Abstract
Kemisk modificerede versioner af trehalose eller trehalose analoger, har anvendelser i biologi, bioteknologi og farmaceutisk videnskab, blandt andre områder. For eksempel har trehalose analoger, der bærer detekterbare tags blevet anvendt til at detektere Mycobacterium tuberculosis og kan have anvendelser som tuberkulose diagnostiske billeddannende midler. Hydrolytisk stabile versioner af trehalose bliver også forfulgt på grund af deres potentiale til anvendelse som ikke-kaloriefattige sødestoffer og biologisk beskyttende midler. Trods appel af denne klasse af forbindelser til forskellige applikationer, deres potentiale forbliver uopfyldt grundet manglen på en robust rute for deres produktion. Her rapporterer vi en detaljeret protokol til hurtig og effektiv ettrins biokatalytisk syntese af trehalose analoger, der omgår problemerne forbundet med kemisk syntese. Ved at udnytte den termostabile trehalose syntase (Tret) enzym fra Thermoproteus Tenax, kan trehalose analoger være generated i et enkelt trin ud fra glucose analoger og uridindiphosphat glucose i højt udbytte (op til kvantitativ omdannelse) i 15-60 min. En enkel og hurtig ikke-kromatografisk oprensning protokol, som består af spin-dialyse og ionbytning, kan levere mange trehalose analoger af kendt koncentration i vandig opløsning i så lidt som 45 minutter. I tilfælde, hvor uomsat glukoseanaloge stadig, kan udføres kromatografisk oprensning af trehalose analoge produkt. Samlet set denne metode giver en "grøn" biokatalytisk platform for den fremskyndede syntese og oprensning af trehalose analoger, der er effektive og tilgængelige for ikke-kemikere. For at eksemplificere anvendeligheden af denne metode beskriver vi en protokol til syntese, all-vandig oprensning og forvaltning af et trehalose-baserede click-kemi-sonde til mycobakterier, som alle tog mindre end 1 time og aktiveret fluorescens detektion af mycobakterier. I fremtiden vi forestiller, at blandt othis applikationer, kan denne protokol anvendes på den hurtige syntese af trehalose-baserede prober for tuberkulose diagnostik. For eksempel, med kort levetid radionuklid-modificeret trehalose analoger (fx 18 F-modificeret trehalose) kunne anvendes til avancerede kliniske billeddannende modaliteter såsom positronemissionstomografi-computertomografi (PET-CT).
Introduction
Trehalose er en symmetrisk ikke-reducerende disaccharid, der består af to glucosedele som er forenet af en 1,1-α, α-glycosidbindingen (figur 1A). Mens trehalose er fraværende fra mennesker og andre pattedyr, findes det almindeligt i bakterier, svampe, planter og invertebrater 1. Den primære rolle af trehalose i de fleste organismer er at beskytte mod miljømæssige påvirkninger, såsom udtørring 1. Desuden er nogle humane patogener kræver trehalose for virulens, herunder tuberkulose-forårsager Mycobacterium tuberculosis, som udnytter trehalose som mediator af celle kuvert biosyntese og som en byggesten til opførelse af immunmodulerende glycolipider 2.
Figur 1: Trehalose og trehalose analoger. (A) Strukturer af naturlig trehalose og en unaturlig trehalose analog, hvor X er en strukturel modifikation. (B) Eksempler på trehalose analoger rapporteret i litteraturen, at har potentielle anvendelser i biopreservation og Bioimaging.
På grund af sin unikke struktur og fysiologiske funktioner, har trehalose trukket stor opmærksomhed til brug i bio (tekno) logisk og biomedicinske anvendelser 3. De beskyttende egenskaber af trehalose observeret i natur- fx til sin slående evne hjælpe med at opretholde livet i "opstandelse" planter, der har gennemgået ekstrem dehydrering 4 -Har ansporede sin omfattende brug i biopreservation applikationer. Trehalose er blevet anvendt til at bevare en bred vifte af biologiske prøver, såsom nukleinsyrer, proteiner, celler og væv 3. For eksempel er trehalose anvendes som stabiliserende additiv i en række farmaceutiske that er på markedet, herunder flere anti-cancer monoklonale antistoffer 3. Samt, er trehalose anvendes som sødestof i fødevareindustrien, og det benyttes flittigt for produktkonservering i både fødevare- og kosmetikindustrien. Vedtagelsen af trehalose for disse typer af kommercielle applikationer var oprindelig begrænset af den manglende evne til at opnå større mængder ren trehalose fra naturlige kilder eller gennem syntese. Imidlertid har en effektiv enzymatisk fremgangsmåde til økonomisk produktion af trehalose ud fra stivelse nylig blevet udviklet, hvilket har ansporet sin udbredt kommerciel anvendelse Fem.
Kemisk modificerede derivater af trehalose, omtalt heri som trehalose analoger, har fået stigende opmærksomhed til forskellige applikationer (generiske struktur vist i figur 1A; specifikke eksempler på trehalose analoger vist i figur 1B) 6. For eksempel, lacto-trehalose er en trehalose analog med en af sine glucoseenheder erstattet med galactose, således sin 4-position hydroxylgruppen har en omvendt stereokemisk konfiguration. Lacto-trehalose har samme stabiliserende egenskaber trehalose men er resistent over for nedbrydning af intestinale enzymer, hvilket gør det attraktivt som en ikke-kalorie fødevaretilsætningsstof 6, 7.
Vores gruppes interesse i trehalose analoger vedrører primært deres værdi som Mycobacterium-specifikke prober og hæmmere. Barry og Davis grupper udviklet en fluorescein-konjugeret keto-trehalose analog, opkaldt FITC-keto-trehalose, som blev vist til metabolisk mærke cellevæggen af levende M. tuberculosis, hvilket muliggør dets detektering ved fluorescensmikroskopi 8. Den BERTOZZI lab udviklede mindre azido-trehalose (TreAz) analoger, som metabolisk kunne mærke cellevæggen og efterfølgende være itected bruge klik kemi og fluorescens-analyse 9. Disse fremskridt peger på muligheden for at anvende trehalose-baserede prober som diagnostiske imagografimidler til tuberkulose. Trehalose analoger er også blevet forfulgt som inhibitorer af M. tuberculosis grund af deres potentiale til at forstyrre veje i bakterie, der er essentielle for levedygtighed og virulens 10, 11, 12.
Hidtil har den største hindring for at udvikle trehalose analoger til bio (techno) logiske og biomedicinske anvendelser er manglen på effektive syntetiske metoder. De to traditionelle ruter til at producere trehalose analoger stole på kemisk syntese (figur 2). Én rute involverer desymmetrization / modifikation af naturlig trehalose, mens den anden involverer begyndende med korrekt funktionaliserede monosaccharid- byggesten og udføre kemisk glycosylering tilsmede 1,1-α, α-glycosidbindingen. Disse metoder, som for nylig er blevet diskuteret i oversigtsartikler 13, 14, har vist sig nyttig til varetagelse flertrins syntese af små mængder af komplekse trehalose-holdige naturlige produkter, såsom sulfolipid-1 fra M. tuberculosis 15. Men begge tilgange er generelt ineffektive, tidskrævende, utilgængelige for ikke-kemikere, og desuden ikke anses for at være miljøvenlige. Således til syntese af visse typer af trehalose analoger, disse strategier ikke ideelle.
Figur 2: Tilgange til trehalose analog syntese. Kemiske tilgange til trehalose analog syntese, vist til venstre, skal du bruge flertrins procedurer, der involverer vanskeligt beskyttion / afbeskyttelse desymmetrization, og / eller glycosylerings trin. Enzymatisk syntese, vist til højre, anvender enzym (er) til stereoselektivt konvertere enkle, ubeskyttede substrater til trehalose analoger i vandig opløsning. Den enzymatiske protokol rapporteret heri anvender en trehalose syntase (Tret) enzym at omdanne glucose analoger og UDP-glucose til trehalose analoger i et enkelt trin. Klik her for at se en større version af dette tal.
En effektiv biokatalytisk vej til trehalose analoger vil lette produktionen, evaluering, og anvendelsen af denne lovende klasse af molekyler. Mens den kommercielle enzymatisk fremgangsmåde til trehaloseproduktion 5 ikke tilpasses til syntetisering analoger fordi den udnytter stivelse som et substrat, der er andre biosyntetiske stimåder i naturen, der kan udnyttes til trehalose analog syntese. Men forskning på dette område, som for nylig blev revideret 6, har været begrænset. En rapport anvendes en metode inspireret af Escherichia coli trehalose biosyntesevejen at få adgang til et enkelt fluor-trehalose analog fra den tilsvarende fluor-glucose. Men denne fremgangsmåde kræver en tre-enzymsystem, der har begrænset effektiviteten og generalitet 8,. En anden fremgangsmåde, der er blevet udforsket, er at anvende trehalose phosphorylase (TREP) i den modsatte retning, hvilket i princippet gør det muligt et-trins syntese af trehalose analoger fra glucose analoger og glucose-1-phosphat 6, 16, 17. Selv om denne fremgangsmåde kan have fremtidig løfte begge inverterende og fastholdelse Treps øjeblikket har ulemper for analog syntese. For eksempel inverterende Treps har en uoverkommeligt expensive donor-molekyle (β-D-glucose 1-phosphat) og fastholdelse Treps har dårlig enzym ekspressionsudbytter / stabilitet og begrænset substrat promiskuitet. Markante forbedringer (fx, via enzym engineering) vil blive nødvendige før TREP-medieret analog syntese er praktisk.
På nuværende tidspunkt er den mest praktiske fremgangsmåde til enzymatisk syntese af trehalose analoger er at bruge en trehalose syntase (Tret), som omdanner glucose og uridindiphosphat (UDP) glucose i trehalose i et enkelt trin 6. Vi har for nylig beskrevet anvendelsen af Thermoproteus Tenax Tret-en termostabil og ensrettet enzym 18 -at syntetisere trehalose analoger fra glucose analoger og UDP-glucose (figur 3) 19. Dette enzym fungerer kun i den syntetiske retning og undgår problemet med trehalose nedbrydning fundet i TREP systemet. Dette ettrinsreaktion could afsluttes i 1 time og en bred vifte af trehalose analoger blev tilgået i højt udbytte (op til> 99% som bestemt ved højtydende væskekromatografi (HPLC)) ud fra let tilgængelige glucose analoge substrater (se tabel 1 i de Repræsentative resultater afsnit).
Figur 3: Tret-katalyseret et-trins syntese af trehalose analoger. Den Tret enzymet fra T. tenax kan stereoselektivt slutte let tilgængelige glucose analoger og UDP-glucose til dannelse af trehalose analoger i et trin. R1-R4 = Variabel strukturel modifikation, f.eks azido-, fluor-, deoxy-, thio-, stereokemiske eller isotopisk markør modifikationer; Y = Variabel heteroatom, f.eks oxygen eller svovl, eller isotopisk mærket heteroatom.
Her giver vi annonceETALJERET protokol for Tret syntese-processen, herunder ekspression og oprensning af Tret fra E. coli, optimeret Tret reaktionsbetingelser og en forbedret oprensningsmetode, der udføres fuldstændigt i den vandige fase. Denne modificerede protokol muliggør en hensigtsmæssig og effektiv syntese og oprensning af forskellige trehalose analoger på en semipræparativ skala (10-100 mg). Vi viser også brugen af denne protokol for at forberede og administrere en trehalose-baserede sonde til mykobakterier i mindre end 1 time, hvilket gjorde det muligt for hurtige fluorescens detektion af mycobakterielle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspression og oprensning af Tret fra Top10 E. coli
BEMÆRK: Kontakt forfatterne at anmode Tret-udtrykkende E. coli-stamme (pBAD Tret plasmid, der indeholder T. tenax tret genet under kontrol af AraC protein, omdannet til Top10 E. coli 19) og overdragelsesaftalen medfølgende materiale . Følgende protokol giver typisk et proteinudbytte på ca. 4 mg / l.
- Forbered en 3 ml natten over kultur af Tret-udtrykkende E. coli.
- Streak Top10 E. coli transformeret med pBAD-Tret ekspressionsvektor på en lysogeni bouillon (LB) agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i ca. 48 timer.
- Pick en enkelt koloni fra pladen og pode 3 ml LB flydende medium indeholdende 100 ug / ml ampicillin i en kultur rør.
- Glasset anbringes i en rystende inkubator ved 37 & #176; C x 175 rpm natten over.
- Inducere proteinekspression i Tret-udtrykkende E. coli.
- Tilføj 750 ml Terrific Broth suppleret med 100 ug / ml ampicillin til en 2.800 ml Fernbach dyrkningskolbe. Overfør 1 ml bouillon fra kolben til en kuvette til senere anvendelse som en blindprøve.
- Tilsæt 3 ml natten over kultur genereret i trin 1.1.4 til kulturen kolben, og derefter placere kolben i en inkubator og ryste ved 37 ° C x 200 rpm. Tjek jævnligt absorbansen af kulturen ved 600 nm versus blank indsamlet i trin 1.2.1.
- Når absorbansen ved 600 nm når mellem 0,5-1,0, inducerer Tret ekspression ved tilsætning 750 pi 1 M arabinoseopløsning (1 mM slutkoncentration) til kulturen. Kolben vende tilbage til inkubatoren og omrystes natten over ved 37 ° C x 200 rpm.
- Pellet og lysere Tret-udtrykkende E. coli-celler.
- Overfør kulturen til en polypropylen Bottle og centrifugeres i 15 min ved 4000 xg ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og resuspender pelleten i 15 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
- Overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør og centrifugeres i 15 minutter ved 4.000 xg ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og enten fortsætte til cellelyse (trin 1.3.4) eller opbevare pelleten ubestemt tid ved -80 ° C.
- Opløs 1 proteaseinhibitor mini tablet i 20 ml vaskebuffer (50 mM NaH 2 PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) i et 50 ml konisk rør.
- Overfør proteaseinhibitoren-holdige vaskebuffer til den koniske rør indeholdende pelleten. Vortex indtil pelleten resuspenderes.
- Overfør resuspenderede celler til et 100 ml bægerglas og lysere cellerne ved sonikering (puls sekvens af 45 sekunder på, 45 sekunder med en kørselstid på 2 minutter og 15 sekunder ved en amplitude på 75 procent).
- Overfør lysatet til en 50 ml konisk rør metalog centrifugeres i 60 minutter ved 15.000 xg ved 4 ° C.
- Præcisere lysatet ved passage gennem en 0,2-,45 um sprøjte filter over i en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Den typiske koncentration af lysat opnået 100 mg / ml.
- Oprense Tret fra E. coli cellelysat hjælp af hurtig protein-væskechromatografi (FPLC).
- Opsætning af FPLC med en nikkel affinitet søjle (5 ml lejevolumen). Kolonnen udvaskes med 10 ml deioniseret vand eller indtil kolonnen er ren af eventuelle forureninger. Ækvilibrering af søjlen under anvendelse af 20 ml vaskebuffer (50 mM NaH 2 PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) ved en strømningshastighed på 1 ml / min.
- Indlæse lysatet (20 ml) opnået fra trin 1.3.8 på søjlen, og der elueres ukodede proteiner med vaskebuffer ved en strømningshastighed på 1 ml / min, indtil absorbansen når baggrundsniveauer (typisk 80-100 ml vaskebuffer er påkrævet) .
- Eluer His-mærket Tret ved anvendelse af en lineær gradient elueringsbuffer (50 mM NaH 2 PO4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) 1-100% i løbet af 60 minutter ved en strømningshastighed på 1 ml / min. Saml 4 ml fraktioner indtil tret har elueres og absorbansen når baseline niveau.
BEMÆRK: Typisk 60 ml elueringsbuffer kræves til eluering af proteinet, og proteinet elueres i 60-100% elueringspuffer interval. Ca. opnås 10-15 ml ren Tret i elueringsbuffer. - Bestemme koncentrationen af Tret ved måling af absorbans ved 280 nm mod en elueringspuffer tomt.
- Exchange Tret i tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) puffer ved dialyse.
- Efter fremstilling dialyserøret ifølge producentens anvisninger, opspæd ved skylning med deioniseret vand og derefter Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
- Indlæse Tret prøven i dialyserøret anvendelse af en sprøjte og stump nål. Dialyse natten over engainst 2 liter Tris-buffer.
- Bestemme koncentrationen af Tret ved måling af absorbans ved 280 nm mod en blank opsamlet fra dialyse vask.
- Overfør Tret opløsningen til en 50 ml konisk rør og fortsætte til trehalose analog syntese (trin 2) eller opbevare enzymet ved 4 ° C.
BEMÆRK: Tret er en termostabil protein. Den Tret blev opbevaret i Tris-buffer ved 4 ° C i flere måneder uden iagttagelse signifikant tab af aktivitet.
2. Et-trins syntese af trehalose Analoger Brug Tret Enzyme
BEMÆRK: Nedenstående protokol beskriver en reaktion skala baseret på 4 ml volumen, som kan levere ca. 15-30 mg trehalose analog afhængigt reaktionseffektivitet og molekylvægten af produktet. Reaktionskomponenterne kan skaleres til at opnå mere eller mindre trehalose analog, hvis det ønskes.
- Tilføj glucose analog (0,080 mmol, masse vil afhænge af molekylvægten), UDP-glucose (0.160 mmol, 97,6 mg), og MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) til et 15 ml konisk rør. De endelige koncentrationer af disse komponenter vil være 20 mM, 40 mM og 20 mM.
- Tilføj Tret i Tris-buffer (opnået fra trin 1.5.4) og om nødvendigt, et passende volumen Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) for at opnå en endelig enzymkoncentration på 300 ug / ml og en endelig volumen på 4 ml. Pipetter blandingen op og ned forsigtigt eller invertsukker røret for at opløse faststofferne.
- Inkubér reaktionen ved 70 ° C under omrystning ved 300 rpm i 1 time, og derefter placere røret på is til afkøling.
3. Oprensning af trehalose Analoger fra Rå enzymatisk reaktion Blanding
- Forskyl en centrifugalfilterenhed (nominel molekylvægt grænse (NWML) 10 kDa) for at fjerne spor glycerol i membranen ved tilsætning af 3 ml deioniseret vand til centrifugalfilterenhed og centrifugering ved 3.000 x g, indtil al væske passerer gennem filteretind i røret (ca. 20 min). Gentag to yderligere gange. Gennemføre dette trin umiddelbart før eller under reaktionen (trin 2.3).
- Efter afkøling af den enzymatiske reaktionsblanding (opnået fra trin 2.3), fyldes i præ-skyllet centrifugalfilterenhed. Skyl reaktionen rør med 1 ml deioniseret vand og overførsel til centrifugalfilterenhed. Gentag skylning af reaktionsrøret til maksimal udvinding af produktet.
- Centrifugeres centrifugalfilterenhed ved 3.000 x g, indtil al væske passerer gennem filteret ind i røret (ca. 20 min). Skyl øvre kammer i centrifugalfilterenhed med 3 ml deioniseret vand og centrifugeres ved 3.000 x g, indtil al væske passerer gennem filteret ind i røret (ca. 20 min). Gentag skylning for maksimal genvinding af produktet.
- Kassér den øverste kammer i centrifugalfilterenhed. Tilføj mixed-bed ionbytterharpiks (3 g) til filtratet ved bunden af røret (typisk filtrat volume er 8-15 ml afhængig af antallet af skylninger). Der omrøres ved stuetemperatur i 1 time med en magnetisk omrører ved en hastighed tilstrækkelig til at holde harpiksperlerne suspenderet i opløsningen.
- Dekanteres og filtreres den til at fjerne harpiksen. Tilsæt 5 ml deioniseret vand for at skylle den resterende harpiks. Dekanteres og filtreres det, at kombinere det med produktopløsningen fra den første dekantering. Gentag skylning af harpiksen til maksimal udvinding af produktet.
- Analyser af reaktionen ved tyndtlagskromatografi (TLC) eller HPLC for at bestemme, om fuldstændig omdannelse af glucose analog udgangsmateriale til trehalose analoge produkt blev opnået. Se trin 4.1 for TLC-analyse og trin 4.2 til HPLC-analyse.
- Fjerne vand ved frysetørring eller rotationsfordampning til opnåelse af tørrede produkt. Hvis der ikke blev observeret nogen uomsat glukoseanaloge under TLC eller HPLC-analyse, oprensning ved chromatografi er unødvendig. Veje det produkt til opnåelse af reaktionen Yield og udfører kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopisk analyse (trin 4.3) for at bekræfte produktets struktur og renhed.
- Hvis der blev observeret uomsat glukoseanaloge under TLC-analyse, adskille den fra trehalose analog anvendelse af en størrelse eksklusion søjle.
- Der fremstilles en 1 x 100 cm søjle indeholdende deioniseret vandmættede, ekstra fine P2 polyacrylamid udelukkelse perlestørrelse medier efter fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: søjle Størrelsen udelukkelse kan genanvendes efter vask med deioniseret vand. - Re-opløse det tørrede enzymatiske reaktionsprodukt (opnået fra trin 3.7) i 0,5 ml deioniseret vand. Påfør produktopløsningen til udelukkelse kolonne størrelsen manuelt eller ved anvendelse af en søjle flow adapter. Skyl hætteglasset, der indeholdt det rå produkt med en anden 0,5 ml deioniseret vand, og indlæse den i kolonne størrelse udstødelse.
- Eluering af produktet med deioniseret vand ved hjælp af tyngdekraften flow og indsamle fraktioner af ca. 2 mL volumen.
- Analyser fraktionerne ved TLC (trin 4.1). Pool fraktionerne indeholdende rent trehalose analog.
- Fjerne vand ved frysetørring eller rotationsfordampning til opnåelse af tørrede produkt. Veje det produkt til opnåelse reaktionsudbyttet og fortsæt til NMR-analyse (se trin 4.3).
- Der fremstilles en 1 x 100 cm søjle indeholdende deioniseret vandmættede, ekstra fine P2 polyacrylamid udelukkelse perlestørrelse medier efter fabrikantens anvisninger.
4. Analyse af trehalose Analoge Products
- Udfør tyndtlagskromatografi (TLC) analyse af Tret reaktion.
BEMÆRK: Denne procedure kan også anvendes til at analysere kolonnen Størrelse eksklusion fraktioner. Det kan være nødvendigt at koncentrere reaktionsblandingen eller søjlefraktioner før TLC-analyse for at observere forbindelse farvning på TLC-pladen.- Mark baner på TLC-pladen overflade med en blyant og anvende analyt (r) og relevante standard (er) til de relevante baner, herunder glukose analog standard, trehalose analoge standard (hvis tilgængelig), reaktionsblandingen (eller fraktioner indsamlet fra størrelse exclusion søjleoprensning), og en co-stedet. Efter påføring hver prøve til TLC-pladen, så pladen tørre.
BEMÆRK: reaktion analyse, er typisk 2 pi af prøven påført på TLC-pladen. - Udvikle TLC ved anvendelse af n-butanol / ethanol / deioniseret vand (5: 3: 2).
- Tør den udviklede TLC-plade og derefter dyppe den i 5% H 2 SO 4 i ethanol (sukker plet) og opvarmes på en varmeplade på høj indstilling, indtil sukkerholdige pletter kan visualiseres (typisk 5 minutter).
- Mark baner på TLC-pladen overflade med en blyant og anvende analyt (r) og relevante standard (er) til de relevante baner, herunder glukose analog standard, trehalose analoge standard (hvis tilgængelig), reaktionsblandingen (eller fraktioner indsamlet fra størrelse exclusion søjleoprensning), og en co-stedet. Efter påføring hver prøve til TLC-pladen, så pladen tørre.
- Udfør HPLC-analyse af Tret reaktionsblandinger ved anvendelse enhver HPLC-system stand til at separere og detektere kulhydrater. Denne protokol indebærer kulhydrat separation ved anvendelse af en aminopropyl-HPLC-søjle og påvisning ved brydningsindeks.
- Vedhæfte aminopropyl søjle (4,6 x 250 mm) indeholdende en præ-kolonne vagt med HPLC.
- Ækvilibrer aminopropyl søjlen med 80% acetonitril i deioniseret vand ved en strømningshastighed på 0,4ml / min.
- Indlæse opløsning af reaktionsprodukt (eller standard) på aminopropyl kolonnen.
- Eluering af produktet (eller standard) med 80% acetonitril i deioniseret vand ved en strømningshastighed på 0,4 ml / min og en søjletemperatur på 50 ° C. Typisk driftstid anvendte 40 min.
BEMÆRK: Både glukoseanaloge udgangsmaterialet og trehalose analoge produkt kan påvises ved brydningsindeks, selvom kunne anvendes andre metoder såsom evaporativ lysspredningsbestemmelse (ELSD). Under anvendelse af de beskrevne betingelser, glucose analoger typisk eluere mellem 10-15 min og trehalose analoger eluere mellem 15-25 min.
- NMR-analyse af oprensede trehalose analoger.
- Opløs renset trehalose analog i D2O (700 uL), og opløsningen overføres til et NMR rør.
- Anskaf en H og 13 C NMR-spektre i henhold til relevante NMR facility protokoller.
- Syntetisere, rense, og administrere 6-TreAz til M. smegmatis (Msmeg).
- Tilføj 6-azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glucose (0,040 mmol, 24,4 mg), og MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) til et 15 ml konisk rør.
- Tilføj Tret i Tris-buffer (opnået fra trin 1.5.4) for at opnå en endelig enzymkoncentration på 300 ug / ml og en endelig volumen på 1 ml. Pipetter blandingen op og ned forsigtigt eller invertsukker røret for at opløse faststofferne.
- Inkubér reaktionen ved 70 ° C under omrystning i 15 min.
- Fortynd den enzymatiske reaktionsblandingen med 3 ml deioniseret vand og overføre den til en forvasket centrifugalfilterenhed (NMWL 10 kDa). Centrifugeres filterenheden ved 3.000 x g, indtil det meste af væsken passerer gennem filteret ind i røret, ca. 10 min.
- Kassér the øvre kammer i centrifugalfilterenhed. Tilføj mixed-bed ionbytterharpiks (0,75 g) til røret og rør / shake ved stuetemperatur i 25 min. Dekanteres og filtreres den til at fjerne harpiksen.
BEMÆRK: Trin 5.1.1-5.1.5 tilvejebringe en vandig opløsning af 6-azido-trehalose (6-TreAz) ved ca. 5 mM koncentration på mindre end 1 time. koncentrationen 5 mM estimeres baseret på kvantitativ omdannelse af substrat til produkt og fortyndingen, der tager steder i løbet af oprensningstrin, antager minimalt tab af produkt under disse trin. Løsningen kan være sterilfiltreret før tilsætning til en biologisk prøve, hvis det ønskes. - Tilsæt passende mængde af 6-TreAz produkt løsning på en log-fase kultur af M. smegmatis (Msmeg), typisk at opnå en endelig kultur volumen på 100-1000 uL og en endelig 6-TreAz koncentration af ~ 25 uM. Inkuber cellerne ved 37 ° C i den ønskede tidsrum, typisk 60 min.
- Udfør klik kemi at konjugere en fluorofor til azid-mærkede celler. I denne protokol, bruge Cu-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) til at levere en fluorofor til celle-overflade azider i Msmeg.
- Centrifuger cellerne ved 3.900 xg i 5 min, og derefter vaske cellerne med PBS indeholdende 0,5% bovint serumalbumin. Gentag to gange.
- Re-suspendere pelleterede celler i 4% para-formaldehyd i PBS til at løse dem. Efter inkubering i 10 minutter, gentag trin 5.2.1 at vaske cellerne.
- Re-suspendere pelleterede celler i 138 pi PBS.
- Tilsæt 3 pi af en 1 mM stamopløsning af alkyn-carboxyrhodamin 110 (Alkyn-488) i DMSO.
- Tilsæt 3 pi af en frisk fremstillet 60 mM stamopløsning af natriumascorbat i deioniseret vand.
- Tilsæt 3 pi af en 6,4 mM stamopløsning af Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA) i tert-butanol / dimethylsulfoxid (DMSO) 4: 1.
- Tilsæt 3 & #956 L af en 50 mM stamopløsning af CuSO4 i deioniseret vand.
- Pipetter cellesuspensionen op og ned, derefter inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
- Gentag trin 5.2.1 at vaske cellerne. Re-suspendere cellerne i 150 pi PBS.
- Udføre cellulær fluorescens analyse. I denne protokol, bruge fluorescensmikroskopi til at visualisere cellulære fluorescens af mærket Msmeg.
- Der tilsættes 10 pi af bakterieceller suspenderet i PBS til et mikroskopobjektglas og let sprede væsken i et tyndt lag ved hjælp af kanten af et dækglas. Lad det lufttørre i mørke.
- Tilsæt 10 uL af montering medium over tørrede prøve, og derefter placere dækglas over prøven og anvende lim (f.eks neglelak) at immobilisere.
- Billede dias ved hjælp af en fluorescens mikroskop ved 100X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T. Tenax Tret blev opnået fra E. coli i et udbytte på cirka 4 mg / l ved anvendelse af standard proteinekspression og oprensningsteknikker. En enkelt nikkel affinitetskromatografitrin var tilstrækkelig til at oprense Tret fra E. coli lysat (en repræsentativ FPLC kurve er vist i figur 4). Som fastslået i vores indledende offentliggørelse på Tret syntese proces, rekombinant T. tenax tret er i stand til at omdanne en bred variation glucose analoger-hvoraf mange er kommercielt tilgængelige, til de tilsvarende trehalose analoger med høj effektivitet 19. Tabel 1, som giver HPLC-bestemt reaktionsudbytter for en række begyndende glucose analoger ved hjælp af vores oprindeligt rapporterede protokol, illustrerer omfanget af Tret substrat promiskuitet og dets egnethed til syntese. Diverse strukturelle ændringer, herunder fluor-, deoxy-, azido-,thio-, og stereokemiske modifikationer i forskellige positioner rundt sukkerringen er godt tolereret af vildtypeenzymet, med de vigtigste undtagelse er modifikationer i 4-stillingen.
Figur 4: Repræsentative resultater for Tret rensning ved FPLC. Oprensning af rekombinant T. tenax Tret fra E. coli lysat blev udført under anvendelse af nikkel-affinitetskromatografi som beskrevet i trin 1.4.1-1.4.4. Blå, ultraviolet (UV) absorbansspor; lysegrøn, koncentration af elueringsbuffer; mørkegrønne, tryk. Toppen svarende til Tret er angivet med en pil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Repræsentative udbytter for Tret reaktion. HPLC-bestemmes og isolerede udbytter af Tret reaktionen i flere trehalose analoger. ND, ikke detekteres. - Angiver reaktionen blev ikke udført på en semipræparativ skala under anvendelse af den optimerede protokol. * Angiver, at en gelpermeationskromatografi trin var påkrævet. Horisontale skillelinjer adskille stilling modifikation på trehalose sukker ring. Tabel tilpasset fra henvisning 19 med tilladelse; opdateret med isolerede udbytter fra dette arbejde. Klik her for at downloade denne fil.
Heri rapporterer vi optimeringer til vores indledende protokol, der forbedrer den samlede effektivitet og hastighed Tret syntese proces. Mens den oprindelige protokol, der anvendes 10 mM glucose enalogue og 40 mM UDP-glucose, blev det bestemt, at sammenlignelige omdannelse kunne opnås ved anvendelse af 20 mM glucose og 40 mM UDP-glucose og fordobler mængden af produkt dannet pr reaktion og begrænse spild af UDP-glucose, som er relativt dyre . Anvendelse af ækvimolære mængder glucose analog og UDP-glucose resulterede i lavere konverteringer. Om ønsket kan reaktionstider også forkortes til under den oprindeligt rapporterede 60 min, men bevare sammenlignelige konvertering for mange analoger, som blev påvist ved den kvantitative omdannelse af 6-GlcAz til 6-TreAz i kun 15 min ved 70 ° C ( Figur 5 og 6).
Oprensningsprotokollen rapporteret heri er væsentligt forbedret, erstatte det oprindelige enzym udfældning / silicagelkromatografi metode med en ikke-kromatografisk centrifugering dialyse / ionbytning metode. Begrundelsen for denne ændring er, at Tret reaction blanding består udelukkende af ioniske arter bortset fra neutral trehalose analoge produkt. Derfor kan blandingen være spin-dialyseret til fjernelse enzym og derefter behandlet med blandet bed ionbytterharpiks for at fjerne alle de ioniske stoffer, der leverer oprenset trehalose analog i vandig opløsning i så lidt som 45 minutter. Denne alt-vandige rensningsmetode undgår miljømæssigt skadelige organiske opløsningsmidler, tidskrævende fordampning og filtreringstrin og tør-load silicagelkromatografi, hvilket er en langsom og besværlig proces, især for ikke-kemikere. For Tret reaktioner, der udviser kvantitativ omdannelse som bestemt ved anvendelse af beskrevne TLC eller HPLC-analyser, denne oprensningsmetode tilvejebringer isolerede udbytter på ca. 60-80% på den rapporterede reaktion skala med produktet tab sandsynligvis på grund af binding af nogle sukker til ionbytning harpiks (se tabel 1 for repræsentative isolerede udbytter). I tilfælde, hvor ikke-reageret glukose analog fortsat,det kan separeres fra det ønskede trehalose analoge produkt under anvendelse af en polyacrylamid størrelseseksklusionssøjle bead-baseret, eluering med vand. Hvis det foretrækkes, kan dette også opnås ved anvendelse af præparativ skala HPLC med en aminopropyl-søjle. Produktrenhed kan vurderes ved TLC, HPLC og / eller NMR-spektroskopisk analyse. Figur 5 viser repræsentative analysedata for 6-TreAz, som blev syntetiseret via den beskrevne protokol. TLC og HPLC data indikerede kvantitativ omdannelse af 6-GlcAz substrat til 6-TreAz produkt til denne reaktion, og det isolerede udbytte efter spin dialyse / ionbytter oprensningstrin var 58%. 1H og 13C NMR-spektroskopisk analyse bekræftede strukturen af 6-TreAz produkt, især herunder α, α-stereokemi af den nyligt dannede glycosidbinding, samt dets renhed.
Figur 5: Repræsentative analysedata for den Tret reaktionen. (A) TLC og (B) HPLC-analyse af Tret-katalyseret omdannelse af 6-GlcAz til 6-TreAz. (C) 1H-NMR og (D) 13C-NMR-spektre af 6-TreAz produkt opnået efter centrifugering dialyse / ionbytning oprensning. Klik her for at se en større version af dette tal.
I betragtning af den ovennævnte værdi af trehalose analoger til den specifikke påvisning af M. tuberculosis bør Tret processen lette udviklingen og anvendelsen af trehalose-baserede prober til tuberkulose forskning og diagnostiske anvendelser. For at demonstrere denne type anvendelse, vi brugte den optimerede TretFremgangsmåde til hurtigt fremstille, oprense og administrere 6-TreAz-en trehalose-baserede click-kemi-sonde 9 -til mykobakterier at aktivere fluorescens detektion (workflow og repræsentative data er vist i figur 6). Kort fortalt blev Tret anvendes til omdannelse af kommerciel 6-GlcAz til 6-TreAz kvantitativt i 15 min, og derefter blev reaktionsblandingen underkastet spin dialyse / ionbytning rensningsmetode, som tog kun 45 min (multiple skyl trin blev udeladt for at forøge fart). Således blev en vandig stamopløsning af ren 6-TreAz med kendt koncentration (~ 5 mM), der genereres i kun 1 time. Den 6-TreAz lager blev straks indgivet til en voksende kultur af modellen bakterie Msmeg (endelig 6-TreAz koncentration ~ 25 uM) for at nå azid mærkning af celleoverfladen, som er indlejret et håndtag for click-kemi-medieret ligering 20, 21 i en fluorescerende probe. efterfølgendemærkede celler blev analyseret ved fluorescensmikroskopi som udviste kraftig fluorescens til 6-TreAz-behandlede celler. Som forventet blev kontrolprøver, der ikke blev behandlet med 6-TreAz eller mangler en funktionel trehalose transportør 22, som er nødvendig for 6-TreAz optag og metabolisk inkorporering 9, viste ingen fluorescens.
Figur 6: Repræsentative resultater for hurtig påvisning af mykobakterier ved hjælp af en Tret-syntetiseret trehalose analog. (A) Arbejdsgang for den hurtig syntese, oprensning og anvendelse af 6-TreAz til fluorescens detektion af Msmeg. Trin 5.1.1-5.1.6 af protokollen blev anvendt til at syntetisere og oprense 6-TreAz (hvilket giver en ~ 5 mM vandig opløsning i 1 time), derefter administrere det at leve Msmeg at udføre metabolisk mærkning af celleoverfladen med azider. Dernæst som beskrevet i trin 5.2.1-5.2.9, skal du klikke på kemi (CuAAC) blev udført for at reagere celle-overflade azider med en alkyn-modificerede fluorophor, alkyn-488. (B) Fluorescence billeddannelse af 6-TreAz-behandlet Msmeg indeholder en funktionel trehalose transportør (vildtype og Δ sugC :: sugC) viste stærk fluorescens, mens kontrolprøver af Msmeg venstre ubehandlet eller mangler trehalose transportør (Δ sugC) ikke . Figur tilpasset fra henvisning 19 med tilladelse; opdateret med workflow og billeddata fra den forbedrede Tret protokollen. Scale barer, 5 um. Vær venligklik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trehalose analoger har potentialet til at påvirke forskellige områder, fra konservering af fødevarer og lægemidler til diagnose og behandling af mikrobielle infektioner 6. Eksisterende flertrins kemisk syntese fremgangsmåder er anvendelige til fremstilling af komplekse trehalose analoger med flere steder af modifikation (f.eks, naturligt forekommende komplekse mycobakterielle glycolipider). Imidlertid er disse metoder altid er lang og ineffektiv, selv når den anvendes til syntese af forholdsvis simple monosubstituerede trehalose analoger 9, 13, 14. er behov for alternative syntetiske fremgangsmåder til hurtigt og effektivt at producere forskellige typer af trehalose analoger, som kan have værdi i de ovennævnte områder. Biokatalytiske tilgange, der udnytter trehalose-syntese enzymer fra naturen holde den mest lovende. Selv om flere trehalose-syntese pathwaysfindes i naturen, mener vi tret fra T. tenax 18 at være den ideelle enzym til trehalose analog syntese af flere grunde.
Tret fra T. Tenax er varmestabil, så reaktioner, der skal opvarmes til forbedret hastighed og til forebyggelse af mikrobiel forurening i indstillinger storstilet produktion. Tret fra T. Tenax er en ensrettet enzym, der er ikke stand til at nedbryde trehalose. Tret fra T. Tenax er modtagelig for ekspression og oprensning fra E. coli, og dets overførsel og lagring er letkøbt. Den Tret reaktionen er et enkelt trin, og det involverer simple substrater glucose og UDP-glucose. Et stort antal strukturelt / funktionelt forskelligartede glucose analoger er tilgængelige fra talrige kommercielle leverandører. UDP-glucose er en relativt billig glucose donor, især i forhold til den TREP donor β-D-glucose 1-phosphat. Tret fra T. Tenax har høj PRomiscuity for glucosesubstratet struktur, så forskellige trehalose analoger er tilgængelige. Produkt oprensning fra reaktionsblandingen Tret er hurtig og enkel.
Heri rapporterede vi en detaljeret optimeret protokol for trehalose analog syntese, der udnytter de ovennævnte positive egenskaber i Tret enzymet. Den Tret fremgangsmåde kan anvendes til adgang til forskellige rene trehalose analoger på en semi-præparativ skala (10-100 mg), selvom yderligere opskalering bør være muligt, hvis det ønskes. Talrige typer af analoger blev tilgået i vores tidligere og nuværende arbejde, herunder azido-, deoxy-, fluor- og thio-trehaloses, samt trehalose stereoisomerer, men andre modifikationer vil også være muligt (f.eks isotopmærkede og radioaktivt mærket trehaloses er af særlig interesse). Trinene syntese og rensning af Tret processen er operationelt enkel og kan let udføres af personale, der ikke er uddannet i syntetisk cheMistry. Et af de mest attraktive træk ved Tret proces er, at både syntesen og oprensningstrin kan udføres i en meget kort periode, der spænder fra 1-4 timer afhængig af antallet af vasketrin ønskes (bemærk: hvis størrelse eksklusion søjle der er behov for oprensning for at separere trehalose analoge produkt fra uomsat glukoseanaloge, dette øger den samlede tid til omkring 2 dage, hvilket stadig væsentligt hurtigere end eksisterende fremgangsmåder til trehalose analog syntese).
Selvom Tret processen er den mest effektive enzymatiske rute til adgang trehalose analoger endnu indberettede, har det nogle ulemper, der giver mulighed for fremtidig forbedring. Første, selv om UDP-glucose er relativt billig sammenlignet med andre sukkerarter donorer, effektiviteten af Tret processen kan forbedres yderligere ved kobling med et enzymatisk syntese af UDP-glucose fra en billigere kilde, fx α-D-glucose 1- phosphat, eller ved identifying en billig erstatning for UDP-glucose. En anden potentiel begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at reaktionen anvendelsesområde i sidste ende styres af substratet tolerance på Tret. Mens tolerancen af vildtype Tret er ganske høj (se tabel 1), kan nogle analoger ikke syntetiseres ved hjælp af denne metode (f.eks 4-stillingen modificerede analoger). Derfor vil konstruerede versioner af Tret med øget substrat tolerance være værdifulde. For det tredje, mens mange Tret-katalyserede reaktioner Fortsæt med kvantitativ omdannelse, lavere omdannelse nødvendiggør et kromatografisk oprensningstrin. I denne protokol, vi fokuseret på at bruge en relativt langsom størrelse udelukkelse proces, da det er billigt, ikke kræver nogen specielt udstyr, og alene kan udføres med vand eluering. Alternativt kunne HPLC-oprensning under anvendelse af en præparativ målestok aminopropyl kolonne anvendes som en hurtigere fremgangsmåde til produkt oprensning. Trods nogle af disse begrænsninger, den Tret proces giveren stærk platform for en hurtig og effektiv forberedelse af trehalose analoger, og bør fremskynde deres evaluering og anvendelse i bio (tekno) logiske og biomedicinske områder. Fremtidige forbedringer af Tret processen, diskuteret ovenfor, vil yderligere styrke forskning og ansøgninger trehalose og dets derivater.
Trehalose analoger har potentiel værdi på forskellige områder. Som nævnt i indledningen, er naturligt trehalose anvendes til biopreservation og fødevarer sødemidler applikationer, så trehalose analoger med egenskaber såsom nedbrydning resistens kan være attraktiv. Hertil kommer en række isotopmærkede og radioaktivt mærkede versioner af naturlige trehalose er kommercielt tilgængelige til forskningsformål, og tret proces kan sikkert give hurtig og effektiv adgang til disse molekyler. Trehalose analoger er også af interesse til målretning patogener med prober og antistoffer siden trehalose er fraværende fra pattedyr. én apdelsen i dette område, der er af særlig interesse er påvisningen af mykobakterier. M. tuberculosis, det agens af tuberkulose, som dræber 1,5 millioner mennesker om året, indeholder unikke trehalose forarbejdning veje, der er fraværende fra pattedyr. For eksempel med trehalose genanvendelse transportøren og nedstrøms enzymer, der inkorporerer trehalose i ydre membran-hjemmehørende glycolipider er ikke til stede i pattedyr 22. Målretning denne mykobakterier-specifikke maskiner med påviselige trehalose analoger repræsenterer en attraktiv tilgang til in vivo billeddannelse af M. tuberculosis infektion i modelsystemer og muligvis menneskelige patienter. Faktisk har de ovenstående eksempler på FITC-keto-trehalose og TreAz (figur 1B) banede vejen for en sådan udvikling 8, 9. For at lette adgangen for disse værktøjer til forskningsverdenen, rapporterede vi heri en protokol for hurtigt synthesizing og brug af 6-TreAz til billedet mykobakterier i kombination med klik kemi.
Denne protokol kan tilpasses til udvikling af andre påviselige trehalose analoger, der kan være nyttige for tuberkulose diagnostiske anvendelser. For eksempel, Barry og Davis først foreslået den mulige anvendelse af 18F-fluor-trehalose som en positronemissionstomografi (PET) probe til in vivo-billeddannelse af mycobakteriel infektion 8. Den Tret proces kan være ideel til at realisere dette mål. Tret er i stand til hurtigt og kvantitativt at frembringe 2-fluor-trehalose ud fra 2-fluor-glucose (se tabel 1), hvilket er kritisk, fordi 18 F-2-fluor-glucose er kortvarig (18 F halveringstid = 110 minutter ), hvilket nødvendiggør ekstremt hurtig kemi. Endvidere 18F-2-fluor-glucose er let tilgængelig, da den allerede anvendes i klinikken for PET-billeddannelse af tumorer. Brug af den beskrevne Tret processen for development af 18. F-fluor-trehalose og andre trehalose analoger til forskellige applikationer er i øjeblikket i gang i vores laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | S374 | |
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
