Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/54485

Abstract

Chemisch gemodificeerde versies van trehalose, trehalose of analoga hebben toepassingen in de biologie, biotechnologie en farmaceutische wetenschappen, onder andere gebieden. Zo hebben trehalose analogen richting detecteerbare labels gebruikt om Mycobacterium tuberculosis te detecteren en kunnen applicaties tuberculose diagnostische beeldvormingsmiddelen hebben. Hydrolytisch stabiele versies van trehalose worden ook nagestreefd vanwege hun potentieel voor toepassing als niet-calorische zoetstoffen en bioprotectieve middelen. Ondanks de aantrekkingskracht van deze klasse van verbindingen voor verschillende toepassingen, in potentie groot onvervulde door het ontbreken van een solide route voor hun productie. Hier melden wij een gedetailleerd protocol voor de snelle en efficiënte one-step biokatalytische synthese van trehalose analogen dat de problemen in verband met chemische synthese omzeilt. Door gebruikmaking van de thermostabiele trehalose synthase (TRUE) enzym uit Thermoproteus tenax, kan trehalose analogen generated in een enkele stap uit glucose analogen en uridine difosfaat glucose in hoge opbrengst (tot kwantitatieve conversie) in 15-60 min. Een eenvoudige en snelle niet-chromatografische zuivering protocol waarbij spin dialyse en ionenuitwisseling veel trehalose analogen van bekende concentratie te leveren in waterige oplossing in slechts 45 minuten. Wanneer ongereageerde glucose-analoog blijft, kan chromatografische zuivering van het trehalose analoge product worden uitgevoerd. Over het algemeen is deze methode zorgt voor een "groene" biokatalytische platform voor de versnelde synthese en zuivering van trehalose analogen die efficiënt en toegankelijk voor niet-chemici. Om de toepasbaarheid van deze methode illustreren, beschrijven we een protocol voor de synthese volledig waterige zuivering en toediening van trehalose-gebaseerde click chemie probe mycobacteriën, hetgeen alles minder dan 1 uur nodig fluorescentiedetectie van mycobacteriën. In de toekomst voor ogen dat we, onder OTHer toepassingen Dit protocol kan worden toegepast op de snelle synthese van trehalose-probes voor tuberculose diagnostiek. Bijvoorbeeld kortlevende radionuclide trehalose gemodificeerde analogen (bijvoorbeeld 18 F-gemodificeerde trehalose) kunnen worden gebruikt voor geavanceerde klinische beeldvormingsmodaliteiten zoals positron emissie tomografie-computed tomografie (PET-CT).

Introduction

Trehalose is een symmetrische niet-reducerende disaccharide bestaande uit twee glucose eenheden die zijn verbonden door een 1,1-α, α-glycosidische binding (Figuur 1A). Terwijl trehalose ontbreekt in mensen en andere zoogdieren wordt aangetroffen bij bacteriën, schimmels, planten en invertebraten 1. De primaire rol van trehalose in de meeste organismen te beschermen tegen milieu-invloeden, zoals uitdroging 1. Bovendien hebben sommige humane pathogenen vereist trehalose voor virulentie, waaronder tuberculose veroorzaakt Mycobacterium tuberculosis, die trehalose gebruikt als een mediator van celwand biosynthese en als bouwsteen voor de constructie van immunomodulerende glycolipiden 2.

Figuur 1
Figuur 1: Trehalose en trehalose analogen. (A) Structuren van trehalose natuurlijke en onnatuurlijke analoge trehalose, waarbij X een structurele modificatie. (B) Voorbeelden van trehalose analogen in de literatuur dat potentiële toepassingen in biopreservation en Bio-imaging hebben.

Door zijn unieke structuur en fysiologische functies, heeft trehalose veel aandacht getrokken voor gebruik in bio (techno) logisch en biomedische toepassingen 3. De beschermende eigenschappen van trehalose waargenomen in natuur- bv, zijn opvallende vermogen om te helpen ondersteunen het leven in 'opstanding' planten die extreme uitdroging hebben ondergaan 4 -hebben spoorde haar uitgebreide gebruik in biopreservation toepassingen. Trehalose is gebruikt voor een breed scala aan biologische monsters, zoals nucleïnezuren, eiwitten, cellen en weefsels 3 behouden. Zo wordt trehalose gebruikt als stabiliserende additief in een aantal farmaceutische thoed op de markt, waaronder een aantal anti-kanker monoklonale antilichamen 3. Eveneens, wordt trehalose gebruikt als zoetstof in de voedingsindustrie, en het wordt uitgebreid voor product bewaren voor voedsel en cosmetische industrie. De vaststelling van trehalose voor deze soorten commerciële toepassingen werd aanvankelijk beperkt door het onvermogen om grote hoeveelheden zuiver trehalose uit natuurlijke bronnen of door middel van synthese te verkrijgen. Echter, een efficiënte enzymatische werkwijze voor de economische productie van trehalose uit zetmeel is recent ontwikkeld, die het wijdverbreide commerciële toepassing heeft aangezet 5.

Chemisch gemodificeerde derivaten van trehalose, hierin aangeduid als trehalose analogen steeds meer aandacht hebben gekregen voor verschillende toepassingen (algemene structuur in figuur 1A, specifieke voorbeelden van trehalose analogen figuur 1B) 6. Bijvoorbeeld, Lacto-trehalose is trehalose analoog met één van de glucose-eenheden vervangen galactose, waardoor de 4-positie hydroxylgroep een omgekeerde stereochemische configuratie. Lacto-trehalose heeft dezelfde eigenschappen als stabiliserende trehalose maar is resistent tegen afbraak door intestinale enzymen, waardoor zowel als niet-calorische additief 6, 7.

het belang van onze fractie in trehalose-analogen in de eerste plaats betrekking heeft op hun waarde als mycobacteriën-specifieke probes en remmers. Barry en Davis groepen ontwikkelde een fluoresceïne-geconjugeerd keto-analoog trehalose, genaamd FITC-keto-trehalose, die bleek metabolisch labelen de celwand van levende M. tuberculosis, waardoor de detectie met fluorescentiemicroscopie 8. De Bertozzi lab ontwikkelde kleinere azido-trehalose (TreAz) analogen die metabolisch kon het etiket van de celwand en vervolgens zijn detweerspiegelde het gebruik van click chemie en fluorescentie analyse 9. Deze ontwikkelingen wijzen op de mogelijkheid van het gebruik van trehalose probes als diagnostische beeldvormingsmiddelen voor tuberculose. Trehalose analogen zijn ook gevoerd als remmers van M. tuberculosis wegens het potentiële trajecten in de bacterie die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid en de virulentie 10, 11, 12 zijn verstoren.

