Summary
Wij rapporteren een verfijnde procedure van de ijzerchloride (FeCl3) geïnduceerde trombose modellen op de halsslagader en mesenterica evenals ader, efficiënt gekarakteriseerd met behulp van intravitale microscopie tot tijd om trombi vorming occlusief bewaken.
Introduction
Arteriële trombose (bloedstolsel) is een veel voorkomende complicatie van vele systemische ziekten verbonden met chronische ontsteking, waaronder atherosclerose, diabetes, obesitas, kanker en chronische auto reumatologische aandoeningen. Trombi die zich in de arteriële circulatie voort uit ongepaste activatie van bloedplaatjes, aggregatie en coagulatie volgende mechanismen, en zijn betrokken in hartaanvallen, beroertes en extremiteiten verlies. De vaatwand is een complex dat meerdere celtypen omvat en wordt beïnvloed door een groot aantal extrinsieke factoren afschuifspanning circulerende bloedcellen, hormonen en cytokinen, alsook expressie van antioxidant eiwitten in de vaatwand. In vitro experimenten kunnen niet repliceren deze complexe omgeving en daarom in vivo studies met diermodellen zijn essentieel voor een beter begrip van de mechanismen betrokken bij trombotische aandoeningen toe.
Muizen is aangetoond sim hebbenilar mechanismen mens in termen van trombose, atherosclerose, ontsteking en diabetes 1,2. Bovendien kunnen transgene en knockout muizen worden gecreëerd om de functie van specifieke genproducten te testen in een complexe fysiologische of pathologische omgeving. Dergelijke studies na te bootsen menselijke pathologie en kunnen belangrijke mechanistische informatie met betrekking tot de ontdekking van nieuwe wegen en therapieën, om te voorzien in en verstrekt belangrijke details in het karakteriseren van drugs effecten op trombose.
Pathologische arteriële trombi optreden als gevolg van laag verwonding of disfunctie en de blootstelling van de bloedstroom naar de endotheliale subendotheliale matrix 3,4. Verschillende trombose modellen zijn ontwikkeld om deze endotheliale beschadiging induceren zoals mechanische schade fotoreactieve verbinding Bengaals gebaseerde oxidatieve schade en verwonding laser 5. In dit spectrum ferrichloride (FeCl3) geïnduceerde vasculaire schade is een veel gebruikt model van trombose. Dit reagens wanneeraangebracht op het buitenste aspect van vaartuigen induceert oxidatieve beschadiging van vasculaire cellen 6-8, met verlies van endotheliale cel bescherming van circulerende bloedplaatjes en componenten van de coagulatie cascade. Het FeCl3 model is eenvoudig en gevoelig voor zowel anticoagulerende en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen, en is uitgevoerd op carotis en femoralis, halsaders en mesenterische en cremasteric arteriolen en venulen bij muizen, ratten, cavia's en konijnen 6-15.
Een meetbare parameters in dit model is de verstreken tijd van de schade naar vat occlusie, gemeten als de bloedstroom stoppen met een Doppler stroommeter of onder directe observatie met intravitale microscopie 6,7,9 voltooien. Een reeks van tijden tussen 5 en 30 min werd gerapporteerd in verschillende studies bij muizen C57Bl6 7-10,16 suggereert dat FeCl3 concentraties vormen van anesthesie, chirurgische technieken, muis leeftijd, genomische achtergrond, meetmethode bLood stroming, en andere omgevingsvariabelen grote invloed in dit model. Deze grote variabiliteit bemoeilijkt studies vergelijken van verschillende onderzoeksgroepen en kan de detectie van kleine verschillen bemoeilijken.
Met een visie om deze variabiliteit te minimaliseren en om een uniform reproduceerbaar in vivo modelsysteem, hebben we de FeCl3-geïnduceerde halsslagader model dat de gegevens zeer reproduceerbare met minimale variatie 6-10,16-19 maakt verfijnd. In dit artikel beschrijven we en delen van de vaardigheden en het verslag een aantal representatieve experimentele voorbeelden die kunnen profiteren van dit model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en manipulaties van de dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) van The Cleveland Clinic in overeenstemming met de Verenigde Staten Public Health Service Beleid inzake de Humane zorg en het gebruik van dieren, en de NIH Gids voor de Zorg en Het gebruik van proefdieren.
1. Voorbereiding:
- Fluorescerende kleurstof voor Labeling Bloedplaatjes
- Bereid rhodamine 6G oplossing, 0,5 mg / ml in zoutoplossing en steriliseren van de oplossing met 0,22 urn filter.
- FeCl3 oplossing
- Maak een verse voorraad oplossing van 30% FeCl3 (watervrij, gelijk aan 1,85 M) in zuiver water, en filter met 0,45 urn filter. Bereid 5 ml vers FeCl3-oplossing in de gewenste concentratie [bijvoorbeeld 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) en 12,5% (0,771 M)] van verdunnen van de 30% FeCl3 oplossing met water ina 6 cm weefselkweek schotel en houd het deksel gesloten.
LET OP: Het gebruik van de cultuur schotel maakt het makkelijker op te pikken het filterpapier verzadigd met FeCl3 oplossing dan om het te halen uit een smalle container, zoals een 1,5 ml microcentrifugebuis. FeCl3 is zeer gevaarlijk is en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas enz., Persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden genomen.
- Maak een verse voorraad oplossing van 30% FeCl3 (watervrij, gelijk aan 1,85 M) in zuiver water, en filter met 0,45 urn filter. Bereid 5 ml vers FeCl3-oplossing in de gewenste concentratie [bijvoorbeeld 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) en 12,5% (0,771 M)] van verdunnen van de 30% FeCl3 oplossing met water ina 6 cm weefselkweek schotel en houd het deksel gesloten.
