Introduction
En begränsning av nuvarande HIV-1-behandlingar är att de måste vara administreras kroniskt för att förhindra sjukdomsprogression. Transplantation av HIV-1 resistent T-lymfocyter, eller hematopoietiska stamceller, har potential att skapa långsiktig kontroll av HIV-1-replikation i frånvaro av läkemedelsbehandling 1,2 och kan också vara en effektiv metod för att uppnå en HIV-1 botemedel 3. Ett sätt att göra celler resistenta mot HIV-1-replikation är att sätta in en eller flera gener som kodar för anti-HIV-1 RNA eller peptider i en infekterad individs celler under en autolog transplantation 4. Flera kandidat anti-HIV-1-gener har utformats med några in kliniska prövningar i kombinationer av två 5 eller tre 6, för att förhindra utvecklingen av HIV-1-resistens mot någon enskild gen.
Anti-HIV-1 RNA är bland de bästa kandidaterna för kombinations genterapi på grund av deras låga potential att framkalla immunsvar och eftersom detranskriberas från mycket korta gensekvenser. Vissa anti-HIV-1 RNA har utformats för att rikta viralt inträde och integration. De flesta anti-HIV-1 RNA riktar efterintegrations steg i virusets livscykel (Figur 1). Post-integration inhibitorer innefattar lock RNA, med inriktning på HIV-1 reglerande proteiner Tat eller Rev 1, och antisense-baserade RNA, med inriktning på olika platser i HIV-1 RNA, såsom ribozymer 7, shRNAs 8 och U1i RNA 9. Metoder som har använts för att jämföra effekten av anti-HIV-1 RNA omfattar övervakning virusreplikation i celler transducerade med gener som kodar för kandidat RNA och mäta viral produktion i celler transient transfekterade med plasmider som uttrycker kandidat RNA och en HIV-1-expressionsplasmid 10 -13. Vi har tidigare använt en HIV-1-produktion analys för att screena HIV-1-RNA för ny ribozym målställen 13-15. Dessa metoder har sedan förfinats för att optimera utformningen av en RNAstörningar molekyl som uttrycks från plasmid-DNA som en shRNA eller levereras som en syntetisk siRNA 16. Analysen mäter produktionen av mogna virus från humana embryonala njur (HEK) 293T-celler, och kan användas för att jämföra effekterna av hämmare som riktar efterintegrations steg i HIV-1-replikationscykeln (Figur 1). För hämmare som riktar steg före integration, är alternativa analyser såsom TZM-bl cellinfektionsanalys 17 som behövs för att utvärdera antiviral effekt.
Stora säkerhetsrisker för leverans av anti-HIV-1 RNA i kliniken är de potentiella off-target effekter på människors RNA eller proteiner och aktivering av medfödda immun sensorer. För att utvärdera toxiciteten av anti-HIV-1 siRNA, har vi använt en cellviabilitet analys i olika cellinjer 16. Vi mätte också aktivering av de dubbelsträngade RNA-immunsensorer, RNA aktiverat proteinkinas R (PKR) och Toll like receptor 3 (TLR3), såväl som expres av interferon stimulerade genen ADAR1 P150. Dessa analyser kan användas för att bekräfta att effekten av anti-HIV-1 RNA är inte på grund av indirekta effekter på cellviabilitet eller immunsensoraktivering. De är också användbara i exklusive kandidat RNA med potentiella toxicitet från vidareutveckling.
I följande protokoll, förfaranden identifiera nya terapeutiska RNA och optimera formatet av befintliga beskrivs. Metoderna är användbara för screening RNA baserade efter integration hämmare av HIV-1-replikation och kan anpassas för att screena andra hämmare efter integration, såsom små molekyler som riktar Rev medierad export av viralt RNA 18 eller crispr / Cas-system utformade för att rikta integrerad HIV-1-DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celler och transfektioner
- Kultur HEK 293T-celler i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Bered en 2 x 10 5 celler / ml suspension i cellodlingsmediet. Tillsätt 500, 100 och 1000 | j, l av cellsuspensionen till varje brunn i 24-brunnars, 96-brunnars och 12-brunnars plattor, för viral produktion, cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser, respektive (Figur 2A).
- Snurra försiktigt plattorna och inkubera dem O / N vid 37 ° C med 5% CO2. Odla celler till 50-70% sammanflytning.
- Enligt en transfektion planen, förbereda spädningar av test RNA och deras kontroller i 1,5 ml mikrotuber (exempel, figur 2B).
- För den virala produktionen assay, förbereda en 10 ng / | il spädning av en HIV-1-expressionsplasmid och tillsätt 10 pl till varje rör. Nästa förbereda 5 iM utspädningar av test RNA och en negativ kontroll RNA. Tillsätt 2,5 eller 10 | il av varje test RNA och negativ kontroll utspädning till motsvarande rör för 25 eller 100 nM slutkoncentrationer.
- För viabilitetsanalys cellen, förbereda 5 pM utspädningar av test RNA och en 10 mg / ml spädning av den positiva kontroll-RNA, med låg molekylvikt Poly I: C. Tillsätt 2 | j, l av test RNA eller positiva kontroll-RNA spädningar till de motsvarande rör för 100 nM eller 200 ^ g / ml slutkoncentrationer, respektive.
- För immunaktiveringsanalys, tillsätt 20 pl av test RNA eller positiva kontroll-RNA späd framställts i steg 1.3.2. till motsvarande rör för 100 nM eller 200 | j, g / ml slutkoncentrationer, respektive.
Obs: För att testa RNA expressionsplasmider, förbereda 10 ng / ul späd i stället för de 5 iM utspädningar av test RNA, vilket ger slutliga mängder av 25 och 100 ng för steg 1.3.1. och 100 ng för steg 1.3.2. och 1.3.3.
- Tillsätt 50, 25 eller 75 ul DMEM till varje transfektion rör för viral produktion, cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser, respektive. För virusproduktionsanalyser, ta celler och beredda transfektion rör till en biosäkerhet nivå 3 (BSL3) laboratorium innan nästa steg.
- Tillsätt 2 | il av transfektionsreagens sekventiellt till transfektionen rören och inkubera 15 till 20 min för att tillåta komplexen att bilda. Se tabell av material för specifika transfektionsreagens som ska användas.
- Tillsätt hela transfektion blandningen från varje mikro rör droppvis till motsvarande positioner i cellodlingsplattor. Snurra försiktigt och inkubera plattorna under 48 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Mät HIV-1-produktion (avsnitt 2), cellviabilitet (avsnitt 3) och immunaktivering (avsnitt 4) i cellodlingsplattor (Figur 2C).
2. Viral Produktion analys
- Ta bort de 24-brunnars cellodlingsplattor från inkubatorn och snurra försiktigt plattorna inuti BSL3 cellodlinghuva. Överföra 150 pl supernatant från varje brunn till en motsvarande brunn i en 96-brunnars flatbottnad platta, som kommer att användas för att kvantifiera HIV-1-produktion.
Notera: Vanliga virala kvantifiering analyser innefattar mätning av uttryck av HIV-1-kapsidprotein (p24) genom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) 20, kvantifiera viralt RNA genom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) 21 och mätning av aktiviteten av HIV-1 RT-enzymet. Steg 2.2 till 2.5 förklara metoder för att kvantifiera HIV-1 RT-aktivitet 13,15,16. - Överföring 5 | il av supernatanten till motsvarande brunnar i en platta med 96 brunnar, innehållande 25 | il av en viral störning cocktail 15 (tabell 1). Inkubera blandningen under 5 min vid RT och överföra plattan till en radioaktivitets arbetsstation.
Obs: Steg 2,2. är endast nödvändigt om radioaktivitet arbetsstation inte är tillgänglig i BSL3 laboratorium. Om plattorna inte behöver tas bort frånBSL3 laboratorium, gå vidare till steg 2,3. och tillsätt 50 ul av radioaktivt / viral störning cocktail (tabell 1) i stället för de 25 pl radioaktivt cocktail. - Förbereda en radioaktiv cocktail 15 (tabell 1), och tillsätt 25 | il till varje brunn av viral supernatant och störningar cocktail. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 2 h.
- Spot 5 | il av reaktionsblandningen på motsvarande rutor i en glasfiber Di Ethyl Amino Ethyl (DEAE) filtermatta av papper och tillåta fläckarna torka i 10 min. Spot reaktionsblandningen på vartannat fyrkantiga så att inga två prover direkt boarder varandra. Detta bidrar till att undvika cross-over mellan prover vid fastställandet impulser per minut (cpm) i steg 2,6.
