Introduction
En begrænsning ved nuværende HIV-1 behandlinger er, at de skal være kronisk administreret for at forhindre progression af sygdommen. Transplantation af HIV-1 resistent T-lymfocyt, eller hæmatopoietiske stamceller, har potentialet til at give langsigtet kontrol af HIV-1-replikation i fravær af lægemiddelbehandling 1,2 og kan også være en effektiv tilgang til at opnå en HIV-1 kur 3. En måde at gøre celler modstandsdygtige mod HIV-1-replikation er at indsætte et eller flere gener der koder for anti-HIV-1 RNA'er eller peptider i en inficeret individs celler under en autolog transplantation 4. Adskillige kandidat anti-HIV-1-gener er blevet designet med nogle ind kliniske forsøg i kombinationer af to 5 eller tre 6, for at forhindre udviklingen af HIV-1 resistens over for en enkelt gen.
Anti-HIV-1 RNA er blandt de bedste kandidater til kombination genterapi på grund af deres ringe potentiale til at fremkalde immunresponser og fordi detranskriberes fra meget korte gensekvenser. Nogle anti-HIV-1 RNA er designet til at målrette viral indtrængen og integration. Men de fleste anti-HIV-1 RNA målrette post-integration trin i den virale livscyklus (figur 1). Post-integration hæmmere omfatter lokkefugle RNA, rettet mod de HIV-1 regulerende proteiner Tat eller Rev 1, og antisense-baserede RNA, rettet mod forskellige steder i HIV-1 RNA, såsom ribozymer 7, shRNAs 8 og U1i RNA 9. Metoder, der er anvendt til at sammenligne virkningen af anti-HIV-1 RNA inkluderer monitorering viral replikation i celler transduceret med gener, der koder for kandidat RNA'er og måle viral produktion i celler transient transficeret med plasmider, der udtrykker kandidat RNA'er og en HIV-1 ekspressionsplasmid 10 -13. Vi har tidligere anvendt et HIV-1-produktion assay til screening HIV-1 RNA til nye ribozym målsteder 13-15. Disse fremgangsmåder er siden blevet raffineret for at optimere udformningen af et RNAinterferens molekyle udtrykt fra plasmid-DNA som en shRNA eller leveres som et syntetisk siRNA 16. Assayet måler produktionen af modne virus fra humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler, og kan anvendes til at sammenligne virkningerne af inhibitorer, der er målrettet efter integration trin i HIV-1-replikation cyklus (figur 1). For inhibitorer, der er målrettet præ-integration trin, er alternative assays, såsom et TZM-bl celle infektivitet assay 17 er nødvendige til vurdering antiviral virkningsfuldhed.
Større sikkerhedsproblemer for levering af anti-HIV-1 RNA i klinikken omfatter potentielle off-target effekter på humane RNA eller proteiner og aktivering af medfødte immun sensorer. For at evaluere toksiciteten af anti-HIV-1 siRNAs, har vi anvendt en celleviabilitetstest i forskellige cellelinier 16. Vi målte også aktivering af det dobbeltstrengede RNA immune sensorer, RNA aktiveret protein kinase R (PKR) og Toll like receptor 3 (TLR3), samt expression af interferon stimulerede gen, ADAR1 P150. Disse assays kan anvendes til at bekræfte, at effektiviteten af anti-HIV-1 RNA'er ikke skyldes indirekte virkninger på cellernes levedygtighed eller immun sensor aktivering. De er også nyttige i at udelukke kandidat RNA'er med potentielle toksiciteter fra yderligere udvikling.
