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Biochemistry

Rapid One-step enzimatica Sintesi e All-acquosa Purificazione di trealosio analoghi

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/54485
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, 2Department of Chemistry, University of Southern Maine

Abstract

versioni di trealosio, o analoghi trealosio modificati chimicamente, avere applicazioni in biologia, biotecnologia e scienza farmaceutica, tra gli altri campi. Per esempio, analoghi trealosio recanti tag rilevabili sono stati utilizzati per rilevare Mycobacterium tuberculosis e possono avere applicazioni come tubercolosi agenti di imaging diagnostico. versioni idroliticamente stabili di trealosio sono perseguiti a causa del loro potenziale per l'uso come dolcificanti non calorici e agenti bioprotettivi. Nonostante il ricorso di questa classe di composti per varie applicazioni, il loro potenziale rimane inutilizzato a causa della mancanza di un percorso robusto per la loro produzione. Qui riportiamo un protocollo dettagliato per la rapida ed efficiente di uno stadio di sintesi di analoghi biocatalitiche trealosio che aggira i problemi associati con la sintesi chimica. Utilizzando l'enzima termostabile trealosio sintasi (Tret) da Thermoproteus tenax, analoghi trealosio può essere generatEd in un unico passaggio da analoghi di glucosio e di glucosio uridina difosfato in alto rendimento (fino a conversione quantitativa) in 15-60 min. Un semplice e rapida protocollo di purificazione non-cromatografica, che consiste di rotazione dialisi e scambio ionico, in grado di fornire molti analoghi trealosio di concentrazione nota in soluzione acquosa in appena 45 min. Nei casi in cui non reagito analogo del glucosio rimane ancora, purificazione cromatografica del prodotto analogo trealosio può essere eseguita. In generale, questo metodo fornisce una piattaforma biocatalitico "verde" per la sintesi accelerato e purificazione di analoghi trealosio che sia efficiente e accessibile anche ai non farmacisti. Per esemplificare l'applicabilità di questo metodo, si descrive un protocollo per la sintesi, tutto-acquosa di purificazione, e la gestione di un clic sonda chimica trealosio-based per micobatteri, ognuno dei quali ha meno di 1 ora e ha consentito la rilevazione di fluorescenza dei micobatteri. In futuro, prevediamo che, tra OTHer le applicazioni, questo protocollo può essere applicato alla rapida sintesi di sonde trealosio-based per la diagnostica della tubercolosi. Per esempio, di breve durata analoghi radionuclide-modificato trealosio (ad esempio, 18 trealosio F-modificato) potrebbe essere usato per le modalità avanzate di imaging clinico come la tomografia a emissione di positroni tomografia computerizzata-(PET-CT).

Introduction

Il trealosio è un disaccaride simmetrica non riducente consistente in due frazioni di glucosio che sono uniti da un 1,1-α, legame α-glicosidico (Figura 1A). Mentre trealosio è assente da esseri umani e altri mammiferi, si trova comunemente nei batteri, funghi, piante e invertebrati 1. Il ruolo primario di trealosio in molti organismi a proteggere dagli stress ambientali, come essiccazione 1. Inoltre, alcuni agenti patogeni umani richiedono trealosio per la virulenza, compresa la tubercolosi Mycobacterium tuberculosis causano, che utilizza trealosio come mediatore della biosintesi busta cellulare e come un blocco di costruzione per la costruzione di glicolipidi immunomodulanti 2.

Figura 1
Figura 1: Il trealosio e analoghi trealosio. (A) Strutture di trealosio naturale e un analogo trealosio innaturale, dove X è una modifica strutturale. (B) Esempi di analoghi trealosio riportati in letteratura che hanno potenziali applicazioni in bioconservazione e bioimmagini.

Grazie alla sua struttura unica e funzioni fisiologiche, trealosio ha attirato grande attenzione per l'uso in bio (tecno) logici e applicazioni biomediche 3. Le proprietà protettive del trealosio osservati in natura- ad esempio, la sua capacità sorprendente per contribuire a sostenere la vita delle piante "Resurrezione", che sono stati sottoposti a disidratazione estrema 4 -hanno spronato il suo ampio uso in applicazioni bioconservazione. Trealosio è stato usato per conservare una vasta gamma di campioni biologici, come acidi nucleici, proteine, cellule e tessuti 3. Per esempio, trealosio viene utilizzato come additivo stabilizzante in un certo numero di prodotti farmaceutici tcappello sono sul mercato, tra cui diversi anticorpi monoclonali anti-cancro 3. Così, trealosio viene utilizzato come dolcificante nell'industria alimentare, ed è ampiamente usato per la conservazione del prodotto sia nell'industria alimentare e cosmetica. L'adozione di trealosio per questi tipi di applicazioni commerciali è stata inizialmente limitata dalla incapacità di ottenere grosse quantità di trealosio puro da fonti naturali o attraverso la sintesi. Tuttavia, è stato recentemente sviluppato un processo enzimatico efficiente per la produzione economica di trealosio da amido, che ha stimolato l'uso commerciale diffuso 5.

Derivati di trealosio chimicamente modificato, qui denominati analoghi trealosio, hanno guadagnato crescente attenzione per varie applicazioni (struttura generica mostrata in figura 1A, esempi specifici di analoghi trealosio illustrati nella Figura 1B) 6. Ad esempio, lacto-trealosio è un analogo trealosio con una sua unità di glucosio sostituito con galattosio, quindi il suo gruppo ossidrilico posizione 4 ha una configurazione stereochimica invertita. Lacto-trealosio ha le stesse proprietà stabilizzanti come trealosio, ma è resistente alla degradazione da parte degli enzimi intestinali, rendendolo attraente come un non-calorico additivo alimentare 6, 7.

l'interesse del nostro gruppo in analoghi trealosio si riferisce in primo luogo al loro valore come sonde e gli inibitori specifici per micobatteri. I gruppi di Barry e Davis hanno sviluppato un cheto-trealosio analogico fluoresceina coniugato, chiamato FITC-cheto-trealosio, che è stato mostrato al metabolicamente etichettare la parete cellulare di vivere M. tuberculosis, che consente il rilevamento da microscopia a fluorescenza 8. Il laboratorio Bertozzi sviluppato più piccolo azido-trealosio (TreAz) analoghi che potrebbero metabolicamente etichetta la parete cellulare e, successivamente, essere detette utilizzando clic chimica e analisi di fluorescenza 9. Questi progressi indicano la possibilità di utilizzare sonde trealosio-based come agenti di imaging diagnostico per la tubercolosi. Analoghi trealosio sono stati perseguiti come inibitori di M. tuberculosis a causa del loro potenziale di distruggere percorsi nel batterio che sono essenziali per la vitalità e la virulenza 10, 11, 12.