- filter Papers
- Snijd het filterpapier 1 mm x 2 mm groot. Geniet genoeg stukken van de cut filter papier in de FeCl3-oplossing in dezelfde schotel.
- Papaverinehydrochloride Solution
- Bereid papaverinehydrochloride oplossing (25 mg / ml) in water en steriliseren van de oplossing met 0,22 urn filter.
- agarose Gel
- Bereid 2% agarosegel in PBS of zoutoplossing in 6-well weefselkweekplaat, ~ 1 cm dikte, en cut het naar halve cirkel met ~ 3 cm diameter.
2. FeCl3 Induced arteria carotis Injury Trombose Model
- Chirurgische ingrepen voor de Trombose Model
- Gebruik 8-12 weken oude muizen C57Bl6 (of andere stammen zoals nodig). Verdoven muizen met het mengsel van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) via intraperitoneale injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen.
Opmerking: Deze hoeveelheid ketamine / xylazine voldoende is om het dier stabiele anesthesie en geen pijn (respons tot teen knijpen) gedurende ten minste 1 uur te houden. - Verwijder vacht op de hals en borst met een klein dier elektrische clipper. Ontharingscrème is niet noodzakelijk. Solliciteer neutrale aardolie oogzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
- Zet de muis in rugligging op het deksel van 15 cm weefselkweek plaat. Gebruik een lange tape (~ 10 cm) tot hin beveiligend ledematen en onderlichaam en twee stukken van kleine band (2 cm x 0,5 cm) aan de voorpoten te beveiligen. Gebruik een 4-0 hechtdraad te wikkelen rond de snijtanden, tape de twee uiteinden van de hechtdraad om het deksel muis rechte hals (figuur 2) te houden.
- Plaats de plaat met de muis hoofd in de richting van de bestuurder onder een chirurgische lichtbron.
- Steriliseer de chirurgische site met alcohol pad. Gebruik de Micro-Adson tang om de huid vast te houden en gebruik maken van een chirurgische schaar om een kleine incisie te maken (2-3 mm).
- Houd de huid van de incisie met de tang en steek chirurgische schaar met kaken in de incisie gesloten. Duw de schaar subcutaan in de richting van de manubrium of kin, en open vervolgens de schaar om de huid uit de subcutane laag te bevrijden.
- Snijd de huid met de chirurgische schaar een middellijn incisie van het manubrium op de omvang van tongbeen (figuur 3A en 3B). Botweg ontleden de dunne fascia (stippellijn, in
OPMERKING: De manubrium (zwarte pijl in figuur 3C) en de luchtpijp (T in figuur 3C) worden gezien na deze stap. - Houd het zachte weefsel en de huid te zien aan de rechterkant van de manubrium met de Graefe tang, plaatst u de hemostaat onder het dashboard naar de 02:00 positie (gele stippellijn in figuur 3C), open de kaken van de hemostaat om het vrije halsader uit de omliggende weefsel.
- Snijd de fascia, zachte weefsel en de huid naar de 02:00 positie (figuur 3C) met de chirurgische schaar om de juiste halsader (Figuur 3D, pijl) bloot te leggen.
- Trekken over 200-300 ul rhodamine 6G-oplossing met behulp van een 1 ml spuit met een 22 G naald, en dan veranderenhet aan 30 G naald.
LET OP: Dit beschermt de 30 G naald tegen beschadiging van zijn fijne punt. de rhodamine 6G oplossing met de 30 G-naald zal het puntje geen schade direct tekenen; Maar het aanraken van de containerwand per ongeluk schade, die injectie kan bemoeilijken veroorzaken. - Spoel de 30 G-naald door langzaam duwen de rhodamine 6G oplossing, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de injectiespuit of de naald blijven. Houd 100 gl rhodamine 6G oplossing voor injectie.
- Bend 2-3 mm uiteinde van de naald een 90 ° hoek met de naaldhouder, welke voorkomt de naald te diep om de halsader en maakt de injectie gemakkelijker gecontroleerd (Figuur 3D).
- Injecteer de rhodamine 6G oplossing in de rechter halsader labelen bloedplaatjes. Om de spuit te stabiliseren en te houden van de naald op zijn plaats, houd de spuit met de ene hand en de naald met de Graefe pincet met een andere hand tijdens de injection.After injectie, klem de injectieplaats met de Graefe pincet om het bloeden te voorkomen.
- Open de kaken van de hemostaat en plaats deze onder de Graefe tang om de vaatwand van de injectieplaats klem, en dan ligeren de injectieplaats met een 6-0 hechtdraad.
LET OP: Als een alternatief van stap 2.1.15, uitoefenen van druk op de injectieplaats met een vinger gedurende 2 minuten zal het bloeden te stoppen; Deze werkwijze heeft het gevaar bestaat dat verdere bloeding of het stolsel op de injectieplaats ongeluk wordt verwijderd. - Botweg ontleden het zachte weefsel en fascia rond de linker onderkaak klier met de hemostaat en de Graefe pincet en trek de klier in de richting van de 07:00 positie (figuur 3E) naar links sternocleidomastoideus (blauwe pijl in figuur 3E) bloot te leggen.
- Botweg ontleden de fascia (figuur 3E, gestippelde lijn) tussen de linker sternocleidomastoideus en de musculus omohyoideus of sternohyoid spier (figuur 3E, groene pijl) gelegen aan de linkerkant van de luchtpijp met de hemostaat.
