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Medicine

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

doi: 10.3791/54479 Published: September 5, 2016

Summary

Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico (FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.

Introduction

trombose arterial (coágulo de sangue) é uma complicação comum de muitas doenças sistêmicas associadas à inflamação crônica, incluindo a aterosclerose, diabetes, obesidade, câncer e doenças reumatológicas auto-imunes crônicas. Trombos que ocorrem no tronco circulação arterial a partir inadequado ativação plaquetária, agregação e mecanismos coagulante subsequentes e estão implicados em ataques cardíacos, derrames e perda de extremidade. A parede do vaso é um sistema complexo que inclui vários tipos de células e é influenciada por uma multitude de factores extrínsecos, incluindo tensão de corte, as células sanguíneas, hormonas e citocinas, bem como a expressão de proteínas antioxidantes que circula na parede do vaso. Experiências in vitro não pode replicar neste ambiente complexo e, por conseguinte, em estudos in vivo utilizando modelos animais são críticos para permitir uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em doenças trombóticas.

Os ratos têm mostrado ter SIMmecanismos lhantes aos seres humanos em termos de trombose, aterosclerose, inflamação e diabetes 1,2. Além disso, camundongos transgênicos e knockout podem ser criados para testar a função de produtos de genes específicos em uma fisiológica complexa ou ambiente patológico. Tais estudos imitar patologia humana e pode fornecer informações mecanicista importante relacionado à descoberta de novos caminhos e terapias, bem como fornecer detalhes importantes na caracterização de efeitos de drogas sobre a trombose.

Trombos arteriais patológicas ocorrer devido à lesão endotelial camada ou disfunção e a exposição do fluxo de sangue para a matriz subendotelial 3,4. Vários modelos de trombose foram desenvolvidos para induzir esse dano endotelial tais como dano mecânico, dano oxidativo baseado em Bengal composto fotorreativa Rose e ferimentos de laser 5. Neste espectro, cloreto férrico (FeCl3) induzida por lesão vascular é um modelo amplamente usado de trombose. Este reagente quandoaplicada ao aspecto exterior dos navios induz danos oxidativos para células vasculares 6-8, com a perda da protecção de células endoteliais a partir de plaquetas e componentes da cascata de coagulação circulantes. O modelo FeCl3 é simples e sensível para ambos os anticoagulantes e anti-plaquetas drogas, e foi realizada em artérias carótida e femoral, veias jugulares e mesentérica e arteríolas cremastérico e vênulas em ratinhos, ratos, cobaias e coelhos 6-15.

Um parâmetro mensurável neste modelo é o tempo decorrido de uma lesão para completar oclusão do vaso, medida como a cessação do fluxo sanguíneo com um medidor de fluxo de Doppler ou sob observação directa com 6,7,9 microscopia intravital. Uma gama de tempos de entre 5 a 30 min tem sido relatada em diferentes estudos em ratinhos C57BL6 7-10,16, sugerindo que as concentrações de FeCl 3, tipos de anestesia, técnicas cirúrgicas, idade rato, fundo genómico, método de medição bfluxo lood, e outras variáveis ​​ambientais têm efeitos significativos neste modelo. Esta ampla variabilidade faz com que seja difícil comparar estudos de diferentes grupos de pesquisa e pode fazer a detecção de diferenças sutis difícil.

Com uma visão para minimizar tais variabilidades e estabelecer um uniforme reprodutível em sistema de modelo vivo, temos refinado o modelo de artéria carótida induzida por FeCl3 que faz com que os dados altamente reproduzíveis com o mínimo de variação 6-10,16-19. Neste artigo descrevemos e compartilhar as habilidades e relatar vários exemplos experimentais representativos que podem beneficiar a partir deste modelo.

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Protocol

Todos os procedimentos e manipulações de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Uso Comissões (IACUC) da The Cleveland Clinic, em conformidade com a política dos Estados Unidos Serviço de Saúde Pública sobre o cuidado humano e uso de animais, e o Guia NIH para o Cuidado e uso de Animais de laboratório.

1. Preparações:

  1. Corante fluorescente para a rotulagem Plaquetas
    1. Preparar solução de rodamina 6G, 0,5 mg / ml, em solução salina e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um.
  2. FeCl3 Solução
    1. Adicione uma solução de fresca de 30% FeCl 3 (anidro, é igual a 1,85 m) em água pura, e filtrar com filtro de 0,45 um. Prepare 5 ml fresco FeCl3 solução na concentração desejada [por exemplo, 2,5% (0,154 m), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) e 12,5% (0,771 M)], através diluindo a solução de 30% FeCl3 com i águaNA 6 cm de placa de cultura de tecidos e manter a tampa fechada.
      NOTA: O uso da placa de cultura faz com que seja mais fácil de pegar o papel de filtro saturado com solução de FeCl 3 do que para buscá-lo a partir de um recipiente estreito, como um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. FeCl3 é extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas e bata de laboratório etc., equipamento de protecção, devem ser sempre tomadas.
  3. Papéis de filtro
    1. Corte o papel de filtro a 1 mm x 2 mm de tamanho. Soak suficiente peças de papel de filtro de corte na solução de FeCl3 no mesmo prato.
  4. Solução de cloridrato de papaverina
    1. Preparar a solução de cloridrato de papaverina (25 mg / ml) em água e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um.
  5. Gel de agarose
    1. Preparar 2% de gel de agarose em PBS ou solução salina em 6 cavidades da placa de cultura de tecidos, ~ 1 cm de espessura, e Cut-lo para semi-círculo com ~ 3 cm de diâmetro.

