Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rask og konkret vurdering av halogene peroxydaseaktivitet i Leukocytt-anriket blodprøver

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

I denne artikkelen en protokoll for rask og standardisert anrikning av leukocytter fra små fullblodprøver, er beskrevet. Denne fremgangsmåten er basert på hypotonisk lysering av erytrocytter og kan brukes til humane prøver, så vel som til blod av ikke-human opprinnelse. Den lille innledende prøvevolum på ca 50 til 100 ul gjør denne metoden anvendelig for å tilbakevendende blodprøver fra små forsøksdyr. Videre er leukocytter berikelse oppnådd i løpet av minutter, og med lave materielle innsats angående kjemikalier og instrumentering, noe som gjør denne metoden er aktuelt i flere laboratorier.

Standardisert rensing av leukocytter er kombinert med en meget selektiv farging metode for å evaluere halogenerende peroksydase-aktivitet av heme peroksidaser, myeloperoksidase (MPO) og eosinofil peroksidase (EPO), dvs. dannelse av underklorsyrling og underbromsyrling (HOCl og HOBr). Mens MPO er sterkt uttrykt i neutrophils, den mest vanlige immuncelletype i humant blod så vel som i monocytter, den tilknyttede enzym EPO er utelukkende uttrykt i eosinofiler. Halogene aktiviteten til disse enzymene blir adressert ved hjelp av nesten HOCl- og HOBr-spesifikk fargestoff aminofenyl fluorescein (APF) og den primære peroksydasesubstrat hydrogenperoksyd. Ved etterfølgende strømningscytometri-analyse alle peroksidase-positive celler (nøytrofiler, monocytter, eosinofiler) kan skilles og deres halogenerings peroksydase-aktivitet kan kvantifiseres. Siden APF-farging kan kombineres med påføringen av celleoverflatemarkører, kan denne protokollen bli utvidet til spesielt adresse leukocytt sub-fraksjoner. Metoden kan brukes til å oppdage HOCl og HOBr produksjon både i menneskelig og gnager leukocytter.

Gitt allment og diversely diskutert immunologisk rollen til disse enzymatiske produktene i kroniske inflammatoriske sykdommer, kan denne protokollen bidra til en bedre forståelse avimmunologiske relevansen av leukocytter-avledet heme peroxidases.

Introduction

Polymorfonukleære leukocytter (PMN, også kalt granulocytter og monocytter) representerer viktige cellulære komponenter i det medfødte immunsystemet i blodet 1,2. De bidrar til det primære forsvar mot patogener, så vel som til aktiveringen av ervervet immunsystemet og initiering av en systemisk inflammatorisk respons 2-4. Likevel spesielt nøytrofile, den mest tallrike typen granulocytter og monocytter også bidra vesentlig til regulering og avslutning av akutte inflammatoriske hendelser 5. Derfor er disse cellene kan også spille en viktig rolle i kroniske inflammatoriske sykdommer som reumatoid artritt 6,7. Faktisk, astma, kronisk inflammatorisk luftveissykdom, er preget av en svekket apoptose av eosinofiler, den nest mest granulocytter type i blodet åtte. Men apoptose av granulocytter og deres rask fjerning av makrofager er to viktige skritt i løpet av mobiltermineringsav betennelse 9-11.

I de navngitte immunceller to nært beslektede enzymer, nemlig Myeloperoxidase (MPO, nøytrofile granulocytter og monocytter) og eosinofil peroksidase (EPO, eosinofile) finnes 12,13. Disse heme peroksydaser er klassisk relatert til den humorale immunrespons som de to-elektronisk oksidere (pseudo) halogenider til de tilsvarende hypo (pseudo) halogensyrer som er kjent for sin bakteriedrepende egenskaper 14-16. Under fysiologiske betingelser MPO hovedsakelig danner underklorsyrling (HOCl) og hypothiocyanite (- OSCN) mens den sistnevnte og hypobromsyre (HOBr) er dannet av EPO 17-19. Nye resultater tyder på at dette (pseudo) halogeneenzymaktivitet kan også bidra til reguleringen av betennelsesreaksjoner og til oppsigelse av immunreaksjoner 20,21. Faktisk ble det HOCl produksjon av MPO og avledede produkter vist seg å undertrykke T-cellebasert adaptive immunresponser 22-24.