Finora, il principale ostacolo allo sviluppo di analoghi trealosio per bio (tecno) applicazioni logiche e biomediche è la mancanza di metodi di sintesi efficienti. I due percorsi tradizionali per produrre analoghi trealosio basano sulla sintesi chimica (Figura 2). Un percorso coinvolge desymmetrization / modifica di trealosio naturale, mentre l'altro comporta iniziano adeguatamente funzionalizzati blocchi monosaccaridi ed eseguendo glicosilazione chimicoforgiare la 1,1-α, legame α-glicosidico. Questi approcci, che sono stati recentemente discussi in articoli di revisione 13, 14, si sono dimostrati utili per compiere sintesi multistadio di piccole quantità di prodotti naturali trealosio contenenti complessi, come sulfolipid-1 da M. tuberculosis 15. Tuttavia, entrambi gli approcci sono generalmente inefficienti, tempo, inaccessibili ai non chimici, e, inoltre, non sono considerati essere rispettosi dell'ambiente. Così, per sintetizzare alcuni tipi di analoghi trealosio, queste strategie non sono ideali.

figura 2
Figura 2: Approcci alla sintesi trealosio analogico. Chimica si avvicina alla sintesi trealosio analogico, mostrato a sinistra, utilizzare le procedure più fasi che coinvolgono Protec difficilepassi zione / deprotezione, desymmetrization, e / o glicosilazione. sintesi enzimatica, mostrata a destra, usa enzima (s) per convertire stereoselettiva semplici, substrati non protetti trealosio analoghi in soluzione acquosa. Il protocollo enzimatica qui riportate utilizza un enzima trealosio sintasi (Tret) per convertire analoghi di glucosio e UDP-glucosio in analoghi trealosio in un unico passaggio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Un efficiente percorso biocatalitico agli analoghi trealosio faciliterebbe la produzione, la valutazione e l'applicazione di questa promettente classe di molecole. Mentre il processo enzimatico commerciale per la produzione di trealosio 5 non è adattabile a sintetizzare analoghi perché utilizza amido come substrato, ci sono altri percorso biosinteticomodi in natura che possono essere utilizzate per la sintesi analogica trealosio. Tuttavia, la ricerca in questo settore, che è stato recentemente rivisto 6, è stato limitato. Un rapporto ha usato un metodo ispirato al coli trealosio via biosintetica Escherichia per accedere a un singolo analogico fluoro-trealosio dal corrispondente fluoro-glucosio. Tuttavia, questo approccio richiede un sistema a tre enzima che ha limitato l'efficienza e generalità 8. Un altro approccio che è stato esplorato è usare trealosio fosforilasi (TRTP) in senso inverso, che in linea permette la sintesi one-step di analoghi trealosio da analoghi di glucosio e di glucosio-1-fosfato 6, 16, 17. Anche se questo approccio può avere promessa futura, sia invertenti e trattenere i TREP attualmente hanno svantaggi per la sintesi analogica. Ad esempio, i TREP inversione hanno un espe proibitivomolecola nsive donatore (β-D-glucosio 1-fosfato) e TREP ritegno hanno scarsa resa di espressione dell'enzima / stabilità e limitato la promiscuità substrato. Saranno necessari miglioramenti significativi (ad esempio, attraverso l'ingegneria enzima) prima di sintesi analogica TREP-mediata è pratico.

Allo stato attuale, l'approccio più pratico per la sintesi enzimatica di analoghi trealosio è usare un enzima trealosio sintasi (TRET), che converte il glucosio e uridina difosfato (UDP) Glucosio in trealosio in un unico passaggio 6. Recentemente abbiamo segnalato l'uso di Thermoproteus tenax Tret-un enzima termostabile e unidirezionale 18 -per sintetizzare analoghi trealosio da analoghi di glucosio e UDP-glucosio (Figura 3) 19. Questo enzima agisce solo nella direzione sintetica ed evita il problema del degrado trealosio trova nel sistema TREP. Questa reazione coul one-stepd essere completato in 1 ora, e una vasta gamma di analoghi trealosio sono stati accessibile in alto rendimento (fino a> 99% come determinato da alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)) da substrati analogo del glucosio prontamente disponibili (vedi tabella 1 nelle Rappresentante dei risultati sezione).

Figura 3
Figura 3: Tret-catalizzata sintesi one-step di analoghi trealosio. L'enzima Tret da T. tenax può stereoselettiva unirsi analoghi di glucosio prontamente disponibili e UDP-glucosio per formare analoghi trealosio in un unico passaggio. R 1 -R 4 = Variabile modifica strutturale, per esempio azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochimica, o modifiche di etichette isotopici; Y = eteroatomo variabile, ad esempio ossigeno o zolfo, o eteroatomo marcati con isotopi.

Qui, forniamo annuncioprotocollo Nell'odontoiatria per il processo di sintesi TRET, compresa l'espressione e la purificazione di Tret da E. coli, ottimizzato condizioni di reazione TRET, ed un metodo di purificazione perfezionato che viene eseguita interamente in fase acquosa. Questo protocollo modificato consente la sintesi opportuno ed efficiente e purificazione di diversi analoghi trealosio su scala semi-preparativa (10-100 mg). Dimostriamo anche l'uso di questo protocollo per la preparazione e la somministrazione di una sonda trealosio-based per micobatteri in meno di 1 ora, che ha permesso la rilevazione di fluorescenza rapida delle cellule micobatteri.

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Protocol

1. Espressione e purificazione di Tret da Top10 E. coli

NOTA: Si prega di contattare gli autori per richiedere la Tret-esprimendo ceppo di E. coli (pBAD Tret plasmide, contenente il gene Tret T. tenax sotto il controllo della proteina AraC, trasformato in Top10 E. coli 19) e l'accordo di trasferimento materiale allegato . Il protocollo che segue fornisce tipicamente una resa di proteine ​​di circa 4 mg / L.

  1. Preparare una cultura durante la notte 3 ml di Tret che esprimono E. coli.
    1. Streak Top10 E. coli trasformato con pBAD-Tret vettore di espressione in un brodo lisogenia (LB) piastra di agar contenente 100 mg ampicillina / mL.
    2. Incubare la piastra a 37 ° C per circa 48 ore.
    3. Scegliere una singola colonia dalla piastra e inoculare 3 mL di terreno liquido LB contenente 100 mg ampicillina / mL in una provetta di coltura.
    4. Posizionare il tubo in un incubatore agitazione a 37 & #176; C x 175 giri al minuto durante la notte.
  2. Indurre l'espressione della proteina in Tret-esprimendo E. coli.
    1. Aggiungere 750 mL Terrific Broth completato con 100 mg / ml ampicillina a un pallone di coltura 2.800 ml Fernbach. Trasferire 1 ml di brodo dal pallone in una provetta per un uso successivo come bianco.
    2. Aggiungere la cultura durante la notte 3 ml generato nel passaggio 1.1.4 al pallone di coltura, quindi posizionare il pallone in un incubatore e agitare a 37 ° C x 200 giri al minuto. Controllare periodicamente l'assorbanza della cultura a 600 nm rispetto al vuoto rilevati nella fase 1.2.1.
    3. Una volta che l'assorbanza a 600 nm raggiunge tra 0,5-1,0, indurre l'espressione Tret con l'aggiunta di 750 ml di soluzione 1 M arabinosio (1 mM concentrazione finale) alla cultura. Riportare il pallone incubatore e agitare una notte a 37 ° C x 200 giri al minuto.
  3. Pellet e la lisi dei Tret-esprimono cellule di E. coli.
    1. Trasferire la cultura di un polipropilene Bottle e centrifugare per 15 min a 4000 xga 4 ° C.
    2. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    3. Trasferire la sospensione cellulare ad una provetta da 50 ml e centrifugare per 15 min a 4000 xga 4 ° C. Eliminare il surnatante e sia procedere alla lisi cellulare (fase 1.3.4) o conservare il pellet a tempo indeterminato a -80 ° C.
    4. Sciogliere mini tablet 1 inibitore della proteasi in 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 8,0) in una provetta da 50 ml.
    5. Trasferire il tampone di lavaggio inibitore contenente proteasi al tubo conico contenente il pellet. Vortex finché il pellet viene risospeso.
    6. Trasferire le cellule risospese in un becher da 100 ml e lisare le cellule mediante sonicazione (sequenza di impulsi di 45 secondi, 45 secondi con un tempo di esecuzione di 2 min e 15 secondi ad una ampiezza di 75 per cento).
    7. Trasferire il lisato in una provetta conica da 50 ml metalloe centrifugare per 60 min a 15.000 xg a 4 ° C.
    8. Chiarire il lisato dal passaggio attraverso un filtro a siringa da 0,2-0,45 micron in una provetta da 50 ml.
      NOTA: La concentrazione tipica di lisato ottenuto è di 100 mg / mL.
  4. Purificare Tret da E. coli lisato cellulare utilizzando proteine veloce cromatografia liquida (FPLC).
    1. Impostare la FPLC con una colonna di nichel affinità (5 ml di volume del letto). Lavare la colonna con 10 mL di acqua deionizzata o finché la colonna è pulito da qualsiasi contaminante. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 8,0) ad una portata di 1 ml / min.
    2. Caricare il lisato (20 mL) ottenuto dalla fase 1.3.8 nella colonna e eluire le proteine ​​senza tag con tampone di lavaggio ad un flusso di 1 mL / min finché l'assorbanza raggiunge livelli di fondo (tipicamente 80-100 ml di tampone di lavaggio sono necessari) .
    3. Eluire His-tag Tret utilizzando un lineare di ggardiente di tampone di eluizione (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) 1-100% più di 60 min ad una velocità di flusso di 1 mL / min. Raccogliere 4 frazioni mL fino a Tret è eluito e l'assorbanza raggiunge livello di base.
      NOTA: Tipicamente, 60 mL di tampone di eluizione sono necessari per eluire la proteina e la proteina eluisce nell'intervallo tampone di eluizione 60-100%. Circa il 10-15 ml di puro Tret nel tampone di eluizione si ottengono.
    4. Determinare la concentrazione di Tret misurando l'assorbanza a 280 nm contro un bianco tampone di eluizione.
  5. Scambio Tret in tris (idrossimetil) aminomethane (Tris) tampone con la dialisi.
    1. Dopo aver preparato il tubo di dialisi secondo le istruzioni del produttore, riempire la risciacquando con acqua deionizzata e poi tampone Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
    2. Caricare il campione di Tret nel tubo di dialisi con una siringa e l'ago smussato. Dializzare durante la notte unContro 2 L di tampone Tris.
    3. Determinare la concentrazione di Tret misurando l'assorbanza a 280 nm contro un bianco raccolto dal lavaggio dialisi.
    4. Trasferire la soluzione Tret ad una provetta da 50 ml e procedere alla sintesi analogica trealosio (fase 2) o conservare l'enzima a 4 ° C.
      NOTA: Tret è una proteina termostabile. Il Tret è stato memorizzato in tampone Tris a 4 ° C per diversi mesi senza osservare significativa perdita di attività.

2. One-step sintesi di trealosio analoghi Utilizzando Tret Enzyme

NOTA: Il protocollo seguente descrive una scala reazione basato su 4 volumi mL, che può erogare circa 15-30 mg di trealosio analogico seconda dell'efficienza di reazione e del peso molecolare del prodotto. I componenti della reazione possono essere scalati per ottenere più o meno trealosio analogico se lo si desidera.