- Tvätta tidningarna 5x under 5 min med 2x saltlösning natriumcitrat (SSC) -buffert (tabell 1), följt av två 1 min tvättningar med 95% etanol. Låt papper för att torka och försegla dem i provpåsar.
- Clip provpåsar containing den filtermatta papper i en kassett och för in kassetten i en mikro scintillationsräknare. Ställ in räknaren för att läsa CPM för 32p med referens datum som anges satsen av [32p] dTTP användes i experimentet. Välj vilka prover för att läsa med hjälp av plattan karta och starta räknaren.
- För någon viral kvantifiering metod, dela upp de värden som erhålls för varje test RNA med den intilliggande negativ kontroll och multiplicera detta värde med 100 för att få den procentuella hämningen av HIV-1-produktion för varje replikat av test RNA. Ett exempel på resultat som jämför olika test RNA vid olika koncentrationer ges i figur 3.
3. Cell Viability Assay
- Ta bort de 96-brunnars plattor från inkubatorn och tillsätt 20 pl av 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetyl-2-tiazolyl] -2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) utspätt i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning ( DPBS) till varje brunn. Inkubera plattorna feller 3 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 150 | il surgjord isopropanol med detergent (1% NP-40, 4 mM HCl i isopropanol) till varje brunn och inkubera plattorna under 2 h vid RT.
- Bestämma absorbansen vid 570 nm i en mikroplatt spektrofotometer.
- Beräkna den relativa MTT metabolismen för varje positiv kontroll och prov RNA genom att dividera det erhållna värdet för varje prov av dess intilliggande transfektion kontroll. Ett exempel på resultat som jämför olika test RNA och en positiv kontroll tillhandahålls i figur 4.
4. Immunaktiveringsanalys
- Ta bort de 12-brunnsplattor från inkubatorn och aspirera odlingsmedia. Försiktigt tvätta cellerna två gånger med DPBS och tillsätt 70 | il kall lysbuffert 22 (inklusive proteas- och fosfatasinhibitorer, tabell 1) i varje brunn. Inkubera plattorna under 10 min på is.
- Överför cellysaten till mikrotuber och snabb frysa dem genom nedsänkning avrör i flytande kväve. Låt prover för att tina och upprepa för ytterligare 2 frysupptiningscykler för totalt tre.
- Centrifugera lysaten för 15 min vid 4 ° C, 15700 x g, för att pelletera cellrester. Överför supernatanten till nya mikrotuber och bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av Coomassie blue (Bradford) -metoden 23,24.
- Lösa 75 ^ g protein från varje prov i en 10% denaturerande polyakrylamidgel och överföring till ett nitrocellulosamembran såsom beskrivits tidigare 25,26.
- Efter elektrofores och överföring till ett membran, avslöjar proteinband genom att inkubera membranet i Ponceau S (tabell 1) under 1 min följt av tvättning i dubbeldestillerat vatten. Använda banden och protein stege som en guide för att skära membranet vid 80 och 55 kDa.
Obs: I steg kan köras 4,4 prov på 16 x 18 cm 2 geler ner till 34 kDa, så att det är lätt att skära membranet vid angivna lägen och inte skära igenomband av intresse. Alternativt kan flera geler köras med samma prover för att undvika att skära membranet. - Tvätta ur Ponceau S färgning med Tris-saltlösning innehållande 0,05% Tween 20 (TBST, tabell 1). Lägg TBST med 5% fettfri mjölk för att helt täcka membranen. Inkubera membranen vid RT med omrörning i en timme.
- Inkubera membranen O / N i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA) och antikroppar späddes till 1 i 1000 mot ADAR1 (110 och 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), och fosfo-IRF3 (47 kDa), för toppen, mitten och botten bitar av membranet, respektive.
- Tvätta membranen 5x under 5 min med TBST och inkubera i TBST med 5% fettfri mjölk och peroxidasmärkta get-anti-kanin-sekundära antikroppar (utspädd till 1 i 5000) under 1 timme.
- Tvätta membranen 5x under 5 minuter med TBST och tillämpa elektrokemiluminiscens (ECL) lösning för att visualisera banden på filmer enligt tillverkarens instruktioner.