- Passeren een naald met 6-0 zijden hechtdraad (ongeveer 15 cm lang) onder het midden van de sternocleidomastoideus (blauwe pijl in figuur 3E), zet de twee uiteinden van de hechtdraad en trek de hechtdraad zijdelings naar de 10:00 positie .
Opmerking: Deze procedure moet zorgvuldig worden uitgevoerd om schade van de linker jugulaire ader, die zich buiten het sternocleidomastoideus voorkomen. - Botweg scheiden de dunne sternohyoid spier- en / of musculus omohyoideus aan de halsslagader (CA) (Figuur 3F pijl) bloot te leggen na het wegrijden de sternocleidomastoideus spier. Snijd de sternohyoid spier- en / of musculus omohyoideus nodig. Gebruik de hemostaat om het zachte weefsel van CA te scheiden zonder dat het aanraken van de CA.
OPMERKING: CA gaat gepaard met de nervus vagus, de witte structuur waargenomen bij - Gebruik een fijne punt tang op te halen de laterale fascia rond de CA terwijl het vermijden van de nervus vagus en CA. Gebruik een andere fijne punt tang om een gat te slaan op de fascia tussen de CA en de nervus vagus.
- Steek de haak door het gat en til de CA, en plaats dan de fijne punt tang onder de CA. Beweeg de haak en tang in tegengestelde richtingen langs de CA om adventitia zacht weefsel te strippen. Gratis minstens ~ 5 mm lengte van CA (figuur 3H, blauwe pijl) uit de omliggende weefsel.
- Om achtergrond fluorescentie te blokkeren, drukt u op het einde van een zwarte plastic koffieopruier plat, crosscut de koffie roerder in een 3 mm stuk, en dan in lengterichting te snijden langs de vouw randen om twee stukken van "U" -vorm kunststof (figuur 3H, groen krijgen pijl).
- Gebruik 8-12 weken oude muizen C57Bl6 (of andere stammen zoals nodig). Verdoven muizen met het mengsel van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) via intraperitoneale injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen.
- Overdracht van de muis en de plaat deksel samen om de microscoop podium en plaats in een geschikte positie onder de 10X water lens. Vult de ruimte tussen de 10X lens en de CA met een zoutoplossing.
- Start de digitale video-opname software-applicatie, en een nieuw bestand te starten en noem maar op dienovereenkomstig. Neem normale schip afbeeldingen en noteer het framenummer bij de video-opname is gestopt.
LET OP: verwijzen naar de video-opname-software op de computer voor het opnemen. We maken gebruik van digitale video-opname-software en de volgende beschrijvingen zijn gebaseerd op deze aanvrage.
LET OP: Aangezien mechanische trauma kan het endotheel beschadigen en leiden tot trombusvorming 20, is het noodzakelijk te bevestigen dat er geen chirurgische letsel aan de vaatwand vóór de FeCl3 schade. Het is ook noodzakelijk om te bevestigen dat er geen resterend weefsel rond de CA, die een belemmering kan vormen en verzwakken het effect van FeCl3 geïnduceerde schade. Noteer het framenummer van de records maakt het gemakkelijk om de video's op basis verstreken tijd later te analyseren. - Beweeg de muis met plaat deksel uit de 10X lens. Vouw een hoek van een papieren handdoek om een dunne en fijne punt maken en gebruiken zorgvuldig dep de zoutoplossing rondom de CA (raak CA) en elders in het operatiegebied. Dit is belangrijk om verdunning van de FeCl3-oplossing voorkomen.
- Gebruik een fijne punt pincet en pick-up een stuk filterpapier verzadigd met FeCl3-oplossing en plaats deze direct op de CA en houd het op het terrein voor 1 min.
LET OP: To steun visualisatie van de bloedstroom en oogst nauwkeurige gegevens, Breng het filter nabij het distale einde van het blootgestelde CA (Figuur 3I) en een kort segment van de proximale locatie (groene pijl in figuur 3I) voor het waarnemen van de bloedstroom bij recente fase (zie hieronder). - Het filtreerpapier (dit tijdstip wordt gedefinieerd als de start van "na verwonding") en spoel de CA met zoutoplossing (minimaal 2 ml).
- Leg de muis met plaat deksel terug naar de 10X lens; observeren het schip en begint op te nemen videobeelden. Noteer het videoframe nummer aan het einde van de eerste minuut van de opname.
OPMERKING: Trombusvorming wordt gekenmerkt door accumulatie van de fluorescerende bloedplaatjes, die wordt waargenomen in real time videobeelden op het computerscherm of onder de microscoop. Record videobeelden direct na de invoering van de muis weer onder de microscoop. Houd opname aan het einde van de eerste minuut na het verwijderen van de fIlter papier. Observeer de gehele vaartuig vanaf het distale naar het proximale sites om informatie over de schade te verkrijgen, en dan richten op het interessegebied (meestal is het middelpunt van het verwonde gebied) voor verdere beeldvorming. - Opnemen videobeelden voor 10 seconden om de minuut gedurende de eerste 10 min (bijvoorbeeld 2:55-03:05) en vervolgens 10 sec iedere minuut tot het einde van het experiment. Noteer de framenummers bij elke opname wordt gestopt.