I de følgende protokoller, procedurer identificere nye terapeutiske RNA og optimere format eksisterende beskrives. Fremgangsmåderne er nyttige til screening RNA baserede post-integration inhibitorer af HIV-1 replikation og kan tilpasses til at screene andre post-integration inhibitorer, såsom små molekyler rettet Rev medieret eksport af viralt RNA 18 eller CRISPR / Cas systemer designet til at målrette integreret HIV-1-DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celler og transfektioner
- Kultur HEK 293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. En 2 x 10 5 celler / ml suspension i celledyrkningsmediet. Der tilsættes 500, 100 og 1000 pi af cellesuspensionen til hver brønd i 24-brønds, 96-brønds og 12-brønds plader, til virusproduktion, cellelevedygtighed og immunaktivering assays, henholdsvis (figur 2A).
- Vend forsigtigt pladerne og inkuberes dem O / N ved 37 ° C med 5% CO2. Grow celler til 50-70% konfluens.
- Ifølge en transfektion plan, forberede fortyndinger af test RNA og deres kontroller i 1,5 ml mikrorør (eksempel, figur 2B).
- For virusproduktion assay fremstilles en 10 ng / pl fortynding af en HIV-1-ekspressionsplasmid og tilsæt 10 ul til hvert rør. Næste forberede 5 uM fortyndinger af test RNA og en negativ kontrol RNA. Læg 2,5 eller 10 pi af hver test RNA og negativ kontrol fortynding til de tilsvarende rør i 25 eller 100 nM slutkoncentrationer.
- For cellelevedygtigheden assay forberede 5 um fortyndinger af test-RNA'er og 10 mg / ml fortynding af den positive kontrol-RNA, lavmolekylær poly I: C. Tilsæt 2 pi test-RNA eller positive kontrol RNA fortyndinger til de tilsvarende rør til 100 nM eller 200 mikrogram / ml endelige koncentrationer henholdsvis.
- Til immun aktivering assay, tilsættes 20 ul test RNA eller positiv kontrol RNA fortyndinger udarbejdet i trin 1.3.2. til de tilsvarende rør til 100 nM eller 200 ug / ml slutkoncentrationer henholdsvis.
Bemærk: test RNA ekspressionsplasmider, forberede 10 ng / pi fortyndinger i stedet for de 5 uM fortyndinger af test-RNA, hvilket giver endelige størrelse 25 og 100 ng for trin 1.3.1. og 100 ng for trin 1.3.2. og 1.3.3.
- Der tilsættes 50, 25 eller 75 pi DMEM til hver transfektion rør for viral production, cellelevedygtighed og immunaktivering assays hhv. For virale produktionsanlæg analyser, bringe celler og tilberedte transfektion rør til en biosikkerhed niveau 3 (BSL3) laboratorium før næste trin.
- Tilsæt 2 pi sekventielt transfektionsreagens til transfektions- rør og inkuberes 15 til 20 minutter for at tillade komplekser til at danne. Se tabellen på materialer til den specifikke transfektion reagens, der skal anvendes.
- Tilføje hele transfektionsblandingen fra hvert mikrorør dråbevis til de tilsvarende positioner i celledyrkningspladerne. Omrystes forsigtigt og inkuberes pladerne i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Mål HIV-1 produktion (afsnit 2), cellernes levedygtighed (afsnit 3) og immun aktivering (afsnit 4) i cellekultur plader (Figur 2C).
2. Viral Production Assay
- Fjern de 24-brønd celle kultur plader fra inkubatoren og bland forsigtigt pladerne inde i BSL3 cellekulturhætte. Overfør 150 pi supernatant fra hver brønd til en tilsvarende brønd i en 96-brønd fladbundet plade, som vil blive brugt til at kvantificere HIV-1-produktion.
Bemærk: Fælles virale kvantificering assays indbefatter måling af ekspressionen af HIV-1 capsid protein (p24) ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) 20, kvantificering viralt RNA ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) 21 og måling af aktiviteten af HIV-1-RT-enzym. Trin 2.2 til 2.5 forklare metoder til at kvantificere HIV-1 RT-aktivitet 13,15,16. - Overfør 5 pi supernatant til tilsvarende brønde i en plade med 96 brønde, der indeholdt 25 pi af en viral afbrydelse cocktail 15 (tabel 1). Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur og overføre pladen til en radioaktivitet arbejdsstation.
Bemærk: Trin 2.2. er kun nødvendigt, hvis en radioaktivitet arbejdsstation er ikke tilgængelig i BSL3 laboratoriet. Hvis pladerne ikke behøver at blive fjernet fraBSL3 laboratorium, gå videre til trin 2.3. og der tilsættes 50 pi radioaktivt / viral forstyrrelse cocktail (tabel 1) i stedet for de 25 pi radioaktivt cocktail. - Forbered en radioaktiv cocktail 15 (tabel 1), og der tilsættes 25 pi til hver brønd af viral supernatant og forstyrrelser cocktail. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Spot 5 pi af reaktionsblandingen på tilsvarende pladser i en glasfiber Di Ethyl Amino Ethyl (DEAE) filtermåtte papir og tillade pletterne tørre i 10 min. Spot reaktionsblandingen på hver firkant, så ikke to prøver direkte kostelev hinanden. Dette hjælper til at undgå cross-over mellem prøver ved bestemmelse tællinger per minut (cpm) i trin 2.6.
- Vask papirerne 5x i 5 minutter med 2 x saltvand natriumcitrat (SSC) buffer (tabel 1), efterfulgt af to 1 minutters vaske med 95% ethanol. Lad aviserne at tørre og forsegle dem i prøveposer.
- Clip prøveposer containing af filtermåtte papir i en kassette, og sæt kassetten i en mikroplade scintillationstæller. Indstil tælleren til at læse CPM for 32P med reference datoen for parti [32 P] dTTP anvendt i eksperimentet. Vælg hvilke prøver at læse ved hjælp af pladen kort og starter tælleren.
- For enhver viral kvantificering fremgangsmåde, opdele de opnåede værdier for hver test-RNA af den tilsvarende negative kontrol og formere denne værdi med 100 for at få den procentvise inhibering af HIV-1-produktion for hver gentagelse af testen RNA'er. Et eksempel på resultaterne, der sammenligner forskellige test RNA'er ved forskellige koncentrationer er tilvejebragt i figur 3.
3. cellelevedygtighed Assay
- Fjern de 96-brønds plader fra inkubatoren, og der tilsættes 20 pi af 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) fortyndet i Dulbeccos phosphatbufret saltvand ( DPBS) til hver brønd. Pladerne inkuberes feller 3 timer ved 37 ° C.
- Tilføj 150 pi syrnet isopropanol med detergent (1% NP-40, 4 mM HCI i isopropanol) til hver brønd og inkuberes pladerne i 2 timer ved stuetemperatur.
- Bestem absorbansen ved 570 nm i en mikroplade-spektrofotometer.
- Beregne den relative MTT metabolismen for hver positiv kontrol og test-RNA ved at dividere værdien opnået for hver prøve ved dens tilstødende transfektion kontrol. Et eksempel på resultaterne, der sammenligner forskellige test RNA'er og en positiv kontrol er tilvejebragt i figur 4.
4. Immune Activation Assay
- Fjern de 12-brønds plader fra inkubatoren og aspireres dyrkningsmediet. Forsigtigt vaske cellerne to gange med DPBS og tilsæt 70 pi kold lysepuffer 22 (herunder protease og phosphataseinhibitorer, tabel 1) til hver brønd. Pladerne inkuberes i 10 minutter på is.
- Overfør cellelysater til mikrorør og hurtigt fryse dem ved at nedsænkerør i flydende nitrogen. Tillad prøverne tø op og gentag til 2 flere fryse optøningscykler for i alt 3.
- Centrifuger lysaterne i 15 minutter ved 4 ° C, 15.700 xg, at pelletere cellerester. Supernatanten overføres til nye mikrorør og bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af Coomassie blue (Bradford) metode 23,24.
- Løse 75 ug protein fra hver prøve i en 10% denaturerende polyacrylamidgel og overført til en nitrocellulosemembran som beskrevet tidligere 25,26.
- Efter elektroforese og overførsel til en membran, afslører proteinbånd ved at inkubere membranen i Ponceau S (tabel 1) i 1 min efterfulgt af vask med dobbeltdestilleret vand. Brug bands og protein stigen som en guide til at skære membranen ved 80 og 55 kDa.
Bemærk: I trin 4.4 kan køres på 16 x 18 cm 2 geler ned til 34 kDa, således at det er let at skære membranen ved de angivne positioner og ikke skære gennembånd af interesse. Alternativt kan flere geler udføres med de samme prøver at undgå at skære membranen. - Skyl den Ponceau S-farvning med Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 (TBST, tabel 1). Tilføj TBST med 5% fedtfri mælk til helt at dække membranerne. Inkuber membranerne ved stuetemperatur under omrøring i 1 time.
- Inkuber membranerne O / N i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA) og antistoffer fortyndet til 1 i 1.000 mod ADAR1 (110 og 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa), og phospho-IRF3 (47 kDa), for den øverste, midterste og nederste stykker af membranen henholdsvis.
- Vask membranerne 5x i 5 minutter med TBST og inkuberes i TBST med 5% fedtfri mælk og peroxidase-mærket gede-anti-kanin sekundære antistoffer (fortyndet til 1 i 5000) i 1 time.
- Vaske membranerne 5x i 5 minutter med TBST og anvende elektrokemiluminescens (ECL) opløsning for at visualisere bånd på filmene ifølge producentens instruktioner.
- Efter at visualisere proteinbånd på film, vaske det midterste og nederste stykker af membranen i 10 minutter med et antistof stripping opløsning. Inkubér membranerne O / N i TBST med 3% BSA og antistoffer mod total PKR (ved 1 i 500) og IRF3 (ved 1 i 1000), for den midterste og nederste stykker hhv. Gentag trin 4.8. og 4.9. anvendelse af peroxidase-mærket gede-anti-mus i stedet for anti-kanin sekundært antistof til PKR membran (midten).
- Vask det nederste stykke af membranen 5x i 5 minutter med TBST og inkuberes membranen i TBST med 3% BSA i 1 time med et antistof mod actin (fortyndet til 1 i 5.000). Gentag trin 4.8. og 4.9. anvendelse af peroxidase-mærket gede-anti-mus i stedet for anti-kanin sekundært antistof. Et eksempel på resultaterne, der sammenligner forskellige test RNA'er og en positiv kontrol er tilvejebragt i figur 5. Se tabellen af materialer til de specifikke antistoffer, der skal anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generel skematisk af procedurerne er vist i figur 2 med et eksempel transfektion plan for tre test RNA'er og en kontrol-RNA tilvejebragt i figur 2B. For virale produktion og cellelevedygtighedsassays, udlæsningen for hver test-konstruktionen er normaliseret til en negativ kontrol. Replikater transficeres i sæt, således at hver test RNA normaliseret til dens tilstødende negativ kontrol. Dette gøres for at undgå ukorrekte oplysninger relateret til tiden mellem kompleksdannende og transfektion, hvilket kan forekomme, hvis for eksempel alle de negative kontroller transficeres først. Da HIV-1 kan påvirke immunreaktioner 27,28, er cellelevedygtigheden og immunaktivering assays udført uden tilsætningen af en HIV-1-udtrykkende plasmid.
For at identificere den optimale længde af RNA-interferens molekyler rettet mod en konserveret sted i HIV-1 RNA (position 1498-141519 i HIV-1-stamme NL4-3) 13 blev et sæt siRNAs designet (figur 3A). Brug af HIV-1-produktion assay procent af RT-aktivitet sammenlignet med celler transficeret med en lang Dicer substrat nonsens siRNA (Sins) blev beregnet for celler transficeret med hver test siRNA ved forskellige mængder af co-transfektion med 100 ng af en plasmid, der udtrykker HIV-1-stamme NL4-3 (figur 3B).