- Efter att visualisera proteinbanden på filmer, tvätta mitten och botten bitar av membranet i 10 minuter med en antikropp stripp lösning. Inkubera membran O / N i TBST med 3% BSA och antikroppar mot total PKR (på en i 500) och IRF3 (vid 1 i 1000), för den mellersta och nedre delar, respektive. Upprepa steg 4,8. och 4,9. användning av peroxidas-märkt get-anti-mus i stället för den anti-kanin sekundär antikropp för PKR membran (mitten).
- Tvätta bottenstycket av membranet 5x under 5 minuter med TBST och inkubera membranet i TBST med 3% BSA under 1 h med en antikropp mot aktin (utspädd till 1 i 5000). Upprepa steg 4,8. och 4,9. användning av peroxidas-märkt get-anti-mus i stället för den anti-kanin sekundär antikropp. Ett exempel på resultat som jämför olika test RNA och en positiv kontroll ges i figur 5. Se tabell av material för specifika antikroppar som skall användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett allmänt schema över de förfaranden som visas i figur 2 med ett exempel transfektion plan för tre test RNA och en styr RNA tillhandahålls i figur 2B. För virala produktion och cellernas viabilitet analyser är utläsningen för varje test konstrukt normaliserat till en negativ kontroll. Replikat transfekteras i satser, så att varje test RNA normaliserades till dess intilliggande negativ kontroll. Detta görs för att undvika felaktiga uppgifter om tiden mellan komplex och transfektion, som kan uppstå om till exempel alla de negativa kontrollerna transfekteras först. Eftersom HIV-1 kan påverka immunsvar 27,28, är cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser göras utan tillsats av en HIV-1-uttryckande plasmid.
För att identifiera den optimala längden av RNA-interferens molekyler rikta en konserverad plats i HIV-1 RNA (position 1498-141519 i HIV-1-stam NL4-3) 13, var en uppsättning av siRNA utformad (figur 3A). Med användning av HIV-1-produktion assay, den procent av RT-aktivitet jämfört med celler som transfekterats med en lång Dicer substrat nonsens siRNA (Synder) beräknades för celler transfekterade med varje test siRNA vid olika mängder av sam-transfektion med 100 ng av en plasmid som uttrycker HIV-1-stam NL4-3 (figur 3B).
Med användning av cellviabilitet analysen, var den procentuella metabolismen av MTT bestämdes för celler transfekterade med de mest effektiva siRNA som identifieras i figur 3B. Data normaliserades till MTT-metabolism i celler behandlade med enbart den transfektionsreagens (Figur 4). En lång dubbelsträngat RNA (Poly I: C) reducerade cellviabilitet; var dock effekten endast signifikant vid den högsta dosen utvärderas. Ingen signifikant minskning av cellviabilitet observerades för siRNA inriktade på 1498 si te i HIV-1 RNA, oavsett deras längd. Använda immunaktivering analysen var samma uppsättning RNA utvärderas för sin potential att utlösa immunsvar (Figur 5). Under förhållanden där Poly I: C aktiverade expression av ADAR1 p150 och inducerades fosforylering av PKR och IRF3, kunde ingen signifikant effekt på immunaktiveringsmarkörer observeras för något av test RNA.
Figur 1. Schematisk av före och efter integrations steg i HIV-1 replikationscykeln. Pre-integration (1-3) och efter integration (4-7) steg i HIV-1-replikering cykel visas i skisserat lådor . klicka här för att se en större version av denna siffra.