OPMERKING: De eindpunten van het model zijn: 1) wanneer de bloedstroom heeft opgehouden gedurende> 30 sec; of 2) indien occlusie wordt niet waargenomen bij 30 minuten na beschadiging. In dit geval gebruikt 30 min voor statistische analyse. Set belichtingstijd van de video-opname tot 10 msec in het begin, zodat het eenvoudig zal zijn om de bloedstroom over de trombi observeren. Wanneer de trombi groot worden en de fluorescentie verzadigt sensor van de camera, wordt het moeilijk om de bloedstroom via thrombi identificeren. Om dit probleem op te lossen, verplaats de beeldvorming center het proximale uninjured (figuur 3I, groene pijl) waarbij bloedstroming nog duidelijk kan worden waargenomen. Ook verhogen Expose Tijd tot 15 of 20 msec bij het scherpstellen op het proximale un-verwonde plaats, zodat de bloedstroom duidelijker waarneembaar. Wanneer de bloedstroom ophoudt, talrijke grotere cellen (leukocyten) beginnen te rollen op de vaatwand aan het proximale locatie van de trombus. Flow stopt meestal binnen 2-3 minuten na het verschijnen van de grote cellen. Noteer de Expose Tijd op de opname opgenomen wanneer het wordt veranderd. Het duurt ongeveer 30 minuten uit de narcose tot het einde van het experiment wanneer de normale wildtype C57Bl6 muizen werden gebruikt.
LET OP LET OP: Gebruik niet het witte geaggregeerde bloedplaatjes stollen als het teken van de bloedstroom staking, die geen nauwkeurige gegevens zal geven en dat wordt beïnvloed door de belichtingstijd. De witte stolsel bedekt het schip lumen betekent niet dat de bloedstroom beëindigd (zie de vertegenwoordiger video 1).
3. FeCl3 Induced mesenterica / veneuze trombose Model
- Verdoven 8-12 weken oude muizen C57Bl6 zoals vermeld in paragraaf 2.1.1. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
- Injecteer Papaverine oplossing (totaal 0,4 mg / muis) intraperitoneaal gut peristaltiek remmen.
- Verwijder vacht op de hals en buik met een dier elektrische clipper. Ontharingscrème is niet noodzakelijk.
- Zet de muis in rugligging op het deksel van 15 cm weefselkweek plaat. Gebruik vier stukken van kleine band (2 cm x 0,5 cm) om alle poten te beveiligen. Gebruik een 4 -0 hechting te wikkelen rond de snijtanden, tape de twee uiteinden van de hechtdraad om het deksel aan de hals rechte (figuur 2) te houden.
- Volg de procedures 2.1.4 -2.1.15 de halsader bloot voor injectie van rhodamine 6G labelen bloedplaatjes.
- Voer een middellijn incisie door de huid van zwaardvormig tot onderbuik met de chirurgische schaar (figuur 4A). Pak de middelste buikvlies (ook wel linea alba, figuur 4A, pijl) met Graefe pincet, dat is duidelijk en heeft geen bloedvaten, til ongeveer 2-3 mm hoog, bevestigen geen darm onder de snijlijn, en snijd het buikvlies geopend longitudinaal met de fijne schaar (figuur 4B).
- Re-veilig de muizen naar rechts laterale positie. De gehalveerde cirkel agarosegel dichtbij de buik, en voorzichtig exterioriseren de darmen en verdeel het bovenop de gel met de Graefe pincet (Figuur 4C). Gebruik de tweede takken voor de trombose experiment (Figuur 4C, pijl).
OPMERKING: Gebruik de hemostaat of Micro-Adson pincet te helpen om de darmen exterioriseren. Vermijd het kwetsen van dedarm en het vat. - Plaats 5-6 druppels zoutoplossing om het vochtgehalte van de darmen en vat te houden. Breng de muis met de plaat deksel samen om de microscoop podium en zet in de juiste positie onder de 10X droge lens.
LET OP: Gebruik een droge lens omdat de jejunoileal membraan zoutoplossing niet kan houden. Zorg ervoor dat u een zoutoplossing te laten vallen op de blootgestelde weefsels om ze vochtig te houden. - Dep de zoutoplossing rond de mesenterica en ader voor de behandeling.
- Gebruik een fijne punt tang op te halen een stuk filterpapier verzadigd met 12,5% FeCl3 oplossing en plaats deze direct op het mesenterica en ader gedurende 1 min (Figuur 4D). Het filtreerpapier (dit tijdstip wordt gedefinieerd als de start van "na verwonding") en spoel gewonden mesenterische slagader en ader met zoutoplossing (minimaal 2 ml).
- Leg de muis met plaat deksel weer onder de 10X droge lens; let op de schepen en beginnen te record videobeelden zoals vermeld in 2.2).