Brug af celleviabilitetstest blev procent metabolisme af MTT bestemt for celler transficeret med de mest effektive siRNAs identificeret i figur 3B. Data blev normaliseret til MTT-metabolisme i celler behandlet med transfektionsreagens alene (figur 4). En lang dobbeltstrenget RNA (poly I: C) reducerede cellelevedygtighed; Men virkningen var kun signifikant ved den højeste dosis evalueret. Ingen signifikant reduktion i cellelevedygtighed blev observeret for siRNA'er rettet mod 1498 si te i HIV-1 RNA, uanset deres længde. Brug af immunaktivering assayet blev det samme sæt af RNA'er evalueret for deres potentiale til at udløse immunresponser (figur 5). I forhold, hvor Poly I: C aktiverede udtryk for ADAR1 P150 og induceret fosforylering af PKR og IRF3, kunne konstateres nogen signifikant effekt på immun aktivering markører for nogen af de test RNA.
Figur 1. Skematisk af præ- og post-integration trin i HIV-1-replikation cyklus. Pre-integration (1-3) og post-integration (4-7) trin i HIV-1-replikation cyklus er vist i skitseret kasser . klik her for at se en større version af dette tal.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematisk af viral produktion, cellelevedygtighed og immunaktivering assays. (A) Plade adhærente celler og kultur i 24 timer. Celler udplades i 24-, 96- og 12- brønds plader i 500, 100 og 1000 pi celledyrkningsmedier for viral produktion, cellelevedygtighed og immunaktivering assays hhv. (B) Forbered transfektion rør, transficere celler og kultur for 48 timer. Et eksempel transfektion plan for et sæt af tre test RNA (RNA1-3) er vist med passende kontroller. Transfektionsproceduren er også illustreret. (C) Udlæsning. Den udlæsning for viral produktion, cellernes levedygtighed og immune aktivering analyser er skrevet og forklaret i detaljer i afsnit 2, 3 og 4, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>
Figur 3. Virkning af test siRNA'er på HIV-1-produktion. (A) Design af siRNA'er med forskellige længder og symmetrier. En konserverede sekvens i HIV-1 RNA (1498 målsted) blev anvendt til at designe symmetriske og asymmetriske siRNA'er (si1498-) med forskellige længder (17 til 29 nukleotid sense strenge). Den forventede sense (top, sort) og antisense (bund, rød) strenge er angivet. (B) Inhibering af HIV-1-produktion ved si1498 længde varianter. Den procentvise (%) inhibering af HIV-1 RT-aktivitet i supernatanten fra HEK293T celler transficeret med symmetriske eller asymmetriske si1498 længde varianter er vist i forhold til en lang Dicer substrat nonsens siRNA (SINS). Hver test RNA blev sammenlignet med SINS i forskellige doser i mindst to uafhængige transfektioner med to til tre gentagelser. Dataene er exprsmelteostpro- som middelværdier ± standardafvigelse midler (SEMs). Dette tal er blevet ændret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning af si1498 længde varianter på celleviabilitet HEK293T celler blev transficeret med poly I:. C ved 50 og 200 ug / ml (pIC50 og PIC200) og forskellige længder og formater af si1498 ved 100 nM. Den% metabolisme af MTT blev bestemt i forhold til celler behandlet med transfektionsreagens alene (Mock, M) i tre uafhængige transfektioner med to til tre gentagelser. Dataene er udtrykt som middelværdier ± SEMs. Uparret student t-tests blev anvendt til at bestemme, hvorvidt forskellige transfektioner significantly (*, P <0,05) reduceret cellelevedygtighed i forhold til de mock transficerede celler. Dette