For å få mer innsikt i den immunologiske rolle av leukocytter fra det medfødte immunsystemet ved kroniske inflammatoriske sykdommer og for å bestemme bidraget av MPO og EPO til denne fysiologiske funksjon vi utviklet en metode for raskt å berike leukocytter fra små blodprøver for en etterfølgende spesifikk bestemmelse av halogene peroksydase-aktivitet i disse cellene. For erytrocytt uttømming har vi valgt en standardisert metode som omfatter to påfølgende hypotone lysis trinn med destillert vann, noe som fører til en rask leukocytt anrikning ved lave materialkostnader. For den etterfølgende bestemmelse av halogene MPO og EPO aktivitet og HOCl- HOBr-spesifikk fargestoff aminofenyl fluorescein (APF) ble anvendt 25-27. I motsetning til anvendelsen av uspesifikk peroxidase farvemetoder 28,29, lar denne tilnærmingen selektiv påvisning av halogene peroksydase-aktivitet, som ofte blir svekket ved alvorlige inflinflammasjon 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane blodprøver ble tatt fra friske frivillige, og brukes leukocytter berikelse protokollen følger retningslinjene for etikk provisjon av Det medisinske fakultet ved Universitetet i Leipzig. Forsøkene med rotte blod ble godkjent av ansvarlig lokal etisk komité (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), i henhold til de tyske retningslinjer for dyr omsorg og bruk.

1. Forsøksoppsett

MERK: Som hypotonisk lyseringsprosedyren for uttømming av erytrocytter fra blodprøvene er et tidskritisk prosedyre, fremstille alt nødvendig utstyr (for eksempel buffere) for denne del av protokollen på forhånd.

  1. Merk av et 15 ml sentrifugerør for hypoton lysering og en 1,5 ml prøve rør for påfølgende aminofenyl fluorescein (APF) farging per blodprøve.
    1. Dersom leukocytt anrikning vil bli utført under sterile betingelser, å utføre denne merking under en strømeske.
  2. Fremstille omtrent 12 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS, 10 mM) per prøve. Avhengig av om leukocyttene skal isoleres under sterile betingelser eller ikke, fremstille PBS enten ved å bruke sterile klar oppløsning fra en leverandør eller ved oppløsning av PBS-tabletter i destillert vann. Kontroller pH-verdi og, om nødvendig, justeres til pH 7,4 ved hjelp av små mengder av 0,1 M HCl og NaOH-løsninger.
    1. Oppløs PBS tabletter (se tabell of Materials) i 200 ml destillert vann for å oppnå en ikke-steril buffer-oppløsning tilstrekkelig til ca 16 prøver. Om ønsket, sterilisere denne oppløsning ved sterilfiltrering.
  3. Fremstille omtrent 1 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS) supplementert med Ca2 + per prøve.
    1. Oppløs 970 mg HBSS salt i 100 ml (endelig volum) dobbeltdestillert vann. Før du fyller opp til sluttvolum, sjekke pH-verdien og juster den til pH 7,4. På grunn av sin lave bufferkapasitet, forberede denne bufferen fersk hver dag end utføre justeringen pH med spesiell omsorg ved hjelp av små mengder av 0,1 M HCl og NaOH-løsninger.
      MERK: Steril oppløsning kan anvendes, avhengig av forsøket. Oppløsningen kan steriliseres ved sterilfiltrering.
  4. I tillegg til to buffere, etikett og forberede et rør (f.eks 50 ml sentrifugering tube) eller kolbe (f.eks 250 ml målebeger) med dobbel-destillert vann for hypoton lysis prosedyren på forhånd. Forbered ca 10 ml vann per prøve.
  5. Fremstille en beholder med knust is for APF farging (avsnitt 3), som er utført på is.
  6. Fremstille porsjoner av APF på forhånd for å tillate rask fremstillingen av arbeidsløsninger som brukes under farging (trinn 3.2) og for å unngå gjentatte frysing og tining av APF løsning.
    MERK: APF blir vanligvis oppnådd som en 5 mg / ml (11,81 mM) stamløsning i metylacetat.
    1. Fryse aliquoter av 10-100 pl i 0,5 ml rør. For APF flekker en endeligfargestoff konsentrasjon på 10 pM blir anvendt (trinn 3.8).