2. FeCl3 Induced carótida Injury Thrombosis Modelo

  1. Procedimentos cirúrgicos para o modelo de trombose
    1. Use 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade (ou outras estirpes como necessário). Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) via injecção intraperitoneal. Confirmar a profundidade da anestesia por beliscar dedo do pé.
      NOTA: Este quantidade de cetamina / xilazina é suficiente para manter o animal em anestesia estável e sem dor (resposta ao dedo do pé que comprime a) durante pelo menos 1 h.
    2. Retire a pele no pescoço e parte superior do tórax com uma pequena clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário. Aplicar neutra pomada de petróleo sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia.
    3. Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use uma fita longa (~ 10 cm) para garantir hinmembros d e parte inferior do corpo, e dois pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 centímetros) para fixar as pernas dianteiras. Use um fio de sutura 4-0 para envolver os incisivos, fita as duas extremidades da sutura com a tampa para manter o pescoço do rato em linha reta (Figura 2).
    4. Coloque placa com cabeça de rato na direcção do operador sob uma fonte de luz cirúrgica.
    5. Esterilizar o local da cirurgia com a almofada de álcool. Use as Micro-Adson pinça para segurar a pele e usar uma tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão (2-3 mm).
    6. Segurar a pele da incisão com uma pinça e inserir as tesouras cirúrgicas, com as maxilas fechadas dentro da incisão. Empurrar a tesoura por via subcutânea em direção ao manubrium ou o queixo, em seguida, abra a tesoura para libertar a pele da camada subcutânea.
    7. Cortar a pele com as tesouras cirúrgicas para fazer uma incisão na linha média a partir da fúrcula ao nível do osso hióide (Figura 3A e 3B). Sem rodeios dissecar a fáscia fina (linha pontilhada, em (Figura 3B e 3C; setas azuis).
      NOTA: O fúrcula (seta preta na Figura 3C) e a traqueia (T na figura 3C) será visto após este passo.
    8. Segurar o tecido mole e pele visto na parte direita da manubrium com a pinça Graefe, inserir a pinça hemostática sob a fáscia para a posição 2:00 (linha pontilhada na Figura 3C amarelo), abrir as maxilas da pinça hemostática para o libertar veia jugular do tecido circundante.
    9. Cortar o fáscia, tecidos moles e da pele para a posição 2:00 (Figura 3C) com as tesouras cirúrgicas para expor a veia jugular direita (Figura 3D, seta).
    10. Desenhe sobre 200-300 ul rodamina 6G solução utilizando uma seringa de 1 ml com 22 G agulha, e depois mudança-lo a 30 g de agulhas.
      NOTA: Isso protege a agulha 30 G de dano da sua ponta fina. Diretamente desenho da solução rodamina 6G com a agulha 30 G não vai danificar a ponta; no entanto encostar na parede do recipiente acidentalmente irá causar danos, o que pode fazer a injeção difícil.
    11. Lave a agulha 30 G lentamente empurrando para fora a solução 6G rodamina, certifique-se não há bolhas de ar permanecer na seringa ou a agulha. Mantenha 100 ul rodamina 6G solução para injecção.
    12. Curva 2 - 3 mm da ponta da agulha para um ângulo de 90 ° com o suporte de agulha, o que irá impedir a inserção da agulha é muito profundo para a veia jugular e faz a injecção mais facilmente controlada (Figura 3D).
    13. Injectar a solução rodamina 6G na veia jugular direito de plaquetas de etiqueta. Para estabilizar a seringa e manter a agulha na posição, segure a seringa com uma mão e a agulha com a pinça Graefe com a outra mão durante o injection.Afinjecção ter, fixar o local da injecção com a pinça Graefe para evitar sangramento.
    14. Abrir as maxilas da pinça hemostática e inseri-lo sob a pinça Graefe para fixar a parede do vaso no local da injecção, e depois ligar o local de injecção com um fio de sutura 6-0.
      NOTA: Como uma alternativa de passo 2.1.15, aplicando pressão no local da injecção com um dedo por 2 min vai parar o sangramento; No entanto, este método tem o risco de provocar sangramento adicional se o coágulo no local da injecção é removido acidentalmente.
    15. Sem rodeios dissecar o tecido mole e fáscia em torno da glândula submandibular esquerda com a pinça hemostática e as pinças Graefe e puxe a glândula para a posição 07:00 (Figura 3E) para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo (seta azul na Figura 3E).
    16. Sem rodeios dissecar a fáscia (Figura 3E, linha pontilhada) entre o músculo esternocleidomastóideo esquerdo eo músculo omo-hióideo ou sternohymuscular oid (Figura 3E, seta verde) localizada no sítio esquerda da traqueia com a pinça hemostática.
    17. Passe uma agulha com 6-0 sutura de seda (cerca de 15 cm de comprimento), sob a meio do músculo esternocleidomastóideo (seta azul na Figura 3E), colocar as duas extremidades da sutura juntos e puxar a sutura lateralmente em direção à posição de 10 horas .
      NOTA: Este procedimento deve ser realizado com cuidado para evitar lesões da veia jugular esquerda, que está localizado fora do músculo esternocleidomastóideo.
    18. Sem rodeios separar o músculo esterno fina e / ou músculo omo-hióideo para expor a artéria carótida (CA) (Figura 3F seta) após se afastar do músculo esternocleidomastóideo. Corte o músculo esterno e / ou músculo omo-hióideo, se necessário. Use a pinça hemostática para separar o tecido mole da CA sem tocar no CA.
      NOTA: CA é acompanhada pelo nervo vago, a estrutura em branco considerado Figura 3F).