tal er blevet ændret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Virkning af si1498 længde varianter på medfødte immunresponser. HEK293T celler blev transficeret med pIC50, PIC200 og forskellige længder og formater af si1498 ved 100 nM. Aktivering af PKR og TLR3 blev vurderet ved måling phosphoryleret PKR og IRF3 hhv. Ekspression af et interferon stimulerede gen (ISG) blev vurderet ved at måle de ISG ADAR1 P150 niveauer i forhold til den konstitutivt udtrykte variant, ADAR1 p110. Ekspressionen af actin blev anvendt som en loading kontrol. Denne figure er blevet ændret fra 16, copyright American Society for Microbiology. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på Buffer / Reagens | Sammensætning |
| Viral forstyrrelser cocktail | 60 mM Tris-HCI (fra 1M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| radioaktivt cocktail | 60 mM Tris-HCI (fra 1M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 ug / ml oligo dT. Umiddelbart inden brug: 8 mM dithiothreitol (DTT, C4 H 10 O 2 S 2) og 5 pi [32P] dTTP (3.000 Ci / mmol) For hver 500 pi cocktail. |
| Radioaktiv / viral forstyrrelser cocktail | 60 mM Tris-HCI (fra 1M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 ug / ml Poly (A), 0,16 ug / ml oligo dT. Umiddelbart inden brug: 8 mM dithiothreitol (DTT, C4 H 10 O 2 S 2) og 5 pi [32P] dTTP (3.000 Ci / mmol) for hver 1 ml cocktail. |
| 2x SSC | 17,53 g NaCl og 8,82 g natriumcitrat - 2H 2 O i en LH 2 O. |
| lyseringsbuffer | 50 mM Tris-HCI (fra 1M Tris-HCI, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (fra 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v glycerol, 1% v / v NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S og 5 ml eddikesyre i 500 ml H2O |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g NaCl og 1 ml Tween 20 i en LH 2 O. |
Tabel 1:. Komponenter i ikke-kommercielle buffere og reagenser Opskrifter til alle ikke-kommercielle buffere og reagenser leveres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIV-1-produktion assayet beskrevet blev udført under anvendelse HEK293T celler (figur 2) og svarer til assays anvendes til at screene HIV-1 RNA til effektiv ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30, og U1i RNA 11,31 målsteder. Hjælp af forskellige metoder til at kvantificere HIV-1-produktion, har de fleste undersøgelser målte virusproduktion 48 timer efter co-transfektion af en HIV-1-ekspressionsplasmid med kandidat- RNA'er. Efter produktionen af HIV-1, umodne virioner undergår proteolytisk spaltning af deres polyproteiner med HIV-1-protease at blive modne virioner, der er i stand til at inficere nye celler. For HIV-1-RT enzymaktivitetsassay beskrevet i trin 2.2. til 2.5., er både produktion og modning skridt evalueret, da RT-enzymet er kun aktiv i modne virioner. I modsætning hertil kan capsidproteinet og viralt RNA forekomme både modne og umodne virioner. Derfor kvantificering HIV-1-produktion ved p24-ELISA eller RT-PCR may brænde virkninger af terapeutiske RNA'er, der virker på modning trin af HIV-1-replikation cyklus, f.eks ribozymer, der lokaliserer til HIV-1-virioner 32 og antisense-molekyler, der inhiberer Gag behandling udover HIV-1-protein-ekspression 13, 31. En begrænsning af virusproduktion assays er, at celler, der anvendes ikke udtrykker de passende receptorer for HIV-1 entry og kan ikke anvendes til at vurdere virkningerne af terapeutiske RNA'er på HIV-1 entry eller integration.