  1. Aggiungere analogo del glucosio (0,080 mmol, massa dipende dal peso molecolare), UDP-glucosio (0.160 mmol, 97,6 mg), e MgCl 2 (0,080 mmoli, 16,3 mg) ad un tubo da 15 ml. Le concentrazioni finali di questi componenti saranno 20 mm, 40 mm e 20 mm rispettivamente.
  2. Aggiungere Tret in tampone Tris (ottenuto dalla fase 1.5.4) e, se necessario, un volume adeguato di tampone Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) per ottenere una concentrazione enzimatico finale di 300 mg / ml e una finale volume di 4 ml. Pipettare la miscela su e giù delicatamente o invertire la provetta per sciogliere i solidi.
  3. Incubare la reazione a 70 ° C con agitazione a 300 rpm per 1 ora, quindi inserire il tubo in ghiaccio per raffreddare.

3. Purificazione di trealosio analoghi dal greggio miscela di reazione enzimatica

  1. Pre-risciacquare un'unità filtro centrifugo (nominale limite di peso molecolare (NWML) 10 kDa) per rimuovere tracce glicerolo nella membrana aggiungendo 3 mL di acqua deionizzata all'unità filtro centrifugo e centrifugazione a 3.000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtronel tubo (circa 20 min). Ripetere altre due volte. Completare questa fase immediatamente prima o durante la reazione (passo 2.3).
  2. Dopo raffreddamento la miscela di reazione enzimatica (ottenuto dalla fase 2.3), trasferire all'unità filtro centrifugo pre-risciacquato. Sciacquare il tubo di reazione con 1 ml di acqua deionizzata e trasferimento all'unità filtro centrifugo. Ripetere risciacquo del tubo di reazione per il massimo recupero del prodotto.
  3. Centrifugare l'unità filtro centrifugo a 3.000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtro nel tubo (circa 20 min). Risciacquare la camera superiore dell'unità filtro centrifugo con 3 mL di acqua deionizzata e centrifugare a 3000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtro nel tubo (circa 20 min). Ripetere risciacquo per il massimo recupero del prodotto.
  4. Eliminare la camera superiore dell'unità filtro centrifugo. Aggiungere a letto misto di resina a scambio ionico (3 g) al filtrato nella parte inferiore del tubo (tipico filtrato volume è 8-15 mL a seconda del numero di risciacqui). Mescolare a temperatura ambiente per 1 ora con ancoretta magnetica ad una velocità sufficiente a mantenere le perle di resina sospese nella soluzione.
  5. Decantare il surnatante e filtrare per rimuovere la resina. Aggiungere 5 ml di acqua deionizzata per lavare la resina rimanente. Decantare il surnatante e filtrare, combinandola con la soluzione di prodotto dalla prima decantazione. Ripetere risciacquo della resina per il massimo recupero del prodotto.
  6. Analizzare la reazione mediante cromatografia su strato sottile (TLC) o HPLC per determinare se è stata raggiunta la completa conversione del glucosio analogico materiale prodotto trealosio analogico partenza. Vedere il punto 4.1 per l'analisi TLC e passo 4.2 per l'analisi HPLC.
  7. Rimuovere l'acqua per liofilizzazione o evaporazione rotante per dare il prodotto essiccato. Se nessun analogo del glucosio non reagito è stato osservato durante TLC o HPLC, la purificazione mediante cromatografia è necessaria. Pesare il prodotto per ottenere la reazione Yield ed eseguire risonanza magnetica nucleare (NMR) spettroscopica analisi (passo 4.3) per confermare la struttura del prodotto e purezza.
  8. Se non reagito analogo del glucosio è stata osservata durante l'analisi TLC, separarlo dal analogico trealosio utilizzando una colonna dimensione di esclusione.
    1. Preparare una colonna 1 x 100 cm che contiene, media P2 di poliacrilamide dimensioni tallone di esclusione deionizzata saturi d'acqua extra-sottili in base alle istruzioni del produttore.
      NOTA: La colonna esclusione dimensionale può essere riutilizzato dopo il lavaggio con acqua deionizzata.
    2. Ridisciogliere il prodotto di reazione enzimatica essiccato (ottenuto dalla fase 3.7) in 0,5 mL di acqua deionizzata. Applicare la soluzione di prodotto alla colonna esclusione dimensioni manualmente oppure utilizzando un adattatore di flusso della colonna. Sciacquare la fiala che conteneva il prodotto grezzo con altri 0,5 ml di acqua deionizzata, e caricarlo nella colonna dimensione di esclusione.
    3. Eluire il prodotto con acqua deionizzata mediante flusso per gravità e raccogliere frazioni di circa 2 mil volume L.
    4. Analizzare le frazioni da TLC (passo 4.1). In comune le frazioni contenenti puro analogico trealosio.
    5. Rimuovere l'acqua per liofilizzazione o evaporazione rotante per dare il prodotto essiccato. Pesare il prodotto per ottenere la resa di reazione e procedere ad analisi NMR (vedi punto 4.3).

4. Analisi di trealosio analogici Prodotti

  1. Eseguire l'analisi cromatografia su strato sottile (TLC) di reazione Tret.
    NOTA: Questa procedura può anche essere utilizzato per analizzare formato frazioni di colonna esclusione. Può essere necessario concentrare la miscela di reazione o di colonna frazioni prima dell'analisi TLC osservare colorazione composto sulla piastra TLC.
    1. Mark corsie sulla superficie della piastra TLC con una matita e applicare analita (s) e dello standard pertinenti (s) per le corsie appropriate, compreso lo standard analogo del glucosio, lo standard trealosio analogico (se presente), la miscela di reazione (o frazioni raccolte dalla dimensioni exclusion colonna di purificazione), e un co-spot. Dopo l'applicazione ciascun campione alla piastra TLC, permettono la piastra si asciughi.
      NOTA: Per l'analisi di reazione, tipicamente 2 ml di campione viene applicato alla piastra TLC.
    2. Sviluppare la piastra TLC usando n -butanol / etanolo / acqua deionizzata (5: 3: 2).
    3. Asciugare la piastra TLC sviluppata, poi immergerlo in 5% H 2 SO 4 in etanolo (zucchero macchia) e il calore su un piatto caldo in alto impostazione fino spot contenenti zucchero possono essere visualizzate (in genere 5 min).
  2. Eseguire l'analisi HPLC delle miscele di reazione Tret utilizzando qualsiasi sistema HPLC in grado di separare e rivelare carboidrati. Questo protocollo prevede la separazione di carboidrati usando una colonna HPLC amminopropil e rilevamento utilizzando indice di rifrazione.
    1. Attaccare amminopropil colonna (4,6 x 250 mm) contenente una guardia pre-colonna alla HPLC.
    2. Equilibrare amminopropil colonna con 80% acetonitrile in acqua deionizzata ad una velocità di flusso di 0,4mL / min.
    3. Caricare la soluzione del prodotto di reazione (o standard) sulla colonna amminopropil.
    4. Eluire il prodotto (o standard) con 80% acetonitrile in acqua deionizzata ad una velocità di flusso di 0,4 mL / min e una temperatura della colonna di 50 ° C. Tipicamente, il tempo di esecuzione utilizzata è 40 min.
      NOTA: Sia il materiale di partenza analogo del glucosio e il prodotto analogo trealosio può essere rilevato da indice di rifrazione, anche se altri metodi come evaporativo rilevamento dispersione della luce (ELSD) potrebbero essere utilizzati. Utilizzando le condizioni descritte, gli analoghi di glucosio tipicamente eluiscano 10-15 min e trealosio analoghi eluiscano tra 15-25 min.
  3. Analisi NMR di analoghi trealosio purificati.
    1. Sciogliere purificata analogico trealosio in D 2 O (700 ml) e trasferire la soluzione di un tubo NMR.
    2. Acquisire 1 H e 13 C NMR secondo opportune protocolli impianto NMR.

  1. Sintetizzare, purificare e amministrare 6-TreAz a M. smegmatis (Msmeg).
    1. Aggiungere 6-azido-6-deossi glucopiranosio (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glucosio (0,040 mmol, 24,4 mg), e MgCl 2 (0,020 mmol, 4,1 mg) ad un tubo da 15 ml.
    2. Aggiungere Tret in tampone Tris (ottenuto dalla fase 1.5.4) per ottenere una concentrazione enzimatico finale di 300 mg / ml e un volume finale di 1 ml. Pipettare la miscela su e giù delicatamente o invertire la provetta per sciogliere i solidi.
    3. Incubare la reazione a 70 ° C con agitazione per 15 min.
    4. Diluire la miscela di reazione enzimatica con 3 mL di acqua deionizzata e trasferirlo ad una unità filtro centrifugo pre-lavata (NMWL 10 kDa). Centrifugare l'unità filtro a 3.000 xg fino maggior parte del liquido passa attraverso il filtro nel tubo, di circa 10 min.
    5. Scartare °e camera superiore dell'unità filtro centrifugo. Aggiungere a letto misto di resina a scambio ionico (0,75 g) al tubo e mescolare / agitare a temperatura ambiente per 25 min. Decantare il surnatante e filtrare per rimuovere la resina.
      NOTA: Procedura 5.1.1-5.1.5 forniscono una soluzione acquosa di 6-azido-trealosio (6-TreAz) a circa 5 mM concentrazione in meno di 1 ora. La concentrazione 5 mM stima basata sulla conversione quantitativa del substrato nel prodotto e della diluizione che si svolge durante le fasi di purificazione, assumendo minima perdita di prodotto durante queste fasi. La soluzione può essere filtrata sterile prima dell'addizione di un campione biologico, se desiderato.
    6. Aggiungere il volume appropriato di soluzione di prodotto 6-TreAz ad una cultura di log-fase del M. smegmatis (Msmeg), in genere per ottenere un volume di coltura di 100-1.000 ml e una concentrazione finale 6-TreAz di ~ 25 micron. Incubare le cellule a 37 ° C per il tempo desiderato, tipicamente 60 min.
  2. Eseguire clicca chimica di coniugare un fluoroforo alle cellule azide marcato. In questo protocollo, utilizzare Cu-catalizzata cicloaddizione azide-alchino (CuAAC) per fornire un fluoroforo per azidi superficie cellulare in Msmeg.
    1. Centrifugare le cellule a 3.900 xg per 5 minuti, e poi lavare le cellule con PBS contenente 0,5% di albumina di siero bovino. Ripetere due volte.
    2. Risospendere le cellule in pellet in 4% para-formaldeide in PBS per risolverli. Dopo incubazione per 10 minuti, ripetere il passaggio 5.2.1 per lavare le cellule.
    3. Risospendere le cellule in pellet in 138 microlitri di PBS.
    4. Aggiungere 3 ml di ± 1 mm soluzione madre di alchini-carboxyrhodamine 110 (Acetilene-488) in DMSO.
    5. Aggiungere 3 ml di un 60 mm appena preparato di soluzione di ascorbato di sodio in acqua deionizzata.
    6. Aggiungere 3 ml di 6,4 mM di soluzione di Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA) in terz -butanol / dimetilsolfossido (DMSO) 4: 1.
    7. Aggiungere 3 & #956; L di 50 mM di soluzione di CuSO 4 in acqua deionizzata.
    8. Pipettare la cella di sospensione su e giù, poi incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min.
    9. Ripetere il passaggio 5.2.1 per lavare le cellule. Risospendere le cellule in 150 microlitri di PBS.
  3. Eseguire l'analisi della fluorescenza cellulare. In questo protocollo, utilizzare la microscopia a fluorescenza di visualizzare la fluorescenza cellulare di etichetta Msmeg.
    1. Aggiungere 10 ml di cellule batteriche sospese in PBS ad un vetrino da microscopio e leggermente diffondere il liquido in uno strato sottile con il bordo di un vetrino. Lasciare asciugare all'aria nel buio.
    2. Aggiungere 10 ml di mezzo di montaggio sopra il campione essiccato, quindi posizionare la copertura scivola sul campione e applicare l'adesivo (ad esempio, smalto per unghie) per immobilizzare.
    3. Immagine le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza a ingrandimento 100X.