2. Hypoton Lysis av Erytrocytter

MERK: Utfør hypotone lysis trinn (unntatt sentrifuge trinn) under en laminær benk for å unngå forurensning. Utføre hele fremgangsmåten ved romtemperatur. Som hypotonisk lysis er en tidskritisk prosess, justere pipetter for vann (2 ml) og PBS (5 ml) tilsetning på forhånd og åpne vann og PBS kolber før prosedyren. Oppbevar PBS-oppløsning, og destillert vann ved romtemperatur før bruk.

  1. Fra hver blodprøve overføre 100 fil til den aktuelle 15 ml sentrifugering tube.
    MERK: I våre eksperimenter blodprøver vanligvis inneholder 10 U / ml heparin, for å unngå koagulering. Likevel på grunn av forskjellige kilder av prøvematerialet arten og konsentrasjonen av anti-koagulant kan variere. Dens innflytelse på APF flekker bør testes av komparativeing resultatene til resultatene oppnådd fra blodprøver supplert med andre typer eller konsentrasjoner av anti-koagulant.
  2. Tilsett 2 ml destillert vann og blandes prøvene ved hjelp av en vortex-blander innstilt på et middels nivå. Inkuber prøvene i 60 sekunder, og deretter tilsett 5 ml PBS per prøve og bland ved hjelp av vortex-blander.
    MERK: Opp til ca 5 prøver kan fremstilles parallelt. Hold prøve rekkefølgen den samme for tilsetningen av vann og PBS for å oppnå sammenlignbare inkubasjonstider.
  3. Etter regenerering av isotoniske betingelser, ved tilsetning PBS (trinn 2.2) pelletere de gjenværende intakte celler i alle prøvene ved sentrifugering i 6 minutter ved romtemperatur og 450 x g.
  4. Fjern supernatanten ved å helle det inn i en tabell avfallet. Fjern så mye væske som mulig ved å snu sentrifugering røret og trykke åpningen på et papirhåndkle. Sørg for at cellen pellet er så tørr som mulig.
  5. Gjenta hypotonisk lyseringsprosedyren som beskrevet tidligere (trinn 2.2).
    NERK: I prinsippet denne hypotonisk lyseringsprosedyre (trinn 2.3 til 2.5) kan gjentas mer enn en gang, avhengig av renheten av den blandede leukocyttkultur-fraksjonen som skal oppnås. Etter to lyse trinn andelen av gjenværende erytrocytter i det oppnådde blandede cellefraksjon er omtrent 25%.
  6. Pellet de gjenværende intakte celler ved sentrifugering i 6 minutter ved romtemperatur og 450 x g. Fjern supernatanten (se trinn 2.4). Legg 500 pl HBSS til pelleten og forsiktig oppløse det inntil en homogen oppløsning er oppnådd. Overfør hver prøve til den tilsvarende merkede 1,5 ml prøverør.
  7. Avhengig av forsøket direkte analysere innhentet prøver (f.eks, via flowcytometri) 25, flekken med fluorescens-merkede antistoffer (for identifisering av enkeltcelletyper) 32, inkuberes med celle stimuli (for celle aktivering eksperimenter) 33 eller lagret på is og bruk seinere. Avhengig av formålet med undersøkelsen, straks utføre påfølgende eksperimenterden blandede leukocyttfraksjonen siden granulocytter har en relativt kort halveringstid på omtrent 20 timer.
    MERK: Dette gjelder også for peroxydaseaktivitet farging beskrevet nedenfor.

3. halogene peroxydaseaktivitet Farging

MERK: HOCl- og HOBr-produksjon av blod-avledet heme peroxidases MPO og EPO er kvantifisert ved hjelp av APF, som er oksidert til fluorescein av de navngitte hypohalous syrer. Derfor, hvis celle merking med fluorescens-merkede antistoffer blir utført i kombinasjon med APF farging unngå fluoroforer som hindrer utslipp signal av fluorescein.

  1. Utføre APF farging ved 4 ° C på is.
  2. For fremstilling av en arbeidsløsning av APF tine en passende porsjon av det fargestoff (f.eks, 10 ul, 11,81 mM) og fortynne det med HBSS til nøyaktig 1 mM (f.eks, tilsett 108,1 mL buffer til 10 ul).
    1. For hver prøve (500 ul celleløsning) fremstille 5 μl av den beskrevne APF-arbeidsløsningen. Følgelig bruker en 10 pl alikvot av APF (11,81 mM), noe som gir 118,1 ul APF arbeidsløsning (1 mM) for å fremstille omtrent 20 prøver. På grunn av tap under pipettering forberede ca 10% mer APF arbeidsløsning enn beregnet.
  3. For å kontrollere den peroksidase spesifisiteten av APF flekker, fremstille kontrollprøver med hem-peroksidase-inhibitor 4-amino-benzosyre-hydrazid (4-ABAH) 35.
    1. Tilbered en 1 M stamløsning av 4-ABAH (151,17 g / mol) i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved fortynning av 75,6 mg 4-ABAH i 500 mL løsningsmiddel. Videre fortynne 4-ABAH 1/10 i HBSS.
  4. For fremstilling av en H to O to arbeidsoppløsningen etikett to 1,5 ml sentrifugeringsrør med "70 mM H 2 O 2" og "7 mM H 2 O 2", henholdsvis.
    1. I røret merket "70 mM H 2 O 2", ferskt fortynne 10 plav en 30% lagerløsning (8,8 mM) i H 2 O 2 ved bruk av 990 mL destillert vann for å oppnå en konsentrasjon på omtrent 88 mM. Oppbevar på is og bruk innen 4 timer.
      MERK: H 2 O 2 blir vanligvis levert som en 30% stamløsning av leverandørene. Ved oppbevaring ved 4 ° C, er den stabil i ca. 3 år. Utføre fortynninger av H 2 O 2 i destillert vann for å unngå dekomponering. H 2 O 2-fortynninger kan også fremstilles i 0,1 M NaOH-løsning.
    2. For bestemmelse av den nøyaktige H 2 O 2 konsentrasjon fremstille et ytterligere 1 til 10 fortynning fra den første H 2 O 2 løsning (ca. 88 mM) ved å tilsette 100 pl av denne oppløsningen til 900 ul destillert vann i 1,5 ml rør merket "7 mM H 2 O 2".
    3. Ta opp et spektrum i det nære ultrafiolette området (for eksempel, 200-300 nm) ved hjelp av et UV-Vis-photospectrometer og bruk av absorbansen ved 240 nm (49, 240 = 34 M -1 cm -1) for å bestemme den faktiske H 2 O 2-konsentrasjonen i den andre H 2 O 2 stamløsning 34. Sørg for at referanse kyvetten inneholder kun destillert vann. For måle bruk kvarts kyvetter som et spektrum i UV-området er registrert.
    4. Fra dette resultat, beregne de nøyaktige konsentrasjonene av begge H 2 O 2 stamløsninger. Juster konsentrasjonen av den første stamløsning i "70 mM H 2 O 2" prøverør til nøyaktig 70 mM ved tilsetning av en passende mengde destillert vann. Lagre den oppnådde arbeidsløsning på is og brukes innen en time.
  5. Tilsett 5 ul av de 4-ABAH arbeidsløsning (100 mM) til de passende prøver for en endelig konsentrasjon på 1 mM. Prøvene inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C i inkubatoren før APF tilsetning.
  6. Tilsett 5 ul APF arbeidsløsning (1 mM) til hver enkelt500 pl prøve å oppnå en endelig farge konsentrasjon på 10 uM. Bland prøvene forsiktig (for eksempel ved hjelp av vortex-blanderen på en middels innstilling) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
  7. Tilsett 5 pl H to O to arbeidsløsning (70 mM) til hver 500 pl prøve for en endelig konsentrasjon på 700 uM. bland forsiktig prøvene og inkuber dem i 60 minutter ved 37 ° C. Utfør nødvendige kontrollmålinger parallelt.
    MERK: Kontrollmålinger viste at 700 mikrometer H 2 O 2 er ikke giftige for cellene. Heller ikke var noen vesentlige cellulære responser observert.
    MERK: APF flekker kan også bli utført ved å utelate tilsetningen av H 2 O 2, avhengig av den vitenskapelige spørsmål. I fravær av hydrogenperoksyd bare basal klorerings MPO og EPO-aktiviteten bestemmes mens tilsetningen av H 2 O 2 tillater påvisning av den maksimale HOCl og HOBr produksjon av cellene. Than sistnevnte betyr en betydelig høyere fluorescerende signal.
  8. For pelletering av cellene, sentrifuger prøvene i 10 min ved romtemperatur, og 400 x g. Fjern grundig supernatanten uten å ødelegge pelleten og tilsett 250 mL HBSS å resuspendere cellene.
    MERK: Prøvene er nå klare for analyse via flowcytometri 25.
  9. Oppbevar prøvene i mørke inntil de skulle analyseres for å unngå bleking. Etter eksitasjon ved 480-490 nm detektere utslipp av fluorescein ved ca. 525 nm 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som rapportert tidligere fremgangsmåten beskrevet ovenfor viste seg å være anvendelig både for mennesker og til ikke-menneskelige materiale 32. Videre, som vist for mus med astmatiske symptomer APF flekker kan være et passende verktøy for å detektere forskjeller i den systemiske pro-inflammatorisk status. Derfor i en senere studie vi brukte denne protokollen for å gjentatte ganger evaluere halogene aktivitet av MPO (og EPO) hos hunn Mørk Agouti rotter med pristan-indusert artritt (PIA). Et representativt eksempel på leukocytt anrikning og fargingen utføres i løpet av dette forsøket er vist i figur 1. Ca. 200 ul helblod ble oppnådd fra retrobulbar venous plexus av dyret under anestesi og heparinisert. Erytrocytt tømming og en påfølgende APF-farging ble utført ved anvendelse av 100 pl prøvevolum. Deretter ble prøven analysert ved flow-cytometri.