At vurdere virkningerne af anti-HIV-1 RNA'er på hele replikationscyklus er forskellige HIV-1-infektion modeller blevet anvendt i forskellige T-lymfocyt-cellelinjer eller primære blodceller 5,33. Eftersom disse cellelinier er vanskelige at transficere, mere arbejdskraftintensive fremgangsmåder, såsom lentiviral vector genindsættelse eller aptamer / peptid konjugation er nødvendige for at levere tilstrækkelige mængder af anti-HIV-1 RNA'er at observere effekter på HIV-1-replikation. Denne begrænsning gør det difficult til hurtigt sammenligne struktur-aktivitetsforhold mellem varianter af en bestemt anti-HIV-1 RNA eller udføre storstilet screening for at identificere den optimale målsted for nye klasser af anti-HIV-1 RNA'er. Mens virusproduktion assays har været nyttige til identifikation af nye anti-HIV-1 RNA-molekyler, alternative cellulære modeller i let transficerede cellelinjer, der understøtter HIV-1-replikation, såsom TZM-bl celler, ville være anvendelig til screening af anti-HIV-1 RNA rettet mod andre trin i replikation cyklus, såsom indrejse og integration.
Afhængigt af den klasse af anti-HIV-1 RNA, har flere potentielle mekanismer på toksicitet blevet beskrevet. For eksempel kan antisense-baserede RNA'er har ikke-tilsigtede virkninger på cellulære RNA'er indeholdende samme eller en lignende sekvens til deres tilsigtede målsted i HIV-1 RNA. Tilsvarende RNA aptamerer, modelleret efter det transeuropæiske aktivering respons element (TAR) eller Rev respons element (RRE), kan påvirke funktionen af cellulære PRoteins, såsom TAR RNA-bindende protein (TRBP) 34. shRNAs og siRNA'er har den ekstra potentiale til at påvirke RNA-interferens pathway ved sekvestrering RNAi-proteiner 35 og nogle U1i molekyler har vist sig at påvirke splejsning og behandling af cellulære RNA'er ved sekvestrering proteiner ifølge U1 lille nukleare RNA-proteinkompleks 36. Mens nogle af disse virkninger kan minimeres ved omhyggelig udformning, målinger af cellulær toksicitet i screeninger for nye anti-HIV-1 RNA-molekyler er anvendelige til at udelukke molekyler med potentielle ikke-tilsigtede effekter fra yderligere udvikling. Endvidere kunne off-target effekter indirekte hæmme HIV-1 produktion, hvilket gør cellulær toksicitet en vigtig måling i validering af effekten af nye anti-HIV-1 molekyler identificeret fra HIV-1 produktions-skærme.
Den celleviabilitetstest beskrevet i trin 3.1. til 3.4. er en variation af et standardassay, der er blevet anvendt til at screene forskellige antivirale molekyle s 37. Assayet måler aktiviteten af NAD (P) H-afhængige cellulære enzymer for at reducere MTT reagenset til dets uopløselige lilla form formazan. Protokollen er tilpasset fra tidligere offentliggjorte metoder 38 og flere kits er tilgængelige ved hjælp MTT eller andre nært beslægtede reagenser. Selv om det er vigtigt at analysere cellelevedygtighed i cellelinjen anvendt til screening anti-HIV-1 RNA, skal det bemærkes, at forskellige cellelinier varierer i deres følsomhed over for RNA-induceret toksicitet. For eksempel Reynolds et al. Viste, at Dicer substrat siRNA'er havde ingen virkning på cellelevedygtighed i HEK293T celler, men signifikant reduceret cellelevedygtighed i MCF7, DU145 og HeLa S3-celler 39. Til assayet beskrevet heri, er HEK293T celler anvendes som eksempel (figur 4); imidlertid har det samme assay også blevet gjort i MCF7-celler til at evaluere potentiel toksicitet i en cellelinie, som er mere følsomme over for små RNA-induceret toksicitet 16.
e_content "> Da anti-HIV-1 RNA kan ikke behandles og præsenteres for det adaptive immunsystem, de betragtes mindre immunogen i forhold til anti-HIV-1 proteiner eller peptider. Men afhængigt af rækkefølgen eller struktur, kan de fremkalde medfødte immunresponser og adskillige immune sensorer og signalveje er blevet identificeret, som kan reagere på små RNA'er (gennemgået i 40). i immunaktivering assayet beskrevet her, blev niveauet af phosphoryleret PKR og IRF3 sammenlignet i celler transficeret med små RNA'er som en angivelse af PKR eller TLR3 aktivering, henholdsvis. både RNA sensorer er til stede i en lang række cellelinier og deres aktivering kan føre til produktion af type 1 interferon og i tilfælde af PKR, en nedlukning i oversættelse. til bedømmelse potentialet for anti-HIV-1 RNA til at aktivere produktionen af type 1 interferoner ved alternative veje, blev niveauer af interferon-stimulerede gen ADAR1 (P150) også sammenlignet i celler transficeret medanti-HIV-1 RNA. Som det fremgår af virkningerne af lang dsRNA positive kontrol, Poly I: C, alle disse responser var aktive i HEK293T celler (figur 5) og lignende effekter blev observeret i MCF7-celler 16. Da disse reaktioner kan inhibere HIV-1-produktion i fravær af virkninger på cellelevedygtighed, den immunaktivering assay tilvejebringer yderligere validering for effektiviteten af nye anti-HIV-1 RNA'er. Yderligere målinger, der kan tilsættes denne vurdering, omfatter måling af produktion af inflammatoriske cytokiner og type 1 interferoner i cellekultursupernatanten, og måling af ekspression af flere interferon-stimulerede gener. Da HIV målceller såsom CD4 + T-celler og makrofager kan udtrykke forskellige niveauer af medfødte immune sensorer, bør ansøgerne identificeret fra analyserne beskrevet i denne protokol også evalueres for potentiel immunstimulering i disse celletyper.Af alle de assays beskrived, det kritiske trin for at opnå reproducerbare og nøjagtige resultater er fremstillingen af DNA eller RNA transfektions- rør (trin 1.3.). Plasmidet DNA eller RNA bør være af høj renhed, med koncentrationer nøjagtigt. Det er også afgørende at omfatte de relevante kontroller. For vurderingen af nye test RNA ekspressionsplasmider i den virale produktion assay en passende negativ kontrol er det tomme ekspressionsplasmid. For antisense-baserede RNA'er, bør en yderligere negativ kontrol plasmid, der udtrykker et ikke-targeting RNA også inkluderes. Sekvenser for en ikke-targeting ribozym og shRNA, der ikke påvirker hiv produktion findes i 13. For test siRNA'er, det eneste negative kontrol, der kan anvendes, er en ikke-targeting RNA og en passende ikke-targeting siRNA sekvens for virusproduktion assayet er tilvejebragt i 16. For cellelevedygtigheden og immunaktivering assays, bør den negative kontrol skal celler behandlet med transfektionsreagens alene, og det er critical at en positiv kontrol, såsom poly I: C er medtaget for at bekræfte, at cellerne reagerer på RNA-induceret toksicitet eller immunaktivering. For RNA ekspressionsplasmider, bør det tomme plasmid også indbefattes for at sikre, at vektoren selv ikke er at have toksiske virkninger på cellerne.
Samlet set de heri beskrevne analyser udgør et godt første skridt mod identifikation af sikre og effektive RNA behandlinger til brug i HIV-1-genet eller medicinsk behandling. For molekyler rettet mod HIV-1 RNA, er det også vigtigt at overveje bevarelsen af deres målområde i HIV-1 cirkulerende stammer, og detaljerede metoder til at beregne bevaring sekvens er tidligere blevet offentliggjort 15. For at flytte et molekyle fremad ind kliniske forsøg, bør udføres toksicitet og effekt langtidsforsøg i primære humane celler og i dyremodeller for at bekræfte, at identificerede kandidater vil være sikkert og effektivt i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbejdet præsenteres her blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) (giver DCB-120.266, PPP-133.377 og HBF-348.967 til AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