    19. Use uma pinça fina ponta para pegar a fáscia lateral, em torno da CA, evitando o nervo vago e CA. Use outro pinça de ponta fina para perfurar um buraco na fáscia entre a CA e nervo vago.
    20. Passe o gancho através do buraco e levante cuidadosamente a CA, e em seguida, coloque a pinça de ponta fina sob a CA. Mova o gancho e uma pinça em sentidos opostos ao longo da CA para retirar tecidos moles adventícia. Livre mm de comprimento, pelo menos, ~ 5 de CA (Figura 3H, seta azul) do tecido circundante.
    21. Para bloquear a fluorescência de fundo, pressione a extremidade de um café agitador de plástico preto para plana, cortam o agitador do café em uma peça a 3 mm, e, em seguida, cortado longitudinalmente ao longo das arestas de dobragem para obter duas peças de "U" de plástico (Figura 3H, verde seta).
    22. (Figura 3H, seta verde). Aplique imediatamente 2-3 gotas de solução salina para evitar a secagem da CA.
  2. Em tempo real de gravação de vídeo
    1. Transferir a tampa do mouse, placa juntos para o estágio do microscópio e coloque em uma posição apropriada sob a lente de água 10X. Preencher o espaço entre a lente e a 10X CA com solução salina.
    2. Inicie a aplicação do software de gravação de vídeo digital, e lançar um novo arquivo e nomeá-lo em conformidade. Gravar imagens normais dos vasos e anote o número do quadro quando a gravação de vídeo é interrompida.
      NOTA: Referência do software de gravação de vídeo do computador para a gravação. Nós usamos o software de gravação de vídeo digital e as seguintes descrições são baseadas nesta aplicação.
      NOTA: Uma vez que tra mecânicaUma pode lesionar o endotélio e levar à formação de trombos 20, que é necessário para confirmar que não há nenhuma lesão cirúrgica da parede do reservatório antes da lesão FeCl3. É também necessário para confirmar que não há tecido à volta da CA, o qual pode formar uma barreira e atenuar o efeito de lesão induzida por FeCl3. Anote o número do quadro dos registros fará com que seja fácil de analisar os vídeos de acordo tempos decorridos mais tarde.
    3. Mova o rato com tampa placa de fora da lente de 10X. Dobre um canto de uma toalha de papel para fazer uma ponta fina e fina e usá-lo para apagar cuidadosamente a solução salina em torno do CA (evitar tocar CA), bem como em outros lugares do campo cirúrgico. Isto é importante para evitar a diluição da solução de FeCl3 utilizado.
    4. Use uma pinça fina ponta e pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de FeCl3 e colocá-lo diretamente no CA e mantê-lo no local durante 1 min.
      NOTA: TO visualização auxílio dos dados precisos da corrente sanguínea e de colheita, colocar o papel de filtro perto da extremidade distal do exposto CA (Figura 3I) e deixar um segmento curto no local proximal (seta verde na Figura 3I) para observar o fluxo sanguíneo na tarde fase (ver abaixo).
    5. Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de "após a lesão") e enxaguar a AC com solução salina (pelo menos 2 ml).
    6. Coloque o mouse com a placa da tampa de volta para a lente 10X; observar o navio e começar a imagens de vídeo de discos. Anote o número de quadros de vídeo no final do primeiro minuto de gravação.
      NOTA: A formação de trombos é identificado pela acumulação das plaquetas fluorescentes, o que é observado em imagens de vídeo em tempo real no ecrã de computador ou sob microscópio. Gravação de imagens de vídeo imediatamente depois de colocar o mouse de volta sob o microscópio. Manter gravação para o final do primeiro minuto após a remoção do fpapel ILTER. Observar todo o recipiente a partir do distai para os locais proximais para obter dados sobre a lesão, e, em seguida, concentrar-se na área de interesse (normalmente é o centro da área lesionada) para mais de imagem.
    7. Imagens de vídeo gravada durante 10 seg a cada minuto durante os primeiros 10 minutos (por exemplo, 02:55 - 03:05) e, em seguida, 10 segundos cada minuto até ao final da experiência. Anote os números de quadro quando cada gravação é interrompida.
      NOTA: Os pontos finais do modelo são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante> 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão. Neste caso, use 30 min para análise estatística. Definir tempo de exposição da gravação de vídeo, como 10 ms, no início, por isso vai ser fácil de observar o fluxo de sangue através da trombos. Quando os trombos se tornar grande e a fluorescência satura o sensor da câmera, torna-se difícil identificar o fluxo de sangue ao longo de trombos. Para resolver este problema, mova o ce de imagemnter ao proximal local ileso (Figura 3I, seta verde), onde o fluxo de sangue pode ainda ser claramente observado. Nós também aumentar o Exposé Tempo para 15 ou 20 ms quando o foco sobre o local lesionado-un proximal, de modo que o fluxo de sangue pode ser observado mais claramente. Quando o fluxo sanguíneo cessará, numerosas células maiores (leucócitos) começam a rolar sobre a parede do vaso no sítio proximal do trombo. Fluxo geralmente pára dentro de 2-3 minutos após o aparecimento de grandes células. Anote o tempo poderá expor na folha de gravação, se ele for alterado. É geralmente leva cerca de 30 min a partir da anestesia ao final da experiência, se foram usados ​​os ratinhos C57BL6 tipo selvagem normais.
      CUIDADO NOTA: Não use o coágulo de plaquetas agregadas branco como o sinal da cessação do fluxo sanguíneo, o que não vai dar uma de dados precisos e é afetado pelo tempo de exposição. O coágulo branco coberto do lúmen do vaso não significa fluxo sanguíneo cessou (veja o vídeo representante 1).

3. FeCl3 Induced artéria mesentérica / Trombose Venosa Modelo

  1. Anestesiar 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade, como mencionado no ponto 2.1.1. Aplicar vet pomada sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia.
  2. Injectar solução de papaverina (total de 0,4 mg / murganho) por via intraperitoneal para inibir o peristaltismo intestinal.
  3. Retire a pele no pescoço e abdómen com um clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário.
  4. Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use quatro pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 cm) para garantir todas as pernas. Utilize uma sutura 4 -0 para envolver em torno dos incisivos, fita as duas extremidades do fio de sutura para a tampa para manter o pescoço linear (Figura 2).
  5. Siga os procedimentos 2.1.4 -2.1.15 para expor a veia jugular para a injecção de rodamina 6G a plaquetas etiqueta.
  6. Realizar uma incisão na linha média através da pele do xifóide ao abdômen inferior usando as tesouras cirúrgicas (Figura 4A). Pegar o peritônio meio (também chamado de linha alba, Figura 4A, seta) com uma pinça Graefe, que é clara e não tem vasos sanguíneos, levante cerca de 2-3 mm de altura, confirme nenhuma intestino sob a linha de corte, e cortar o peritônio aberta longitudinalmente com as tesouras finas (Figura 4B).
  7. Re-garantir os ratos para decúbito lateral direito. Colocar o gel de agarose semi-círculo para o abdómen, e suavemente exteriorizar os intestinos e espalhá-la no topo do gel com a pinça Graefe (Figura 4C). Use as segundas ramificações para o experimento trombose (Figura 4C, seta).
    NOTA: Utilize a pinça hemostática ou pinça Micro-Adson para ajudar a exteriorizar os intestinos. Evitar ferir ado intestino e o recipiente.
  8. Colocar 5-6 gotas de solução salina para manter a humidade do intestino e vasos. Transferir o mouse com a tampa placa juntos para o estágio do microscópio e coloque na posição apropriada sob a lente seca 10X.
    NOTA: Use uma lente seca, porque a membrana jejunoileal não pode segurar solução salina. Certifique-se a cair solução salina sobre os tecidos expostos a mantê-los úmidos.
  9. Seque a solução salina à volta da artéria mesentérica e na veia antes do tratamento.
  10. Use uma pinça fina ponta para pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de 12,5% FeCl3 e colocá-lo diretamente na artéria mesentérica e veia durante 1 min (Figura 4D). Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de "após a lesão") e enxaguamento a artéria mesentérica e na veia feridos com solução salina (pelo menos 2 ml).
  11. Coloque o mouse com placa de tampa de volta sob a lente seca 10X; observar os vasos e começar a recimagens de vídeo ord como mencionado no 2.2).
    NOTA: Os pontos finais desta experiência são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante> 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão, e, neste caso, usar 30 minutos para análise estatística.
  12. No final do experimento, a eutanásia os ratos usando overdose de cetamina / xilazina (mg 200/20 / Kg), seguido por deslocamento cervical após nenhuma respiração e batimentos cardíacos são confirmadas.

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Representative Results

Carótida Thrombosis Modelo
Em ratos com C57BL6 fundo, recomendamos a utilização de 7,5% FeCl3 para tratar o navio durante 1 min como ponto de partida. Sob o tratamento de 7,5% FeCl3, fronteiras da área lesada e parede normal do vaso são facilmente identificados sob o microscópio (Veja o vídeo on-line 1), sugerindo que a camada endotelial foi significativamente danificada. Os trombos formados imediatamente após FeCl3 tratamento, e são observados em todos os ratinhos C57BL6 WT 1 min após a lesão. Os trombos formados inicialmente são instáveis ​​e partes delas são geralmente lavados pelo fluxo de sangue, de modo que os trombos formados se tornam menores em 2-3 minutos após a lesão. Os trombos começar a ampliar 3-4 minutos após a remoção do papel de filtro e depois destes trombos formados são estáveis ​​e, geralmente, não são lavados. O tempo oclusiva média é de 11,3 ± 3,16 min nos ratinhos C57BL6 (n = 14) quando 7,5% FeCl 3 é usado 6,7,19 (Figura 5A e vídeo on-line 1). Nos estudos anteriores que demonstraram que tanto a diminuição e aumento das concentrações de FeCl 3 diminuir a diferença entre uma estirpe de ratinho anti-trombótica e WT ratinhos 6; Pela nossa experiência, o tratamento da artéria carótida com 7,5% de FeCl 3 para 1 min é suficiente para satisfazer todos os nossos propósitos. Além de testar a função de genes específicos usando camundongos knockout 7,8,16,19,21, seguindo-se quatro experimentos representativas que utilizem este modelo:

Perfusão intravenosa de tipo ativador do plasminogênio tecidual Mediated Trombólise
Do tipo activador do plasminogénio tecidual (tPA) é uma das drogas aprovadas pela FDA para o tratamento trombólise nos Estados Unidos da América 22. Observou-se, assim, a trombólise tPA-mediada no modelo de trombose da artéria carótida. trombose foiiniciado com 7,5% de FeCl 3 e deixa-se formar durante 5 min antes de tPA (de 1 mg / kg de peso corporal) foi perfundida através de um cateter na veia jugular (22GA). Como se mostra na Figura 5B e vídeo linha 2, o trombo continuamente ampliada e ocupava cerca de 50% da luz 5 min após a lesão. Os trombos continuou a aumentar após a perfusão de tPA sugerindo que o tPA não afecta a activação e agregação de plaquetas. Trombólise começou cerca de 4 minutos após a injeção tPA. Os trombos formados foram encontrados para sofrer variações de tamanho várias vezes durante o período de observação de 30 min e sem oclusão do vaso aconteceu no presente caso. Estes dados mostram claramente que o tPA não se pode inibir completamente a formação de trombos mediada por plaquetas, mesmo que leva à trombólise. Assim, prevemos que futuras experiências utilizando o modelo de trombose arterial induzida por FeCl3 pode ser utilizado para avaliar trombolítica e outras terapias farmacológicas que pode ter um prev proeminentetante efeito sobre a formação de trombos.

Perfusão de PAR4 Anticorpo para ratos inibe a trombose
Receptor activado de protease 4 (PAR4) é um receptor acoplado a proteína G (GPCR) em plaquetas, que é activado por clivagem proteolítica do seu exodomain N-terminal 23 e, subsequentemente leva a etapas de activação de plaquetas. O laboratório Nieman gerou uma PAR4 anticorpo policlonal de cabra (CAN12) que tem como alvo o cluster aniônica de PAR4, e atrasa clivagem PAR4, afectando assim um passo crítico para PAR4 mediada ativação plaquetária 24. Por perfusão de 1 mg / kg deste anticorpo para os ratinhos C57BL6, descobrimos que a inibição da clivagem de PAR4 significativamente prolongada vezes para a formação do trombo oclusivo no FeCl3 carótida induzida modelo de trombose arterial de 7,5% (Figura 5C e vídeo em linha 3). Isto demonstra que a induzida por FeCl3 modelo de trombose cum ser utilizada para avaliar os efeitos dos agentes anti-plaquetários e caracterizar potenciais estratégias terapêuticas.

Targeting específicos de trombos mediada por nanopartículas
Rápida de coágulos de remoção para restabelecer o fluxo de sangue é crucial no tratamento de doenças vasculares oclusivas, incluindo acidente vascular cerebral isquémico e enfarte do miocárdio. A entrega sistémica de medicamentos trombolíticos tais como tPA, mostrou acima, podem lisar os trombos formados, mas não podem evitar por completo a activação de plaquetas e re-agregação / oclusão. Além disso, a entrega direta sistêmica de tais agentes de serina-protease pode levar a indiscriminada ação off-alvo, levando a grandes efeitos colaterais, incluindo hemorragia. O laboratório Sen Gupta projetou veículos de entrega com base sintética de nanopartículas de inspiração de plaquetas que podem se ligar a plaquetas ativadas associada ao coágulo e proteínas sob hemodinâmica fluxo de cisalhamento 25-27. Nós, portanto, examinado se essas nanopartículas podemligam-se aos trombos formando ativamente em uma artéria.

Conforme mencionado na experiência para tPA da perfusão, foi colocado um cateter na veia jugular e ligado a uma bomba de injecção para injecção de nanopartículas com um caudal uniforme. Nesta experiência, não corante fluorescente foi injectada no rato para rotular plaquetas. Em vez disso, as nanopartículas foram marcadas com Rohdamine B; Por conseguinte, eles foram capazes de ser observadas ao microscópio intravital. A trombose foi iniciada com 7,5% de FeCl3 durante 1 min de tratamento, como mencionado anteriormente. Uma vez que em ratinhos WT, foi encontrada uma quantidade significativa de trombos para formar 5 min após a lesão, foi selecionado o ponto de tempo para a injecção de nanopartículas para detectar se as nanoparticulas se ligar de forma eficiente para as trombos formam activamente. Tal como mostrado na Figura 5D e vídeo em linha 4, após a injecção de nanopartículas fluorescentes, fomos capazes de identificar uma forma de montanha-trombo, que foi progressivamente abrangidas pelas partículas fluorescentes. Estes estudos demonstram a utilidade do modelo de trombose induzida por FeCl3 para avaliar a capacidade de direccionamento (e subsequente eficácia terapêutica) de sistemas de distribuição de drogas em partículas alvo de coágulos.

Papel das outras do que plaquetas na formação do trombo Glóbulos vermelhos.
Estudos recentes têm sugerido que as células vermelhas do sangue (RBC) desempenham um papel importante na FeCl3 modelo de trombose induzida por 28 e que são o primeiro componente de sangue aderente à parede do vaso lesionado 29,30. Para explorar este fenómeno, que marcado com RBCs 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 uM de concentração final). Os RBCs Dil-marcadas foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em soro fisiológico com 35% de hematócrito. A suspensão RBC Dil-marcado (100 mL por ratinho) foi injeteEd nos ratos trombocitopénicos que foram irradiados letalmente 5 dias antes da experiência 19. Estes ratos trombocitopênicos têm significativa diminuição das plaquetas, o que irá aumentar a chance de RBC aguardando à parede do vaso, se eles fazem. Em contraste com as experiências utilizando plaquetas marcadas por fluorescência (Figura 5), não houve qualquer acumulação óbvia de células fluorescentes foi encontrado na parede do vaso após danos vasculares (Figura 6A, v ídeo linha 5). No entanto, juntamente com a formação do trombo rico em plaquetas, RBCs começou a acumular-se no trombo, que ilustra a forma do coágulo (Figura 6A). Imunofluorescência da artéria carótida ferido demonstraram que as principais células que aderiram à parede do vaso são plaquetas (CD41 positivo, verde), enquanto os glóbulos vermelhos Dil-marcados são principalmente preso dentro do trombo (Figura 6B & C). Estes estudos demonstram que oFeCl3 modelo de trombose induzida pode ser utilizada na obtenção de visão mecanicista em componentes celulares e moleculares e eventos espaço-temporais da formação de trombos.

Trombose mesentérica Modelo
Para o modelo de trombose mesentérica, uma elevada concentração de FeCl 3 (10 - 12,5%), é recomendado que os navios são geralmente rodeados por tecido adiposo, o que pode impedir a difusão de FeCl 3 em direcção à parede do vaso e, assim, impede vaso de FeCl3 induzida lesão 7. Este modelo é mais adequado para o estudo trombose venosa. Como mostrado na linha de vídeo 6, trombo foi visto em torno de ~ 15 seg na veia mesentérica após a aplicação tópica do papel de filtro saturado com 12,5% FeCl3 solução, mas a formação de trombos é drasticamente retardada na artéria mesentérica. O tempo médio necessário para a formação de trombo oclusivo é ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) em m veia esenteric e cerca de 23 ± 9,9 min (n = 10) na artéria mesentérica quando 12,5% FeCl3 é utilizado 7.

figura 1
Figura 1. Ferramentas de cirurgia. As ferramentas mínimas necessárias para a cirurgia do rato são mostrados. Veja a lista Materiais para informações mais detalhadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Rato Fixação para a cirurgia. Fixe o mouse sobre a tampa cultura prato 15 cm para modelo de trombose da artéria carótida ou para a injeção de rodamina 6G corante para o modelo de trombose mesentérica.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Modelo de Trombose da Artéria carótida. Procedimentos para expor a veia jugular, a injecção de rodamina 6G fluorescente corante no sistema sanguíneo e a exposição da artéria carótida esquerda são mostrados. Em (A), a linha indica que a incisão de fúrcula ao nível do osso hióide; em (B), setas azuis indicam submaxilares, e as linhas pontilhadas amarelas representam a fáscia entre as glândulas submandibular; em (C), as setas azuis indicam glândulas submaxilares, seta preta indica manubrium, e a linha pontilhada amarela indica a posição de corte para expor a veia jugular; em (D), seta azul indica veia jugular; em (E), seta amarela indica glândula submandibular esquerda, azul indicad setaes deixou músculo esternocleidomastóideo, linha amarela pontilhada indica fascia, e seta verde indica o músculo omo-hióideo ou do músculo esterno; em (F), a seta indica azul artéria carótida, as linhas pontilhadas mostram o amarelo músculo esterno fina e / ou do músculo omo-hióideo; em (G), a seta azul indica artéria carótida e seta verde indica nervo vago; em (H), a seta azul indica artéria carótida e a seta verde indica o plástico "U" agitador do café; e em (I), a seta indica azul o papel de filtro situado com solução de FeCl3, e a seta verde indica que a artéria carótida. T indica traquéia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. artéria mesentérica e Trombose Venosa Modelo. A exposição dos vasos mesentéricos, bem como FeCl3 tratamento é mostrado. Em (A), a seta azul indica alba, o tecido fibroso branco sem navio; Em (B), uma incisão cortar sozinho a linha alba foi mostrado; em (C), as setas azuis indicam o segundo arco das artérias mesentéricas e veias; em (D), a seta azul indica o papel de filtro situado com solução de FeCl3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Experimentos representativa, utilizando a artéria carótida Thrombosis Modelo. (A). A formação de trombos no theC57Bl / 6 rato tratado com 70,5% de FeCl3. (B). TPA mediada efeito trombolítico. (C). A injecção de anticorpo direccionamento do receptor de trombina de rato PAR4 na trombose foi mostrado. (D). O trombo-site-alvo nanovehicles se ligam especificamente a formação de trombos foi activamente mostrado . Inj. P indica injecção de partículas; e Peak B indica pico de bandas de partículas para os trombos. Todas as imagens foram tomadas sob mesma ampliação. Barra de escala = 300 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Papel de RBC na formação de trombos. (A) os ratinhos que receberam trombocitopénica perfusão de hemácias Dil-marcados foram submetidos ao modelo de trombose da artéria carótida e imagens depois de 7,5% FeCl (B & C) As artérias carótidas feridos foram colhidas, e cortes congelados foram preparados. As plaquetas foram coradas com CD41 (Verde) e glóbulos vermelhos foram mostrados em vermelho (Dil). Os núcleos foram corados com DAPI. Os navios mostrados em (B e C) eram de dois ratinhos diferentes. Barras de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

video 1
Video 1: video Representante do modelo de trombose da artéria carótida em ratos de tipo selvagem (WT). (Botão direito do mouse para baixar.) Este vídeo mostra a formação de trombos representante na artéria carótida de camundongos WT induzida por papel de filtro a aplicação tópica situadocom 7,5% de solução de FeCl3. As plaquetas foram marcadas por injecção intravenosa de rodamina 6G, e foi feita de vídeo no modo monocromático. A massa branca é plaquetas coagulado.

video 2
Vídeo 2: activador de plasminogénio tecidular (tPA) efeito trombolítica mediada detectado pelo modelo de trombose da artéria carótida. (Botão direito do mouse para baixar.) Rotulagem de plaquetas e formação de trombos foram iniciados, como mencionado no vídeo 1 e tPA foi injetado por via intravenosa 5 minutos após 7,5% FeCl3 lesão.

vídeo 3
Vídeo 3: droga antiplaquetária, na anti-receptor de protease activada 4 (PAR4) mamente anticorpo, mediada por efeito anti-trombótico detectado pelo modelo de trombose da artéria carótida. (Botão direito do mouse para baixar.) Neste experimento, os ratos receberam anticorpo PAR4 e rodamina 6G injecção 10 min antes da formação de trombos foi iniciada pela aplicação tópica de papel de filtro situado com 7,5% FeCl3.

video 4
Vídeo 4: direccionamento específicos de trombos mediada por nanopartículas. (Botão direito do mouse para baixar). Nesta experiência, a formação de trombos da artéria carótida foi iniciado com 7,5% de FeCl3 sem plaquetas rotulagem. Nanopartículas foi marcado com rodamina B e injectado por via intravenosa no rato 5 min após a lesão.

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Vídeo 5: ligação das células vermelhas do sangue detectadas pelo modelo de trombose da artéria carótida. (Botão direito do mouse para baixar.) Os glóbulos vermelhos (hemácias) foram marcadas com 1,1 'dioctadecil-3,3,3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 mM de concentração final) e 100 ul da GVs Dil-marcados (35% hematócrito) foram injectadas em ratinhos trombocitopénicos. Não rotulagem de plaquetas foi realizada neste experimento. Trombo foi iniciado como mencionado acima with7.5% FeCl3.

vídeo 6
Vídeo 6: vídeo Representante do modelo de trombose da artéria e veia mesentérica em ratos WT. (Direito-click a baixar.) As plaquetas foram marcadas por injecção intravenosa de rodamina 6G, e trombo foi iniciado topicamente após a aplicação de um pedaço de papel de filtro com 12,5% FeCl3 solução durante 1 min. O vaso foi observada sob 10X lente seco.

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Discussion

O FeCl3 induzida pelo modelo é um dos modelos mais amplamente utilizados de trombose, que não só pode fornecer informações valiosas sobre as modificações genéticas na função das plaquetas e trombose 7,8,16,19,31-33, mas também pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação de compostos terapêuticos e estratégias para o tratamento e prevenção das doenças aterotrombóticas 11,17,34-37. Aqui temos mostrado nossas modificações e aperfeiçoamentos do presente modelo e mostrou evidência adicional da utilidade desta técnica, que é suficientemente sensível para determinar os efeitos de anticoagulante (tPA) e drogas anti-plaquetas de anticorpos (PAR4). Em adição ao estudo mecanicista de trombose, o modelo pode também ser utilizada para estudar, a entrega de drogas segmentados por trombos nanotecnologia baseada. Ele também pode ser usado para a detecção da formação da parede do vaso espécies reactivas de oxigénio (ROS), por injecção de ROS fluorescente indicador 21.

Meticulosotécnicas são necessárias para efectuar estes modelos. O operador deve ter habilidades cirúrgicas suficientes, bem como uma profunda compreensão da biologia celular vascular e sangue. Vários pontos-chave da carótida induzida modelo de trombose da artéria FeCl 3 são 6: (1) expor bastante comprimento da artéria carótida (~ 5 mm) para permitir a aplicação do papel de filtro e deixar um espaço para observar o fluxo sanguíneo sob microscopia intravital em fase tardia ; (2) retirar claramente o tecido mole em volta da adventícia da artéria carótida para permitir que o papel de filtro para contactar a parede do vaso e produzir directamente uma lesão mesmo; (3) confirmar nenhuma lesão mecânica à parede do vaso e sem a formação de trombos antes da aplicação de FeCl3 papel de filtro saturados; (4) estão na base da artéria carótida com um pedaço de "U" de plástico preto para separar a artéria do tecido circundante, para bloquear a fluorescência de fundo, e para prevenir a difusão de FeCl3. Por estas estratégias, temos gerado altamentedados reprodutíveis com o tipo selvagem C57BL / 6, e nesta estirpe de ratinho 7,5% FeCl3 induzida trombose tempo é de 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. A injecção na veia jugular de rodamina 6G para marcar células circulantes pode ser um desafio. Como uma alternativa, uma injecção na veia da cauda pode ser realizada antes de fixar o rato sobre a tampa da placa de 15 cm. Em comparação com o modelo de artéria carótida, o modelo de artéria e veia mesentérica é mais fácil e menos intensivo cirurgicamente. No entanto, como mencionado na Secção resultado, devido à cobertura dos vasos por tecido adiposo, o modelo de trombose mesentérica é melhor para o estudo de trombose venosa, mas exige um maior tamanho da amostra para minimizar o erro entre ratinhos diferentes.

A limitação deste modelo é que o mecanismo não é claro e ainda controversa. Inicialmente, acreditava o mecanismo deste modelo a ser o de FeCl3 gerada ROS desnudamento induzida de células endoteliais, e subsequently levou a exposição dos componentes do sangue ao subendotélio pró-trombótico, para tornar a adesão de plaquetas, agregação e formação de trombos 6,11. Por reconstituição de plaquetas pré-tratadas com GPVI anticorpo para os ratos trombocitopénicos, nós demonstramos que o modelo FeCl3 depende GPVI de plaquetas, e bloquear GPVI de plaquetas inibida dramaticamente induzida por FeCl3 19 formação de trombos. Esta descoberta está de acordo com relatórios anteriores 38 e sugere que o modelo de FeCl 3 pode ser mais propensos a imitar a fisiopatologia da ruptura de placas ateroscleróticas humanas trombose mediada 6. No entanto, vários estudos recentes têm proposto novos mecanismos que incluem a adesão de células vermelhas do sangue na parede do vaso, bem como efeito físico-química de FeCl3 a agregação induzida de proteínas do plasma e células do sangue 29,30. Estas novas descobertas sugerem que os potenciais mecanismos de este modelo pode ser mais complexa.

Por perfusão de glóbulos vermelhos Dil-rotulados nos camundongos trombocitopenia e, em seguida, induzir FeCl3 Triggered lesão da artéria carótida com 7,5% de FeCl3, descobrimos que as principais células que aderem às paredes dos vasos feridos são plaquetas (Figura 6 e vídeo on-line 5 ). Nós não encontrou óbvio adesão hemácias, ea acumulação de glóbulos vermelhos no trombos parecia mais provável que seja um resultado de aprisionamento. Nossas descobertas combinar os conceitos de hemostasia primária e secundária 39. A diferença da nossa observação a partir dos relatórios anteriores podem ser de hipóxia e alteração hemodinâmica, como no estudo de Barr e colegas 30, onde os FeCl 3 artérias carótidas danificadas para exame de microscopia eletrônica de varredura foram preparadas em ratos que tinham o ventrículo esquerdo anteriormente exposto sem assistência de um ventillation mecânica. concentração de oxigênio no sangue e hemodinâmica será drasticamente diminuída tanto como pulmonar efunção cardíaca será afectada imediatamente após o peito é aberto sem ventilação mecânica. Privação de oxigênio tem sido associado com o desencadeamento da via pró-coagulante e trombose 40 e pode também aumentar a RBC aderência. Outra publicação recente mostrou que o tratamento da artéria carótida com uma concentração muito elevada de FeCl 3 (20%) durante 5 ou 10 min conduz a uma concentração em estado estacionário de FeCl3 a ~ 50 mM no lúmen do vaso lesionado 29 . Eles, portanto, infundido directamente 50 mM de FeCl3 em vários componentes do sangue e examinaram o efeito de FeCl3 na agregação ex-vivo, que os levou a propor um novo mecanismo, 2-fase para a acção de FeCl3 em 29 de formação de trombos. Embora bastante interessante, os resultados deste estudo devem ser interpretados com cautela, uma vez que não representa o modelo FeCl3 comumente usados. Em contraste com a elevada concentração de FeCl 3 (20%, 1 M, conforme indicado no papel) e o tratamento a longo (5 ou 10 minutos), os nossos estudos anteriores, bem como Barr et ai. demonstraram que 10% FeCl 3 de tratamento durante 1 minuto é suficiente para induzir a formação de trombo oclusivo rápido na artéria carótida dentro de 7 min 6,30. Além disso, na maior parte das experiências utilizando o modelo de FeCl 3, mais uma baixa concentração de FeCl 3 (5 - 7,5%) é usado.

Uma outra limitação deste modelo é que, devido ao dano oxidativo grave para o endotélio, bem como desnudação endotelial pós-tratamento FeCl3, este modelo não pode ser uma ferramenta adequada para estudar a inflamação endotelial trombose associada. No entanto, através da utilização destas técnicas para preparar a artéria carótida em combinação com a perfusão de leucócitos marcados com fluorescência, que podem testar a adesão e de rolamento dos leucócitos no endotélio inflamatória 41.

em summary, temos refinado e padronizou a induzida pelo modelo de lesão vascular FeCl3 para produzir uma lesão altamente reprodutível na artéria carótida e quantificar o tempo de cessação do fluxo sanguíneo com precisão por microscopia intravital. Este modelo é suficiente e sensível para testar o anticoagulante e drogas anti-plaquetas, e também é adequado para estudos da nanomedicina segmentados por trombos. Em combinação com transplante de medula óssea, a infusão de plaquetas nos ratos trombocitopénicos ou injecção directa intravascular de drogas candidatas, que demonstraram que este é uma ferramenta conveniente, simples e sensível para estudar a trombose in vivo 7-10,16,19,42,43 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose
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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

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