OPMERKING: De eindpunten van dit experiment zijn: 1) wanneer de bloedstroom heeft opgehouden gedurende> 30 sec; of 2) indien occlusie niet in 30 minuten gemeten na verwonding, en in dat geval gebruikt 30 min voor statistische analyse. - Eind experiment euthanaseren de muizen middels overdosering ketamine / xylazine (200/20 mg / kg), gevolgd door cervicale dislocatie na geen ademhaling en hartslag worden bevestigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Halsslagader Trombose Model
In muizen met C57BL6 achtergrond, raden we u aan 7,5% FeCl3 voor de behandeling van het schip voor 1 min als uitgangspunt. Onder behandeling van 7,5% FeCl3, worden de grenzen van de gewonde gebied en de normale vaatwand gemakkelijk te herkennen onder de microscoop (zie online video 1), wat suggereert dat de endotheliale laag aanzienlijk beschadigd was. De bloedproppen gevormd direct na FeCl3 behandeling, en worden waargenomen in alle WT C57Bl6 muizen 1 min na een blessure. Het aanvankelijk gevormde trombi onstabiel en delen daarvan worden gewoonlijk verwijderd door de bloedstroom gewassen, zodat de gevormde trombi kleiner is 2 - 3 min na beschadiging. Trombi beginnen te vergroten 3-4 minuten na het verwijderen van het filter papier en deze later vormden trombi zijn stabiel en meestal niet weggespoeld. De gemiddelde afsluitende tijd is 11,3 ± 3.16 min in de C57Bl6 muizen (n = 14) bij 7,5% FeCl 3 wordt gebruikt 6,7,19 (Figuur 5A en online video 1). In de eerdere studies hebben we aangetoond dat zowel verlaging en verhoging van FeCl3 concentraties vermindert het verschil tussen een anti-trombotische muizenstam en WT-muizen 6; Uit ervaring behandeling van de halsslagader met 7,5% FeCl3 gedurende 1 min is voldoende om al onze doeleinden voldoen. Naast de functie van specifieke genen te testen met behulp van knockout muizen 7,8,16,19,21, na zijn vier representatieve experimenten met dit model:
Intraveneuze perfusie van weefsel plasminogeenactivator gemedieerde trombolyse
Weefsel-type plasminogeen activator (tPA) is een van de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor trombolyse behandeling in de Verenigde Staten 22. We observeerden dus de tPA-gemedieerde trombolyse in de halsslagader trombose model. trombose wasgestart met 7,5% FeCl3 en laat vormen gedurende 5 minuten voor tPA (1 mg / kg lichaamsgewicht) werd geperfuseerd via een halsader katheter (22GA). Zoals getoond in figuur 5B en online video 2, de trombus voortdurend vergroot en bezetten ongeveer 50% van de lumen 5 min na beschadiging. De trombi bleef vergroten na tPA perfusie suggereert dat tPA geen invloed bloedplaatjes activering en aggregatie. Trombolyse begon ongeveer 4 minuten na tPA injectie. De gevormde trombi bleken grootte variaties herhaaldelijk ondergaan tijdens de 30 minuten observatieperiode en geen vat occlusie gebeurd in dit geval. Deze gegevens toonden duidelijk aan dat tPA-gemedieerde bloedplaatjes trombusvorming niet volledig kan remmen, zelfs al leidt tot trombolyse. Daarom envision we toekomstige experimenten onder toepassing van de FeCl3 geïnduceerde arteriële trombose model kan worden gebruikt voor trombolytische en andere aanvullende therapieën die een prominente prev hebben evaluerendiger effect op trombusvorming.
Perfusie van PAR4 antilichaam aan muizen Remt Trombose
Protease geactiveerde receptor 4 (PAR4) een G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) op bloedplaatjes die wordt geactiveerd door proteolytische splitsing van het N-terminale exodomain 23 en vervolgens leidt tot stappen bloedplaatjesactivatie. De Nieman lab is een geiten polyklonaal antilichaam PAR4 (CAN12) de anionische cluster van PAR4 gericht, en vertraagt PAR4 splitsing, waardoor een kritische stap voor PAR4 gemedieerde activering van bloedplaatjes beïnvloeden 24 gegenereerd. Door perfusie van 1 mg / kg van het antilichaam aan de C57BL6 muizen, vonden we dat remming van PAR4 splitsing significant verlengd malen trombusvorming in 7,5% FeCl3 geïnduceerde halsslagader trombosemodel occlusief (Figuur 5C en online video 3). Hieruit blijkt dat de FeCl3 geïnduceerde trombose model ceen worden gebruikt om de effecten van anti-plaatjes middelen te evalueren en karakteriseren potentiële therapeutische strategieën.
Nanodeeltjes gemedieerde Trombi-specifieke targeting
Rapid stolsel verwijderen van het herstel van de bloedstroom is cruciaal in de behandeling van occlusieve vasculaire ziekten waaronder ischemische beroerte en hartinfarct. Systemische toediening van trombolytische middelen zoals tPA hierboven getoonde, kunnen de gevormde trombi te lyseren, maar niet geheel voorkomen bloedplaatjes activering en re-aggregatie / occlusie. Daarnaast kunnen systemische directe levering van dergelijke serineprotease agenten leiden tot willekeurige off-target actie, wat leidt tot ernstige bijwerkingen, waaronder bloeding. De Sen Gupta lab is ontworpen plaatjes-geïnspireerde nanodeeltjes gebaseerde synthetische levering voertuigen die te stollen bijbehorende geactiveerde bloedplaatjes en eiwitten kunnen binden onder hemodynamische afschuiving stroom 25-27. We aldus onderzocht of deze nanodeeltjes kunnenbinden aan de actieve vormen van thrombi in een slagader.
Zoals in experiment tPA perfusie werd een katheter in de halsader en verbonden met een injectiepomp voor injectie van nanodeeltjes op gelijkmatige stroomsnelheid. In dit experiment werd geen fluorescentie kleurstof geïnjecteerd in de muis bloedplaatjes labelen. In plaats daarvan werden de nanodeeltjes gemerkt met Rohdamine B; Daarom waren ze in staat onder intravitale microscoop in acht te nemen. De trombose werd gestart met 7,5% FeCl3 behandeling van 1 min zoals eerder vermeld. Aangezien in WT-muizen, een aanzienlijke hoeveelheid trombi bleek 5 minuten na verwonding vormen, selecteerden we dit tijdstip voor injectie van nanodeeltjes te detecteren of de nanodeeltjes efficiënt binden aan de actieve vormen van trombi. Zoals getoond in figuur 5D en online video 4, na injectie van fluorescente nanodeeltjes, konden we een berg-vormige identificerentrombus beperkingen die tegen de fluorescerende deeltjes werd bedekt. Deze studies tonen het nut van de FeCl3 geïnduceerde trombose model om de targeting vermogen (en daaropvolgende therapeutische werkzaamheid) van trombus gerichte deeltjesvormige geneesmiddelafgiftesystemen evalueren.