2 "src =" / filer / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Figur 2. Schematisk av viral produktion, cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser. (A) Plate adherenta celler och odling under 24 h. Celler ströks ut i 24-, 96- och 12- brunnsplattor i 500, 100 och 1000 il cellodlingsmedia för viral produktion, cellviabiliteten och immunaktivering analyser, respektive. (B) Förbered transfektion rör, transfektera celler, och kultur under 48 timmar. Ett exempel transfektion plan för en uppsättning av tre test RNA (RNA1-3) visas med lämpliga kontroller. Transfektion förfarande illustreras också. (C) Läs ut. Den avläsning för viral produktion, cellviabiliteten och immunaktivering analyser är skrivna och förklaras i detalj i avsnitten 2, 3 och 4, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>
Figur 3. Effekt av test siRNA på HIV-1-produktion. (A) Konstruktion av siRNA med olika längder och symmetrier. En konserverad sekvens i HIV-1-RNA (1498 målställe) användes för att konstruera symmetriska och asymmetriska siRNA (si1498-) med olika längder (17 till 29 nukleotid sense strängarna). Den förväntade känsla (topp, svart) och antisense (botten, röd) är strängar anges. (B) Hämning av HIV-1-produktion genom si1498 längdvarianter. Den procentuella (%) inhibering av HIV-1 RT-aktivitet i supernatanten från HEK293T-celler transfekterade med symmetriska eller asymmetriska si1498 längdvarianter visas i förhållande till en lång Dicer substrat nonsens siRNA (SINS). Varje test RNA jämfört med Sins vid olika doser i minst två oberoende transfektioner med två till tre replikat. Uppgifterna är exprEssed som medelvärden ± standardavvikelse medel (SEM). Denna siffra har ändrats från 16, copyright American Society for Microbiology. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av si1498 längd varianter på cellviabiliteten HEK293T celler transfekterades med poly I:. C på 50 och 200 mikrogram / ml (PIC50 och PIC200) och olika längder och format av si1498 vid 100 nM. Den% metabolism av MTT bestämdes i förhållande till celler behandlade med den transfektionsreagens enbart (Mock, M) i tre oberoende transfektioner med två till tre replikat. Data uttrycks som medelvärden ± SEM. Oparade Students t-tester användes för att bestämma om de olika transfektioner significantly (*, P <0,05) reducerad cellviabilitet i förhållande till mock-transfekterade celler. Denna siffra har ändrats från 16, copyright American Society for Microbiology. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av si1498 längd varianter på medfödda immunsvar. HEK293T-celler transfekterades med PIC50, PIC200 och olika längder och format för si1498 vid 100 nM. Aktivering av PKR och TLR3 utvärderades genom mätning av fosforylerad PKR och IRF3, respektive. Expression av en interferon stimulerade gen (ISG) utvärderades genom att mäta ISG ADAR1 P150 nivåer i förhållande till konstitutivt uttryckta varianten, ADAR1 p110. Expressionen av aktin användes som en laddningskontroll. denna figure har ändrats från 16, copyright American Society for Microbiology. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn buffert / reagens | Sammansättning |
| Viral störning cocktail | 60 mM Tris-HCl (från 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| radioaktivt cocktail | 60 mM Tris-HCl (från 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 10 | ig / ml Poly (A), 0,33 ^ g / ml oligo-dT. Sattes omedelbart före användning: 8 mM ditiotreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) och 5 pl [32p] dTTP (3000 Ci / mmol) För varje 500 | il cocktail. |
| Radioaktivt / viral störning cocktail | 60 mM Tris-HCl (från 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 | ig / ml Poly (A), 0,16 ^ g / ml oligo dT. Sattes omedelbart före användning: 8 mM ditiotreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) och 5 | j, l [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) för varje 1 ml cocktail. |
| 2 x SSC | 17,53 g NaCl och 8,82 g natriumcitrat - 2H 2 O i ett LH 2 O. |
| lysbuffert | 50 mM Tris-HCl (från 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (från 0,5 M, pH 8,0), 10% vol / vol glycerol, 1% volym / volym NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S och 5 ml ättiksyra i 500 ml H2O |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g NaCl och 1 ml Tween 20 i en LH 2 O. |
Tabell 1:. Komponenter i icke-kommersiella buffertar och reagenser Recept för alla icke-kommersiella buffertar och reagenser tillhandahålls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIV-1-produktion analys som beskrivits utfördes med användning av HEK293T-celler (figur 2) och liknar analyser som användes för att screena HIV-1-RNA för effektiv ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30, och U1i RNA 11,31 målställen. Med hjälp av olika metoder för att kvantifiera HIV-1-produktion, har de flesta studierna mättes viral produktion 48 timmar efter samtransfektion av en HIV-1-expressionsplasmid med kandidat RNA. Följer på produktionen av HIV-1, omogna virioner undergår proteolytisk spjälkning av sina polyproteiner av HIV-1-proteas för att bli mogna virioner, med förmåga att infektera nya celler. För HIV-1 RT-enzymaktivitet analys som beskrivs i steg 2.2. till 2,5., både produktion och mognadssteg utvärderas, eftersom RT-enzymet är endast aktiv i mogna virioner. I motsats härtill kan kapsidproteinet och viralt RNA vara närvarande i både mogna och omogna virioner. Därför kvantifiera HIV-1-produktion av p24 ELISA eller RT-PCR may missar effekter av terapeutiska RNA som verkar på mognaden steg av HIV-1-replikationscykeln, såsom ribozymer som lokaliserar till HIV-1-virioner 32 och antisense-baserade molekyler som hämmar Gag bearbetning förutom HIV-1-proteinexpression 13, 31. En begränsning av virusproduktionsanalyser är att de celler som används inte uttrycker lämpliga receptorer för HIV-1 post och kan inte användas för att utvärdera effekterna av terapeutiska RNA på HIV-1 post eller integration.