(figur 1A), en sterk uttynning av erytrocytter fra prøven ble oppnådd. Videre forskjellige leukocytt-typene var tydelig merkbar, som ble identifisert ved anvendelse av fluorescens-merket celleoverflatemarkører (ikke vist). I korthet erytrocytt (CD235a-positiv) / celleavfall region kun utgjorde 22% av hendelsene mens om lag 48% av hendelsene ble identifisert som CD16-positive nøytrofile. Videre er 3% av hendelsene ble hver identifisert som CCR3-positive eosinofiler og CD14-positive monocytter og omtrent 19% av hendelsene utgjorde CD5 / CD19-positive B og T-lymfocytter, respektivt. Intensiteten fordelingen av APF-avledet fluorescens (figur 1B) klart tillot diskriminering av peroksidase-negative erytrocytter og lymfocytter mens monocytter og eosinofiler førte til en moderat APF oksidasjon og nøytrofile var sterkt peroksidase-positive under chOsen eksperimentelle forhold. Disse resultatene er i samsvar med den høye overflod av MPO i de sistnevnte celler sammenlignet med enzymkonsentrasjonen i monocytter 20. Den relativt svake reaksjon av eosinofiler kan forklares ved det faktum at ingen bromid ble tilsatt, noe som kan ha ført til at EPO-avledet dannelse av HOBr. Foreløpige studier på isolerte eosinophils overraskende ikke viser en stor påvirkning av eksternt lagt bromide på APF oksidasjon av disse cellene. Likevel, oksydasjon av APF av eosinofiler ble observert, som kan forklares ved innføring av små mengder av Br - via bufferoppløsninger som brukes (PBS og HBSS). Alternativt EPO kan også fremstille små mengder av HOCl, i det minste under sure betingelser (for eksempel i phagolysosomes).

Figur 1
Figur 1: Leukocytt berikelse og APF-utleded fluorescens i en blodmikroprøve fra en rotte. En mengde på om lag 200 pl fullblod ble oppnådd fra retrobulbar venous plexus av en kvinnelig Mørk Agouti rotte. Etter påføring av den beskrevne hemolyse fremgangsmåte til 100 ul blod og en påfølgende APF farging av blandede cellefraksjon ble analysert ved flow-cytometri. Som vist av FSC / SSC- Plot (A) erytrocytter ble sterkt utarmet fra prøven og de ​​ulike leukocytt typene kan lett bli preget. Fordelingen av APF-avledet fluorescens intensitet (B) viste klart heme peroksidase-negative celler (erytrocytter og lymfocytter) samt leukocytter med moderate (eosinofile og monocytter) eller sterk (nøytrofile) halogene peroxydaseaktivitet. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i humant blod isolering av peroksidase-positive celler fokuserer ofte bare på disse cellene, og inkluderer en separasjon av neutrofiler fra andre leukocytter ved tetthetsgradient sentrifugering 38. Likevel som neutrofiler er mye mindre rik på murine blodprøver 39 for de sistnevnte mer kompliserte metoder må benyttes 40. Videre har begge metoder også føre til fjerning av peroksidase-positive monocytter fra prøvene og, på grunn av behovet for større blodvolum (for eksempel 400 ul 41), gjelder ikke for mikroprøver erholdt i løpet av tilbakevendende blodprøver fra små forsøksdyr 38,40. Rensing av murine nøytrofile fra peritoneal eksudater trenger også ofringen av dyr, og dessuten ikke gir blod-avledet granulocytter 38,40. Nylig utviklet metoder for å oppnå høyt rensede granulocytter fraksjoner fra murine blood (f.eks bruk av antistoffer) er ofte dyre, kompliserte og tidkrevende 40,42,43 og igjen bare fokusere på rensing av en peroksidase-positive leukocytter type.

Således kan fremgangsmåten presentert her har et par fordeler i forhold til andre fremgangsmåter som anvendes for rensing av peroksidase-positive leukocytter. Som det er basert på små blodprøver de oppnådde cellene representerer situasjonen i sirkulasjon. På grunn av den lille innledende prøvevolumet er nødvendig for protokollen fremgangsmåten er anvendbar for både menneskelige og ikke-menneskelige blod, til tross for de artsspesifikke forskjeller i overflod av nøytrofiler. Faktisk, vi var selv i stand til å anvende den beskrevne metoden til første blodvolum så små som 50 pl (data ikke vist). Den lille blodprøven som trengs for metoden gjør det også velegnet for gjentatte blod tilbaketrekking fra små forsøksdyr eller til spesielle medisinske applikasjoner (f.eks nyfødt diagnose). som than leukocytt berikelse er basert på uttømming av erytrocytter alle peroksidase-positive celler (nøytrofiler, eosinofiler, monocytter) er inkludert i den oppnådde blandede leukocyttfraksjonen og kan hver for seg analysert ved hjelp av strømningscytometri. Metoden er rask, pålitelig og har lave krav til kjemikalier og instrumentering, noe som gjør den protokoll egnet for flere vitenskapelige miljøer.

Som neutrofiler kan lett aktiveres en kritisk trinn i løpet av den beskrevne fremgangsmåte er den nøyaktige justering av pH-verdien av bufferoppløsninger som brukes (PBS og HBSS, se trinn 1.2 og 1.3 i protokollen avsnitt). Videre inkubasjonstid på blodcellene med destillert vann bør ikke være lenger enn 60 sekunder før gjenoppretting normosmotic betingelser (se trinn 2.2 i protokollen seksjonen. Den (nesten) fullstendig fjerning av oppløsningsmiddel fra cellepelleten (trinn 2.4) før tilsetning av vann for andre hypoton lysis er et annet viktig skritt som buffere rester vil redusere effektiviteten av hypotonisk lyseringsprosedyren. En annen kritisk trinn refererer til anvendelsen av H 2 O 2 under APF farging. Selv om den påførte mengden ikke bør være cytotoksisk, bør celle vitalitet kontrolleres. Under våre studier vi vanligvis bruke fargestoffet 5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine jodid (JC-1) for påvisning av tidlige apoptotiske hendelser.

Dessuten er det et par begrensninger i den beskrevne forenklet leukocytter berikelse metode. Mens teknikken kan anvendes på blodprøver fra flere arter (menneske, rotte og mus har blitt prøvd), leukocytt-mengde oppnådd etter lysis av erytrocytter avhenger av deres opprinnelige mengde i blodet. Sistnevnte absolutt varierer mellom artene 39 og er også avhengig av den inflammatoriske tilstanden til individet analysert. Videre, mens den lyseringsprosedyren kan utføres med opp til etthundre prøver i parallell mellomsentrifugeringstrinn utgjør en begrensning som, avhengig av sentrifugen benyttes, bare opp 30 prøver kan behandles parallelt. Videre, mens APF detekterer lett HOCl og HOBr i nærvær av SCN -, halogene aktiviteten av MPO og EPO påvirker også til den sistnevnte pseudo-halogenid. Derved hypothiocyanite (- OSCN) blir dannet, som er i stand til å oksidere APF. En annen begrensning kommer fra egenskapene til det APF fargestoff som brukes for bestemmelse av HOCl- og HOBr-produksjon av MPO og EPO. Som fargestoff oksyderes til fluorescein, kan fargingen ikke kombineres med fluoriserende antistoffer med et emisjonsspektrum i det samme området. Selvfølgelig noen interferens mellom den APF-avledet fluorescens og signalet fra tilleggs fluorescente signalene må kontrolleres og kompensert for i den flowcytometer.

Ellers, hvis påvisning av halogene peroksydaseaktivitet er ikke omfanget av forestudie, etter anvendelse av erytrocytt uttømming metode andre analytiske fremgangsmåter kan brukes i stedet for APF. Som beskrevet hypotonisk lysis fremgangsmåte fører bare til en delvis uttømming av erytrocytter og som alle leukocytt er fortsatt til stede i den oppnådde blandede cellefraksjon, eneste metoder som tillater skal anvendes en enkelt celle analyse. Fremgangsmåter som omfatter lysering av celler (f.eks, Vest-plott analyse) vil ikke gi pålitelige resultater. Den lille innledende prøvevolumet kan være et hinder for slike analytiske metoder.

Når det gjelder undersøkelse av MPO (og EPO) aktivitet i leukocytter ofte bare den generelle oksidant produksjon av cellene blir adressert i stedet for spesifikt å evaluere heme peroksidaseaktivitet 44,45. Dessuten ofte ikke gjøres forsøk på å skille mellom halogene og peroksydase-aktiviteten av MPO og EPO 46,47. Metoder, som spesifikt adresserer klorerings MPO aktiviteten ved quantifying HOCl-avledede produkter som chlorotyrosine oppdager ikke over-oksidert og / eller metaboliseres produkter, og dermed ofte føre til en undervurdering av den virkelige HOCl-produksjon 48. Videre har denne fremgangsmåten, så vel som deteksjonen av HOCl-avledede 2-chloroethidium er også tidkrevende, trenger kostbart analytisk utstyr og omfatte lysering av cellene 48-50 .Det finnes mange rapporter om nye fargestoffer for den spesifikke bestemmelse av klorerings MPO aktivitet innen vitale celler 44,51,52. Likevel hittil bare APF og tilhørende sammensatte hydroksyfenyl fluorescein (HPF) er kommersielt tilgjengelig, og derfor rutinemessig brukt i forskning 25,33.

Faktisk, ved hjelp av APF kan vi vise at den klorerings MPO aktivitet ikke bare kan kvantifiseres ved hjelp av det isolerte enzym 53 men også ved å anvende fargestoff til levende celler 26,33. Dermed ved å kombinere rask leukocytter berikelse fra blodmikroprøvene nevnt ovenfor med enn APF farging vi utviklet en protokoll, som er egnet til å spesifikt og samtidig ta opp halogeneringsaktiviteten av MPO og EPO i alle peroxidase positive leukocytter, dvs. nøytrofiler, monocytter og eosinofiler 32. Videre har fremgangsmåten ikke krever cellelyse, noe som gir et bredt utvalg av analytiske metoder, herunder flowcytometri og konfokal mikroskopi fluoriserende. Videre har denne peroksidaseaktivitet fargingen kan kombineres med påføringen av celleoverflatemarkører, noe som tillater den spesifikke analyse av leukocytt sub-fraksjoner, avhengig av den vitenskapelige oppgaven. Men det må tas i betraktning at de anvendte fluorescens-merket antistoff ikke kommer i konflikt med fluorescein-baserte fluorescens signal som brukes til å kvantifisere HOCl- og HOBr-avledet APF oksidasjon.

Oppsummert denne fremgangsmåte kan tilveiebringe et nytt verktøy for å få mer innsikt i den fysiologiske rollen av halogene peroksydase-aktiviteten av immunologiske relevant blodavledede peroksydaser MPO og EPO, som fortsatt ikke godt forstått 8,20,23. Videre i en dyrestudie på revmatoid artritt kunne vi nylig observere at denne protokollen kan føre til evalueringen av den MPO-avledet HOCl produksjon som en ny klinisk markør ved kroniske inflammatoriske sykdommer (upubliserte data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

Immunologi Blood forberedelse leukocytter berikelse myeloperoxidase eosinofil peroksidase klorerings aktivitet aminofenyl fluorescein
Rask og konkret vurdering av halogene peroxydaseaktivitet i Leukocytt-anriket blodprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter