Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/54485
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, 2Department of Chemistry, University of Southern Maine

Abstract

מבחינה כימית גרסאות מותאמות של trehalose, או אנלוגים trehalose, יש יישומים בביולוגיה, ביוטכנולוגיה, ומדע התרופות, בין שדות אחרים. למשל, אנלוגים trehalose נושאות תגים לזיהוי שימשו לגילוי שחפת Mycobacterium ייתכן יישומים כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. גרסאות יציבה hydrolytically של trehalose גם אלה נשאפים בשל הפוטנציאל שלהם לשמש ממתיקים שאינם הקלורי וסוכני מוגני ביו. למרות הערעור של מש' זו של חומרים עבור יישומים שונים, את הפוטנציאל שלהם נשאר בלתי ממומש בשל חוסר מסלול חזק לייצור שלהם. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט לסינתזת biocatalytic צעד אחד המהירה ויעילה של אנלוגים trehalose שעוקפת את הבעיות קשורות סינתזה כימית. על ידי ניצול של synthase trehalose thermostable (TreT) האנזים מן Thermoproteus Tenax, אנלוגים trehalose יכול להיות generatאד בשינה בצעד אחד לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז דיפוספט uridine בתשואה גבוהה (עד מרה כמוני) ב 15-60 דקות. פרוטוקול טיהור פשוט ומהיר ללא chromatographic, אשר מורכב של דיאליזת ספין חילוף יונים, יכול לספק אנלוגים trehalose רבים של ריכוז ידוע בתמיסה מימית קטן כמו 45 דקות. במקרים בהם אנלוגי גלוקוז unreacted עדיין נשאר, טיהור chromatographic של המוצר אנלוגי trehalose יכול להתבצע. בסך הכל, שיטה זו מספקת פלטפורמת biocatalytic "ירוקה" לסינתזה המזורזת וטיהור אנלוגים trehalose כי הוא יעיל ונגיש-כימאים לא. כדי להדגים את תחולתה של שיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה, כל-מימית טיהור, והמינהל של בדיקה הכימיה לחץ מבוסס-trehalose כדי mycobacteria, שכולן לקח פחות משעה 1 ואפשרה גילוי הקרינה של mycobacteria. בעתיד, אנו צופים כי, בין othאה יישומים, פרוטוקול זה ניתן להחיל את הסינתזה המהירה של בדיקות מבוססות trehalose לאבחון שחפת. למשל, נמשך זמן קצר אנלוגים trehalose שונים-רדיונוקלידים (למשל, 18 F-modified trehalose) יוכל לשמש עבור שיטות הדמיה קליניות מתקדמות כגון טומוגרפיה-טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT).

Introduction

Trehalose הוא דו סוכר סימטרי הלא צמצום מורכב משני moieties גלוקוז כי מצטרפים (איור 1 א) 1,1-α, α-glycosidic אג"ח. בעוד trehalose נעדר בני אדם ויונקים אחרים, הוא נפוץ למצוא חיידקים, פטריות, צמחים, וחסרי חוליות 1. התפקיד העיקרי של trehalose ברוב האורגניזמים הוא להגן מפני לחצים סביבתיים, כגון התייבשות 1. בנוסף, פתוגנים אנושיים מסוימים דורשים trehalose עבור ארסיות, כולל שחפת Mycobacterium גרימה-שחפת, אשר מנצלת trehalose כמתווך של ביוסינתזה מעטפת תא כאבן בניין לבניית glycolipids אימונו-2.

איור 1
איור 1: trehalose ו אנלוגים trehalose. (אמבנים) של trehalose הטבעי באנלוג trehalose טבעי, כאשר X הוא שינוי מבני. (ב) דוגמאות של אנלוגים trehalose מהמדווח בספרות כי יש יישומים פוטנציאליים biopreservation ו bioimaging.

בשל המבנה פיסיולוגי הפונקציות הייחודיים שלה, trehalose משך תשומת לב משמעותית לשימוש ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו 3. מאפייני המגן של trehalose שנצפתה Nature-למשל, היכולת המרשימה שלה כדי לסייע לקיים חיים בצמחים "תחיית מתים" שעברו התייבשות קיצונית 4 -האם דרבנו השימוש הנרחב שלה ביישומי biopreservation. Trehalose נעשה שימוש כדי לשמור על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כגון חומצות גרעין, חלבונים, תאים ורקמות 3. למשל, trehalose משמש כתוסף מייצב מספר t תרופותכובע הנמצא בשוק, כולל נוגדנים חד שבטיים כמה אנטי סרטניים 3. כמו כן, trehalose משמש כממתיק בתעשיית המזון, וזה נעשה שימוש נרחב לשימור מוצר בשתי תעשיות המזון והקוסמטיקה. אימוץ trehalose עבור סוגים אלה של יישומים מסחריים בתחילה היה מוגבל על ידי חוסר היכולת להשיג בכמויות גדולות של trehalose הטהור ממקורות טבעיים או באמצעות סינתזה. עם זאת, תהליך אנזימטי יעיל לייצור החסכוני של trehalose מעמילן פותח לאחרונה, אשר דרבן השימוש המסחרי הנרחב שלו 5.

מבחינה כימית שונה נגזרות של trehalose, תיקרא להלן אנלוגים trehalose, צברו תשומת לב גוברת עבור יישומים שונים (מבנה גנרי שמוצג באיור 1 א; דוגמאות ספציפיות של אנלוגים trehalose שמוצג באיור 1) 6. לדוגמה, לקטו-trehalose הוא אנלוגי trehalose עם אחת מיחידות גלוקוז שלה מוחלף עם גלקטוז, ובכך קבוצת הידרוקסיל 4-עמדתה בעל תצורה stereochemical הפוכה. יש לקטו-trehalose אותו במאפייני הייצוב כמו trehalose אבל הוא עמיד השפלה ידי אנזימים במעיים, מה שהופך אותו אטרקטיבי כתוסף מזון שאינו הקלורי 6, 7.

העניין של הקבוצה שלנו ב אנלוגים trehalose מתייחס בעיקר לשווים כפי בדיקות ספציפיות mycobacteria ומעכבים. קבוצות בארי דייוויס פתחו אנלוגי trehalose-keto מצומדות-והעמסה, בשם FITC-קטו-trehalose, אשר הוצג מטבולית לתייג את דופן התא של שחפת חייה, מה שמאפשר זיהוי על ידי הקרינה מיקרוסקופיה 8. המעבדה Bertozzi שפותחה קטן azido-trehalose (TreAz) אנלוגים שיכול מבחינה מטבולית לתייג את דופן התא, ובהמשך להיות detected באמצעות כימיה לחץ קרינת ניתוח 9. ההתפתחויות הללו מצביעות על האפשרות של שימוש בדיקות מבוסס trehalose כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. אנלוגים trehalose יש גם רדופים כמו מעכבים מ שהחפת בשל הפוטנציאל שלהם לשבש מסלולי החיידק חיוניים כדאי ארסי 10, 11, 12.

עד כה, המכשול העיקרי לפיתוח אנלוגים trehalose עבור ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו הוא חוסר שיטות סינטטיות יעילות. שני המסלולים המסורתיים לייצור אנלוגים trehalose להסתמך על סינתזה כימית (איור 2). תוואי אחד כרוך desymmetrization / שינוי של trehalose הטבעי, ואילו השני כרוך החל אובניים בניין monosaccharide פונקציונלי כראוי וביצוע הכימי glycosylation כדילזייף את הקשר 1,1-α, α-glycosidic. גישות אלה, ואשר נדונו לאחרונה במאמרי ביקורת 13, 14, הוכיחו שימושיות עבור להשיג סינתזה רבה שלבים של כמויות קטנות של מוצרים טבעיים מורכבים המכיל trehalose, כגון -1 sulfolipid משחפת מ 15. עם זאת, שתי הגישות הן בדרך כלל לא יעילות, זמן רב, נגיש שאינם כימאים, וכן, בנוסף, אינם נחשבים להיות ידידותי לסביבה. לפיכך, סינתזת סוגים מסוימים של אנלוגים trehalose, אסטרטגיות אלה אינן אידיאליות.

איור 2
איור 2: גישות סינתזה אנלוגית trehalose. כימית גישות סינתזה אנלוגית trehalose, יוצגה בפינה השמאלית, השתמש נהלים רבים שלבים שכוללים פרוטק קשהtion / deprotection, desymmetrization, ו / או צעדים glycosylation. סינתזה אנזימתי, יוצג בפינה הימנית, משתמשת אנזים (ים) האחרונים stereoselectively להמיר מצעים פשוטים, לא מוגנים כדי trehalose אנלוגים בתמיסה מימית. פרוטוקול האנזימטית דיווחה בזאת משתמשת synthase trehalose (TreT) אנזים להמיר אנלוגים גלוקוז ו- UDP גלוקוז לתוך אנלוגים trehalose בשלב אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוואי biocatalytic יעילים אנלוגים trehalose יקלו על הייצור, הערכה, והיישום של הכיתה המבטיחה הזה של מולקולות. בעוד התהליך המסחרי אנזימטי לייצור trehalose 5 אינו מסתגל כדי לסנתז אנלוגים משום שהוא מנצל עמילן כמו מצע, יש נתיב biosynthetic אחרדרכים בטבע כי עשוי להיות מנוצלת לסינתזה אנלוגית trehalose. עם זאת, המחקר בתחום זה, אשר נסקר 6 לאחרונה, היה מוגבל. אחד הדיווחים השתמשו בשיטה בהשראת מסלול biosynthetic trehalose Escherichia coli לגשת אנלוגי fluoro-trehalose אחת מן-גלוקוז fluoro המקביל. עם זאת, גישה זו דורשת מערכה תלת-אנזים הגבילה יעילות בכלליות 8. גישה אחרת, שהיה כבר בחנה היא להשתמש phosphorylase trehalose (TreP) בכיוון ההפוך, אשר באופן עקרוני מתיר סינתזת צעד אחד של אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז-1-פוספט 6, 16, 17. למרות שגישה זו עשויה להיות הבטחה עתידית, הן TrePs ההיפוך והשמירה כרגע יש חסרונות לסינתזה אנלוגית. לדוגמה, TrePs היפוך יש expe להחרידמולקולת תורם nsive (β-D- גלוקוז 1-פוספט) ו TrePs שמירה יש תשואות ביטוי אנזים עניה / יציבות הפקרות מצע מוגבלת. שיפורים משמעותיים (למשל, באמצעות הנדסת אנזים) יהיה צורך לפני הסינתזה אנלוגית בתיווך TreP הוא מעשי.

כיום, הגישה המעשית ביותר לסינתזה האנזימטית של אנלוגים trehalose היא להשתמש synthase trehalose (TreT) אנזים, אשר ממירה דיפוספט גלוקוז uridine (UDP) -glucose לתוך trehalose בתוך יחיד בשלב 6. אנחנו דיווחנו לאחרונה על שימוש Thermoproteus Tenax TreT-אנזים thermostable ו חד כיווני 18 -כדי לסנתז אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז ו- UDP-גלוקוז (איור 3) 19. אנזים זה פועל רק בכיוון הסינטטי ימנע את הבעיה של שפלת trehalose נמצאת במערכת TreP. coul תגובה חד-שלבית זוd להסתיים 1 שעה, ועוד מגוון רחב של אנלוגים trehalose היו לגשת בתשואה גבוהה (עד> 99% כפי שנקבע על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)) מ מצעים אנלוגיים גלוקוז זמינים (ראה לוח 1 נציג התוצאות סָעִיף).

איור 3
איור 3: סינתזת צעד אחד TreT-זרז של אנלוגים trehalose. האנזים TreT מהטי Tenax יכול stereoselectively להצטרף אנלוגים גלוקוז זמינים ו- UDP גלוקוז כדי ליצור אנלוגים trehalose בצעד אחד. R 1 -R 4 = שינוי המבנים משתנים, למשל azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochemical, או שינויי תווית איזוטופי; Y = heteroatom משתנה, למשל חמצן או גופרית, או isotopically שכותרתו heteroatom.

כאן, אנו מספקים מודעהפרוטוקול etailed עבור תהליך סינתזת TreT, כוללים ביטוי וטיהור TreT מן E. coli, אופטימיזציה תנאי תגובת TreT, וכן שיטת טיהור משופרת כי מתבצעת לחלוטין בשלב המימי. פרוטוקול שונה זו מאפשר סינתזה וטיהור ומועילות ויעילה של אנלוגים trehalose המגוונים בסולם למחצה preparative (10-100 מ"ג). כמו כן, אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקול זה להכנה ונהל בדיקה מבוססת-trehalose כדי mycobacteria בתוך פחות משעה 1, הדבר שאפשרה גילוי הקרינה המהיר של תאי mycobacterial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביטוי טיהור של TreT מ coli Top10 E.

הערה: נא ליצור קשר עם הכותבים לבקש זן החיידק TreT להביע (פלסמיד pBAD TreT, המכיל את הגן ט Tenax tret בשליטת החלבון AraC, הופך Top10 E. coli 19) והסכם העברת החומר הנלווה . הפרוטוקול הבא בדרך כלל נותן תשואת חלבון של כ -4 מ"ג / L.

  1. הכן תרבות הלילה 3 מ"ל של TreT להביע E. coli.
    1. Top10 E. coli Streak הפך עם pBAD-TreT וקטור ביטוי על מרק lysogeny (LB) צלחת אגר המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.
    2. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 48 שעות.
    3. פיק מושבה אחת מהצלחת ולחסן 3 מיליליטר של מדיום נוזל LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר צינור תרבות.
    4. מניחים את הצינור בתוך חממה רועד ב 37 & #176; C x 175 סל"ד לילה.
  2. להשרות ביטוי החלבון TreT להביע E. coli.
    1. להוסיף 750 מרק נהדר מ"ל השלימו עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין בקבוק תרבות 2,800 מ"ל Fernbach. העברת 1 מ"ל מרק מהבקבוק קובט לשימוש מאוחר יותר בתור ריק.
    2. מוסיף את תרבות 3 מיליליטר הלילה שנוצרה בשלב 1.1.4 בקבוק התרבות, ולאחר מכן למקם את הבקבוק באינקובטור ולנער על 37 מעלות צלזיוס x 200 סל"ד. לבדוק מדי פעם את ספיגת התרבות ב 600 ננומטר לעומת הריק שנאסף בשלב 1.2.1.
    3. לאחר הספיגה ב 600 ננומטר מגיעה בין 0.5-1.0, להשרות ביטוי TreT על ידי הוספת 750 μL של 1 M פתרון arabinose (1 ריכוז סופי מ"מ) לתרבות. מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור ולנער לילה בשעה 37 ° C x 200 סל"ד.
  3. גלולת lyse תאי חיידק TreT להביע.
    1. מעבירים את התרבות על b פוליפרופילןottle צנטריפוגות במשך 15 דקות XG ב 4000 ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 15 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS).
    3. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant יעבור תא תמוגה (שלב 1.3.4) או לאחסן הגלולה ללא הגבלה זמן ב -80 מעלות צלזיוס.
    4. ממיסים לוח מיני 1 מעכבי פרוטאז ב 20 מ"ל של חיץ לשטוף (50 מ"מ לאא 2 PO 4, 500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ imidazole, pH 8.0) בצינור חרוטי 50 מ"ל.
    5. מעביר את החיץ לשטוף מעכב המכיל פרוטאז אל צינור החרוטים המכיל הגלולה. וורטקס עד הגלולה הוא מושעה מחדש.
    6. העבירו מחדש מושעה תאים כדי מבחנת מיליליטר 100 ו lyse התאים על ידי sonication (רצף דופק של 45 שניות על, 45 שניות את עם זמן ריצה של 2 דקות ו -15 שניות אמפליטודה של 75 אחוזים).
    7. מעבירים את lysate אל צינור חרוטי מתכת 50 מ"לו צנטריפוגות במשך 60 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. להבהיר את lysate ידי מעבר דרך פילטר מזרק 0.2-0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
      הערה: ריכוז אופייני lysate המתקבל הוא 100 מ"ג / מ"ל.
  4. לטהר TreT מן lysate תא החיידק באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC).
    1. הגדרת FPLC עם טור זיקה ניקל (נפח המיטה 5 מ"ל). לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל של מים ללא יונים או עד טור נקי מכל מזהמים. לאזן את העמודה באמצעות 20 מ"ל של חיץ לשטוף (50 מ"מ לאא 2 4 PO, 500 מ"מ NaCl, 20 imidazole מ"מ, pH 8.0) בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה.
    2. טען את lysate (20 מ"ל) המתקבל צעד 1.3.8 על הטור ו elute חלבונים לא מתוייגת עם חיץ לשטוף בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה עד ספיגת מגיע לרמות הרקע (בדרך כלל 80-100 מ"ל של חיץ לשטוף נדרשים) .
    3. Elute שלו מתויג TreT באמצעות גרם ליניאריradient של חיץ elution (50 מ"מ לאא 2 PO 4, 500 מ"מ NaCl, 250 מ"מ imidazole, pH 8.0) 1-100% מעל 60 דקות בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. אסוף 4 שברי מיליליטר עד TreT יש eluted ואת הספיגה מגיעה לרמת בסיס.
      הערה: בדרך כלל, 60 מ"ל של חיץ elution נדרשים elute החלבון, ואת החלבון elutes בטווח 60-100% חיץ elution. כ 10-15 מ"ל של TreT טהור במאגר elution מתקבלים.
    4. קבע את הריכוז של TreT על ידי מדידת ספיגת ב 280 ננומטר נגד ריק חיץ elution.
  5. המרת TreT לתוך טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חיץ על ידי דיאליזה.
    1. לאחר הכנת צינורות דיאליזה פי הוראות היצרן, הממשלה היא על ידי שטיפה עם מים ללא יונים ואז חיץ טריס (50 מ"מ טריס, 300 מ"מ NaCl, pH 8.0).
    2. טען המדגם TreT לתוך צינורות דיאליזה באמצעות מזרק מחט קהה. Dialyze בן לילהונגדי 2 ליטר של טריס חיץ.
    3. קבע את הריכוז של TreT על ידי מדידת ספיגת ב 280 ננומטר נגד ריק שנאספו מן הרחצה דיאליזה.
    4. מעבירים את הפתרון TreT צינור חרוטי 50 מ"ל ולהמשיך סינתזה אנלוגי trehalose (שלב 2) או לאחסן את האנזים ב 4 ° C..
      הערה: TreT הוא חלבון thermostable. TreT אוחסן חיץ טריס ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ללא התבוננות אובדן משמעותי של הפעילות.

2. סינתזה צעד אחד של אנלוגים trehalose שימוש אנזים TreT

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר בסולם תגובה מבוסס על 4 נפחי מיליליטר, אשר יכול לספק כ 15-30 מ"ג של אנלוגי trehalose תלוי יעיל תגובה ועל משקל מולקולרי של המוצר. רכיבי התגובה וניתן לשנותם כדי להשיג פחות או יותר אנלוגי trehalose אם ירצו בכך.

  1. להוסיף אנלוגי גלוקוז (0.080 mmol, המוני יהיה תלוי המשקל המולקולרי), גלוקוז UDP (0.160 מילימול, 97.6 מ"ג), ו MgCl 2 (0.080 mmol, 16.3 מ"ג) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל. הריכוזים הסופיים של רכיבים אלה יהיו 20 מ"מ, 40 מ"מ, ו -20 מ"מ, בהתאמה.
  2. להוסיף TreT טריס חיץ (המתקבל צעד 1.5.4), ואם יש צורך, נפח מתאים של חיץ טריס (50 מ"מ טריס, 300 מ"מ NaCl, pH 8.0) כדי להשיג ריכוז האנזים הסופי של 300 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו סופית נפח 4 מ"ל. Pipet את התערובת למעלה ולמטה בעדינות או להפוך את הצינור כדי לפזר את המוצקים.
  3. דגירה התגובה על 70 מעלות צלזיוס עם רועד ב 300 סל"ד במשך שעה 1, ולאחר מכן למקם את הצינור על קרח כדי לקרר.

טיהור 3. אנלוגים trehalose מתערובת התגובה האנזימטית גולמי

  1. טרום לשטוף יחידת מסנן צנטריפוגלי (מגבלת משקל מולקולרי הנומינלי (NWML) 10 KDA) להסיר גליצרול עקבות בקרום ידי הוספת 3 מ"ל של מים ללא יונים אל יחידת מסנן צנטריפוגלי ו centrifuging ב 3,000 XG עד שכל הנוזל עובר דרך המסנןלתוך הצינור (כ 20 דק '). חזור פעמיים נוספות. שלם צעד זה מייד לפני או במהלך התגובה (שלב 2.3).
  2. לאחר קירור תערובת התגובה האנזימטית (המתקבלת צעד 2.3), ולהעביר אותו אל יחידת מסנן צנטריפוגלי מראש שטופים. יש לשטוף את צינור התגובה עם 1 מ"ל של מים ללא יונים והעברה יחידת מסנן צנטריפוגלי. שטיפה חוזרת של צינור התגובה להתאוששות מקסימלית של המוצר.
  3. צנטריפוגה יחידת מסנן צנטריפוגלי ב 3000 XG עד שכל הנוזל עובר דרך המסנן לתוך הצינור (כ 20 דק '). יש לשטוף את החדר העליון של יחידת מסנן צנטריפוגלי עם 3 מ"ל מים צנטריפוגות deionized ב 3000 XG עד שכל הנוזל עובר דרך המסנן לתוך הצינור (כ 20 דק '). חזור שטיפה להתאוששות מקסימלית של המוצר.
  4. מחק את החדר העליון של יחידת מסנן צנטריפוגלי. להוסיף שרף מעורב-מיטת יון-חליפין (3 גרם) אל התסנין בתחתית הצינור (כרך התסנין הטיפוסיume הוא 8-15 מ"ל תלוי במספר שטיפות). מערבבים בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם בר ומערבבים מגנטי במהירות מספיק כדי לשמור על חרוזים שרף המרחפים הפתרון.
  5. למזוג supernatant ולסנן אותה להסיר את השרף. הוסף 5 מ"ל מים ללא יונים לשטוף את שרף הנותרים. למזוג supernatant ולסנן אותו, שילוב עם פתרון המוצר מן decantation הראשון. שטיפה חוזרת של שרף להתאוששות מקסימלית של המוצר.
  6. לנתח את התגובה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) או HPLC כדי לקבוע אם המרה מלאה של אנלוגי גלוקוז חומר המוצא למוצר אנלוגי trehalose הושגה. ראה שלב 4.1 לניתוח TLC צעד 4.2 לניתוח HPLC.
  7. סר מים על ידי lyophilization או אידוי סיבובי לתת המוצר היבש. אם לא אנלוגי גלוקוז unreacted נצפתה במהלך TLC או ניתוח HPLC, טיהור ידי כרומטוגרפיה הוא מיותר. לשקול את המוצר כדי לקבל את תגובת Yield ולבצע תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיות ניתוח (שלב 4.3) כדי לאשר מבנה המוצר וטוהר.
  8. אם אנלוגי גלוקוז unreacted נצפה במהלך ניתוח TLC, להפריד אותו אנלוגי trehalose באמצעות טור הדרת גודל.
    1. הכין טור 1 x 100 סנטימטרים המכיל תקשורת הדרת גודל חרוז polyacrylamide P2 רווי במי deionized, במיוחד קנס לפי הוראות היצרן.
      הערה: עמודת הדרת הגודל ניתן לעשות שימוש חוזרת לאחר שטיפה עם מים ללא יונים.
    2. Re-לפזר את מוצר התגובה האנזימטית היבש (המתקבל צעד 3.7) ב 0.5 מיליליטר של מים ללא יונים. החל פתרון המוצר לעמודת הדרת הגודל באופן ידני או באמצעות מתאם זרם טור. יש לשטוף את הבקבוקון שהכיל מוצר הגולמי עם 0.5 מיליליטר מי deionized, לטעון אותו לתוך טור דרת גודל.
    3. Elute המוצר עם מים ללא יונים על ידי זרימת כוח הכבידה ולאסוף שברים של כ -2 מ 'נפח L.
    4. לנתח את השברים על ידי TLC (שלב 4.1). פינת השברים המכילים אנלוגי trehalose טהור.
    5. סר מים על ידי lyophilization או אידוי סיבובי לתת המוצר היבש. לשקול את המוצר כדי להשיג את תשואת התגובה וממשיך ניתוח NMR (ראה שלב 4.3).

4. ניתוח של מוצרי trehalose Analogue

  1. בצעו כרומטוגרפיה-שכבה דקה (TLC) ניתוח של תגובת TreT.
    הערה: הליך זה יכול לשמש גם כדי לנתח שברי עמודת הדרת גודל. זה עשוי להיות נחוץ כדי לרכז את שברי תערובת או עמודת תגובה לפני ניתוח TLC להתבונן מכתים המתחם על צלחת TLC.
    1. מארק נתיבי על פני צלחת TLC עם עיפרון ולהחיל אנליטי (ים) ו תקן מתאים (ים) האחרונים הנתיבים המתאימים, לרבות תקן גלוקוז האנלוגי, התקן האנלוגי trehalose (אם קיימים), את תערובת התגובה (או השברים שנאספו דואר גודלטיהור טור xclusion), וא-נקודה co. לאחר החלת כל דגימה לצלחת TLC, לאפשר צלחת לייבוש.
      הערה: לקבלת ניתוח תגובה, בדרך כלל 2 μL של מדגם מוחל על צלחת TLC.
    2. לפתח את צלחת TLC באמצעות n -butanol / אתנול / מים ללא יונים (5: 3: 2).
    3. יבש את צלחת TLC המפותחות, ואז לטבול את זה ב 5% H 2 SO 4 באתנול (כתם סוכר) ומחממים על פלטה חשמלית על הגדרה גבוהה עד כתמים המכילים סוכר ניתן דמיינו (בדרך כלל 5 דקות).
  2. ביצוע ניתוח HPLC של תערובות התגובה TreT באמצעות כל מערכת HPLC מסוגל להפריד ואיתור פחמימות. פרוטוקול זה כרוך הפרדת פחמימות באמצעות טור HPLC aminopropyl וזיהוי באמצעות מקדם שביר.
    1. צרף aminopropyl עמודה (4.6 x 250 מ"מ) המכיל שומר מראש עמודת HPLC.
    2. לאזן aminopropyl עמודה עם 80% אצטוניטריל במים deionized בקצב זרימה של 0.4 mL / min.
    3. טען את הפתרון של מוצר תגובה (או רגיל) על טור aminopropyl.
    4. Elute המוצר (או רגיל) עם 80% אצטוניטריל במים deionized בקצב זרימה של 0.4 mL / min ובטמפרטורה טור של 50 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, זמן הריצה בשימוש הוא 40 דקות.
      הערה: שניהם אנלוגי גלוקוז חומר המוצא והמוצר האנלוגי trehalose יכולים להיות מזוהה על ידי קדם שביר, אם כי שיטות אחרות כגון זיהוי פיזור אור האוויר (ELSD) יוכל לשמש. שימוש בתנאים המתוארים, אנלוגים גלוקוז בדרך כלל elute בין אנלוגים 10-15 דקות trehalose elute בין 15-25 דקות.
  3. ניתוח התמ"ג של אנלוגים trehalose מטוהרים.
    1. ממיסים אנלוגי trehalose מטוהרים D 2 O (700 μL) ולהעביר הפתרון צינור NMR.
    2. רוכשת 1 H ו- 13 ספקטרום C תמ"ג פי פרוטוקולי מתקן תמ"ג מתאימים.

ילדה = "jove_title"> 5. החלת-מסונתז TreT אנלוגים trehalose כדי זיהוי של Mycobacteria

  1. לסנתז, לטהר, ולנהל 6-TreAz למ 'smegmatis (Msmeg).
    1. להוסיף glucopyranose 6-azido-6-deoxy (6-GlcAz, 0.020 mmol, 4.1 מ"ג), גלוקוז UDP (0.040 mmol, 24.4 מ"ג), ו MgCl 2 (0.020 mmol, 4.1 מ"ג) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. להוסיף TreT טריס חיץ (המתקבל צעד 1.5.4) כדי להשיג ריכוז האנזים הסופי של 300 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו נפח סופי של 1 מ"ל. Pipet את התערובת למעלה ולמטה בעדינות או להפוך את הצינור כדי לפזר את המוצקים.
    3. דגירת התגובה על 70 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 15 דקות.
    4. לדלל את תערובת התגובה האנזימטית עם 3 מ"ל של מים ללא יונים ולהעביר אותו ליחידה מסנן צנטריפוגלי מראש שטף (NMWL 10 KDA). צנטריפוגה יחידת מסנן ב 3000 XG עד שרוב הנוזל עובר דרך המסנן לתוך הצינור, כ 10 דק '.
    5. ה מחקתא דואר העליון של יחידת מסנן צנטריפוגלי. להוסיף שרף מעורבת-מיטה יון-חליפין (0.75 גר ') אל הצינור ומערבבים / שייק בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. למזוג supernatant ולסנן אותה להסיר את השרף.
      הערה: שלבים 5.1.1-5.1.5 לספק בתמיסה מימית של 6-azido-trehalose (6-TreAz) בכ -5 ריכוז מ"מ פחות מ -1 שעה. ריכוז 5 המ"מ נאמד על בסיס ההמרה כמוני של מצע למוצר ואת הדילול שלוקח מקומות במהלך השלבים לטיהור, בהנחת הפסד מינימאלי של המוצר במהלך השלבים הבאים. הפתרון יכול להיות סטרילי, מסוננים לפני בנוסף דגימה ביולוגית אם תרצה בכך.
    6. להוסיף הנפח המתאים של פתרון מוצר 6-TreAz לתרבות יומן פאזיים של מ smegmatis (Msmeg), בדרך כלל כדי להשיג נפח תרבות סופי של 100-1,000 μL וריכוז 6-TreAz סופי של ~ 25 מיקרומטר. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך פרק הזמן הרצוי, בדרך כלל 60 דקות.
  2. בצע לחץ כימיה כדי להטות fluorophore לתאים שכותרתו יזידו. בפרוטוקול זה, השתמש cycloaddition Cu-catalyzed אזיד-אלקין (CuAAC) כדי לספק fluorophore כדי azides-פני תא Msmeg.
    1. צנטריפוגה התאים ב 3,900 XG במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם PBS המכיל אלבומין 0.5% שור. חזור פעמיים.
    2. Re- להשעות את התאים pelleted ב 4% para-הפורמלין PBS לתקן אותם. לאחר דוגרים במשך 10 דקות, חזור על שלב 5.2.1 כדי לשטוף את התאים.
    3. Re- להשעות תאים pelleted ב 138 μL PBS.
    4. להוסיף 3 μL של פתרון המניות 1 מ"מ של אלקין-carboxyrhodamine 110 (אלקין-488) ב DMSO.
    5. להוסיף 3 μL של פתרון מוכן טרי 60 מ"מ המניות של ascorbate נתרן במים deionized.
    6. להוסיף 3 μL של פתרון המניות 6.4 מ"מ של טריס [(1-בנזיל-1H-1,2,3-triazol-4-י.ל.) מתיל] אמין (TBTA) ב טרט -butanol / dimethylsulfoxide (DMSO) 4: 1.
    7. הוסף 3 & #956; L של פתרון המניות 50 מ"מ של CuSO 4 במים deionized.
    8. Pipet למעלה ההשעיה תא ולמטה, ואז דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    9. חזור על שלב 5.2.1 כדי לשטוף את התאים. מחדש להשעות את התאים 150 μL PBS.
  3. ביצוע ניתוח הקרינה הסלולרית. בפרוטוקול זה, השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין קרינה סלולרית של Msmeg שכותרתו.
    1. הוסף 10 μL של תאים חיידקיים המרחפים PBS לשקופית מיקרוסקופ קלות להפיץ את הנוזל לתוך שכבה דקה באמצעות קצה coverslip. אפשר לייבוש באוויר בחושך.
    2. הוסף 10 μL של מדיום גובר על המדגם המיובש, ולאחר מכן למקם תלושים לכסות על המדגם וליישם דבק (למשל, לק) כדי לשתק.
    3. תמונה שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 100X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ט Tenax TreT התקבל בחיידק הזה תשואה של כ -4 מ"ג / L להשתמש בביטוי חלבון סטנדרטי טכניקות טיהור. צעד כרומטוגרפיה זיקת ניקל יחיד היה מספיק כדי לטהר TreT מן lysate coli (עקבות FPLC נציג מוצגות באיור 4). כפי שנקבע בפרסום הראשוני שלנו על תהליך הסינתזה TreT, רקומביננטי ט Tenax TreT הוא מסוגל להמיר רחבה של אנלוגים-רבים גלוקוז מגוון אשר הזמינים באופן מסחרי-אל אנלוגים trehalose להתכתב עם יעילות גבוהה 19. טבלה 1, אשר נותנת תשואות תגובה שנקבע HPLC במשך מספר החל אנלוגים גלוקוז באמצעות הפרוטוקול בתחילה דיווח שלנו, ממחישה את היקף הפקרות המצע של TreT והתאמת לסינתזה. שינויים מבניים שונים ומגוונים, ובהם fluoro-, deoxy-, azido-, thio-, ושינויי stereochemical בנקודות שונות סביב טבעת הסוכר הם נסבלים היטב על ידי אנזים wild-type, למעט הראשי להיות שינויים בבית-עמד 4.

איור 4
איור 4: נציג תוצאות לטיהור TreT ידי FPLC. טיהור של רקומביננטי ט Tenax TreT מן lysate החיידק בוצע באמצעות כרומטוגרפיה זיקה ניקל כמתואר בשלבים 1.4.1-1.4.4. כחולות, סגול עקבות ספיגות (UV); ירוק בהיר, ריכוז של חיץ elution; ירוק כהה, לחץ. השיא המתאים TreT מסומן בחץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ge = "1"> איור 1
טבלה 1: תשואות נציג עבור התגובה TreT. HPLC שנקבע ותשואות מבודדות של תגובת TreT עבור אנלוגים trehalose כמה. ND, לא זוהה. - מציין את התגובה לא בוצעה בסולם למחצה preparative באמצעות פרוטוקול מותאם. * מציין כי צעד כרומטוגרפיה הדרת גודל נדרש. קווים מפרידים אופקיים להפריד את עמדת השינוי על טבעת סוכר trehalose. טבלה מותאמת התייחסות 19 עם רשות; עודכן לכלול תשואות מבודדות מהעבודה הזו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

בזאת, אנו מדווחים אופטימיזציות לפרוטוקול הראשוני שלנו המשפרות את היעילות הכוללת ומהירות של תהליך סינתזת TreT. בעוד הפרוטוקול המקורי השתמשו גלוקוז 10 מ"מalogue ו -40 גלוקוז UDP מ"מ, נקבע כי המרה דומה יכולה להיות מושגת באמצעות גלוקוז 20 מ"מ ו -40 מ"מ UDP-גלוקוז, ותכפיל את כמות המוצר ביעילות שנוצר לכל תגובה וצמצום בזבוז-גלוקוז UDP, שהוא יחסית יקר . באמצעות כמויות equimolar של אנלוגי גלוקוז ו- UDP גלוקוז הביא המרות נמוכות. אם תרצה, זמני תגובה יכול גם להתקצר פחות דקות 60 דיווחו בתחילה תוך שמירה המרה דומה עבור אנלוגים רבים, אשר באה לידי ביטוי על ידי המרה כמותית של 6-GlcAz 6-TreAz רק 15 דקות ב 70 ° C ( איורים 5, 6).

פרוטוקול הטיהור דיווח בזאת הוא השתפר באופן משמעותי, החלפת שיטת ג'ל כרומטוגרפיה המקורית אנזים ממטרים / סיליקה עם דיאליזת ספין הלא chromatographic / שיטת חילוף יונים. רציונל שינוי זה הוא כי TreT rתערובת eaction מורכבת כולה מינים יוניים למעט המוצר האנלוגי trehalose הניטראלי. לכן, את התערובת יכולה להיות dialyzed לסיבוב כדי להסיר אנזים ואז שטופל שרף חילוף יונים מעורב מיטה כדי להסיר את כל מינים היוניים, ומספק אנלוגי trehalose מטוהר בתמיסה מימית קטן כמו 45 דקות. שיטת טיהור כל-מימית זה תמנע ממסים אורגניים מזיקים לסביבה, גוזל זמן צעדי אידוי סינון, כרומטוגרפיה סיליקה ג'ל יבש עומס, וזה תהליך איטי ומסורבל, במיוחד עבור כימאים לא. לתגובות TreT כי התערוכה מרה כמותיים כפי שנקבע באמצעות TLC המתואר או מנתח HPLC, שיטת טיהור זה מספקת תשואות מבודדות של כ 60-80% בקנה מידת התגובה דיווח, עם אובדן המוצר סבירה בשל מחייב של קצת סוכר על חילוף היונים שרף (ראה לוח 1 עבור תשואות מבודדות נציג). במקרים בהם אנלוגי גלוקוז unreacted נשאר,ניתן להפריד אותו מהמוצר האנלוגי trehalose הרצוי באמצעות טור הדרת גודל polyacrylamide מבוסס חרוז, משחררים עם מים. אם העדיף, זה גם יכול להיות מושלם באמצעות HPLC preparative בקנה מידה עם טור aminopropyl. טוהר מוצרים ניתן להעריך על ידי TLC, HPLC, ו / או ניתוח ספקטרוסקופיות NMR. איור 5 מציג נתונים אנליטיים נציג 6-TreAz, אשר היה מסונתז באמצעות פרוטוקול המתואר. נתוני TLC ו HPLC הצביעו מרה כמוני של מצע 6-GlcAz 6-TreAz מוצר עבור התגובה הזו, לבין התשואה המבודדת לאחר השלבים לטיהור חליפי ספין דיאליזה / יון הייתה 58%. H 1 ו -13 ניתוח ספקטרוסקופיות C NMR אישר את מבנה המוצר 6-TreAz, בעיקר כולל α, α-סטראוכימיה של קשר גליקוזידי שהוקמה זה עתה, כמו גם טוהר שלה.

איור 5 איור 5: נתונים אנליטיים נציג עבור תגובת TreT. (א) TLC ו (ב) ניתוח HPLC הגיור TreT-זרז של 6-GlcAz 6-TreAz. (ג) 1 H NMR ו- (ד) 13 C תמ"ג ספקטרום של המוצר 6-TreAz המתקבל לאחר טיהור החליפין דיאליזה ספין / יון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בהינתן ערך הנ"ל של אנלוגים trehalose עבור זיהוי ספציפי של שחפת, תהליך TreT אמור להקל על פיתוח ושימוש בדיקות מבוססי trehalose למחקר שחפת יישומים אבחוניים. כדי להדגים את זה סוג של יישום, השתמשנו אופטימיזציה TreTתהליך להכין במהירות, לטהר, ולנהל 6-TreAz-בדיקת כימיה לחץ מבוסס-trehalose 9 -כדי mycobacteria לאפשר גילוי קרינה (עבודה ונתוני נציגים מוצגים באיור 6). בקצרה, TreT שמש להמרת 6-GlcAz המסחרי 6-TreAz כמותית 15 דקות, ולאחר מכן את תערובת התגובה הייתה נתונה שיטת חליפי טיהור ספין הדיאליזה / יון, אשר לקחה רק 45 דקות (צעדי שטיפה מרובים הושמטו כדי להגדיל מְהִירוּת). לפיכך, פתרון מניות מימי של 6-TreAz הטהור של ריכוז ידוע (~ 5 מ"מ) נוצר רק 1 שעה. מניית 6-TreAz הייתה מנוהלת באופן מיידי לתרבות הגוברת של חיידק המודל Msmeg (ריכוז 6-TreAz סופי ~ 25 מיקרומטר) כדי להשיג תיוג יזיד של השטח פני התא, אשר מוטבע ידית בתיווך כימיה לחץ קשירת 20, 21 של בדיקת ניאון. לְאַחַר מִכֵּן,תאי שכותרתו נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הראה קרינה חזקה עבור תאים-TreAz שטופל 6. כצפוי, דגימות בקרה שלא טופלו 6-TreAz או שהיו חסרים טרנספורטר trehalose תפקודית 22, אשר נדרש עבור 6-TreAz ספיגת ההתאגדות מטבולית 9, לא הראו פלואורסצנטי.

איור 6
איור 6: תוצאות נציג לצורך זיהוי מהיר של mycobacteria באמצעות אנלוגי trehalose-מסונתז TreT. (א) Workflow לסינתזה המהיר, טיהור, ושימוש 6-TreAz לגילוי קרינה של Msmeg. שלבי 5.1.1-5.1.6 של הפרוטוקול שמש לסנתז ולטהר 6-TreAz (מתן ~ 5 מ"מ בתמיסה מימית ב 1 שעה), ואז לנהל את זה לחיות Msmeg להשיג תיוג המטבולית של פני התא עם azides. לאחר מכן, כמתואר בשלבים 5.2.1-5.2.9, לחץ כימיה (CuAAC) בוצעה על מנת להגיב azides פני קרום התא עם fluorophore אלקין-שונה, אלקין-488. (ב) דימות פלואורסצנטי של 6-TreAz שטופלו Msmeg המכיל טרנספורטר trehalose תפקודית (סוג בר Δ sugC :: sugC) הראו הקרינה חזקה, ואילו דגימות השליטה Msmeg אינו מטופל או חסר טרנספורטר trehalose (Δ sugC) לא . איור מותאם התייחסות 19 עם רשות; מעודכן עם נתוני עבודה והדמיה מפרוטוקול TreT השתפר. ברי סולם, 5 מיקרומטר. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנלוגים trehalose יש פוטנציאל להשפיע בתחומים שונים, החל משימור מזון ותרופות כדי אבחון וטיפול של זיהומים חיידקים 6. שיטות קיימות סינתזה כימית רבות שלבים שימושיות להפקת אנלוגים trehalose מורכבים עם מספר אתרים של שינוי (למשל, המתרחשים glycolipids mycobacterial מורכב באופן טבעי). עם זאת, שיטות אלו תמיד ממושך ובלתי יעילות, גם כאשר מוחלים על הסינתזה של אנלוגים trehalose monosubstituted הפשוטים יחסית 9, 13, 14. גישות סינטטיות אלטרנטיביות יש צורך במהירות וביעילות לייצר סוגים שונים של אנלוגים trehalose כי יכול להיות ערך בתחומים הנ"ל. גישות biocatalytic המנצלים אנזימים סינתזה-trehalose מהטבע לקיים את ההבטחה ביותר. למרות מסלולים כמה סינתזה-trehaloseקיים בטבע, אנו רואים TreT מהטי Tenax 18 להיות האנזים האידיאלי עבור סינתזה אנלוגית trehalose מכמה סיבות.

TreT מהטי Tenax הוא thermostable, המאפשר תגובות להיות מחוממות עבור מהירות משופרת למניעת זיהום מיקרוביאלי הגדרות ייצור בקנה מידה גדולה. TreT מהטי Tenax הוא אנזים חד כיווני שאינו מסוגל משפיל trehalose. TreT מהטי Tenax ניתן ביטוי וטיהור מ E. coli, המשלוח והאחסון שלו הוא קליל. תגובת TreT היא צעד אחד והיא כוללת את הגלוקוז מצעים פשוט גלוקוז UDP. מספר רב של אנלוגים גלוקוז מגוונים מבחינה מבנית / תפקודי זמין מיצרנים מסחריים רבים. UDP-גלוקוז הוא תורם גלוקוז זול יחסית, במיוחד בהשוואה-פוספט 1 TreP התורם β-D- גלוקוז. יש TreT מהטי Tenax PR גבוהomiscuity למבנה המצע גלוקוז, אנלוגים trehalose כך שונים נגישים. טיהור מוצרים מתערובת תגובת TreT היא מהירה וישירה.

בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימיזציה מפורט לסינתזה אנלוגית trehalose כי מהוון על התכונות חיוביות הנ"ל של אנזים TreT. תהליך TreT ניתן להשתמש כדי לגשת למגוון אנלוגים trehalose טהור בסולם למחצה preparative (10-100 מ"ג), אם כי בקנה מידה-אפ נוסף צריך להיות אפשרי אם רוצים. סוגים רבים של אנלוגים היו לגשת בעבודה לפני ועכשיו שלנו, כולל azido-, deoxy-, fluoro-, ו thio-trehaloses, כמו גם stereoisomers trehalose, אך שינויים אחרים כמו כן ניתן יהיה (למשל, שכותרתו איזוטופ יציב radiolabeled trehaloses הם בעלי עניין מיוחד). שלבי הסינתזה וטיהור של תהליך TreT הם פשוט מבחינה תפעולית יכולים להתבצע בקלות על ידי אנשים שאינם מאומנים che הסינטטימיסטרי. אחד המאפיינים האטרקטיביים ביותר של תהליך TreT הוא ששני צעדי הסינתזה וטיהור ניתן לבצע בתוך פרק זמן קצר ביותר, הנעים בין 1-4 שעות תלויות במספר השלבים לשטוף הרצוי (הערה: אם עמודת הדרת גודל טיהור יש צורך להפריד את המוצר האנלוגי trehalose מ אנלוגי גלוקוז unreacted, זה מגביר את הזמן הכולל לכ 2 ימים, שהוא עדיין מהיר יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות לסינתזה אנלוגית trehalose).

למרות תהליך TreT הוא הדרך האנזימטית היעילה ביותר לגישה אנלוגים trehalose דיווח עדיין, יש לו כמה חסרונות המספקים הזדמנות לשיפור בעתיד. ראשית, על אף-גלוקוז UDP הוא יחסית זול לעומת תורמים סוכר אחרים, את היעילות של תהליך TreT יכול להשתפר עוד יותר על ידי צימוד זה עם סינתזה אנזימטית של גלוקוז UDP ממקור זול, למשל, α-D-גלוקוז 1 פוספט, או על ידי identifying ממלא מקום זול-גלוקוז UDP. מגבלת פוטנציאל שנייה של שיטה זו היא כי היקף התגובה בסופו של דבר נשלט על ידי סובלנות המצע של TreT. בעוד סובלנות של TreT wild-type הוא גבוה למדי (ראה טבלה מס '1), כמה אנלוגים לא יכול להיות מסונתז בשיטה זו (למשל, 4-עמדת-modified אנלוגים). לכן, הגירסות מהונדסות של TreT בסובלנות מצע גדל תהיינה יקרות. שלישית, בעוד TreT-catalyzed תגובות רבות להמשיך המרה כמוני, המרה נמוכה מחייבת צעד טיהור chromatographic. בפרוטוקול זה, התמקדנו באמצעות תהליך הדרת גודל איטי יחסית שכן הוא זול, אינו דורש שום ציוד מיוחד, והוא יכול להתבצע אך ורק עם elution מים. לחלופין, טיהור HPLC העסיקה טור aminopropyl preparative בקנה מידה יכולה לשמש כשיטה מהר לטיהור מוצר. למרות כמה המגבלות הללו, תהליך TreT מספקפלטפורמה חזקה לעריכה המהירה ויעילה של אנלוגים trehalose, וצריכה לזרז ההערכה והיישום שלהם ביו (טכנו) שדות הגיוניים ביו. שיפורים עתידיים של תהליך TreT, שנדונו לעיל, יהיה עוד יותר לחזק את המחקר ויישומים הקשורים trehalose ונגזרותיו.

אנלוגים trehalose יש ערך פוטנציאלי בתחומים שונים. כפי שהוזכר במבוא, trehalose הטבעי משמש ליישומי המתקת biopreservation ומזון, כך trehalose אנלוגים עם תכונות כמו התנגדות שפלה עשויים להיות אטרקטיביים. בנוסף, מגוון רחב של גרסות radiolabeled שכותרתו איזוטופ היציבות של trehalose הטבעי זמין מסחריים למטרות מחקר, ותהליך TreT בהחלט יכול לספק גישה מהירה ויעילה למולקולות אלה. אנלוגים trehalose הם גם עניין למיקוד פתוגנים עם בדיקות ומעכבים מאז trehalose נעדר יונקים. ap אחתקפול בתחום זה הוא בעל עניין מיוחד הוא הגילוי של mycobacteria. מ שחפת, הסוכן סיבתי של שחפת, אשר הורג 1.5 מיליון איש בשנה, מכיל מסלולי עיבוד-trehalose ייחודיים שנעדרים מיונקים. לדוגמא, טרנספורטר trehalose-המחזור והאנזימים במורד משלבי trehalose לתוך glycolipids קרום התושב החיצוני אינם נוכחים ביונקים 22. מיקוד מכונה mycobacteria ספציפי זה עם אנלוגים trehalose לגילוי מייצג גישה אטרקטיבית הדמית in vivo של זיהום שחפת במערכות מודל ואולי בחולים אנושיים. ואכן, הדוגמאות לעיל של trehalose FITC-keto ו TreAz (איור 1B) סללו את הדרך להתפתחויות כאלה 8, 9. כדי להקל על גישה של הכלים הללו לקהילת המחקר, דיווחנו במסמך זה פרוטוקול במהירות synthesizing ושימוש 6-TreAz כדי mycobacteria תמונה בשילוב עם הכימיה לחץ.

פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לפיתוח אנלוגים trehalose לזיהוי אחרים שעשויה להיות שימושי עבור יישומי אבחון שחפת. למשל, בארי דיוויס הציע את השימוש הראשון האפשרי של 18 F-fluoro-trehalose בתור טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) בדיקה בתחום ההדמיה vivo של זיהום mycobacterial 8. תהליך TreT עשוי להיות אידיאלי למימוש מטרה זו. TreT מסוגל במהירות וכמותית מניבות trehalose 2-fluoro מ-גלוקוז 2-fluoro (ראו טבלה 1), שהוא קריטי כי 18 F-2-fluoro-גלוקוז היא קצרת מועד (18 F מחצית החיים = 110 דק ' ), דבר המחייב כימיה מהר מאוד. יתר על כן, 18 F-2-fluoro-גלוקוז זמינה משום שהוא כבר נמצא בשימוש במרפאת הדמית PET של גידולים. שימוש בתהליך TreT המתואר עבור development של 18 F-fluoro-trehalose ו אנלוגים trehalose אחרים עבור יישומים שונים מתנהל כיום במעבדות שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB agar Research Products International L24021
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
Luria broth Research Products International L24045
Terrific Broth Research Products International T15050
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256
Phosphate-buffered Saline GE Healthcare SH30256
Imidazole Sigma Aldrich I5513
Sodium chloride BDH BDH9286
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific S374
Syringe filter, 0.45 µm Fisher Scientific 09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free Thermo Scientific 88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL GE Healthcare 17-5248-02
TRIS base ultrapure Research Products International T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 Fisher Scientific 21-152-16
Glucose analogues CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) CarboSynth MA02620
UDP-Glucose abcam Biochemicals ab120384
Magnesium chloride hexahydrate  Fisher Scientific M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit EMD Millipore UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin Bio-Rad 444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media Bio-Rad 150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates EMD Millipore 1056280001
n-Butanol Fisher Scientific A399
Ethanol Fisher Scientific S25310A
Sulfuric acid Fisher Scientific A300
Acetonitrile EMD Millipore AX0145
Deuterium oxide, 99.8% Acros Organics 351430075
Aminopropyl HPLC column Sigma Aldrich 58338
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 5470
Para-formaldehyde Ted Pella 18505
Alkyne-488 Sigma Aldrich 761621
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Click Chemistry Tools 1061
tert-Butanol Sigma Aldrich 360538
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich W387520
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotechnology 10001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
  2. Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
  3. Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
  4. Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
  5. Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
  6. Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
  7. Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
  8. Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
  9. Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
  10. Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
  11. Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
  12. Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
  13. Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
  14. Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
  15. Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
  16. Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
  17. Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
  18. Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
  19. Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
  20. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
  21. Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  22. Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).

Tags

ביוכימיה גיליון 120 אנלוגי trehalose סינתזה אנזימטית synthase trehalose TreT mycobacteria שחפת לחץ כימיה הקרינה
צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meints, L. M., Poston, A. W.,… More

Meints, L. M., Poston, A. W., Piligian, B. F., Olson, C. D., Badger, K. S., Woodruff, P. J., Swarts, B. M. Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues. J. Vis. Exp. (120), e54485, doi:10.3791/54485 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter