Abstract
Kimyasal trehaloz veya trehaloz analogları sürümlerini değiştirilmiş, diğer alanlar arasında biyoloji, biyoteknoloji ve ilaç bilimi uygulamaları var. Örneğin, tespit etiketleri taşıyan trehaloz analoglan Mycobacterium tuberculosis tespit etmek için kullanılmıştır ve tüberküloz tanısal görüntüleme maddeleri gibi uygulamalar olabilir. trehalozun hidrolitik olarak kararlı versiyonları da bağlı kalorisiz tatlandırıcılar ve Bio koruyucu maddeler olarak kullanım için potansiyel takip edilmektedir. Çeşitli uygulamalar için bileşikler sınıfının itiraz rağmen, potansiyel nedeniyle bunların üretimi için güçlü bir yol olmadığı için tamamlanmamış kalır. Burada, kimyasal sentez ile ilgili sorunlarını ortadan trehaloz analoglarının hızlı ve etkili bir tek-aşamalı biyokatalitik sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Thermoproteus Tenax gelen ısı ayarlı trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanarak, trehaloz analoglan generat olabilirEd glükoz analogları ve yüksek verimle üridin difosfat glukozdan tek bir aşamada (kantitatif dönüşüme kadar) 15-60 dakika içinde. sıkma diyaliz ve iyon değişim oluşur basit ve hızlı bir sigara kromatografik saflaştırma protokolü gibi az 45 dakika içinde sulu bir çözelti içinde bilinen konsantrasyonda bir çok trehaloz analoglarını sağlayabilir. reaksiyona girmemiş glükoz analoğu hala devam durumlarda, trehaloz analog ürününün kromatografik saflaştırması gerçekleştirilebilir. Genel olarak, bu yöntem olup, özelliği kimyagerler etkin ve erişilebilir hızlandırılmış sentezi ve trehaloz analogları saflaştırılması için bir "yeşil" biyokatalitik bir platform sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği örnek için, sentez seyahati sulu arıtma bir protokol açıklar ve mikobakterilerin floresens az 1 saat sürdü ve etkinleştirilmiş her biri mikobakteriler için trehaloz-bazlı tıklama kimyası prob uygulanması. Gelecekte, oth arasında, o tasavvurUygulamalar er, bu protokol, tüberküloz teşhis için trehaloz-bazlı prob hızlı sentezi uygulanabilir. Böyle pozitron emisyon tomografisi-bilgisayarlı tomografi (PET-BT) olarak (örneğin, 18 F-modifiye trehaloz) ileri klinik görüntüleme yöntemleri için kullanılan olabilir Örneğin, kısa ömürlü radyonüklid modifiye trehaloz analogları.
Introduction
Trehaloz, bir 1,1-α, α-glikosidik bağ (Şekil 1A) ile bağlanmış iki glukoz gruplarından oluşan simetrik indirgeyici olmayan disakkarittir. Trehaloz, insan ve diğer memelilerde eksik olsa da, bakteri, mantar, bitki ve omurgasız 1 yaygın olarak bulunur. En organizmalarda trehaloz birincil rolü, kuruma 1 ile çevresel strese karşı korumaktır. Buna ek olarak, bazı insan patojenleri hücre kılıfı sentezi bir aracısı olarak ve bağışıklık glikolipitler 2 yapımı için bir yapı bloğu olarak trehaloz kullanan tuberculosis neden Mycobacterium tuberculosis dahil olmak üzere, hastalık oluşturma etkisi için trehaloz gerektirir.
Şekil 1: Trehaloz, trehaloz analogları. (AX, yapısal değişiklik doğal trehaloz ve doğal olmayan bir trehaloz analog, bir) Yapıları. Bio ve bio potansiyel uygulamalara sahip literatürde trehaloz analogları (B) Örnekler.
Kendine özgü yapısı ve fizyolojik fonksiyonları, trehaloz mantıksal biyo (tekno) kullanım ve biyomedikal uygulamalarda 3 önemli dikkat çekti. Doğa-örneğin gözlenen trehaloz koruyucu özellikleri, çarpıcı yeteneği 4 sahibi olur Biyokoruma uygulamalarında geniş kullanım mahmuzlu aşırı dehidratasyon uğramıştır "diriliş" Bitkilerde yaşam sürdürebilmek yardımcı olur. Trehaloz, örneğin nükleik asitler, proteinler, hücre ve doku 3 arasındaki biyolojik örnekler, geniş bir dizi korumak için kullanılmıştır. Örneğin, trehaloz ilaç t sayısında bir stabilize edici katkı maddesi olarak kullanılırşapka birçok anti-kanser monoklonal antikorlar 3 olmak üzere, piyasada bulunmaktadır. Yanı sıra, trehaloz gıda sektöründe tatlandırıcı olarak kullanılır ve bu kapsamlı hem gıda ve kozmetik sanayiinde ürün korunması için kullanılır. Ticari Bu tür uygulamalar için trehaloz kabul ilk doğal kaynaklardan ya da sentez yoluyla saf trehaloz toplu miktarlarının elde edilmesi için yetersizlik ile sınırlıydı. Bununla birlikte, nişasta trehaloz ekonomik üretimi için etkin bir enzimatik proses son zamanlarda yaygın ticari kullanımı teşvik ettiği geliştirilmiştir 5.
6; kimyasal trehaloz değiştirilmiş türevleri, (Şekil 1B de gösterilen trehaloz analoglarının spesifik örnekleri, genel yapısı Şekil 1A'da gösterilen), çeşitli uygulamalar için giderek artan bir ilgi kazanmıştır, trehaloz analogları olarak adlandırılan. Örneğin, lakto-trehaloz böylece 4-pozisyonunda hidroksil grubu, bir ters stereokimyasal konfigürasyona sahiptir, galaktoz ile ikame onun glikoz birimleri ile bir trehaloz analogudur. Lacto-Trehaloz aynı stabilize edici özelliklere sahip fakat kalorisiz gıda katkı maddesi 6, 7 gibi cazip hale bağırsak enzimleri bozunmaya karşı dayanıklı olmaktadır.
trehaloz analogları Bizim Grubun faiz öncelikle mikobakteriler-spesifik problar ve inhibitörleri olarak değeri ile ilgilidir. Barry ve Davis grupları floresan mikroskobu 8 tarafından algılama sağlayan metabolik canlı M. tuberculosis hücre duvarını etiketlemek için gösterilen FITC-keto-trehaloz adında bir floresan konjuge keto-trehaloz analog, geliştirdi. BERTOZZI laboratuvar metabolik det olmak sonradan hücre duvarını etiket olabilir ve küçük azido-trehaloz (TreAz) analogları geliştirdiyansıtılmaktadır tıklama kimya ve floresan analizi 9 kullanarak. Bu gelişmeler, tüberküloz için tanısal görüntüleme maddeleri olarak trehaloz-dayanan problar kullanılarak olasılığına işaret etmektedir. Trehaloz analogları da canlılığı ve ölümcüllüğün 10, 11, 12 için gerekli olan bakteri yollarının bozmaya nedeniyle potansiyel M. tuberculosis inhibitörleri olarak takip edilmiştir.