De rol van Red anders dan Bloedplaatjes in trombusvorming Blood Cells.
Recente studies hebben gesuggereerd dat rode bloedcellen (RBC's) spelen een belangrijke rol bij de FeCl3-geïnduceerde trombose model 28 en zijn de eerste hechtende bloedproduct aan de verwonde vaatwand 29,30. Om dit fenomeen te onderzoeken, gelabeld we RBC met 1.1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perchloraat (Dil, 10 uM uiteindelijke concentratie). De Dil-gemerkte rode bloedcellen werden tweemaal gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in zoutoplossing met 35% hematocriet. De Dil-gelabelde RBC suspensie (100 pi per muis) was injected in de trombocytopenische muizen die letaal bestraald 5 dagen voor het experiment 19. Deze trombocytopenische muizen hebben significant verminderde bloedplaatjes, waardoor de kans op RBC afwachten naar de vaatwand neemt toe, als ze. In tegenstelling tot de experimenten met fluorescentie gemerkte bloedplaatjes (figuur 5), geen duidelijke accumulatie van fluorescerende cellen op de vaatwand na verwonding van bloedvat (figuur 6A, online v ideo 5). Echter, samen met de vorming van de bloedplaatjes-trombi, RBC begon te accumuleren in de trombus die de vorm van het stolsel (figuur 6A) toont. Immunofluorescentiekleuring van de gewonde halsslagader aangetoond dat grote cellen gehecht aan de vaatwand zijn bloedplaatjes (CD41 positief, groen), terwijl de Dil-gelabelde RBC voornamelijk gevangen in de trombi (figuur 6B en C). Deze studies tonen dat deFeCl3 geïnduceerde trombose model kan worden gebruikt bij het verkrijgen van mechanistische inzicht in cellulaire en moleculaire componenten en spatio-temporeel gebeurtenissen in trombusvorming.
Mesenteriale trombose Model
Voor de mesenteriale trombose model, een hoge concentratie van FeCl3 - is (10 12,5%) aanbevolen als de vaten meestal zijn omgeven door vetweefsel, die FeCl3 diffusie naar de vaatwand kunnen belemmeren en voorkomt zo dat vaartuig FeCl3 geïnduceerde letsel 7. Dit model is geschikt voor veneuze trombose studie. Zoals weergegeven in online video 6, werd trombus gezien rond ~ 15 sec in de mesenterische ader na plaatselijke toediening het filtreerpapier verzadigd met 12,5% FeCl3-oplossing, maar trombusvorming dramatisch vertraagd in de mesenteriale slagader. De gemiddelde tijd tot trombusvorming occlusief is ~ 17 ± 7.2 min (n = 11) in m esenteric ader en ongeveer 23 ± 9,9 minuten (n = 10) in mesenterica bij 12,5% FeCl3 gebruikt 7.
Figuur 1. Chirurgie Extra. De minimale benodigde gereedschappen voor muizen een operatie worden getoond. Zie Materialen lijst voor meer gedetailleerde informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Mouse Fixatie voor Heelkunde. Bevestig de muis op de 15 cm cultuur schotel deksel voor halsslagader trombose model of voor de injectie van rhodamine 6G kleurstof voor de mesenteriale trombose model.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. halsslagader Trombose Model. Procedures om de halsader bloot te leggen, injectie van rhodamine 6G fluorescente kleurstof in het bloed en de blootstelling van de linker halsslagader worden getoond. In (A), de lijn geeft de incisie van manubrium tot het niveau van het tongbeen; in (B), blauwe pijlen geven onderkaak klieren, en gele gestippelde lijnen geven de fascia tussen de onderkaak klieren; in (C), blauwe pijlen geven onderkaak klieren, zwarte pijl geeft manubrium en gestippelde gele lijn geeft de positie aan te snijden om de halsader bloot te leggen; (D), blauwe pijl geeft halsslagader; in (E), gele pijl geeft links onderkaak klier, blauwe pijl indicates linker sternocleidomastoideus, gestippelde gele lijn geeft fascia, en de groene pijl geeft de musculus omohyoideus of sternohyoid spier; in (F), blauwe pijl geeft halsslagader, de gele gestippelde lijnen geven de dunne sternohyoid spier- en / of de musculus omohyoideus; in (G), de blauwe pijl geeft de halsslagader en de groene pijl geeft aan nervus vagus; in (H), de blauwe pijl geeft halsslagader en de groene pijl geeft de plastic "U-vorm" koffieopruier; en (I), de blauwe pijl geeft het filterpapier gelegen met FeCl3 oplossing en groene pijl geeft de halsslagader. T geeft luchtpijp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. mesenterica en veneuze trombose model. Blootstelling van mesenteriale vaartuigen, alsmede FeCl3 behandeling wordt getoond. In (A), de blauwe pijl geeft linea alba, de witte vezelig weefsel zonder vaartuig; In (B), een incisie alleen snijd de linea alba werd aangetoond; in (C), de blauwe pijlen geven de tweede boog van de mesenterische arteriën en aders; in (D), de blauwe pijl geeft de filter papier ligt met FeCl3 oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Representatieve Experimenten met de halsslagader trombosemodel. (A). Trombusvorming in theC57Bl / 6 muizen behandeld met 70,5% FeCl3. (B). TPA gemedieerde trombolytische effect. (C). Injectie van antilichaamtargeting muis trombinereceptor PAR4 voor trombose krijgt. (D). Trombus-sitegerichte nanovehicles specifiek binden aan actieve vormen trombi kreeg . Inj. P geeft injectie van deeltjes; en Peak B geeft piek banding van deeltjes tot de trombi. Alle beelden werden genomen in het kader van dezelfde vergroting. Schaal bar = 300 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Rol van RBC bij trombusvorming. (A) trombocytopenische muizen die perfusie van Dil-gelabelde RBC ontvangen werden aan de halsslagader trombosemodel en beelden na 7,5% FeCl
Video 1: Vertegenwoordiger video van de halsslagader trombose model in wild type (WT) muizen. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Deze video laat de vertegenwoordiger van trombusvorming in de halsslagader van WT muizen geïnduceerd door plaatselijk aanbrengen van filterpapier gelegenmet 7,5% FeCl3-oplossing. Bloedplaatjes werden gelabeld door intraveneuze injectie van rhodamine 6G en video is genomen in monochroom. De witte massa clotted bloedplaatjes.