För att utvärdera effekterna av anti-HIV-1-RNA på hela replikationscykeln, har olika HIV-1 infektionsmodeller använts i olika T-lymfocyt-cellinjer eller primära blodceller 5,33. Eftersom dessa cellinjer är svåra att transfektera, mer arbetsintensiva metoder såsom lentivirusvektor geninsättning eller aptamer / peptid konjugering är nödvändiga för att leverera tillräckliga mängder av anti-HIV-1 RNA att observera effekter på HIV-1-replikation. Denna begränsning gör det difficult att snabbt jämföra struktur-aktivitetssamband mellan varianter av en viss anti-HIV-1-RNA eller utföra storskalig screening för att identifiera den optimala målstället för nya klasser av anti-HIV-1-RNA. Medan virusproduktionsanalyser har varit användbara för att identifiera nya anti-HIV-1 RNA-molekyler, alternativa cellulära modeller i lätt transfekterade cellinjer som stödjer HIV-1-replikation, såsom TZM-BL celler skulle vara användbart för att screena anti-HIV-1 RNA efter andra steg i replikationscykeln, såsom in- och integration.
Beroende på den klass av anti-HIV-1-RNA, har flera potentiella mekanismer för toxicitet beskrivits. Till exempel kan antisens-baserade RNA har off-target effekter på cellulära RNA som innehåller samma eller en liknande sekvens till deras avsedda målplats i HIV-1 RNA. På samma sätt, RNA aptamers, modellerad efter den transaktiveringsresponselementet (TAR) eller Rev-responselementet (RRE), skulle kunna påverka funktionen hos cellulära proteins, såsom TAR RNA-bindande protein (TRBP) 34. shRNAs och siRNA har den extra möjlighet att påverka RNA-interferens vägen genom att binda RNAi-proteiner 35 och vissa U1i molekyler har visat sig påverka skarvning och bearbetning av cellulära RNA genom att binda proteiner i U1 snrna-proteinkomplex 36. Medan vissa av dessa effekter kan minimeras genom noggrann design, mätningar av cellulär toxicitet i skärmar för nya anti-HIV-1 RNA-molekyler är användbara i exklusive molekyler med potentiella off-target effekter från vidareutveckling. Dessutom kan off-target effekter indirekt hämma HIV-1-produktion, vilket gör cellulär toxicitet ett viktigt mått i bekräftandet av effekten av nya anti-HIV-1-molekyler som identifierats från HIV-1-produktion skärmar.
analys cellviabiliteten beskrivs i steg 3.1. till 3,4. är en variant av en standardanalys som har använts för att screena skiftande antiviral molekyl s 37. Analysen mäter aktiviteten av NAD (P) H-beroende cellulära enzymer för att reducera MTT-reagens till dess olösliga purpurfärgade formulär, formazan. Protokollet är anpassat från tidigare publicerade metoder 38 och flera kit är tillgängliga med hjälp av MTT eller andra närbesläktade reagens. Även om det är viktigt att analysera cellviabilitet i cellinje som användes för screening av anti-HIV-1 RNA, bör det noteras att olika cellinjer varierar i deras känslighet mot RNA-inducerad toxicitet. Till exempel Reynolds et al. Visade att Dicer substrat siRNA hade ingen effekt på cellviabilitet i HEK293T celler, men betydligt mindre cellviabiliteten i MCF7, DU145 och HeLa S3-celler 39. För den analys som beskrivs häri, är HEK293T celler används som exempel (figur 4); har dock samma analys även gjorts i MCF7-celler för att utvärdera potentiella toxiciteten i en cellinje som är mer känsliga för små RNA-inducerad toxicitet 16.
e_content "> Eftersom anti-HIV-1 RNA kan inte bearbetas och presenteras för det adaptiva immunsystemet, de anses vara mindre immunogena än anti-HIV-1-proteiner eller peptider. Beroende på deras sekvens eller struktur, kan de framkalla medfödda immunsvar, och flera immun sensorer och signalvägar har identifierats som kan svara på små RNA (översikt i 40). i immunaktivering analysen beskrivs här, var nivåerna av fosforylerad PKR och IRF3 jämföras celler transfekterade med små RNA som en indikering av PKR eller TLR3 aktivering, respektive. Båda RNA-sensorer är närvarande i ett brett spektrum av cellinjer och deras aktivering kan leda till produktion av typ 1-interferoner och, i fallet med PKR, ett driftstopp i översättning. för att utvärdera potentialen för anti-HIV-1-RNA för att aktivera produktionen av typ 1-interferoner av alternativa vägar, var nivåerna av interferonstimulerad gen ADAR1 (P150) jämfördes också i celler transfekterade medanti-HIV-1-RNA. Som framgår av effekterna av den långa dsRNA positiv kontroll, Poly I: C, alla dessa svar var aktiva i HEK293T celler (Figur 5) och liknande effekter observerades i MCF7-celler 16. Eftersom dessa svar kunde inhibera HIV-1-produktion i frånvaro av effekter på cellviabilitet, ger immunaktiveringsanalys ytterligare validering för effektiviteten av nya anti-HIV-1-RNA. Ytterligare mätningar som kan läggas till denna utvärdering bland annat mätning av produktionen av inflammatoriska cytokiner och typ 1-interferoner i cellodlingssupernatant och mäta uttrycket av flera interferonstimulerade gener. Eftersom HIV målceller såsom CD4 + T-celler och makrofager kan uttrycka olika nivåer av medfödda immunsensorer, bör kandidater som identifierats från de analyser som beskrivs i detta protokoll också utvärderas för potentiell immunstimulering i dessa celltyper.För alla analyserna beskriverd, är det kritiska steget för att erhålla reproducerbara och exakta resultat framställning av DNA eller RNA transfektion rören (steg 1,3).. Plasmid-DNA eller RNA bör vara av hög renhet med koncentrationer noggrant bestämmas. Det är också viktigt att inkludera lämpliga kontroller. För utvärdering av nya prov RNA expressionsplasmider i virusproduktionen analys är en lämplig negativ kontroll den tomma expressionsplasmiden. För antisense-baserade RNA, bör en ytterligare negativ kontroll plasmid som uttrycker ett icke-målsökande RNA också ingå. Sekvenser för en icke-inriktning ribozym och shRNA som inte påverkar HIV produktion finns i 13. För test siRNA, är den enda negativ kontroll som kan användas ett icke-målsökande RNA och en lämplig icke-målsökande siRNA-sekvensen för det virala produktionen analysen tillhandahålls i 16. För cellviabiliteten och immunaktiveringsanalyser, bör den negativa kontrollen vara celler behandlade med enbart den transfektionsreagens och det är critical att en positiv kontroll, såsom Poly I: C ingår för att bekräfta att cellerna är känsliga för RNA-inducerad toxicitet eller immunaktivering. För RNA-expressionsplasmider, bör den tomma plasmiden också inkluderas för att säkerställa att själva vektorn inte är att ha toxiska effekter på cellerna.
Sammantaget de analyser som beskrivs häri utgör ett bra första steg mot att identifiera säkra och effektiva RNA terapier för användning i HIV-1-genen eller läkemedelsbehandling. För molekyler som riktar HIV-1 RNA, är det också viktigt att tänka på bevarandet av deras målställe i HIV-1 cirkulerande stammar och detaljerade metoder för att beräkna sekvenskonservering har tidigare publicerats 15. För att flytta en molekyl framåt i kliniska prövningar, bör studier långsiktig toxicitet och effektivitet utföras i primära humana celler och i djurmodeller för att bekräfta att identifierade kandidater kommer att vara säkra och effektiva på kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbetet presenteras här stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) (ger DCB-120.266, PPP-133.377 och HBF-348.967 till AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