Tot nu toe, het belangrijkste obstakel voor de ontwikkeling van trehalose analogen voor bio (techno) logisch en biomedische toepassingen is het gebrek aan efficiënte synthetische methoden. De twee traditionele routes te produceren trehalose analogen afhankelijk chemische synthese (Figuur 2). Één route omvat desymmetrization / modificatie van natuurlijke trehalose, terwijl de andere gaat ab goed gefunctionaliseerde monosaccharide bouwblokken en het uitvoeren van chemische glycosylering tesmeden de 1,1-α, α-glycosidische binding. Deze benaderingen, die onlangs in review artikelen 13, 14 hebben besproken, zijn nuttig voor het uitvoeren van meerdere stappen synthese van kleine hoeveelheden complexe-trehalose bevattende natuurlijke producten, zoals sulfolipid-1 van M. tuberculosis 15 bewezen. Is de benadering die in het algemeen inefficiënt, tijdrovend, ontoegankelijk voor niet-chemici en, bovendien, niet als milieuvriendelijk. Zo synthetiseren van bepaalde trehalose analogen, deze strategieën zijn niet ideaal.

Figuur 2
Figuur 2: Benaderingen trehalose analoge synthese. Chemical zal trehalose analoge synthese, getoond aan de linkerkant, gebruiken meerdere stappen procedures die moeilijk bescherming te betrekkentie / ontscherming, desymmetrization en / of glycosylatie stappen. Enzymatische synthese, zie rechts, gebruikt enzym (en) stereoselectief omzetten eenvoudige onbeschermde substraten analogen in waterige oplossing trehalose. De enzymatische protocol dit formulier gebruikt een trehalose synthase (TRUE) enzym glucose analogen en UDP-glucose omzetten in trehalose analogen in een enkele stap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een efficiënte biokatalytische route naar trehalose analogen zou de productie, evaluatie, en de toepassing van deze veelbelovende klasse van moleculen te vergemakkelijken. Terwijl de commerciële enzymatische werkwijze voor de productie van trehalose 5 is niet aangepast aan het synthetiseren van analogen omdat het gebruik maakt van zetmeel als substraat, zijn er andere biosynthetische padwijze natuur waarvan gebruik wordt gemaakt voor trehalose analoge synthese. Echter, onderzoek op dit gebied, die onlangs werd beoordeeld 6, is beperkt. Eén melding gebruikte werkwijze geïnspireerd door Escherichia coli trehalose biosynthese route om een fluor-analoog trehalose uit de overeenkomstige fluor-glucose. Deze benadering vereist een drie-enzymsysteem dat beperkte efficiëntie en algemeenheid 8. Een andere benadering die is onderzocht is trehalose fosforylase (TREP) gebruik in de omgekeerde richting, die in principe één-stap synthese van trehalose analogen van glucose analogen en glucose-1-fosfaat 6, 16, 17 mogelijk maakt. Hoewel deze aanpak belofte voor de toekomst kan hebben, zowel omkeren en behouden TREP hebben momenteel nadelen voor analoge synthese. Bijvoorbeeld, het omkeren van TREP een onbetaalbaar ervansive donormolecuul (β-D-glucose 1-fosfaat) en behouden TREP slechte enzymexpressie opbrengsten / stabiliteit en beperkte substraat promiscuïteit. Significante verbeteringen (bijvoorbeeld via enzyme engineering) nodig zal zijn voordat TREP-gemedieerde analoge synthese is praktisch.

Momenteel is de meest praktische benadering voor de enzymatische synthese van trehalose analogen is een trehalose synthase (Tret) enzym dat glucose omzet en uridine difosfaat (UDP) glucose in trehalose in een enkele stap 6 gebruikt. We hebben onlangs gemeld het gebruik van Thermoproteus tenax Tret-een thermostabiel enzym en unidirectionele 18 -de trehalose synthetiseren analogen van glucose analogen en UDP-glucose (figuur 3) 19. Dit enzym werkt alleen in de richting synthetische en vermijdt het probleem van trehalose afbraak in het TREP systeem. Deze éénfasige reactie could vullen in 1 uur, en een grote verscheidenheid aan trehalose analogen werden benaderd in hoge opbrengst (tot> 99% zoals bepaald door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)) uit gemakkelijk beschikbare glucose analoge substraten (zie tabel 1 in de Representatieve resultaten sectie).

figuur 3
Figuur 3: TRet gekatalyseerde één-stap synthese van trehalose analogen. De Tret enzym uit T. tenax stereoselectief kan deelnemen beschikbaar glucose analogen en UDP-glucose trehalose analogen vormen in één stap. R1-R4 = Variable structurele modificatie, bijvoorbeeld azido-, fluor, deoxy-, thio-, stereochemische of isotoop label wijzigingen; Y = variabele heteroatoom, zoals zuurstof of zwavel, of een isotoop gemerkte heteroatoom.

Hier bieden we adEDETAILLEERDE protocol voor de Tret synthesewerkwijze, waaronder expressie en zuivering van Tret van E. coli geoptimaliseerde Tret reactieomstandigheden en een verbeterde zuiveringswerkwijze die volledig in de waterfase wordt uitgevoerd. Deze gewijzigde protocol kan de doelmatige en efficiënte synthese en zuivering van diverse analogen trehalose op semi-preparatieve schaal (10-100 mg). We tonen ook het gebruik van dit protocol voor het bereiden en toedienen van een trehalose-gebaseerde probe voor mycobacteriën in minder dan 1 uur, waarbij de snelle fluorescentie detectie van mycobacteriële cellen mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expressie en zuivering van Tret van Top10 E. coli

LET OP: Neem contact op met de auteurs van de Tret-uiting van E. coli-stam te vragen (pBAD Tret plasmide, met daarin de T. tenax tret gen onder de controle van de AraC proteïne, getransformeerd in Top10 E. coli 19) en de bijbehorende materiaal overeenkomst tot overdracht . Het volgende protocol geeft kenmerkend een eiwit opbrengst van ongeveer 4 mg / l.

  1. Bereid een 3 ml overnacht cultuur van Tret expressie E. coli.
    1. Streak Top10 E. coli getransformeerd met pBAD-Tret expressievector op lysogenie bouillon (LB) agar plaat bevattende 100 ug / ml ampicilline.
    2. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende ongeveer 48 uur.
    3. Kies een enkele kolonie van de plaat en enten 3 ml vloeibaar LB-medium dat 100 ug / ml ampicilline in een kweekbuis.
    4. Plaats de buis in een schudincubator bij 37 & #176; C x 175 rpm 's nachts.
  2. Induceren eiwitexpressie in Tret expressie brengende E. coli.
    1. 750 ml Terrific Broth toe gesupplementeerd met 100 ug / ml ampicilline om een ​​2800 mL Fernbach kolf. Breng 1 ml kweekvloeistof uit de kolf naar een cuvet voor later gebruik als blanco.
    2. Voeg de 3 ml overnacht cultuur gegenereerd in stap 1.1.4 om de cultuur kolf, en zet de kolf in een incubator en schud bij 37 ° C x 200 rpm. Controleer regelmatig de absorptie van de cultuur bij 600 nm ten opzichte van de verzamelde stap 1.2.1 leeg.
    3. Zodra de absorptie bij 600 nm 0,5-1,0 bereikt tussen induceren Tret expressie door toevoeging van 750 gl 1 M oplossing arabinose (1 mM eindconcentratie) aan de kweek. Breng de kolf in de incubator en schud de nacht bij 37 ° C x 200 rpm.
  3. Pellet en lyseren de Tret expressie E. coli-cellen.
    1. Breng de cultuur tot een polypropyleen bottle en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C.
    2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Breng de celsuspensie om een ​​50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en doorgaat naar een lysis (stap 1.3.4) cel of bewaar de pellet onbepaalde tijd bij -80 ° C.
    4. Los 1 proteaseremmer mini-tablet in 20 ml wasbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0) in een 50 ml conische buis.
    5. Breng de protease-inhibitor bevattende wasbuffer het conische buis met de pellet. Vortex totdat de pellet wordt geresuspendeerd.
    6. Transfer-geresuspendeerde cellen aan een 100 ml bekerglas en lyseren de cellen door sonicatie (pulssequentie van 45 seconden aan en 45 seconden met een looptijd van 2 minuten en 15 seconden bij een amplitude van 75 procent).
    7. Transfer het lysaat om een ​​50 ml metalen conische buisen centrifugeer gedurende 60 minuten bij 15.000 xg bij 4 ° C.
    8. Verduidelijking van het lysaat door doorgang door een 0,2-0,45 urn spuitfilter in een 50 ml conische buis.
      OPMERKING: De typische concentratie lysaat verkregen 100 mg / ml.
  4. Zuiver Tret uit E. coli cellysaat via snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC).
    1. Stel de FPLC met een nikkel-affiniteitskolom (5 ml bed volume). Was de kolom met 10 ml gedeïoniseerd water of totdat de kolom vrij van verontreinigingen. Equilibreren van de kolom met 20 ml wasbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0) bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut.
    2. Laad het lysaat (20 ml) verkregen uit stap 1.3.8 op de kolom en elueer ongemerkte eiwitten met wasbuffer met een stroomsnelheid van 1 ml / min, totdat de absorptie achtergrondniveaus bereikt (typisch 80-100 ml wasbuffer vereist) .
    3. Elueren His-tag Tret door een lineaire gradient elutiebuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8,0) van 1-100% in 60 minuten bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut. Verzamel 4 ml fracties totdat Tret is uitgewassen en de absorptie basisniveau bereikt.
      OPMERKING: Gewoonlijk 60 ml elutiebuffer nodig om het eiwit te elueren en het eiwit elueerde in het 60-100% bereik elutiebuffer. Ongeveer 10-15 ml zuiver Tret in elutiebuffer worden verkregen.
    4. Bepaal de concentratie van Tret door meting van absorptie bij 280 nm tegen een blanco elutiebuffer.
  5. Exchange Tret in tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris) buffer door middel van dialyse.
    1. Na bereiding van de dialyseslang volgens de instructies van de fabrikant, eerste door spoelen met gedeïoniseerd water en vervolgens Tris buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
    2. Laad de Tret monster in de dialyse slang met behulp van een injectiespuit en stompe naald. Dialyseren 's nachts eengainst 2 L Tris-buffer.
    3. Bepaal de concentratie van Tret door meting van absorptie bij 280 nm tegen een blanco vanuit het dialyse wassen.
    4. Breng de oplossing Tret een 50 mL conische buis en ga verder met trehalose analoge synthese (stap 2) of bewaar het enzym bij 4 ° C.
      LET OP: Tret is een thermostabiel eiwit. De Tret werd opgeslagen in Tris-buffer bij 4 ° C gedurende enkele maanden zonder inachtneming significant activiteitsverlies.

2. Een stap Synthese van Trehalose analogen gebruik van Tret Enzyme

OPMERKING: De onderstaande protocol beschrijft een reactieschaal basis van 4 ml volume, dat ongeveer 15-30 mg trehalose analoog kan leveren afhankelijk reactierendement en het molecuulgewicht van het product. De reactiecomponenten kunnen worden geschaald op min of meer analoge trehalose te verkrijgen indien gewenst.

  1. Voeg glucose-analogon (0,080 mmol, massa zal afhangen van het molecuulgewicht), UDP-glucose (0.160 mmol, 97,6 mg) en MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) teneinde een 15 ml conische buis. De uiteindelijke concentraties van deze componenten zal 20 mM, 40 mM en 20 mM, respectievelijk.
  2. Voeg Tret in Tris buffer (verkregen uit stap 1.5.4) en eventueel een geschikt volume Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) tot een uiteindelijke enzymconcentratie van 300 ug / ml en een uiteindelijk bereiken volume van 4 ml. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig of omkeren van de buis om de vaste stoffen op te lossen.
  3. Incubeer de reactie bij 70 ° C onder schudden bij 300 rpm gedurende 1 uur en zet de buis op ijs te koelen.

3. Zuivering van trehalose analogen van ruwe enzymatische reactie Mengsel

  1. Voorspoelen een centrifugale filtereenheid (nominaal molecuulgewicht grens (NWML) 10 kDa) om sporen glycerol te verwijderen uit het membraan door het toevoegen van 3 ml gedeïoniseerd water om de centrifugale filtereenheid en centrifugeren bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filterin de buis (ongeveer 20 min). Herhaal nog tweemaal. Vul deze stap onmiddellijk vóór of tijdens de reactie (stap 2,3).
  2. Na afkoelen van het enzymatische reactiemengsel (verkregen bij stap 2,3), mogelijk in de pre-gespoeld centrifugale filtereenheid. Spoel de reactiebuis met 1 mL gedeïoniseerd water en breng de centrifugale filtereenheid. Herhaal spoelen van de reactiebuis voor maximale terugwinning van product.
  3. Centrifugeer de centrifugale filtereenheid bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filter in de buis (ongeveer 20 min). Spoel de bovenste kamer van de centrifugale filtereenheid met 3 ml gedeïoniseerd water en centrifugeer bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filter in de buis (ongeveer 20 min). Herhaal het spoelen voor een maximale herstel van het product.
  4. Gooi de bovenste kamer van de centrifugale filter unit. Add gemengd bed ionen-uitwisselingshars (3 g) aan het filtraat op de bodem van de buis (typische filtraat volUme is 8-15 ml, afhankelijk van het aantal spoelingen). Roer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met een magnetische roerstaaf met een snelheid die voldoende is om de harskorrels gesuspendeerd in de oplossing te houden.
  5. Decanteer het supernatant en filteren om de hars te verwijderen. Voeg 5 ml gedeïoniseerd water om de resterende hars te spoelen. Decanteer het supernatant en filteren, te combineren met de productoplossing uit het eerste decantatie. Herhaal spoelen van de hars voor maximale terugwinning van product.
  6. Analyseer de reactie door dunne laagchromatografie (TLC) of HPLC te bepalen of volledige omzetting van de glucose-analoog uitgangsmateriaal trehalose analoge product werd verkregen. Zie stap 4.1 voor TLC-analyse en stap 4.2 voor HPLC-analyse.
  7. Verwijderen water door vriesdrogen of rotatieverdamping het gedroogde product. Indien geen ongereageerde glucose analoge tijdens TLC of HPLC-analyse werd waargenomen, zuivering door chromatografie onnodig. Weeg het product aan het reactiemengsel verkrijgen yield en voert kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopische analyse (stap 4,3) aan productstructuur en zuiverheid bevestigt.
  8. Als ongereageerde glucose analoge tijdens TLC-analyse werd waargenomen, scheiden van de trehalose analoge toepassing van een gelfiltratiekolom.
    1. Bereid een 1 x 100 cm kolom met gedeïoniseerd water verzadigde, extra fijne P2 polyacrylamide korrelgrootte uitsluitingsmedia volgens de instructies van de fabrikant.
      LET OP: De grootte exclusie kolom kan worden hergebruikt na het wassen met gedemineraliseerd water.
    2. Opnieuw oplossen van het gedroogde enzymreactie product (verkregen uit stap 3.7) in 0,5 ml gedeïoniseerd water. Breng de productoplossing de gelfiltratiekolom handmatig of met behulp van een kolom flowadaptor. Spoel het flesje dat het ruwe product met een andere 0,5 ml gedeïoniseerd water bevatte en laden in de gelfiltratiekolom.
    3. Elueer product met gedeïoniseerd water door zwaartekracht en laat fracties van ongeveer 2 mL volume.
    4. Analyseer de fracties volgens TLC (stap 4,1). Verzamel de fracties die zuiver trehalose analoog.
    5. Verwijderen water door vriesdrogen of rotatieverdamping het gedroogde product. Weeg het product om de reactie opbrengst en ga verder met NMR analyse (zie stap 4,3).

4. Analyse van Trehalose Analoog Producten

  1. Analyse uitvoeren dunnelaagchromatografie (TLC) van Tret reactie.
    Opmerking: Deze procedure kan ook worden gebruikt om gelfiltratiekolom fracties te analyseren. Het kan noodzakelijk zijn het reactiemengsel of kolomfracties vóór TLC analyse verbinding kleuring mbt de TLC-plaat te concentreren.
    1. Mark lanen op de TLC plaat met een potlood en analyt (en) en relevante norm (en) bij de daarvoor bestemde rijstroken, waaronder glucose analoge standaard, de trehalose analoge standaard (indien aanwezig), het reactiemengsel (of fracties verzameld size exclusion kolomzuivering), en een co-spot. Na het opbrengen elk monster op de TLC-plaat, zodat de plaat drogen.
      OPMERKING: Bij reactie analyse wordt kenmerkend 2 pl monster op DLC plaat.
    2. Ontwikkel het TLC-plaat met behulp van n-butanol / ethanol / gedemineraliseerd water (5: 3: 2).
    3. Droog de ontwikkelde TLC-plaat, dip dan 5% in H 2 SO 4 in ethanol (suiker kleuring) en verwarm op een hete plaat op de hoogste stand totdat suikerhoudende plekken kunnen worden gevisualiseerd (gewoonlijk 5 min).
  2. Voer een HPLC analyse van Tret reactiemengsels met behulp van een HPLC-systeem kan scheiden en detecteren van koolhydraten. Dit protocol gaat koolhydraten scheiding met behulp van een aminopropyl HPLC-kolom en detectie met behulp van brekingsindex.
    1. Attach aminopropyl kolom (4,6 x 250 mm) met een voorgevulde guard kolom aan de HPLC.
    2. Equilibreren aminopropyl kolom met 80% acetonitril in gedeioniseerd water met een stroomsnelheid van 0,4ml / min.
    3. Laad de oplossing van reactieproduct (of standaard) op de kolom aminopropyl.
    4. Elueer het product (of standaard) met 80% acetonitril in gedeïoniseerd water met een stroomsnelheid van 0,4 ml / min en een kolomtemperatuur van 50 ° C. Typisch, de looptijd gebruikt is 40 min.
      OPMERKING: Zowel de glucose analoge uitgangsmateriaal en het trehalose analoge product kan worden gedetecteerd door brekingsindex, hoewel andere werkwijzen zoals verdampings- lichtverstrooiingsdetectie (ELSD) worden gebruikt. Met de beschreven omstandigheden, glucose analogen typisch elueren tussen 10-15 min en trehalose analogen elueren tussen 15-25 min.
  3. NMR-analyse van gezuiverd trehalose analogen.
    1. Ontbinden gezuiverd trehalose in analoog D 2 O (700 ui) en breng de oplossing een NMR buis.
    2. Verwerven 1 H en 13C NMR spectra overeenkomstig passende NMR faciliteit protocollen.