Video 2: Tissue plasminogen activator (tPA) gemedieerde trombolytische effect gedetecteerd door de halsslagader trombose model. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Bloedplaatjes etikettering en trombusvorming werden geïnitieerd zoals vermeld in video 1 en tPA werd geïnjecteerd intraveneus 5 min na 7,5% FeCl3 letsel.
Video 3: trombocytenaggregatieremmer, na mely anti-protease activated receptor 4 (PAR4) antilichaam-gemedieerde anti-trombotische effect gedetecteerd door de halsslagader trombose model. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) In dit experiment, muizen kregen PAR4 antilichaam en rhodamine 6G injectie 10 min voor trombusvorming werd geïnitieerd door plaatselijk aanbrengen van filter papier ligt met 7,5% FeCl3.
Video 4: nanodeeltjes gemedieerde trombi-specifieke targeting. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) In dit experiment werd de halsslagader trombusvorming gestart met 7,5% FeCl3 zonder etikettering bloedplaatjes. Nanodeeltjes werd gemerkt met Rhodamine B en intraveneus geïnjecteerd in de muis 5 min na beschadiging.
Video 5 "src =" / files / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Video 5: Binding van de rode bloedcellen gedetecteerd door de halsslagader trombose model. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Rode bloedcellen (RBC) werden gemerkt met 1,1-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perchloraat (Dil, 10 uM uiteindelijke concentratie), en 100 ul van de Dil-gemerkte rode bloedcellen (hematocriet 35%) werd geïnjecteerd in de muizen trombocytopenie. Nr bloedplaatjes labeling werd uitgevoerd in dit experiment. Trombus werd geïnitieerd zoals hierboven with7.5% FeCl3 genoemd.
Video 6: Vertegenwoordiger video van de mesenteriale slagader en veneuze trombose model op WT muizen. (Rechts-click downloaden.) bloedplaatjes werden gelabeld door intraveneuze injectie van rhodamine 6G en trombus werd gestart na topicaal aanbrengen van een stuk filtreerpapier met 12,5% FeCl3-oplossing gedurende 1 minuut. Het schip werd waargenomen onder 10X droge lens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FeCl3-geïnduceerde model is een van de meest gebruikte trombose modellen, die niet alleen waardevolle informatie over genetische modificatie op bloedplaatjesfunctie en trombose 7,8,16,19,31-33 kunnen verschaffen, maar kan ook een waardevol hulpmiddel voor de evaluatie van de therapeutische samenstellingen en strategieën voor de behandeling en preventie van ziekten atherothrombotische 11,17,34-37. Hier hebben we modificaties en verfijningen van het model getoond en toonde aanvullend bewijs van de bruikbaarheid van deze techniek, die voldoende gevoelig voor de effecten van anticoagulant (tPA) en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen (PAR4 antilichaam) te bepalen. Naast de mechanistische onderzoek van trombose kan het model ook worden gebruikt om-gebaseerde nanotechnologie, trombi-gerichte geneesmiddelafgifte te bestuderen. Het kan ook worden gebruikt voor de detectie van vaatwand reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming door injectie van fluorescente ROS indicator 21.
Nauwkeurigtechnieken nodig om deze modellen voeren. De exploitant moet voldoende chirurgische vaardigheden, evenals een diep begrip van vasculaire en bloed celbiologie hebben. Een aantal belangrijke punten van de FeCl3-geïnduceerde halsslagader trombose model zijn 6: (1) bloot genoeg lengte van de halsslagader (~ 5 mm) om de toepassing van het filter papier toe en laat een ruimte om de bloedstroom in het kader van intravitale microscopie te observeren in de late fase ; (2) duidelijk strip de adventitia zacht weefsel rond de halsslagader om de filter papier om de vaatwand direct contact op te nemen en produceren een nog blessure; (3) te bevestigen geen mechanische schade aan de vaatwand en geen trombusvorming vóór toepassing van FeCl3 -verzadigde filter papier; (4) ten grondslag aan de halsslagader met een stukje "U" vormige zwarte plastic om de slagader te scheiden van omringend weefsel, om achtergrondfluorescentie te blokkeren en te voorkomen FeCl 3 diffusie. Door deze strategieën, hebben we zeer gegenereerdreproduceerbare gegevens met de wildtype C57BL / 6 muizen, en in deze muizenstam 7,5% FeCl3 geïnduceerde trombose bedraagt 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. De halsader injectie van rhodamine 6G labelen circulerende cellen kan een uitdaging zijn. Als alternatief kan een staartader injectie worden uitgevoerd voor het bevestigen van de muis in de 15 cm plaat deksel. In vergelijking met de halsslagader model, de mesenterische slagader en ader model is eenvoudiger en minder chirurgisch intensief. Zoals vermeld in de sectie resultaat, wegens het feit dat de schepen door vetweefsel, de mesenteriale trombose model beter is voor het bestuderen van veneuze trombose maar vereist een grotere steekproef om de fout tussen verschillende muizen minimaliseren.
De beperking van dit model is dat het mechanisme is niet duidelijk en nog steeds omstreden. Aanvankelijk het mechanisme van dit model werd aangenomen dat van FeCl3 gegenereerde ROS geïnduceerde erosie van endotheelcellen en subsequently leidde tot de blootstelling van bloedcomponenten aan de prothrombotische subendotheel, van bloedplaatjes adhesie, aggregatie en trombusvorming 6,11 renderen. Bij reconstitutie van plaatjes voorbehandeld met GPVI antilichaam tegen het trombocytopenie muizen, hebben we aangetoond dat het FeCl3 model afhankelijk GPVI van bloedplaatjes en bloedplaatjes blokkeren GPVI sterk geremd FeCl3 geïnduceerde vorming van trombi 19. Deze bevinding is in lijn met eerdere rapporten 38 en suggereert dat de FeCl3 model meer kans om de pathofysiologie van menselijke atherosclerotische plaque-gemedieerde trombose 6 nabootsen kan zijn. Echter, een aantal recente studies nieuwe mechanismen waaronder adhesie van rode bloedcellen aan de vaatwand en fysisch effect van FeCl3 geïnduceerde aggregatie van plasma-eiwitten en bloedcellen 29,30 voorgesteld. Deze nieuwe inzichten suggereren dat de mogelijke mechanismen van dit model kan complexer zijn.
Door perfusie van Dil-gemerkte rode bloedcellen in de trombocytopenische muizen en vervolgens het induceren FeCl3 -triggered letsel aan de halsslagader met 7,5% FeCl3, vonden we dat de belangrijkste cellen hechten aan de vaatwanden gewonden zijn bloedplaatjes (figuur 6 en online video 5 ). We vonden het niet voor de hand liggende rode bloedcellen hechting, en de accumulatie van RBC in de trombi leek de meeste kans om een resultaat van trapping zijn. Onze bevindingen komen overeen met de begrippen primaire en secundaire hemostase 39. Het verschil van onze waarneming van de vorige rapporten kan van hypoxie en hemodynamische veranderingen zoals in het onderzoek van Barr en collega 30, waarbij de FeCl3 gewonden halsslagaders voor scanning elektronenmicroscopie onderzocht werden op muizen die had de linker ventrikel eerder blootgesteld zonder hulp van een mechanische ventilatie. Bloed zuurstof concentratie en hemodynamica zal drastisch worden verlaagd als zowel long- enhartfunctie zal onmiddellijk worden getroffen nadat de kist wordt geopend zonder mechanische ventilatie. Zuurstoftekort is lang geassocieerd met activering van de procoagulant route en trombose 40 en ook kunnen RBC hechting verbeteren. Een andere recente publicatie is aangetoond dat behandeling van de halsslagader met een zeer hoge concentratie van FeCl3 (20%) gedurende 5 of 10 minuten leidt tot een steady-state concentratie van FeCl3 bij ~ 50 mM in het lumen van het verwonde vat 29 . Zij dus rechtstreeks toegediend 50 mM FeCl3 in verschillende bloedcomponenten en het effect van FeCl3 samentelling ex vivo, die hebben geleid tot een nieuwe, 2-fasen mechanisme voor de werking van FeCl3 in trombusvorming 29 voorstellen onderzocht. Hoewel heel interessant, de resultaten van deze studie moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd omdat het niet de FeCl3 model veelgebruikte vertegenwoordigen. In tegenstelling tot de hoge concentratie FeCl 3 (20%, 1 M zoals in het papier) en lange behandeling (5 of 10 minuten), onze eerdere studies en Barr et al. hebben aangetoond dat 10% FeCl3 behandeling van 1 min is om een snelle occlusieve trombusvorming in de halsslagader binnen 7 min 6,30 induceren. Bovendien, in de meeste van de experimenten met het FeCl3 model, een verdere lage concentratie van FeCl3 (5-7,5%) gebruikt.
Een andere beperking van dit model is dat door de strenge oxidatieve schade aan het endotheel en blootleggen van endotheelweefsel na FeCl3 behandeling, dit model mogelijk niet het juiste instrument endotheliale ontsteking geassocieerd trombose bestuderen. Echter, door deze technieken om de halsslagader in combinatie met perfusie van fluorescent gelabelde leukocyten bereiden we de adhesie en rolling van de leukocyten te testen op de inflammatoire endotheel 41.
in summAry hebben we verfijnd en gestandaardiseerd de FeCl3-geïnduceerde vasculaire schade model naar een zeer reproduceerbare letsel aan de halsslagader te produceren en te kwantificeren bloeddoorstroming stoppen tijd nauwkeurig door intravitale microscopie. Dit model volstaat en gevoelig voor de anticoagulerende en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen te testen, en is ook geschikt voor studies van trombi gerichte nanomedicine. In combinatie met beenmergtransplantatie, bloedplaatjes infusie in de trombocytopenische muizen of directe intravasculaire injectie van kandidaat geneesmiddelen, hebben we aangetoond dat dit een geschikte, eenvoudig en gevoelig middel om trombose in vivo studie 7-10,16,19,42,43 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
- Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
- Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
- Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
- Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
- Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
- Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
- Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
- Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
- Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
- Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
- Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
- Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
- Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
- Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
- Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
- Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
- Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
- Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
- Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
- Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
- Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
- Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
- Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
- Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
- Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