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Representative Results

T. tenax Tret è stata ottenuta da E. coli in una resa di circa 4 mg / L utilizzando tecniche di espressione proteica e purificazione standard. Una singola fase di cromatografia di affinità nichel era sufficiente per purificare Tret da E. coli lisato (una traccia FPLC rappresentativo è mostrato in Figura 4). Come stabilito nella nostra pubblicazione iniziale sul processo di sintesi Tret, ricombinante T. tenax Tret è in grado di convertire una vasta gamma di glucosio analoghi, molti dei quali sono disponibili in commercio da corrispondenti analoghi trealosio ad alta efficienza 19. Tabella 1, che dà rese di reazione HPLC-determinato per un numero di avviamenti analoghi di glucosio utilizzando il protocollo inizialmente riportato, illustra la portata di promiscuità substrato di Tret e la sua idoneità per sintesi. Diverse modifiche strutturali, tra cui fluoro-, deoxy-, azido-,thio- e modifiche stereochimica in diverse posizioni intorno al ring di zucchero sono ben tollerati dalla wild-type enzima, con l'eccezione principale è modifiche al 4 posizioni.

Figura 4
Figura 4: Risultati rappresentativi per tret purificazione mediante FPLC. Purificazione della ricombinante T. tenax tret da E. coli lisato è stata effettuata mediante cromatografia di affinità nickel come descritto nei passaggi 1.4.1-1.4.4. Blu, raggi ultravioletti (UV) traccia assorbanza; verde chiaro, la concentrazione del tampone di eluizione; verde scuro, pressione. Il picco corrispondente al Tret è indicato con una freccia. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Tabella 1: Rese rappresentative per la reazione di Tret. HPLC-determinato e rese isolate della reazione Tret per diversi analoghi trealosio. ND, non rilevato. - Indica la reazione non è stata eseguita su una scala semi-preparativa utilizzando il protocollo ottimizzato. * Indica che è stato richiesto un passo cromatografia dimensione esclusione. linee di divisione orizzontali separano la posizione di modifica sull'anello di zucchero trealosio. Tabella adattato da riferimento 19 con il permesso; aggiornato per includere i rendimenti isolati da questo lavoro. Clicca qui per scaricare il file.

Qui, riportiamo le ottimizzazioni al nostro protocollo iniziale che migliorano l'efficienza complessiva e la velocità del processo di sintesi Tret. Mentre il protocollo originale usato 10 mM di glucosioalogue e 40 mM UDP-glucosio, è stato determinato che la conversione comparabile potrebbe essere ottenuta utilizzando glucosio 20 mM e 40 mM UDP-glucosio, raddoppiando la quantità di prodotto generato per reazione e limitando lo spreco di UDP-glucosio, che è relativamente costoso . Utilizzando quantità equimolari di analogo del glucosio e UDP-glucosio ha provocato conversioni inferiori. Se lo si desidera, i tempi di reazione possono anche essere ridotti a meno inizialmente riportato 60 min pur mantenendo conversione comparabile per molti analoghi, che è stato dimostrato dalla conversione quantitativa del 6-GlcAz a 6 TreAz in soli 15 minuti a 70 ° C ( le figure 5 e 6).

Il protocollo di purificazione qui riportate è sostanzialmente migliorato, sostituendo il metodo di cromatografia su gel enzima precipitazioni / silice originale con un metodo di scambio non-cromatografica rotazione dialisi / ione. La ragione di questa modifica è che il Tret rmiscela eaction consiste interamente di specie ioniche escluso il prodotto analogo trealosio neutro. Pertanto, la miscela può essere spin-dializzato per rimuovere enzima e quindi trattati con misto-letto di resina a scambio ionico per rimuovere tutte le specie ioniche, offrendo purificato analogo trealosio in soluzione acquosa in appena 45 min. Questo metodo di purificazione all-acquosa evita solventi dannosi dell'ambiente organici, fasi di evaporazione e filtrazione richiedono tempo, e asciutto-carico cromatografia su gel di silice, che è un processo lento e ingombrante, soprattutto per i non-chimici. Per le reazioni Tret che esibiscono la conversione quantitativa come determinato con il TLC descritto o analisi HPLC, questo metodo di purificazione fornisce rendimenti isolati di circa 60-80% su scala reazione riportato, con la perdita di prodotto probabilmente dovuto al legame di po 'di zucchero per lo scambio ionico resina (vedi Tabella 1 per le rese isolati rappresentativi). Nei casi in cui rimane analogico non reagito glucosio,può essere separato dal prodotto trealosio analogico desiderato usando una colonna di esclusione dimensionale branello basato poliacrilammide, eluendo con acqua. Se si preferisce, questo potrebbe anche essere realizzato utilizzando HPLC preparativo scala con una colonna amminopropil. purezza del prodotto può essere valutata mediante TLC, HPLC, e / o l'analisi NMR spettroscopica. La Figura 5 mostra i dati rappresentativi analitici per 6-TreAz, che è stato sintetizzato mediante il protocollo descritto. I dati di TLC e HPLC indicato conversione quantitativa del substrato 6-GlcAz al prodotto 6-TreAz per questa reazione, e la resa isolata dopo lo spin dialisi / ioni fasi di purificazione di cambio è stata del 58%. 1 H e 13 C NMR analisi spettroscopica confermano la struttura del prodotto 6-TreAz, in particolare compresi α, α-stereochimica del legame glicosidico nuova formazione, così come la sua purezza.

Figura 5 Figura 5: dati analitici rappresentante per la reazione di Tret. (A) TLC e (B) analisi HPLC della conversione Tret-catalizzata di 6-GlcAz a 6-TreAz. (C) 1 H NMR (D) 13 C NMR del prodotto 6-TreAz ottenuto dopo la centrifugazione dialisi purificazione scambio / ionico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dato il valore di cui sopra degli analoghi trealosio per la rilevazione specifica di M. tuberculosis, il processo di Tret dovrebbe facilitare lo sviluppo e l'utilizzo di sonde trealosio-based per la ricerca della tubercolosi e applicazioni diagnostiche. Per dimostrare questo tipo di applicazione, abbiamo usato il Tret ottimizzatoprocesso per preparare rapidamente, purificare e amministrare la sonda chimica 6-TreAz-a trealosio a base di clic 9 -per micobatteri per consentire il rilevamento di fluorescenza (flusso di lavoro e dati rappresentativi sono mostrati in figura 6). Brevemente, TRIS stato usato per convertire commerciale 6-GlcAz a 6-TreAz quantitativamente in 15 min, e quindi la miscela di reazione viene sottoposto alla / ione metodo di purificazione scambio di spin dialisi, che impiega solo 45 min (più passaggi di risciacquo sono stati omessi per aumentare velocità). Così, un magazzino soluzione acquosa di puro 6-TreAz di concentrazione nota (~ 5 mm) è stata generata in solo 1 ora. Lo stock 6-TreAz è stato immediatamente somministrato a una crescente cultura del modello batterio Msmeg (concentrazione finale 6-TreAz ~ 25 micron) per realizzare l'etichettatura azide della superficie cellulare, che inserita una maniglia per click chimica mediata legatura 20, 21 una sonda fluorescente. Successivamente,cellule marcate sono state analizzate mediante microscopia a fluorescenza, che ha mostrato una forte fluorescenza per 6-TreAz trattati cellule. Come previsto, campioni di controllo che non sono stati trattati con 6-TreAz o che mancavano un trealosio transporter funzionali 22, che è richiesto per 6-TreAz assorbimento e incorporazione metabolica 9, non ha mostrato alcuna fluorescenza.

Figura 6
Figura 6: Risultati rappresentativi per la rapida individuazione di micobatteri utilizzando un analogo trealosio Tret-sintetizzato. (A) Flusso di lavoro per la rapida sintesi, la purificazione e l'uso della 6-TreAz per il rilevamento della fluorescenza di Msmeg. I passaggi 5.1.1-5.1.6 del protocollo sono stati utilizzati per sintetizzare e purificare 6-TreAz (dando un ~ 5 mM soluzione acquosa in 1 ora), poi amministrare a vivere Msmeg realizzare marcatura metabolica della superficie cellulare con azidi. Inoltre, come descritto nei passaggi 5.2.1-5.2.9, clicca chimica (CuAAC) è stata eseguita a reagire azidi superficie cellulare con un fluoroforo alchino-modificato, alchini-488. (B) imaging di fluorescenza di 6-TreAz trattati Msmeg contenente un trasportatore trealosio funzionale (wild type e Δ sugC :: sugC) hanno mostrato una forte fluorescenza, mentre i campioni di controllo di Msmeg lasciata non trattata o manca il trasportatore trealosio (Δ sugC) non l'ha fatto . Figura adattato da riferimento 19 con il permesso; aggiornato con il flusso di lavoro e di imaging dati del protocollo di Tret migliorata. Barre di scala, 5 micron. per favoreclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Analoghi trealosio hanno il potenziale di impatto vari campi, dalla conservazione dei prodotti alimentari e farmaceutici per la diagnosi e il trattamento delle infezioni microbiche 6. Esistenti metodi di sintesi più fasi chimiche sono utili per la produzione di analoghi trealosio complessi con più siti di modifica (ad esempio, in natura complesse glicolipidi micobatteri). Tuttavia, questi metodi sono sempre lungo e inefficiente, anche se applicato alla sintesi di relativamente semplici analoghi trealosio monosostituito 9, 13, 14. approcci sintetici alternativi sono necessari per rapidamente ed efficientemente produrre vari tipi di analoghi trealosio che possono avere valore nei settori summenzionati. approcci biocatalitici che sfruttano gli enzimi trealosio-sintesi della natura mantengono il più promettente. Anche se diversi percorsi trealosio-sintetizzareesistono in natura, consideriamo TRIS da T. tenax 18 per essere l'enzima ideale per la sintesi trealosio analogico per diversi motivi.

Tret da T. tenax è termostabile, consentendo reazioni da riscaldare per migliorare la velocità e per la prevenzione della contaminazione microbica in ambienti di produzione su larga scala. Tret da T. tenax è un enzima unidirezionale che non è in grado di degradare trealosio. Tret da T. tenax è suscettibile di espressione e la purificazione da E. coli, e la sua spedizione e stoccaggio è facile. La reazione Tret è un singolo passo e si tratta di glucosio substrati semplici e UDP-glucosio. Un gran numero di strutturalmente / funzionalmente diversi analoghi di glucosio sono disponibili presso numerosi rivenditori commerciali. UDP-glucosio è un donatore di glucosio relativamente poco costoso, soprattutto in confronto alla TREP donatore β-D-glucosio 1-fosfato. Tret da T. tenax ha alta promiscuity per la struttura del substrato di glucosio, così vari analoghi trealosio sono accessibili. purificazione del prodotto dalla miscela di reazione Tret è veloce e semplice.

Qui, abbiamo riportato un protocollo dettagliato ottimizzato per la sintesi analogica trealosio che capitalizza gli attributi di cui sopra positivi dell'enzima Tret. Il processo Tret può essere utilizzato per accedere a una varietà di analoghi trealosio puri su una scala semi-preparativa (10-100 mg), anche se ulteriore scale-up dovrebbe essere possibile, se desiderato. Numerosi tipi di analoghi sono stati raggiunti nel nostro lavoro precedente e presente, tra azido-, deoxy-, fluoro-, e tio-trehaloses, così come stereoisomeri trealosio, ma altre modifiche saranno anche possibile (ad esempio, stabile marcati con isotopi e radiomarcato trehaloses sono di particolare interesse). I passaggi di sintesi e di purificazione del processo di Tret sono operativamente semplici e possono essere facilmente eseguite da personale che non sono addestrati a Che sinteticoMistry. Una delle caratteristiche più interessanti del processo Tret è che entrambi i passaggi di sintesi e di purificazione possono essere eseguiti in un breve periodo di tempo, che vanno da 1-4 ore a seconda del numero di fasi di lavaggio desiderato (nota: se la colonna esclusione dimensionale purificazione è necessaria per separare il prodotto trealosio analogico dal analogo del glucosio che non ha reagito, questo aumenta il tempo totale di circa 2 giorni, che è ancora sostanzialmente più veloce rispetto ai metodi esistenti per la sintesi analogica trealosio).

Anche se il processo Tret è la via enzimatica più efficace per accedere analoghi trealosio ancora denunciati, ha alcuni inconvenienti che forniscono opportunità di miglioramento futuro. In primo luogo, anche se UDP-glucosio è relativamente poco costoso rispetto ad altri donatori di zucchero, l'efficienza del processo Tret potrebbe essere ulteriormente migliorata con l'accoppiamento con una sintesi enzimatica di UDP-glucosio da una fonte conveniente, per esempio, α-D-glucosio 1- fosfato, o identifying un surrogato economico per UDP-glucosio. Una seconda limitazione potenziale di questo metodo è che la portata reazione viene infine regolato dalla tolleranza substrato tret. Mentre la tolleranza di tipo selvaggio Tret è abbastanza alto (vedi Tabella 1), alcuni analoghi non possono essere sintetizzati utilizzando questo metodo (ad esempio, analoghi 4 posizioni modificati). Pertanto, le versioni ingegnerizzate di Tret con maggiore tolleranza substrato sarà prezioso. In terzo luogo, mentre molte reazioni Tret-catalizzate procedere con la conversione quantitativa, la conversione più bassa richiede una fase di purificazione cromatografica. In questo protocollo, ci siamo concentrati sull'utilizzo di un processo di dimensioni relativamente lento esclusione dal momento che è poco costoso, non richiede alcuna attrezzature specializzate, e può essere eseguita esclusivamente con eluizione acqua. In alternativa, HPLC purificazione che impiega una colonna preparativa amminopropil scala potrebbe essere utilizzato come metodo rapido per la purificazione del prodotto. Nonostante alcune di queste limitazioni, il processo di Tret fornisceuna potente piattaforma per la preparazione rapida ed efficiente di analoghi trealosio, e dovrebbe accelerare la loro valutazione e l'applicazione nel bio (tecno) campi logici e biomedico. Futuri miglioramenti al processo di Tret, di cui sopra, rafforzerà ulteriormente la ricerca e le applicazioni relative al trealosio e dei suoi derivati.

analoghi trealosio hanno un potenziale valore in vari settori. Come accennato nell'introduzione, trealosio naturale viene utilizzato per applicazioni bioconservazione e dolcificanti cibo, così trealosio analoghi con proprietà quali la resistenza degradazione può essere attrattivo. Inoltre, una varietà di versioni stabili marcati con isotopi e radiomarcati di trealosio naturale sono disponibili in commercio per scopi di ricerca, e il processo Tret può certamente fornire un accesso rapido ed efficiente per queste molecole. analoghi trealosio sono anche di interesse per il targeting patogeni con sonde e inibitori dal trealosio è assente da mammiferi. Un applicatura in questa zona che è di particolare interesse è il rilevamento di micobatteri. M. tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi, che uccide 1,5 milioni di persone ogni anno, contiene percorsi di trealosio-elaborazione uniche che sono assenti da mammiferi. Ad esempio, il trasportatore trealosio-riciclaggio e enzimi valle che incorporano trealosio in glicolipidi membrana residente esterne non sono presenti nei mammiferi 22. Targeting per questo macchinario specifico per micobatteri con analoghi trealosio rilevabili rappresenta un approccio interessante per imaging in vivo di infezione da M. tuberculosis in sistemi modello e pazienti possibilmente umani. In effetti, gli esempi sopra di FITC-cheto-trealosio e TreAz (Figura 1B) hanno aperto la strada a tali sviluppi 8, 9. Per facilitare l'accesso di questi strumenti per la comunità di ricerca, abbiamo riportato qui un protocollo per la rapida synthesizing e l'utilizzo di 6-TreAz di micobatteri di immagini in combinazione con la click chemistry.

Questo protocollo può essere adattato per lo sviluppo di altri analoghi trealosio rilevabili che possono essere utili per applicazioni diagnostiche tubercolosi. Per esempio, Barry e Davis prima proposto il possibile uso di 18 F-fluoro-trealosio come la tomografia ad emissione di positroni (PET) della sonda per l'imaging in vivo di infezione da micobatteri 8. Il processo di Tret può essere ideale per la realizzazione di questo obiettivo. Tret è in grado di rapidamente e quantitativamente generare 2-fluoro-trealosio da 2-fluoro-glucosio (vedi Tabella 1), che è critica perché 18 F-2-fluoro-glucosio è di breve durata (18 F emivita = 110 min ), che richiede la chimica estremamente veloce. Inoltre, 18 F-2-fluoro-glucosio è prontamente disponibile perché è già utilizzato in clinica per l'imaging PET di tumori. Uso del processo di Tret descritto per il devURALE di 18 F-fluoro-trealosio e altri analoghi trealosio per varie applicazioni è attualmente in corso nei nostri laboratori.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB agar Research Products International L24021
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
Luria broth Research Products International L24045
Terrific Broth Research Products International T15050
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256
Phosphate-buffered Saline GE Healthcare SH30256
Imidazole Sigma Aldrich I5513
Sodium chloride BDH BDH9286
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific S374
Syringe filter, 0.45 µm Fisher Scientific 09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free Thermo Scientific 88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL GE Healthcare 17-5248-02
TRIS base ultrapure Research Products International T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 Fisher Scientific 21-152-16
Glucose analogues CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) CarboSynth MA02620
UDP-Glucose abcam Biochemicals ab120384
Magnesium chloride hexahydrate  Fisher Scientific M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit EMD Millipore UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin Bio-Rad 444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media Bio-Rad 150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates EMD Millipore 1056280001
n-Butanol Fisher Scientific A399
Ethanol Fisher Scientific S25310A
Sulfuric acid Fisher Scientific A300
Acetonitrile EMD Millipore AX0145
Deuterium oxide, 99.8% Acros Organics 351430075
Aminopropyl HPLC column Sigma Aldrich 58338
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 5470
Para-formaldehyde Ted Pella 18505
Alkyne-488 Sigma Aldrich 761621
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Click Chemistry Tools 1061
tert-Butanol Sigma Aldrich 360538
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich W387520
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotechnology 10001

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References

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