最终浓度）。的DiI标记的RBCs用PBS洗涤两次并再悬浮于用35％的血细胞比容盐水。的DiI标记的RBC悬浮液（每只小鼠100微升）是注射编入已在实验19 5天前被致死剂量照射的小鼠血小板。这些血小板小鼠具有显著减少血小板，这将增加红细胞的伺机到血管壁的机会，如果他们这样做。相比之下，使用荧光标记的血小板（ 图5）的实验中，荧光细胞没有明显的积累在容器壁上发现血管损伤（ 图6A， 在线 视频5）之后。然而，随着富血小板血栓的形成沿，红细胞开始，其中示出了凝块（ 图6A）的形状的血栓积聚。在受损的颈动脉的免疫荧光染色证实，附着于血管壁的主要细胞是血小板（CD41阳性，绿色），而DiI标记的RBCs主要捕集的血栓（ 图6B＆amp; C）内。这些研究表明，该氯化铁诱发血栓模型能够获得在血栓形成的细胞和分子成分时空事件机械性的认识加以利用。
肠系膜血栓形成模型
对肠系膜血栓形成模型中，的FeCl 3的高浓度-建议（10 12.5％），为容器通常是由脂肪组织包围，其可以阻碍朝血管壁的FeCl 3扩散，从而防止容器从的FeCl 3诱导的受伤7。这种模式是比较适合静脉血栓形成研究。随着在线视频6所示，血栓周围可见〜在肠系膜静脉15秒后局部涂敷12.5％ 氯化铁溶液中，但血栓形成饱和滤纸在肠系膜动脉显着地推迟。的平均时间为闭塞性血栓形成是〜17±7.2分钟（N = 11），以m esenteric静脉和时12.5％的FeCl 3用于7在肠系膜动脉约23±9.9分钟（10例）。
图1. 手术工具。鼠标手术的最小必要的工具所示。有关更多详细信息，材料清单。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.小鼠固定外科手术。固定鼠标上15厘米培养皿盖颈动脉血栓形成模型或罗丹明6G染料的注射肠系膜血栓形成模型。得到=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图3.颈动脉血栓形成模型。程序以露出颈静脉，若丹明6G的注射荧光染料进入血液系统和左颈动脉的曝光被示出。在（A）中 ，该行表示从柄到舌骨水平切口;在（B）中 ，蓝色箭头表示颌下腺和黄的虚线表示颌下腺之间的筋膜;在（C）中 ，蓝色箭头表示颌下腺，黑色箭头表示柄，和黄色点线表示切割以暴露颈静脉的位置;在（D），蓝色箭头表示颈内静脉;在（E），黄色箭头指示左颌下腺，蓝色箭头indicatES左胸锁乳突肌，点缀黄线表示筋膜和绿色箭头指示肩胛舌骨肌或胸骨舌骨肌;在（F）中 ，蓝色箭头表示颈动脉，黄色虚线表示薄胸骨舌骨肌和/或肩胛舌骨肌;在（G），蓝色箭头表示颈动脉和绿色箭头指示迷走神经;在（H），蓝色箭头表示颈动脉和绿色箭头指示的塑料“U形”咖啡搅拌器;和（I）中，蓝色箭头表示位于与的FeCl 3溶液中的滤纸上，绿色箭头指示颈动脉。 T表示气管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.肠系膜动脉和肠系膜血管静脉血栓形成模型。曝光以及氯化铁治疗证明。在（A），蓝色箭头表示白线，无船白色的纤维组织;在（B），切口独砍白线被证明;在（C）中 ，蓝色箭头表示肠系膜动脉和静脉的第二拱;在（D），蓝色箭头表示位于与三氯化铁3溶液的滤纸。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.代表性实验采用颈动脉血栓形成模型 。（A）。在theC57Bl / 6小鼠血栓形成7治疗5.5％的FeCl 3（B）中。的tPA介导的溶解血栓的作用。（℃）。抗体靶向小鼠凝血酶受体PAR4上显示出血栓形成的注入。（D）积极结果表明形成血栓血栓网站定位nanovehicles特异性结合。注射。 P表示颗粒注射;和峰值B表示颗粒与血栓的峰条纹。所有图像相同的放大倍数下拍摄。比例尺= 300微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.对血栓形成的RBC的作用。（A）， 使接收的DiI标记的RBCs的灌注后7.5％的FeCl经受颈动脉血栓形成模型和图像血小板小鼠
视频1：在野生型（WT）小鼠的颈动脉血栓形成模型中的代表性视频。 （右键点击下载）。该视频显示在局部施用滤纸诱导野生型小鼠颈动脉代表血栓形成位于用7.5％ 氯化铁溶液。血小板被罗丹明6G静脉注射标记和视频拍摄于单色模式。白色质量凝结的血小板。
视频2：组织型纤溶酶原激活剂（tPA）介导的溶栓由颈动脉血栓形成模型的检测效果。 （右键点击下载）发起血小板标签和血栓形成在视频中提到的，和tPA的是静脉注射5分钟后，7.5％的氯化铁的伤害。
视频3：抗血小板药物，NA的mely抗蛋白酶激活受体4（PAR4）抗体，介由颈动脉血栓形成模型中检测到的抗血栓效果。 （右击下载。）在该实验中，小鼠接受PAR4抗体和罗丹明6G注射10分钟前血栓形成通过局部施用位于与7.5％的FeCl 3滤纸启动。
视频4：纳米介导的特异性血栓靶向。 （右击进行下载。）在该实验中，颈动脉血栓形成，用7.5％的FeCl 3发起无标记血小板。纳米标记有罗丹明B及静脉注射到受伤后鼠标5分钟。
视频5“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg“/>
视频5：通过颈动脉血栓形成模型检测出的红血细胞的结合。 （右击下载。）红血细胞（红细胞）分别标以1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'- Tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐（语，10μM最终浓度），并加入100μl的DiI标记的RBCs（35％血细胞比容）注射到血小板的小鼠。无血小板标记是在该实验中进行。发起血栓with7.5％的FeCl 3如上所述。
视频6：野生型小鼠肠系膜动脉和静脉血栓形成模型的代表录像。 （右键CLI放来下载。）血小板由若丹明6G的静脉注射标记的，和血栓施加一个片滤纸与12.5％的FeCl 3溶液1分钟后，局部启动。下10X干燥透镜观察容器中。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所述的FeCl 3诱导的模型是最广泛使用的血栓形成的模型，它不仅可以提供有关对血小板功能和血栓形成7,8,16,19,31-33遗传修饰的有价值的信息中的一个，但也可以是一个有价值的工具用于治疗化合物和战略动脉粥样硬化性疾病11,17,34-37的治疗和预防的评价。在这里，我们已经表明我们的修改和该模型的改进和表明该技术中，这是足够敏感以确定抗凝物（tPA），抗血小板药物（PAR4抗体）的效应的效用的额外证据。除了血栓形成的机理研究，该模型也可以用来研究了基于纳米技术-，血栓靶向药物递送。它也可以通过荧光ROS指示剂21的注入用于检测血管壁的活性氧（ROS）的形成。
细致技术是必须执行这些模型。操作者应该有足够的手术技巧，以及血管和血液细胞生物学的深刻理解。所述的FeCl 3诱导的颈动脉血栓形成模型的几个关键点是6：（1）暴露颈动脉（〜5mm）的足够的长度，以允许滤纸的应用，并留下一个空间在后期阶段观察到下活体显微镜血流; （2）清楚地剥离围绕颈动脉的外膜的软组织，以允许滤纸于血管壁直接接触，并产生一个甚至损伤; （3）确认无机械性损伤的血管壁和的FeCl 3 -饱和滤纸的应用程序之前，无血栓形成; （4）背后颈动脉用一块的“U”形的黑色塑料到动脉从周围组织中分离出来，以阻止背景荧光，并防止的FeCl 3扩散。通过这些策略，我们已经产生高与野生型C57BL / 6小鼠，并在此小鼠品系7.5％的FeCl 3诱导血栓形成的时间是11.3±3.16分钟（14例）6,7,19重现性的数据。若丹明6G的颈静脉注射标记的循环细胞可以是具有挑战性的。作为一种替代，一个尾静脉注射可以在15厘米板盖紧固鼠标之前进行。在比较颈动脉模型中，肠系膜动脉和静脉模型是更容易，更手术密集。然而，如在结果部分中提及，由于由脂肪组织的血管的覆盖范围，肠系膜血栓形成模型是研究静脉血栓更好，但需要更大的样本大小，以尽量减少不同的小鼠之间的误差。
该模型的限制是，该机理尚不清楚，还存在争议。起初，这种模式的机制被认为是氯化铁血管内皮细胞产生的活性氧引起的剥蚀，和苏bsequently导致血液成分的暴露于促血栓形成内皮下膜，以使血小板粘附，聚集和血栓形成6,11。由血小板用GPVI抗体与血小板小鼠预处理的重建，我们已经证明了的FeCl 3模型依赖于血小板的GPVI和阻塞血小板GPVI显着抑制的FeCl 3诱导血栓形成19。这一发现是符合先前的报告38和表明的FeCl 3模型更可能模仿人的动脉粥样硬化斑块破裂的介血栓6病理生理学。然而，最近的一些研究已经提出了新的机制，包括红血细胞的粘附于血管壁以及血浆蛋白和血细胞29,30的的FeCl 3诱导的聚集的生理化学效应。这些新的见解提出该模型的潜在机制可能更复杂。
通过DiI标记的RBCs的灌注到血小板小鼠，然后诱发的FeCl 3 -triggered损伤，与7.5％的颈动脉的FeCl 3，我们发现，重要的细胞附着在受损血管壁是血小板（ 图6和在线视频5 ）。我们没有发现明显的红细胞的粘附，并且在血栓红细胞的积累似乎最有可能俘获的结果。我们的研究结果相符原发性和继发止血39的概念。我们从以前报告的观察的差异可能是由缺氧和如在由Barr和同事30，其中对于扫描电子显微镜检查了的FeCl 3受损的颈动脉中小鼠此前没有暴露左心室制备了研究血液动力学改变机械ventillation的援助。血液中氧气浓度与血液动力学将大幅下降既是肺和胸部时没有机械通风打开后心功能会立即受到影响。氧气剥夺一直与促凝血途径和血栓形成40的触发，并且还可以提高红细胞的粘附有关。另一个最近的出版物已经示出的颈动脉的治疗用的FeCl 3（20％）的非常高的浓度为5或10分钟导致的FeCl 3的稳态浓度在约50mM的在受损血管29的管腔。因此，它们直接输注的50mM的FeCl 3成各种血液成分和审查的FeCl 3的上聚集体外的影响，这导致他们提出的FeCl 3的血栓形成29的动作的新颖，2相的机制。虽然挺有意思的，需要谨慎解读，因为它并不代表常用的氯化铁模型，从这项研究结果。在对比的FeC的高浓度L 3（20％，1M如纸表示）和长处理（5或10分钟），我们以前的研究以及Barr 等 。已经表明，10％的FeCl 3处理1分钟是足以引起7分钟6,30内颈动脉中的迅速闭塞性血栓的形成。另外，在大多数使用的FeCl 3的模式，的FeCl 3的进一步低浓度的实验的（5 - 7.5％）被使用。
这种模式的另一个限制是，由于严重的氧化损伤的内皮以及内皮剥脱后的FeCl 3处理，该模型可能是不正确的工具来研究内皮炎症有关的血栓形成。然而，通过使用这些技术来制备与荧光标记的白细胞的灌注组合颈动脉中，我们可以对炎症内皮41测试白细胞的粘附和轧制。
在SUMM元，我们已经完善和规范了氯化铁诱导的血管损伤模型，以产生对颈动脉高度重复性的伤害和活体显微镜精确定量血流停止的时间。该模型是足够和敏感测试抗凝和抗血小板药物，并且还适用于血栓靶向纳米的研究。在骨髓移植，血小板输注到血小板小鼠或候选药物直接注入血管内的组合，我们已经证明，这是一种方便，简单和敏感的工具来研究血栓体内 7-10,16,19,42,43 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
- Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
- Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
- Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
- Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
- Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
- Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
- Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
- Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
- Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
- Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
- Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
- Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
- Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
- Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
- Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
- Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
- Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
- Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
- Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
- Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
- Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
- Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
- Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
- Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
- Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