Şimdiye kadar, biyo (tekno) mantıksal ve biyomedikal uygulamalar için trehaloz analogları geliştirmek için ana engel verimli sentetik yöntemlerin olmaması. Trehaloz analogları üreten iki geleneksel yolları kimyasal sentez üzerinde (Şekil 2) güveniyor. Diğer düzgün fonksiyonelleştirilmiş monosakkarit yapı taşları ile başlayan ve kimyasal glikosilasyonu kullanılmasını içermektedir ise bir rota, doğal trehalozun desymmetrization / modifikasyonunu içerir1,1-α, α-glikosidik bağ oluşturmak. En son derlemelerde 13, 14 tartışılmıştır Bu yaklaşımlar, M. tuberculosis 15 bu tür sulfolipid-1 gibi kompleks bir trehaloz içeren doğal ürünler, küçük miktarlarda çok adımlı bir sentez gerçekleştirilmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, her iki yaklaşım olmayan kimyagerler genellikle zaman alıcı, verimsiz erişilemez ve buna ek olarak, çevre dostu olarak kabul edilmez. Bu nedenle, trehaloz analoglarının belirli türleri sentezlenmesi için, bu stratejiler ideal değildir.
Şekil 2: trehaloz analog sentezi Yaklaşımlar. Kimyasal solda gösterilen, trehaloz analog sentezi yaklaşımlar, zor korumanız içeren çok adımlı prosedürleri kullanmakma / korumanın kaldırılması, desymmetrization ve / veya glikosilasyon adımları. sağda gösterilen enzimatik sentezi, stereoselektif olarak, sulu çözelti içinde analogları trehaloza basit korumasız substratlar dönüştürme enzim (ler) kullanır. Burada rapor enzimatik protokolü tek bir aşamada trehaloz analogları glikoz analogları ve UDP-glikoz dönüştürmek için bir trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
trehaloz analogları etkin bir biyokatalitik rota moleküllerinin bu umut verici sınıfının üretim, değerlendirme ve uygulama kolaylaştıracaktır. Trehaloz üretimi 5 ticari enzimatik işlem, bir alt-tabaka olarak nişasta kullandığı için analoglarını sentez için uyumlu değildir, diğer biyosentetik yolu vardırtrehaloz analog sentezi için istismar edilebilir doğada yolları. Ancak, son zamanlarda 6 gözden geçirilmiştir, bu alanda, araştırma, sınırlı olmuştur. Bir rapor ilgili floro-glikoz tek floro-trehaloz analog ulaşmak için Escherichia coli trehaloz biyosentetik yolunun esinlenerek bir yöntem kullanılır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, verimlilik ve genelliğini 8 sınırlı üç enzim sistemi gerektirir. Araştırılmış olan bir başka yaklaşım, ilke olarak glükoz analogları ve glükoz-1-fosfat 6, 16, 17 trehaloz analoglarının bir-adımlık sentez izin ters yönde, trehaloz fosforilaz (TREP) kullanmaktır. Bu yaklaşım, gelecekte söz var olsa da, her ikisi de eviren ve istinat TrePs şu anda analog sentezi için dezavantajları var. Örneğin, tersini TrePs yasaklı deneyimlerini varnsive verici molekül (β-D-glikoz 1-fosfat) ve tutma TrePs düşük enzim sentezleme verimler / kararlılık ve belirli alt-tabaka karışıklık sahiptir. (Enzim mühendisliği yoluyla, örneğin) önemli gelişmeler TREP-aracılı analog sentezi önce gerekli olacak pratik.
Şu anda, trehaloz analoglarının enzimatik sentezi için en pratik yaklaşım, kan şekeri ve üridin difosfat (UDP), tek bir aşama 6'da trehaloza -glükoz dönüştüren bir trehaloz sintaz (tRet) enzimi kullanılmasıdır. Son zamanlarda glükoz analogları ve UDP-glikoz (Şekil 3) 19 trehaloz analoglarını sentez -to Thermoproteus Tenax tRet-termostabil ve tek yönlü enzim 18 kullanımını bildirmiştir. Bu enzim sadece sentetik yönde çalışır ve TREP sisteminde bulunan trehaloz bozulması problemini önler. Bu tek-aşamalı bir reaksiyon coul1 saat içinde tamamlanması d ve hazır glükoz analoğu substratlar (Örnek Sonuçlar Tablo 1 den (yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tespit edildiği üzere>% 99 kadar) trehaloz analogları geniş bir çeşitliliği yüksek verimde erişilen Bölüm).
Şekil 3: trehaloz analoglarının tRet katalizörlü tek aşamalı sentezi. T. Tenax gelen Tret enzimi stereoselektif tek adımda trehaloz analogları oluşturmak için hazır glikoz analogları ve UDP-glikoz katılabilirsiniz. R1 -R4 dün = Değişken yapısal değişiklik, örneğin, azido, floro, deoksi, tiyo, stereokimyasal veya izotopik etiketli modifikasyon; Y, örneğin, oksijen ya da kükürt ya da izotopik olarak etiketlenmiş heteroatom değişken heteroatom, =.
Burada, biz reklamı sağlamaktRet reaksiyon koşulları optimize E.coli'den ekspresyonu ve tRet saflaştırılması dahil olmak üzere, tRet sentez işlemi için etailed protokol, ve sulu faz içinde tamamen gerçekleştirilir geliştirilmiş bir saflaştırma yöntemi. Bu modifiye protokol, yarı-preparatif skala (10-100 mg) üzerinde, çeşitli trehaloz benzerlerinin uygun ve verimli bir sentezi ve saflaştırılması sağlar. Biz de hazırlanması ve mikobakteri hücrelerin hızlı floresan algılama özellikli az 1 saat, mikobakterinin bir trehaloz tabanlı prob uygulanması için bu protokolün kullanımını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Top10 E.coli'den 1. Ekspresyonu ve Saflaştırılması tRet
NOT: Tret-ifade eden E. coli suşu istemek için yazarları irtibata geçiniz ve beraberindeki malzeme transferi anlaşması (Top10 E. dönüştü AraC proteinin kontrolü altında T. tenax tret geni içeren, pBAD Tret plazmid 19 coli) . Aşağıdaki protokol, tipik olarak, yaklaşık 4 mg / L'lik bir protein verimi verir.
- E. coli Tret ifade eden bir 3 mL gecede kültür hazırlayın.
- Bir lizojeni etsuyu (LB), 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden agar plaka üzerine pBAD-tRet ifade vektörü ile transforme edilen bir çizgi Top10 E.coli.
- yaklaşık 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
- plakadan tek bir koloni almak ve bir kültür tüpü içinde 100 ug / ml ampisilin içeren LB sıvı ortam 3 ml inoküle.
- 37 & # bir sallayarak inkübatör tüp yerleştirin176 C gecede 175 rpm x.
- E. coli tRet salgılayan protein ifadesini teşvik eder.
- Ekle 750 mL Terrific Broth 2.800 ml Fernbach kültürü şişesine 100 ug / ml ampisilin ile takviye edilmiştir. boş olarak, daha sonra kullanılmak üzere bir küvete şişeye transfer 1 ml suyu.
- Kültür şişeye aşama 1.1.4 üretilen 3 ml gecelik kültürden ekleyin, sonra bir kuluçka içine yerleştirilir ve 37 ° C x 200 rpm'de çalkalanır. Periyodik adım 1.2.1 toplanan boş karşı 600 nm kültürünün absorbansı kontrol edin.
- 0.5-1.0 arasında ulaşan 600 nm'de absorbans sonra, kültüre 1 M arabinoz çözeltisi (1 mM nihai konsantrasyon), 750 uL eklenmesiyle tRet ifadesini teşvik eder. inkübatör için şişeyi dönün ve x 200 rpm, 37 ° C'de gece boyunca çalkalanır.
- Pelet tRet-ifade eden E. coli hücreleri lize edildi ve.
- Bir polipropilen b kültürü aktarınottle ve 4 ° C'de 4000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun.
- Süpernatant atılır ve fosfat tamponlu tuz 15 mL (PBS) içinde pelet yeniden askıya.
- 4 ° C'de 4,000 x g'de 15 dakika boyunca 50 ml konik bir tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatantı atın ve her iki lizis (adım 1.3.4) hücre veya -80 ° C'de süresiz pelet saklamak için devam edin.
- 50 ml konik bir tüp içinde, yıkama tamponu (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCI, 20 mM imidazol, pH 8.0) içinde 20 mL 1 proteaz inhibitörü, mini tablet içinde çözülür.
- topaklarını içeren konik tüp proteaz inhibitörü ihtiva eden yıkama tamponu aktarın. pelet kadar Vorteks yeniden askıya alındı.
- (Yüzde 75 bir amplitüd 2 dakika ve 15 saniyelik bir çalışma süresi ile kapalı, 45 saniye ile 45 saniye arasında puls dizisi) 100 ml beher yeniden süspansiyon haline hücreleri aktarın ve sonikasyon ile hücrelerin lize.
- 50 ml metal konik tüp lizat aktarınve 4 ° C de 15,000 x g'de 60 dakika boyunca santrifüje tabi tutun.
- 50 ml konik bir tüp içine 0.2-0.45 um şırınga filtresinden geçirilerek lizat açıklık getirmektedir.
Not: Elde edilen lizat, tipik konsantrasyonu 100 mg / mL olduğunu.
- Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) kullanılarak E. coli hücre lizatından tRet saflaştınlır.
- Bir nikel afinite kolonuna (5 ml yatak hacmi) ile FPLC ayarlayın. iyonu giderilmiş su 10 mL ya da sütun, kirletici maddelerden arınmış kadar sütun yıkayın. Yıkama tamponu 20 mL kullanılarak kolon dengeye (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0), 1 mL / dakikalık bir akış hızında püskürtülür.
- kolona aşama 1.3.8 elde edilen lizat (20 mL) yükleyin ve absorbans, arka plan seviyeleri ulaşıncaya kadar 1 ml / dk'lık bir akış oranında yıkama tamponu ile etiketsiz proteinleri elüte (yıkama tamponu tipik olarak 80-100 ml gereklidir) .
- Zehir doğrusal gramı kullanılarak tRet His-etiketli1 ml / dk'lık bir akış hızında 60 dakika boyunca% 1-100 arasında elüsyon tamponu (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) radient. Tret yıkanan ve absorbans temel seviyeye ulaşana kadar 4 mL kesirler toplayın.
Not: Genellikle, elüsyon tamponu 60 ml protein elüt edilmesi için gerekli olan ve protein% 60-100 elüsyon tamponu aralığında elüt edilmektedir. Yaklaşık elüsyon tampon maddesi içinde saf tRet 10-15 ml elde edilir. - bir elüsyon tamponu boşluğa karşı 280 nm'de absorbans ölçülerek tRet konsantrasyonunu belirler.
- Tris Değişim tRet diyaliz ile (hidroksimetil) aminometan (TRIS) tamponu.
- üreticinin talimatlarına göre diyaliz tüpüne hazırladıktan sonra, iyonu giderilmiş su ve sonra Tris tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8.0) ile durulama Asal.
- Bir şırınga ve künt bir iğne kullanılarak diyaliz tüp içine Tret örnek yükleyin. gece boyunca diyalizTris tamponu 2 L aykırı.
- Diyaliz yıkama toplanan bir boşluğa karşı 280 nm'de absorbans ölçülerek tRet konsantrasyonunu belirler.
- 50 ml konik tüp Tret çözüm aktarın ve trehaloz analog sentezi (adım 2) devam ya da 4 ° C'de enzim saklayın.
Not: tRet termostabil bir proteindir. TRet aktivitesinde belirgin bir kayıp uygulanmaksızın birkaç ay boyunca 4 ° C sıcaklıkta Tris tamponu içinde saklandı.
TRet enzim kullanılarak Trehaloz Analoglarının 2. tek aşamalı sentezi
NOT: protokolü aşağıdaki reaksiyon verimliliği ve ürünün moleküler ağırlığına bağlı olarak trehaloz analoğunun yaklaşık 15-30 mg sağlayabilir 4 mL hacmine bağlı olarak bir reaksiyon ölçeği, tarif eder. reaksiyon bileşenleri istenirse daha fazla veya daha az trehaloz analog elde etmek için ölçeklenebilir.
- (0.080 mmol, kütle moleküler ağırlığına bağlıdır) glikoz analog ekleme, UDP-glikoz (0.15 ml konik bir tüp 160 mmol, 97.6 mg) ve (0.080 mmol MgCI2, 16.3 mg) eklenmiştir. Bu bileşenlerin son konsantrasyonları sırası ile 20 mM, 40 mM ve 20 mM olacaktır.
- gerektiğinde Tris tamponu uygun bir hacmi (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8.0), 300 ug / ml ve son bir son enzim konsantrasyonu elde etmek için, (aşama 1.5.4 de elde edilmiş) Tris tamponu tRet ekleyin ve 4 mL hacim. Pipetleyin Karışım yukarı ve aşağı yavaşça veya katıların çözünmesi için tüp ters.
- 1 saat süre ile 300 rpm'de çalkalanarak 70 ° C'de reaksiyon inkübe, daha sonra soğuması için buz üzerinde tüp yerleştirin.
Ham enzimatik tepkime karışımından Trehaloz Analoglarının 3. saflaştırılması
- Tüm sıvı filtre içinden geçinceye kadar santrifüj filtre ünitesine deiyonize su 3 mL ekleme ve 3000 x g'de santrifüj zar eser gliserol ayrılması için bir santrifüjlü filtre ünitesi (nominal moleküler ağırlık limitli (NWML), 10 kDa) ön-durulamatüpe (yaklaşık 20 dakika). iki ek kez tekrarlayın. hemen önce ya da reaksiyon (adım 2.3) sırasında bu adımı tamamlayın.
- (Adım 2.3 de elde edilmiş), enzimatik reaksiyon karışımı soğutulduktan sonra, önceden durulanmıştır santrifüj filtre birimine aktarmak. santrifüj filtre ünitesine iyonu giderilmiş su ve transfer 1 ml reaksiyon tüpü durulayın. ürünün maksimum geri kazanımı için reaksiyon tüpünün tekrarlayın durulama.
- Tüm sıvı tüpün (yaklaşık 20 dakika) içine filtreden geçer kadar 3.000 xg'de santrifüj filtre ünitesi santrifüj. Tüm sıvı borusu (yaklaşık 20 dakika) içine filtre geçene kadar 3,000 x g'de iyonu giderilmiş su ve santrifüj 3 mL santrifüj filtre ünitesinin üst bölmeyi durulayın. ürünün maksimum iyileşme için durulama tekrarlayın.
- Santrifüj filtre ünitesinin üst bölmeyi atın. Tüp (tipik süzülen madde hacim altındaki süzüntüye karma-yataklı iyon-değişim reçinesi (3 gr) ilaveume durulama sayısına bağlı olarak 8-15 ml) 'dir. çözeltisi içinde süspansiyon haline getirilmiş reçine boncuklarını tutmak için yeterli bir hızda Manyetik bir karıştırma çubuğuna sahip olan, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılır.
- Süpernatantı Durusu ve reçine çıkarmak için filtre. Geri kalan reçine durulama iyonu giderilmiş suyun 5 mL ekleyin. süpernatant süzün ve birinci dekantasyon ürün çözeltisi ile birleştirerek, süzün. ürünün maksimum geri kazanımı için reçine tekrarlayın durulama.
- trehaloz analog ürünün başlangıç malzemesinin glükoz analoğu tam dönüşüm elde olup olmadığını belirlemek için ince katman kromatografisi (TLC) veya HPLC vasıtasıyla reaksiyonun analiz edin. TLC analizi için adım 4.1 ve HPLC analizi için 4.2 adım.
- kurutuldu ürün elde liyofilizasyon veya döner buharlaştırma ile suyun çıkarılması. tepkimeye girmemiş glükoz analoğu TLC ya da HPLC analizi sırasında gözlenmediğinde, kromatografi ile saflaştırma gereksizdir. Reaksiyon Yie elde etmek üzere ürün tartılırld ve nükleer manyetik rezonans gerçekleştirmek (NMR) spektroskopik analizi (adım 4.3) ürün yapısı ve saflığını teyit etmek.
- reaksiyona girmemiş glükoz analoğu TLC analizi gözlenen ise, bir ebat eksklüzyon kolonu kullanılarak trehaloz analog ayırın.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak deiyonize suya doymuş, ekstra-ince P2 poliakrilamid kordon boyut dışlama ortam içeren 1 x 100 cm kolon hazırlanmıştır.
Not: ebat eksklüzyonlu kolon, iyonu giderilmiş suyla yıkandıktan sonra yeniden kullanılabilir. - Yeniden çözülür kurutuldu enzimatik tepkime ürünü iyonu giderilmiş su, 0.5 mL (adım 3.7 de elde edilmiş). El ile boyut dışlama sütununa veya bir sütun akış adaptör ile bir ürün çözeltisi uygulanır. deiyonize su bir başka 0.5 mL ham ürünü ihtiva şişeyi yıkayın ve boyut dışlama sütununa yüklemek.
- yerçekimi akışı ile, iyonu giderilmiş su ile ürün elde edilmiştir ve yaklaşık 2 m fraksiyonlarım toplamakL hacmi.
- TLC (adım 4.1) ile kesirler analiz edin. Saf trehaloz analog içeren kesirler Havuzu.
- kurutuldu ürün elde liyofilizasyon veya döner buharlaştırma ile suyun çıkarılması. Reaksiyon verimi elde etmek ve NMR analizi geçmek için ürünü tartılır (adım 4.3).
- üreticinin talimatlarına uygun olarak deiyonize suya doymuş, ekstra-ince P2 poliakrilamid kordon boyut dışlama ortam içeren 1 x 100 cm kolon hazırlanmıştır.
Trehaloz benzer ürünler 4. analizi
- TRet reaksiyon ince tabaka kromatografisi (TLC) analizi gerçekleştirebilir.
NOT: Bu prosedür, aynı zamanda ebat eksklüzyonlu kolon fraksiyonları analiz etmek için kullanılabilir. TLC plaka bileşik lekeleme gözlemlemek için TLC analizi öncesinde reaksiyon karışımı ya da sütun fraksiyonları konsantre gerekli olabilir.- Mark bir kalem ile TLC plakası yüzeyinde şeritleri ve toplanan uygun glikoz analog standart, trehaloz analog standart (varsa), reaksiyon karışımına dahil şerit, (ya da fraksiyonlara analit (ler) ve ilgili standart (lar) uygulanır boyut exclusion kolon saflaştırması), ve bir ko-Noktası. TLC plakasına her bir örnek uygulandıktan sonra, levha kurumaya bırakın.
Not: Reaksiyon analizi için numune tipik olarak 2 uL TLC plakasına uygulanır. - N-butanol / etanol / deiyonize su kullanılarak TLC plakası geliştirmek (5: 3: 2).
- Şeker içeren noktalar (genellikle 5 dakika) görüntülenebilir kadar sonra yüksek ayarda bir sıcak plaka üzerinde etanol (şeker leke) ve ısı% 5 H 2 SO 4 daldırın, geliştirilen TLC plakası kurutun.
- Mark bir kalem ile TLC plakası yüzeyinde şeritleri ve toplanan uygun glikoz analog standart, trehaloz analog standart (varsa), reaksiyon karışımına dahil şerit, (ya da fraksiyonlara analit (ler) ve ilgili standart (lar) uygulanır boyut exclusion kolon saflaştırması), ve bir ko-Noktası. TLC plakasına her bir örnek uygulandıktan sonra, levha kurumaya bırakın.
- Ayrılması ve karbonhidrat saptayabilen bir HPLC sistemi kullanılarak tRet Reaksiyon karışımlarının HPLC analizi yapın. Bu protokol kırılma indeksi kullanan bir aminopropil HPLC kolonu ve algılama kullanarak karbonhidrat ayrılmasını gerektirir.
- HPLC için bir ön-sütun guard içeren aminopropil sütunu (4.6 x 250 mm) takın.
- 0.4 bir akış oranında, deiyonize su içinde% 80 asetonitril ile aminopropil sütun dengeyemL / dakika.
- aminopropil kolonuna reaksiyon ürünü (veya standart) çözeltisi yerleştirin.
- 0.4 ml / dakikalık bir akış oranı ve 50 ° C kolon sıcaklığı deiyonize su içinde% 80 asetonitril ile ürün (veya standart) yıkayın. Tipik olarak, kullanılan çalışma süresi 40 dakikadır.
NOT: buharlaştırıcı ışık saçma tespiti (ELSD) gibi diğer yöntemler kullanılabilir, ancak glükoz analoğu başlangıç malzemesi ve trehaloz analog ürünün her ikisi de, kırılma endeksi ile tespit edilebilir. dk ve trehaloz analogları 15-25 dakika arasında Zehir 10-15 arasında tarif edilen koşullar kullanılarak, glikoz benzerleri genellikle Zehir.
- Saflaştınldı trehaloz analoglarının NMR analizi.
- D 2 O (700 uL) içinde arıtılmış trehaloz analog çözülür ve bir NMR tüpüne çözeltisi aktarın.
- 1 H NMR ve uygun tesisin protokollerine göre 13C NMR spektrumları elde edin.
- , Sentez arındırmak, ve M. smegmatis 6-TreAz (Msmeg) yönetmek.
- 15 ml konik bir tüp 6-azido-6-deoksi glukopiranoz (6-GlcAz, 0.020 mmol, 4.1 mg), UDP-glikoz (0.040 mmol, 24.4 mg) ve MgCl2 (0.020 mmol, 4.1 mg) eklenir.
- 300 ug / mL'lik bir son enzim konsantrasyonu 1 ml'lik bir nihai hacim elde etmek için (adım 1.5.4 de elde edilmiş) Tris tamponu tRet ekleyin. Pipetleyin Karışım yukarı ve aşağı yavaşça veya katıların çözünmesi için tüp ters.
- 15 dakika boyunca çalkalayarak 70 ° C 'de reaksiyon inkübe edin.
- iyonu giderilmiş su, 3 mL ile enzimatik tepkime karışımı seyreltik bir önceden yıkanmış, santrifüj, filtre ünitesinin (NMWL 10 kDa) aktarın. sıvının çoğu, yaklaşık tüp içine filtre üzerinden 10 dakika geçinceye kadar 3.000 xg'de filtre ünitesini santrifüj.
- Sil incisantrifüj filtre ünitesinin e üst bölme. 25 dakika için oda sıcaklığında tüp ve bir karıştırma / titremesi karma yataklı iyon-değişim reçinesi (0.75 g) ekleyin. Süpernatantı Durusu ve reçine çıkarmak için filtre.
Not: Adım 5.1.1-5.1.5 az 1 saat, yaklaşık 5 mM konsantrasyonda 6-azido-trehaloz (6-TreAz) sulu bir çözüm sağlar. 5 mM konsantrasyonu, ürünün alt tabaka kantitatif dönüşüm ve bu adımlar sırasında ürünün asgari seviyede kayıp varsayarak, saflaştırma adımları sırasında yer alır seyreltme göre tahmin edilir. Çözelti steril olarak filtrelenir, istenirse, bir biyolojik numuneye eklenmeden önce olabilir. - 100-1,000 uL nihai kültür hacmi ve 25 uM aralığında bir son 6-TreAz konsantrasyon elde etmek için, tipik olarak, M. smegmatis bir log-faz kültürünü (Msmeg) 6-TreAz ürün çözeltisinin uygun bir hacim. istenen süre, tipik olarak 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- Azid etiketli hücrelere bir flüorofor konjuge için kimya tıklayın gerçekleştirin. Bu protokol, Msmeg hücre yüzeyi azidler bir florofor sağlamak için bakır ile katalize edilen azit-alkin sikloadisyon (CuAAC) kullanın.
- 5 dakika boyunca 3,900 x g'de santrifüjleyin hücreleri, ve daha sonra PBS,% 0.5 sığır serum albümini ihtiva eden hücreleri yıkayın. İki kez tekrarlayın.
- bunları düzeltmek için PBS içinde% 4 para-formaldehit pelet hücreleri yeniden askıya. 10 dakika süreyle kuluçkalandıktan sonra hücreler, yıkama adımı 5.2.1 tekrarlayın.
- 138 uL PBS içinde pelet hücreleri yeniden askıya.
- DMSO içinde alkin karboksirodamin 110 (Alkin-488) 'in bir 1 mM stok çözelti 3 mcL.
- iyonu giderilmiş su içinde sodyum askorbat taze hazırlanmış bir 60 mM stok solüsyonu 3 uL ekleyin.
- Tert-butanol / dimetilsülfoksit Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA) içindeki bir 6.4 mM stok çözeltisi (DMSO) 3 mcL 4: 1 arasındadır.
- 3 & # ekle956; deiyonize su içinde CuSO 4 bir 50 mM stok solüsyonu ilave.
- Pipet Hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı, daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
- Adımı tekrarlayın 5.2.1 hücreleri yıkamak için. 150 ul PBS hücrelerin yeniden askıya.
- Hücresel floresan analizi yapın. Bu protokol, etiketli Msmeg hücresel floresan görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanın.
- Bir mikroskop lamı PBS içinde süspansiyon haline getirilmiş bakteri hücreleri 10 ul ekleyin ve hafifçe lamel kenarına kullanılarak ince bir tabaka halinde sıvı yayıldı. karanlıkta kuru hava için izin verin.
- Daha sonra yapıştırıcı kapak numunesi üzerinde kayıyor yerleştirin ve uygulamak, kurutulmuş numune üzerinde montaj orta 10 uL ekleyin (örneğin, oje) hareketsiz hale getirmek.
- Görüntü 100X büyütmede bir floresan mikroskop kullanılarak slaytlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T. Tenax tRet yaklaşık 4 mg, standart protein ekspresyonu ve saflaştırma teknikleri kullanılarak / L'lik bir verimle elde etmek üzere, E. coli 'den elde edilmiştir. Tek bir nikel afinite kromatografisi adım (a Örnek FPLC izleme Şekil 4'te gösterilmiştir), E. coli lizattan tRet saflaştırmak için yeterliydi. TRet sentez işlemi üzerindeki ilk yayında kurulmuş olarak, yeniden birleştirici T. Tenax tRet çeşitli glükoz analogları-çoğu, geniş bir dönüştürme yeteneğine sahiptir ticari olarak temin-karşılık gelen trehaloz analoglan yüksek verimlilik, 19 vardır. Bizim ilk rapor protokol kullanılarak glükoz analogları başlayan bir dizi HPLC belirlenmiş reaksiyon verimlerini verir Tablo 1, tRet alt tabaka karışıklık ve sentez için uygunluğu kapsamını göstermektedir. azido, floro-, deoksi dahil olmak üzere çeşitli yapısal değişiklikler,tiyo, şeker halka etrafında farklı konumlarda stereokimyasal değişiklikler olan temel durum, 4-pozisyonunda değişiklik olması ile, vahşi tip enzimin tarafından iyi tolere edilir.
Şekil 4: FPLC tarafından Tret arıtma için Temsilcisi sonuçları. E.coli lizat rekombinant T Tenax tRet saflaştırılması 1.4.1-1.4.4 adımlarda açıklandığı gibi, nikel benzerlik kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mavi, ultraviyole (UV) absorbansı izleme; açık yeşil, elüsyon tampon konsantrasyonu; koyu yeşil, basınç. Tret tekabül zirve bir okla gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Tret reaksiyonu için tipik verimleri. HPLC tarafından belirlenen ve birkaç trehaloz analogları tRet reaksiyon izole verim. ND, algılanmıyor. - Reaksiyon optimize edilmiş protokolü kullanılarak yarı hazırlayıcı ölçekte yapılmamıştır gösterir. * Bir boyut dışlama kromatografisi aşaması gerekli olduğunu gösterir. Yatay bölme çizgileri trehaloz şeker halkası üzerinde değişiklik konumunu ayırın. izni ile referans 19 uyarlanan Tablo; Bu çalışmada izole verim içerecek şekilde güncellenmiş. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Bu yazıda, Tret sentez sürecinin genel verimliliğini ve hızını artırmak bizim ilk protokole optimizasyonları rapor. Orijinal protokol 10 mM glukoz kullandık ikenalogue ve 40 mM UDP-glikoz, karşılaştırılabilir dönüştürme reaksiyonu etkin başına oluşturulan ürün miktarını iki katına ve nispeten pahalı olan UDP-glikoz ve atık, sınırlama, 20 mM glükoz ve 40 mM UDP-glukoz kullanılarak elde edilebilir olduğu tespit edilmiştir . glikoz analog ve UDP-glukoz eşmolar miktarda kullanarak alt dönüşüm sonuçlandı. Eğer arzu edilirse de (70 ° C 'de sadece 15 dakika içinde 6-TreAz 6-GlcAz nicel dönüşümü ile ortaya konmuştur Birçok analogları, karşılaştırılabilir dönüştürme koruyarak, reaksiyon süreleri, aynı zamanda, ilk rapor, 60 dakika daha azına kısaltılabilir ) 5 Şekiller ve 6.
Burada rapor saflaştırma protokolü esas olmayan bir kromatografik sıkma diyaliz / iyon değişimi yöntemi orijinal enzim çökeltme / silika jel kromatografi yöntemi yerine artırıldı. Bu değişiklik gerekçesi Tret r kieaction karışımı nötr trehaloz analog ürünün dışında iyonik türlerin tamamı oluşur. Bu nedenle, karışım spin diyaliz enzim kaldırmak ve daha sonra az 45 dakika içinde sulu çözelti içinde saflandırıldı trehaloz analog teslim iyonik türlerin kaldırmak için karma yataklı iyon değiştirme reçinesi ile muamele olabilir. Bu, tüm sulu saflaştırma yöntemi çevresel zararlı organik çözücüler, zaman alıcı bir buharlaşma ve filtrasyon adımları, özellikle de sigara kimyacılar için yavaş ve hantal bir süreçtir, kuru yük silis jel kromatografisi, önler. HPLC analizleri tarif TLC kullanarak veya belirlenen kantitatif dönüşüm sergileyen Tret reaksiyonlar için, bu arıtma yöntemi nedeniyle iyon değişimi bazı şeker bağlayıcı ürün kaybı ile bildirilen reaksiyon ölçeğinde büyük olasılıkla yaklaşık% 60-80 izole verim sağlar reçine (temsilci izole verim için bakınız Tablo 1). reaksiyona girmemiş glükoz analoğu kalması durumunda,Bu, su ile yıkanarak, bir poliakrilamit tane bazlı boyut dışlama kolonu kullanılarak istenen trehaloz analog üründen ayrılabilmektedir. Eğer tercih edilirse, bu da bir aminopropil sütunu ile preparatif skala HPLC ile gerçekleştirilebilir. Ürün saflığı TLC, HPLC, ve / veya NMR spektroskopik analizleri ile tespit edilebilir. Şekil 5, tarif edilen protokol ile sentezlendi 6-TreAz için temsili analitik verileri gösterir. TLC ve HPLC verileri, bu reaksiyon için 6-TreAz ürün 6-GlcAz substrat nicel bir dönüşüme işaret ve sıkma diyaliz / iyon değişimi saflaştırma aşamalarından sonra izole edilmiş verim,% 58 idi. 1H ve 13C NMR spektroskopik analizi, özellikle α, yeni oluşan glikosidik bağın a-stereokimya, yanı sıra saflığı da dahil olmak üzere, 6-TreAz ürünün yapısını teyit etmiştir.
Şekil 5: tRet reaksiyonu için tipik analitik veriler. (A), TLC (B) 6-TreAz 6-GlcAz bölgesinin tRet ile katalizlenmiş dönüşümü HPLC analizi. Eğirme diyaliz / iyon değişimi saflaştırmadan sonra elde edilen 6-TreAz ürünün (C) 1H-NMR ve (D), 13C NMR spektrumları,. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
M. tuberculosis spesifik tespiti için trehaloz benzerlerinin yukarıda belirtilen değeri göz önüne alındığında, Tret süreç tüberküloz araştırma ve teşhis uygulamaları için trehaloz-tabanlı prob geliştirilmesini ve kullanımını kolaylaştırmak gerekir. Bu tür bir uygulama göstermek için, optimize edilmiş Tret kullanılanhızla hazırlanması, saflaştırılması ve 6-TreAz-bir trehaloz tabanlı tıklama kimya probunu floresan algılamasını etkinleştirmek için 9 Yapılır mikobakteriler yönetmek için süreç (iş akışı ve temsili veriler Şekil 6'da gösterilmiştir). Kısaca, tRet kantitatif 15 dakika içinde 6-TreAz ticari 6-GlcAz dönüştürmek için kullanılmıştır, ve daha sonra reaksiyon karışımı, sadece 45 dakika sürdü eğirme diyaliz / iyon değişimi saflaştırma yöntemi, tabi tutuldu ve (birden fazla durulama adımları geliştirmek için atlanmış hız). Bu nedenle, bilinen konsantrasyonda saf 6-TreAz (~ 5 mM) bir sulu stok çözeltisi, sadece 1 saat içinde elde edildi. 6-TreAz hazır hemen tıklama kimyası aracılı bağlanmasından 20, 21 arasında bir kolu gömülü hücre yüzeyi, bir azid etiketleme gerçekleştirmek için bir model bakteri Msmeg (son 6-TreAz konsantrasyonu ~ 25 uM) artan bir kültür uygulanmıştır bir floresan prob. Daha sonra,etiketli hücreler 6-TreAz ile tedavi edilen hücreler için güçlü bir floresan gösterdi floresan mikroskobu ile analiz edildi. Beklendiği gibi, 6-TreAz ya da muamele edilmemiş kontrol numuneleri 6-TreAz alımı ve metabolik dahil 9 için gerekli olan, bir işlevsel trehaloz taşıyıcı 22, eksik, Resim floresan gösterdi.
Şekil 6: Bir Tret sentezlenmiş trehaloz analog kullanarak mikobakteri hızlı tespiti için Temsilcisi sonuçları. (A) 6-Tre hızlı sentezi, saflaştırılması ve kullanım için iş akışıMsmeg floresans algılama için Az. Protokol 5.1.1-5.1.6 azidlerinden ile hücre yüzeyinde metabolik etiketleme gerçekleştirmek için Msmeg yaşamak için onu yönetmek sonra, sentez ve (a ~ 5 mm 1 saat içinde sulu çözelti vererek) 6-TreAz saflaştırmak için kullanıldı Adımlar. adımda 5.2.1-5.2.9 de tarif edildiği gibi,, kimya (CuAAC) seçeneğini bir alkin ile modifiye edilmiş fluorofor, alkin-488 ile hücre yüzeyi azidler tepkimeye gerçekleştirilmiştir. Işlevsel trehaloz taşıyıcı Msmeg kontrol numuneleri muamele edilmemiş ya da trehaloz taşıyıcı (Δ sugC) eksik kalan ise (vahşi tip ve Δ sugC :: sugC), mutlaka floresan gözlenmemiştir ihtiva eden 6-TreAz tedavi edilen Msmeg (B) floresan görüntüleme . izni ile referans 19 uyarlanan Şekil; gelişmiş Tret protokolünden iş akışı ve görüntüleme verileri ile güncellendi. Ölçek çubukları, 5 um. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trehaloz analogları gıda ve ilaç korunması mikrobiyal enfeksiyonların 6 tanı ve tedavi, çeşitli alanları etkileme potansiyeline sahiptir. Mevcut çok basamaklı kimyasal sentez yöntemi (doğal karmaşık mikobakteriyel glikolipitler ortaya çıkan gibi) modifikasyon birden fazla site kompleks trehaloz analoglarını üretmek için de yararlıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler, nispeten basit bir tekli ikame edilmiş trehaloz analogları 9, 13, 14 sentezine uygulandığı zaman da kaçınılmaz uzun ve verimsizdir. Alternatif sentetik yaklaşımlar hızlı ve verimli bir şekilde bahsedilen alanlarda değeri olabilir trehaloz analogları çeşitli üretmek için gereklidir. Doğadan trehaloz-sentezleyen enzimlerin istismar Biyokatalitik yaklaşımlar en vaat tutun. Birkaç trehaloz sentezleme yollarının rağmendoğadaki, biz çeşitli nedenlerle trehaloz analog sentezi için ideal bir enzim T. Tenax 18 den Tret düşünün.
T. Tenax adlı tRet reaksiyonları gelişmiş hız ve büyük ölçekli üretim ortamlarında mikrobiyal bulaşma önlenmesi için ısıtılmasını sağlar, termostabildir. T. Tenax adlı tRet trehaloz parçalama yeteneğine sahip olmayan bir tek yönlü bir enzimdir. T. Tenax adlı tRet E.coli'den ekspresyonu ve saflaştırılması için uygun olup, ve nakliye ve depolama kolay olan. Tret reaksiyonu tek bir adımdır ve basit yüzeyler şekeri ve UDP-glukoz içerir. yapısal / işlevsel farklı glukoz analogları çok sayıda çok sayıda ticari satıcılardan temin edilebilir. UDP-glikoz, özellikle TREP donör β-D-glikoz 1-fosfat ile karşılaştırıldığında, nispeten pahalı olmayan bir glukoz donörüdür. T. Tenax gelen Tret yüksek pr vardırglukoz alt-tabaka yapısı omiscuity, böylece çeşitli trehaloz analogları erişilebilir. Tret reaksiyon karışımından ürün arıtma hızlı ve basittir.
Bu yazıda, Tret enziminin yukarıdaki olumlu özellikleri istifade trehaloz analog sentezi için ayrıntılı bir optimize protokol bildirdi. TRet işlemi arzu edildiği takdirde, ek ölçek büyütme mümkün olmalıdır olsa da, bir yarı-preparatif skala (10-100 mg), saf trehaloz benzerlerinin çeşitli ulaşmak için kullanılabilir. Analoglarının çok sayıda türleri azido, deoksi, floro ve tiyo-trehaloses, hem de trehaloz stereoizomerler de dahil olmak üzere önceden ve bu çalışma, erişilebilir, ancak diğer modifikasyonlar da mümkündür (örneğin, izotop etiketli ve radyo-etiketli trehaloses), özellikle ilgi konusudur. Tret sürecinin sentez ve saflaştırma aşamaları operasyonel basit ve kolayca sentetik che eğitimli olmayan personel tarafından yapılabilirmistry. Eğer ebat eksklüzyonlu kolon: tRet işleminin en çekici özelliklerinden biri, her iki Sentez ve saflaştırma adımları, (istenilen yıkama adımlarının sayısına bağlı olarak 1-4 saat arasında değişen bir zaman çok kısa bir süre içinde yürütülebilir olmasıdır arıtma reaksiyona girmemiş glikoz analog trehaloz analog ürünü ayırmak için gerekli olan, bu hızlı trehaloz analog sentezi için mevcut yöntemlere) önemli ölçüde daha hala yaklaşık 2 gün, toplam süresini artırır.
Tret süreç henüz bildirilen trehaloz analogları erişen en verimli enzimatik yol olmasına rağmen, gelecekte iyileştirme için fırsat sağlamak bazı dezavantajları vardır. UDP-glikoz başka şeker vericilerine göre daha ucuz olmasına rağmen Birincisi, tRet işleminin verimliliği daha ucuz bir kaynak, UDP-glikoz bir enzimatik sentezi, örneğin, α-D-glikoz 1 ile birleştirilmesi suretiyle geliştirilebilir fosfat, identifyi göreUDP-glikoz için ucuz bir vekil ng. Bu yöntemin ikinci bir dezavantaj, reaksiyon kapsamı sonuç olarak tRet substrat tolerans tabi olmasıdır. Vahşi tip tRet toleransı (Tablo 1 e bakınız) çok yüksek olsa da, bazı analoglar, bu yöntem (örneğin, 4-konumunda modifiye edilmiş benzerleri) kullanılarak sentez edilemez. Bu nedenle, artan substrat toleransı Tret ve mühendislik sürümleri değerli olacaktır. Birçok tRet katalizörlü tepkimeler niceliksel dönüşüm ile devam Üçüncü olarak ise, daha düşük dönüşüm kromatografik saflaştırma aşamasını zorunlu kılmaktadır. Bu protokol, biz ucuz olduğu için herhangi bir özel ekipman gerektirmez, nispeten yavaş boyut dışlama işlemi kullanarak odaklanmış ve su yıkamayla sadece yapılabilir. Seçenek olarak ise, bir preparatif ölçek aminopropil sütunu kullanılarak HPLC ile saflaştırma ürünün saflaştırılması için daha hızlı bir yöntem olarak kullanılabilir. Bu sınırlamaların bazıları rağmen, Tret süreci sağlartrehaloz analoglarının hızlı ve etkin hazırlık için güçlü bir platform ve biyo (tekno) kendi değerlendirme ve uygulama mantıklı ve biyomedikal alanları hızlandırmak gerekir. Yukarıda tartışılan Tret sürecine gelecek gelişmeler, daha fazla araştırma ve trehaloz ve türevleri ile ilgili uygulamalar güçlendirecektir.
Trehaloz analogları çeşitli alanlarda potansiyel değere sahiptir. Giriş kısmında zikredildiği gibi, doğal trehaloz şekilde trehaloz gibi bozunma direnci gibi özellikleri olan analogları çekici olabilir, Biyokoruma ve gıda tatlandırma uygulamalar için kullanılır. Buna ek olarak, doğal trehaloz kararlı izotop etiketli ve radyo etiketli versiyonları çeşitli araştırma amaçlı ticari olarak mevcuttur ve Tret süreci kesinlikle bu moleküllerin hızlı ve verimli erişim sağlayabilir. Trehaloz analoglan trehaloz memelilerde eksik olduğu problar ve inhibitörlerle patojenleri hedefleme için de ilgi konusudur. Bir apÖzellikle ilgi çekici olan bu alanda plikasyon mikobakterilerin tespitidir. M. tuberculosis, yılda 1,5 milyon kişinin ölümüne tüberküloz etkeni, memelilerden bulunmadığına eşsiz trehaloz işleme yolları içerir. Örneğin, trehaloz-geri kazanım taşıyıcı ve dış zar yerleşik glikolipitler halinde trehaloz dahil alt enzimler, memelilerde 22 mevcut değildir. Tespit trehaloz analogları ile mikobakteriler özel amaçlı hedefleme model sistemlerinde ve muhtemelen insan hastalarda M. tuberculosis enfeksiyonunun in vivo görüntüleme için çekici bir yaklaşım sunmaktadır. Nitekim, FITC-keto-trehaloz ve TreAz (Şekil 1B) Yukarıdaki örnekleri bu tür gelişmelerin 8, 9 yolunu açmıştır. araştırma topluluğunun bu araçların erişimini kolaylaştırmak için, biz burada hızla için bir protokol bildirdi synthesizing ve tıklama kimya ile birlikte görüntü mikobakterilere 6-TreAz kullanarak.
Bu protokol, tüberküloz teşhis uygulamaları için yararlı diğer tespit trehaloz analoglarının geliştirilmesi için adapte edilebilir. Örneğin, Barry ve Davis, ilk mikobakteriyel enfeksiyon, 8, in vivo görüntüleme için, pozitron emisyon tomografisi (PET) prob olarak 18 F-floro-trehaloz olası kullanımını önermiştir. Tret süreci bu hedefini gerçekleştirmeye için ideal olabilir. 18F-2-floro-glükoz (18F yarı ömür = 110 dakika kısa ömürlü olduğu tRet hızlı ve nicel şekilde 2-floro-glikoz 2-floro-trehaloz üretme kapasitesine sahip önemlidir (Tablo 1 e bakınız) ), son derece hızlı kimya gerektiren. Zaten tümörlerin PET görüntülemesi için klinikte kullanılmaktadır, çünkü Ayrıca, 18F-2-floro-glukoz kolayca kullanılabilir. dev için tarif tRet sürecinin kullanımı18 F-floro-trehalozun elopment ve çeşitli uygulamalar için diğer trehaloz analogları laboratuarımızda halen devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | S374 | |
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