  1. Synthetiseren, zuiveren, en te beheren 6-TreAz M. smegmatis (Msmeg).
    1. Voeg 6-azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glucose (0,040 mmol, 24,4 mg) en MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) in een 15 ml conische buis.
    2. Voeg Tret in Tris buffer (verkregen uit stap 1.5.4) tot een uiteindelijke enzymconcentratie van 300 ug / ml en een eindvolume van 1 ml te bereiken. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig of omkeren van de buis om de vaste stoffen op te lossen.
    3. Incubeer de reactie bij 70 ° C onder schudden gedurende 15 minuten.
    4. Verdun het enzymatische reactiemengsel met 3 ml gedeïoniseerd water en overbrengen naar een vooraf gewassen centrifugale filtereenheid (NMWL 10 kDa). Centrifugeer de filtereenheid bij 3000 xg tot het meeste van de vloeistof door het filter in de lengte van ongeveer 10 minuten.
    5. teruggooi the bovenkamer van de centrifugale filter unit. Add gemengd bed ionen-uitwisselingshars (0,75 g) aan de buis en roer / schudden bij kamertemperatuur gedurende 25 min. Decanteer het supernatant en filteren om de hars te verwijderen.
      OPMERKING: Stappen 5.1.1-5.1.5 bieden een waterige oplossing van 6-azido-trehalose (6-TreAz) bij ongeveer 5 mM concentratie in minder dan 1 uur. De 5 mM concentratie wordt geschat op basis van de kwantitatieve omzetting van substraat naar product en de verwatering die plaatsen neemt tijdens het zuiveringsproces stappen, uitgaande van minimaal verlies van het product tijdens deze stappen. De oplossing kan steriel gefiltreerd voor toevoeging aan een biologisch monster indien gewenst.
    6. Voeg de juiste hoeveelheid van 6-TreAz product oplossing voor een log-fase kweek van M. smegmatis (Msmeg), doorgaans naar een uiteindelijk cultuur volume van 100-1000 pi en een laatste 6-TreAz concentratie van ~ 25 pm te bereiken. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende de gewenste tijd, gewoonlijk 60 minuten.
  2. Voer op chemie een fluorofoor-gelabelde cellen azide conjugeren. In dit protocol gebruiken Cu-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) een fluorofoor celoppervlak aziden leveren Msmeg.
    1. Centrifugeer de cellen bij 3900 g gedurende 5 minuten en daarna wassen van de cellen met PBS bevattende 0,5% runderserumalbumine. Herhaal tweemaal.
    2. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 4% para-formaldehyde in PBS om ze op te lossen. Na incubatie gedurende 10 min Herhaal stap 5.2.1 om de cellen te wassen.
    3. Re-schorten gepelleteerde cellen in 138 pi PBS.
    4. Voeg 3 ul van een 1 mM voorraadoplossing van alkyn-carboxyrhodamine 110 (Acetyleenalkoholen-488) in DMSO.
    5. Voeg 3 ul van een vers bereide 60 mM voorraadoplossing van natriumascorbaat in gedeïoniseerd water.
    6. Voeg 3 ul van een 6,4 mM voorraadoplossing van tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA) in tert-butanol / dimethylsulfoxide (DMSO) 4: 1.
    7. Voeg 3 & #956, L van een 50 mM voorraad oplossing van CuSO4 in gedemineraliseerd water.
    8. Pipet de celsuspensie op en neer, daarna incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    9. Herhaal stap 5.2.1 om de cellen te wassen. Resuspendeer de cellen in 150 pi PBS.
  3. Voer cellulaire fluorescentie analyse. In dit protocol gebruiken fluorescentiemicroscopie cellulaire fluorescentie van gemerkte Msmeg visualiseren.
    1. Voeg 10 ul van bacteriële cellen gesuspendeerd in PBS tot een microscoopglaasje uitgespreid en licht de vloeistof in een dunne laag met de rand van een dekglaasje. Laat droog in het donker aan de lucht.
    2. Voeg 10 ul van montage medium over de gedroogde monster, leg deksel bevestiging over het monster en toe te passen lijm (bijv nagellak) te immobiliseren.
    3. Beeld de glaasjes met een fluorescentiemicroscoop bij 100x vergroting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

T. tenax Tret werd verkregen van E. coli in een opbrengst van ongeveer 4 mg / l gebruikt standaard eiwitexpressie en zuiveringstechnieken. Eén nikkel affiniteitschromatografiestap volstond om Tret zuiveren uit E. coli-lysaat (vertegenwoordiger FPLC spoor wordt getoond in figuur 4). Zoals vermeld in onze eerste publicatie op Tret synthesewerkwijze, recombinante T. tenax Tret is in staat om een brede variatie glucose-analoga waarvan vele commercieel verkrijgbare de corresponderende trehalose afgeleiden met hoog rendement 19. Tabel 1, die-HPLC bepaald reactieopbrengsten geeft voor een aantal uitgangspunten glucose analogen in onze initieel gerapporteerde protocol illustreert de reikwijdte van Tret het substraat promiscuïteit en de geschiktheid voor synthese. Diverse structurele wijzigingen, met inbegrip van fluor, deoxy-, azido-,thio- en stereochemische wijzigingen op verschillende plaatsen rondom de suikerring goed verdragen door het wild-type enzym, met de belangrijkste uitzondering wijzigingen op de 4-plaats.

figuur 4
Figuur 4: Representatieve resultaten voor Tret zuivering door FPLC. Zuivering van recombinant T. tenax Tret uit E. coli lysaat werd uitgevoerd met nikkel affiniteitschromatografie zoals beschreven in de stappen 1.4.1-1.4.4. Blauw, ultraviolet (UV) sporen; lichtgroen, concentratie van de elutiebuffer; donkergroen druk. De piek die overeenkomt met Tret is aangegeven met een pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Tabel 1: Representatieve opbrengsten voor de Tret reactie. HPLC bepaald en geïsoleerde opbrengsten van de reactie Tret enkele trehalose analogen. ND, niet gedetecteerd. - Geeft aan dat de reactie werd niet uitgevoerd op een semi-preparatieve schaal met behulp van de geoptimaliseerde protocol. * Geeft aan dat een grootte-uitsluitingschromatografie stap nodig was. Horizontale scheidslijnen te scheiden van de positie van de wijziging op de trehalose suiker ring. Tabel aangepast uit referentie 19 met toestemming; bijgewerkt om geïsoleerde opbrengsten uit dit werk op te nemen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Hierin beschrijven we optimalisaties onze oorspronkelijke protocol dat de algehele efficiëntie en snelheid van de Tret synthese te verbeteren. Terwijl het oorspronkelijke protocol 10 mM glucose eenloog en 40 mM UDP-glucose, werd vastgesteld dat vergelijkbare omzetting kan worden verkregen met 20 mM glucose en 40 mM UDP-glucose, verdubbelt de hoeveelheid product gegenereerd per reactie en de verspilling van UDP-glucose, hetgeen relatief duur beperken . Met behulp van equimolaire hoeveelheden glucose analoge en UDP-glucose resulteerde in lagere conversies. Desgewenst kan reactietijden worden verkort tot minder dan de oorspronkelijk gerapporteerde 60 min terwijl vergelijkbare conversie behouden vele analogen, die blijkt uit de kwantitatieve omzetting van 6-GlcAz tot 6-TreAz slechts 15 minuten bij 70 ° C ( figuren 5 en 6).

Het zuiveringsprotocol dit formulier wordt aanzienlijk verbeterd, vervanging van de oorspronkelijke enzym precipitatie / silicagelchromatografie werkwijze met een niet-chromatografische rotatie dialyse / ionenuitwisseling methode. De reden voor deze modificatie is dat de Tret reaction mengsel bestaat volledig uit ionische soorten, behalve voor de neutrale trehalose analoge product. Derhalve kan het mengsel van roterend gedialyseerd enzym te verwijderen en vervolgens behandeld met een gemengd bed ionenuitwisselingshars om alle ionen te verwijderen, levert gezuiverd analoog trehalose in waterige oplossing in slechts 45 min. Dit alles waterige zuiveringswerkwijze vermijdt milieubelastende organische oplosmiddelen, tijdrovende verdamping en filtratiestappen en droog-load silicagel chromatografie, wat een langzame en moeizaam proces, vooral voor niet-chemici. Voor Tret reacties die kwantitatieve omzetting vertonen zoals bepaald met de beschreven TLC of HPLC-analyse, deze zuiveringswerkwijze verschaft geïsoleerde opbrengst van ongeveer 60-80% op de gerapporteerde reactieschaal, met productverlies waarschijnlijk door binding van wat suiker aan het ionuitwisselende hars (zie tabel 1 voor representatieve geïsoleerde opbrengsten). Wanneer ongereageerde glucose analoog blijft,kan worden gescheiden van het gewenste analoge trehalose product op een polyacrylamide-bead based gelfiltratiekolom, geëlueerd met water. Indien gewenst, kan dit ook worden bereikt met gebruik van preparatieve schaal HPLC kolom met aminopropyl. Productzuiverheid kan worden beoordeeld met TLC, HPLC en / of NMR-spectroscopische analyse. Figuur 5 toont representatieve analysegegevens voor 6-TreAz, die via de beschreven protocol werd gesynthetiseerd. De TLC en HPLC gegevens gaven kwantitatieve omzetting van 6-GlcAz substraat 6-TreAz product van deze reactie, en de geïsoleerde opbrengst na de spin dialyse / ionenuitwisseling zuiveringsstappen was 58%. 1 H en 13C NMR spectroscopische analyse bevestigde de structuur van de 6-TreAz product, met name zoals α, α-stereochemie van de nieuw gevormde glycosidische binding, en de zuiverheid.

figuur 5 Figuur 5: Representatieve analytische data voor de Tret reactie. (A) en TLC (B) HPLC-analyse van Tret gekatalyseerde omzetting van 6-GlcAz tot 6-TreAz. (C) 1H NMR en (D) 13 C NMR-spectra van de 6-TreAz verkregen na centrifugeren dialyse / ionenwisseling zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gezien voornoemde waarde van trehalose analogen voor de specifieke detectie van M. tuberculosis, dient de Tret proces de ontwikkeling en het gebruik van trehalose-probes voor tuberculose onderzoek en diagnostische toepassingen te vergemakkelijken. Om dit type toepassing te demonstreren, gebruikten we de geoptimaliseerde TretWerkwijze snel bereiden, te zuiveren en te beheren 6-TreAz-a-trehalose gebaseerde click chemie probe 9 -de mycobacteriën te fluorescentiedetectie mogelijk (workflow en representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 6). Kort samengevat, Tret werd gebruikt voor commerciële 6-GlcAz converteren naar 6-TreAz kwantitatief in 15 min, en vervolgens werd het reactiemengsel onderworpen aan de spin dialyse / ionenuitwisseling zuiveringswerkwijze, die slechts 45 minuten duurde (veelvoudige spoelen stappen weggelaten toenemen snelheid). Aldus wordt een waterige voorraadoplossing van zuiver 6-TreAz van bekende concentratie (~ 5 mM) werd geproduceerd in slechts 1 uur. De 6-TreAz monster werd direct toegediend aan een groeiende kweek van het model bacterie Msmeg (uiteindelijke 6-TreAz concentratie ~ 25 uM) om azide etikettering van het celoppervlak die een handgreep geïntegreerd voor click-chemie bemiddelde ligatie 20, 21 of verwezenlijken een fluorescerende probe. Hierop volgend,gelabelde cellen werden geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie, die een sterke fluorescentie vertoonde voor 6-TreAz-behandelde cellen. Zoals verwacht, werden controlemonsters die niet werden behandeld met 6-TreAz of die missen een functioneel trehalose transporteur 22, die nodig is voor 6-TreAz opname en metabole inbouw 9 vertoont geen fluorescentie.

figuur 6
Figuur 6: Representatieve resultaten voor de snelle detectie van mycobacteriën met een Tret-trehalose gesynthetiseerd analoog. (A) workflow voor snelle synthese, zuivering en gebruik van 6-TreAz voor fluorescentiedetectie van Msmeg. 5.1.1-5.1.6 stappen van het protocol gebruikt te synthetiseren en te zuiveren 6-TreAz (die een ~ 5 mM waterige oplossing in 1 uur), vervolgens toedienen leven Msmeg aan metabolisch merken van het celoppervlak met aziden bereiken. Vervolgens wordt, zoals beschreven in de stappen 5.2.1-5.2.9 op chemie (CuAAC) werd uitgevoerd aan celoppervlak aziden reageren met een alkyn-gemodificeerde fluorofoor, alkyn-488. (B) Fluorescentie beeldvorming van 6-TreAz behandeld Msmeg met een functionele trehalose transporter (wild type en Δ sugC :: sugC) toonde sterke fluorescentie, terwijl de controlemonsters van Msmeg onbehandeld of ontbreekt de trehalose transporter (Δ sugC) niet . Figuur aangepast van referentie 19 met toestemming; bijgewerkt met workflow en beeldgegevens van de verbeterde Tret protocol. Schaalbalken, 5 urn. alsjeblieftklik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trehalose analogen hebben het potentieel om verschillende gebieden beïnvloeden, van conservering van voedsel en medicijnen tot diagnose en behandeling van microbiële infecties 6. Bestaande meerstaps chemische synthese werkwijzen bruikbaar voor het produceren van complexe trehalose afgeleiden met meerdere plaatsen van modificatie (bijvoorbeeld natuurlijk voorkomende complexe mycobacteriële glycolipiden). Deze werkwijzen zijn steevast lang en inefficiënt, zelfs wanneer toegepast op de synthese van trehalose betrekkelijk eenvoudige monogesubstitueerde analogen 9, 13, 14. Alternatieve syntheseroutes nodig om snel en efficiënt produceren verschillende soorten trehalose analogen die waarde in de bovengenoemde gebieden kan hebben. Biokatalytische benaderingen die-trehalose synthese van enzymen uit de natuur te benutten houdt u de meest belofte. Hoewel verscheidene trehalose synthese routesbestaan in de natuur, beschouwen we Tret uit T. tenax 18 de ideale enzym trehalose analoge synthese om verschillende redenen.

Tret van T. tenax thermostabiel, zodat reacties worden verwarmd verbeterde snelheid en voor het voorkomen van microbiële besmetting in grootschalige productie-instellingen. Tret van T. tenax is een unidirectionele enzym dat niet kunnen afbreken trehalose. Tret van T. tenax vatbaar is voor expressie en zuivering uit E. coli, en de verzending en opslag gemakkelijk. De Tret reactie is een enkele stap en het gaat om de eenvoudige substraten glucose en UDP-glucose. Een groot aantal structureel / functioneel diverse glucose analogen zijn verkrijgbaar bij talrijke commerciële leveranciers. UDP-glucose is een relatief goedkope glucose donor, vooral in vergelijking met de TREP donor β-D-glucose 1-fosfaat. Tret van T. tenax heeft hoge promiscuity het glucosesubstraat structuur, zodat verschillende trehalose analogen toegankelijk. Product zuivering uit de Tret reactiemengsel snel en ongecompliceerd.

Hierin hebben we melding gemaakt van een gedetailleerde geoptimaliseerd protocol voor trehalose analoge synthese, dat speelt in op de bovengenoemde positieve eigenschappen van de Tret enzym. De Tret werkwijze kan worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van zuiver trehalose analogen op semi-preparatieve schaal (10-100 mg), hoewel extra opschaling mogelijk moet zijn indien gewenst. Talrijke typen analogen toegankelijk in onze vroegere en huidige werk, waaronder azido-, deoxy-, fluor- en thio-trehaloses, alsmede trehalose stereoisomeren, maar andere modificaties mogelijk zijn (bijvoorbeeld stabiele isotoop gemerkt en radioactief gemerkt trehaloses zijn van bijzonder belang). De synthese en zuivering stappen van de Tret proces operationeel eenvoudig en kan gemakkelijk uitgevoerd door personen die niet zijn opgeleid in synthetische che worden uitgevoerdMistry. Een van de aantrekkelijke kenmerken van het Tret werkwijze is dat zowel de synthese en zuivering stappen kunnen worden uitgevoerd in een zeer korte tijd, variërend van 1-4 uur, afhankelijk van het aantal wasstappen gewenste (opmerking: als gelfiltratiekolom zuivering is nodig om het product trehalose analoge scheiden van ongereageerde glucose analoge gebruiksomstandigheden, de totale tijd tot ongeveer 2 dagen, hetgeen nog steeds aanzienlijk sneller dan de bestaande werkwijzen voor analoge trehalose synthese).

Hoewel het Tret proces is de meest efficiënte enzymatische route om toegang trehalose analogen Nog gemeld, heeft het een aantal nadelen die kans oog op een verhoogde verschaffen. Ten eerste, hoewel UDP-glucose is relatief goedkoop in vergelijking met andere donors suiker, de efficiëntie van de Tret werkwijze kan verder worden verbeterd door koppeling met een enzymatische synthese van UDP-glucose uit een goedkopere, bijvoorbeeld α-D-glucose 1- fosfaat, of door identifying een goedkoop surrogaat voor UDP-glucose. Een tweede mogelijke beperking van deze werkwijze is dat de reactie scope uiteindelijk onder het substraat tolerantie van Tret. Terwijl de tolerantie van wildtype Tret vrij hoog (zie tabel 1), kunnen sommige analoga niet worden gesynthetiseerd via deze methode (bijvoorbeeld 4-positie-gemodificeerde analogen). Daarom zal gemanipuleerde versies van Tret substraat met verhoogde tolerantie waardevol zijn. Ten derde, terwijl veel Tret-gekatalyseerde reacties doorgaan met kwantitatieve conversie, lagere conversie vereist een chromatografische zuiveringsstap. In dit protocol, concentreren we ons op een relatief langzame size exclusion voortgezet omdat het goedkoop is, vereist geen speciale apparatuur, en kan uitsluitend worden uitgevoerd met water elutie. Alternatief zou HPLC zuivering onder toepassing van een preparatieve schaal aminopropyl kolom worden gebruikt als een snellere methode voor productzuivering. Ondanks een aantal van deze beperkingen, de Tret proces biedteen krachtig platform voor de snelle en efficiënte voorbereiding van de trehalose-analogen, en moeten hun evaluatie en de toepassing ervan in de bio (techno) logisch en biomedisch gebied te versnellen. Toekomstige verbeteringen in het proces Tret, hierboven besproken, verder zal versterken onderzoek en toepassingen in verband met trehalose en zijn derivaten.

Trehalose analogen potentiële waarde in verschillende gebieden. Zoals vermeld in de inleiding, wordt natuurlijke trehalose voor biopreservation en voedsel zoet- toepassingen, zodat trehalose afgeleiden met eigenschappen zoals afbraak resistentie aantrekkelijk. Bovendien verschillende stabiele isotoop gemerkt en radioactief gemerkte versies van natuurlijke trehalose zijn commercieel verkrijgbaar voor onderzoeksdoeleinden en de Tret proces kan zeker zorgen voor een snelle en efficiënte toegang tot deze moleculen. Trehalose analogen zijn ook van belang voor het richten pathogenen met probes en remmers omdat trehalose afwezigheid van zoogdieren. Eén applicatie in dit gebied dat van bijzonder belang is de detectie van mycobacteriën. M. tuberculosis, de verwekker van tuberculose, waarvan 1,5 miljoen doden per jaar, bevat unieke trehalose-verwerkingsroutes die afwezig zoogdieren. Bijvoorbeeld, de trehalose-recycling vervoerder en downstream enzymen die trehalose te nemen in de buitenste membraan-resident glycolipiden niet aanwezig zijn bij zoogdieren 22. Gericht op deze mycobacteriën-specifieke machines met detecteerbare trehalose analogen vertegenwoordigt een aantrekkelijke benadering voor in vivo beeldvorming van M. tuberculosis-infectie in modelsystemen en mogelijk menselijke patiënten. Sterker nog, de bovenstaande voorbeelden van FITC-keto-trehalose en TreAz (Figuur 1B) de weg geëffend voor dergelijke ontwikkelingen 8, 9. Om toegang te krijgen van deze tools om de onderzoeksgemeenschap te vergemakkelijken, we hierin melding gemaakt van een protocol voor het snel synthesizING en het gebruik van 6-TreAz om de afbeelding mycobacteriën in combinatie met click chemie.

Dit protocol kan worden aangepast voor de ontwikkeling van andere detecteerbare trehalose analogen die bruikbaar zijn voor tuberculose diagnostische toepassingen kunnen zijn. Bijvoorbeeld Barry en Davis eerst het eventuele gebruik van 18F-fluor-trehalose als een positron emissie tomografie (PET) probe voor in vivo beeldvorming van mycobacteriële infectie 8 voorgesteld. De Tret proces kan ideaal voor het realiseren van dit doel zijn. Tret kan snel en kwantitatief genereren van 2-fluor-trehalose van 2-fluor-glucose (zie tabel 1), die van cruciaal belang omdat 18 F-2-fluor-glucose kortstondige (18 F halfwaardetijd = 110 min ), noodzakelijk zeer snel chemie. Bovendien 18 F-2-fluor-glucose gemakkelijk beschikbaar omdat deze reeds in de kliniek voor PET beeldvorming van tumoren gebruikt. Gebruik van de beschreven werkwijze voor de Tret develing van 18F-fluor-trehalose en andere trehalose analogen voor verschillende toepassingen is momenteel in onze laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB agar Research Products International L24021
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
Luria broth Research Products International L24045
Terrific Broth Research Products International T15050
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256
Phosphate-buffered Saline GE Healthcare SH30256
Imidazole Sigma Aldrich I5513
Sodium chloride BDH BDH9286
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific S374
Syringe filter, 0.45 µm Fisher Scientific 09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free Thermo Scientific 88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL GE Healthcare 17-5248-02
TRIS base ultrapure Research Products International T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 Fisher Scientific 21-152-16
Glucose analogues CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) CarboSynth MA02620
UDP-Glucose abcam Biochemicals ab120384
Magnesium chloride hexahydrate  Fisher Scientific M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit EMD Millipore UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin Bio-Rad 444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media Bio-Rad 150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates EMD Millipore 1056280001
n-Butanol Fisher Scientific A399
Ethanol Fisher Scientific S25310A
Sulfuric acid Fisher Scientific A300
Acetonitrile EMD Millipore AX0145
Deuterium oxide, 99.8% Acros Organics 351430075
Aminopropyl HPLC column Sigma Aldrich 58338
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 5470
Para-formaldehyde Ted Pella 18505
Alkyne-488 Sigma Aldrich 761621
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Click Chemistry Tools 1061
tert-Butanol Sigma Aldrich 360538
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich W387520
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotechnology 10001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
  2. Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
  3. Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
  4. Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
  5. Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
  6. Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
  7. Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
  8. Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
  9. Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
  10. Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
  11. Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
  12. Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
  13. Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
  14. Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
  15. Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
  16. Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
  17. Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
  18. Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
  19. Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
  20. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
  21. Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  22. Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).

Tags

Biochemie trehalose analoog enzymatische synthese trehalose synthase Tret mycobacteriën tuberculose klik chemie fluorescentie
Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meints, L. M., Poston, A. W.,More

Meints, L. M., Poston, A. W., Piligian, B. F., Olson, C. D., Badger, K. S., Woodruff, P. J., Swarts, B. M. Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues. J. Vis. Exp. (120), e54485, doi:10.3791/54485 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter