Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

anvendelser af Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54487

Abstract

På trods af den regenerative kapacitet skeletmuskulatur, permanente funktionelle og / eller kosmetiske underskud (f.eks volumetrisk muskeltab (VML) fra traumatisk skade, sygdom og forskellige medfødte, genetiske og erhvervede tilstande er ret almindelige. Tissue engineering og regenerativ medicin teknologier har et enormt potentiale til at tilvejebringe en terapeutisk løsning. imidlertid udnyttelse af biologisk relevante dyremodeller i kombination med langsgående vurderinger af relevante funktionelle foranstaltninger er kritisk for udviklingen af ​​forbedrede regenerative terapeutiske midler til behandling af VML-lignende skader. i denne forbindelse en kommerciel muskel vægtstangssystem kan anvendes til at måle længden, spænding, kraft og hastighed parametre i skeletmuskulatur. Vi anvendte dette system, sammen med en stærk, tofaset stimulator, at måle in vivo kraft produktion som respons på aktivering af den forreste crural rum i rotte bagben. Vi har PREVIgere brugt dette udstyr til at vurdere den funktionelle konsekvenser af VML skade på tibialis anterior (TA) muskel, samt omfanget af funktionel genopretning efter behandling af de sårede TA musklen med vores manipuleret væv muskel reparation (TEMR) teknologi. For sådanne undersøgelser, er den venstre fod af en bedøvet rotte forsvarligt forankret til en fodplade forbundet med en servomotor, og den fælles peronealnerve stimuleres af to perkutane nåleelektroder til at fremkalde muskelkontraktion og dorsiflexion af foden. Den peronealnerve stimulation-induceret muskelsammentrækning måles over en vifte af stimulation frekvenser (1-200 Hz), for at sikre en eventuel plateau i kraft produktion, der giver mulighed for en nøjagtig bestemmelse af peak tetanic kraft. Samt vurdering af omfanget af VML skade samt graden af ​​funktionel bedring efter behandling, kan denne metode let anvendes til at studere diverse aspekter af muskel fysiologiske og patofysiologiske. En sådan fremgangsmåde shoULD hjælpe med en mere rationel udvikling af forbedrede lægemidler for muskel reparation og regeneration.

Introduction

Skeletal muscle har en bemærkelsesværdig iboende kapacitet til reparation i respons på skade eller sygdom 1,2. Eksperimentelt robustheden af denne regenerative reaktion er veldokumenteret i dyremodeller ved at studere, fx tidsforløbet for skeletmuskel skader, reparation og regenerering efter anvendelse af myotoxins (f.eks cardiotoxin) 3-7. Mere specifikt efter omfattende cardiotoxin-induceret muskelskader (38-67% af muskelfibre 8), er regenerering medieret af satellit celler, bosat stamceller, der modnes i sidste ende blive funktionelle muskelfibre 4,9-13. Slutresultatet er forøget efter skade funktionel regenerering af sunde, force-producerende muskelvæv 14-16. Selvom detaljerne er godt uden for rammerne af denne rapport, det mekanistiske grundlag for muskel regenerering afspejler de omhyggeligt orkestreret begivenheder talrige celletyper fra flere slægter udnytte canonical signaleringsforløb kritisk for både vævsudvikling og morfogenese 5,17-21. Vigtigt er myotoxin-induceret regenerering aktiveret af, at den ekstracellulære matrix, neuronal innervation og blodkar perfusion forbliver strukturelt intakt efter cardiotoxin-induceret muskelskade 3,8,22. I stærk kontrast, disse centrale vævsstrukturer og komponenter er per definition helt fraværende i forbindelse med VML skade; hvor frank tab af væv på grund af en række årsager, resulterer i vedvarende funktionelle og kosmetiske mangler 23-25.

Uanset de ekstra udfordringer forbundet med muskel reparation og regeneration efter VML skade sammenlignet med myotoxin-induceret muskelskade, forbedret forståelse af det mekanistiske grundlag for skeletmuskulatur regenerering og reparation, i mange forskellige sammenhænge, ​​ville være godt tjent med udnyttelse af biologisk relevante dyremodeller i kombination med langsgående enssessments af relevante funktionelle foranstaltninger. Som omtalt heri, undersøgelser af rotte bagben giver en fremragende model-system til dette formål. Mere specifikt musklerne i den forreste crural rum (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) og hallicus longus (HL)), der er ansvarlige for dorsiflexion af foden, identificeres let og manipuleret. Desuden er de tjent med de store blodkar (iliaca og brancher), og er innerverede af nerver (ischiadicus og grene, herunder Peroneal) kører længden af benet 26-28. Som sådan kan man anvende rotte bagben model til direkte vurdere skeletalmuskelfunktion / patologi in vivo, eller at vurdere mere indirekte virkning af patologi-relaterede ændringer i blodkar eller nerver på tilsvarende skeletmuskel funktion. I begge scenario kan sygdommens alvorlighed, samt behandlingens effektivitet bestemmes som en funktion af muskelkraft produktion (moment) og tilsvarende fod movement 29-34.

Ideelt set er kraftmålinger ledsaget af histologiske undersøgelser og genekspression analyser nøjere vurdere den strukturelle og molekylære status skeletmuskel. Grundlæggende histologi og immunhistokemi, for eksempel, er i stand til at besvare spørgsmål om muskel størrelse, muskelfibrene alignment, ekstracellulær matrix sammensætning, placering af kerner, celleantal, og proteinlokalisering. Genanalyse, til gengæld er nødvendige for at identificere de molekylære mekanismer, der kan påvirke / modulerer løbetiden af ​​muskelfibre, sygdomstilstande og metabolisk aktivitet. Mens disse metoder giver afgørende oplysninger, de generelt repræsenterer terminal endpoints, og vigtigst af alt, de ikke direkte fat på funktionsevne af skeletmuskulatur, og dermed er korrelativ snarere end forårsagende. Men når histologiske undersøgelser og genekspression analyser evalueres i forbindelse med funktionel measures, da mekanismerne i kraft produktion og funktionel regenerering kan mest præcist identificeret.

I denne henseende kan den kraft, som frembringer evner af en muskel kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Alle tre metoder har både fordele og begrænsninger. I et in vitro eksperiment, for eksempel musklen er fuldstændig isoleret og fjernet fra kroppen af dyret. Ved at fjerne de påvirkninger af blodkar og nerver, der forsyner den muskel, kan bestemmes kontraktile evne af vævet i en tæt kontrolleret ydre miljø 35. In situ muskel test tillader musklen, der skal isoleres, som med in vitro præparater imidlertid , innervation og blodforsyning forbliver intakt. Fordelen ved in situ eksperimentelle model er, at det tillader en person muskel, der skal undersøges, mens innervation og blodforsyningen er minimalt forstyrres 36. I beggein vitro og in situ forsøg kan farmakologiske behandlinger anvendes mere direkte uden at skulle redegøre for virkningerne af eventuelle omkringliggende væv eller virkningen af kredsløbssygdomme på de målte kontraktile respons 37. Men in vivo funktion testning, som beskrevet heri, er den mindst invasive teknik til evaluering muskelfunktionen hos dets native miljø 38, og kan udføres gentagne gange over tid (dvs. i længderetningen). Som sådan vil det være omdrejningspunktet for diskussionen nedenfor.

I denne henseende perkutane elektroder indsat nær musklen af ​​interesse, eller den motoriske nerve, der tjener det, tilvejebringe et elektrisk signal til musklen. En transducer måler derefter de resulterende ændringer længde eller kraft i den aktiverede muskler som anvist af en forudbestemt, tilpasset software-protokol. Ud fra disse data kan bestemmes de fysiske egenskaber af musklen. Disse indbefatter force-frekvens, maksimal stivkrampe, force-hastighed, stivhed, længde spændinger og træthed. Muskel længde eller kraft kan også holdes konstant, således at musklen kontrakter isometrisk eller isotonisk. Vigtigt er det, kan disse eksperimentelle protokoller hurtigt udført, let gentaget, og customized- alt imens dyret bedøvet og med et opsving periode på timer til dage. Et enkelt dyr kan undergå in vivo kraft teste flere gange, således at langsgående studier af sygdomsmodeller eller evaluering af terapeutiske platforme / teknologier.

Som beskrevet heri, et kommercielt muskel vægtstangssystem sammen med en stærk, er bi-fase stimulator anvendes til at udføre in vivo muskelfunktion test for at vurdere bidraget af tibialis anterior muskel i rotte bagben til dorsalfleksion af foden via stimulering af den peronealnerve. Vi har udviklet en protokol, der er specielt designet til at evaluere regenerativ medicin / tissue engineering teknologier til muskel reparation efter traumatisk VML skade af rotte TA musklen. Det bør noteres; EDL og HL skal dissekeres ud af den forreste crural cockpittet for at specifikt evaluere TA musklen (de udgør ca. 15-20% af den samlede tibialis anterior drejningsmoment målt efter peronealnerve stimulation (Corona et al., 2013) ). Fordi denne fremgangsmåde indeholder omfattende langsgående analyse af muskel fysiologi / funktion, kan det kaste vigtigt mekanistisk indsigt i en lang række andre typer af fysiologiske undersøgelser samt en bred vifte af sygdom eller terapeutiske områder 39. For eksempel in vivo muskelfunktion test er gældende for studier af motion fysiologi, iskæmi / reperfusion forskning, myopati, nerveskader / neuropati og vasculopati, sarcopeni og muskeldystrofier 40.

Protocol

Alle dyr blev humant behandlede og alle protokoller blev godkendt af University of Virginia IACUC.

1. Klargøring af udstyr

  1. Sørg for, at alle maskiner er tilsluttet korrekt.
  2. Tænd for computeren, efterfulgt af high-power bi-fase stimulator og dual-mode løftestang system.
  3. På dette tidspunkt, skal du placere dyret ind i anæstesi kammer leveres med 2% isofluran, og tænd for varmelegemet, således at platformen er opvarmet til 37 ° C.
  4. Placer elektroderne i 70% ethanol, således at polytetrafluorethylen (PTFE) belagt tips er oversvømmet, og vil blive desinficeret, mens opsætning af enheden og softwaren.
  5. Find og åbn håndtaget kontrolsystem software på skrivebordet.
    BEMÆRK: Dette vil være den nødvendige software til at udføre funktionstest.

2. Software Setup

  1. Når programmet er åbnet (figur 1A), ændre parameterets for øjeblikkelig Stim under menuen Setup til de ønskede værdier.
    BEMÆRK: I denne protokol, alle parametre forbliver på de forudindstillede niveauer med undtagelse af "Run Time (s)", som er ændret til 180 sekunder (figur 1B).
  2. Opret en Autosave mappe under menuen Opsætning.
  3. Find en type-stand vindue mærket "Autosave Base". Indtast navnet på prøven, for eksempel "Rat1-date-tidspunkterne". Direkte til venstre for "Automatisk lagring Base" type-stand vindue, skal du klikke på boksen "Aktiver Automatisk lagring."
  4. På toppen af ​​Control Screen, skal du vælge "Sequencer". Et nyt vindue åbnes. På bunden af ​​det nye vindue, skal du vælge "Åbn Sequence". Et nyt vindue åbnes. Vælg den færdiglavede sekvens, og klik på OK. En protokol liste med sekvens parametre, herunder hyppighed, varighed af stimuli, og hviletid vil udvikle sig i vinduet med navnet: Sequence Editor (figur 1C). Klik på "Load Sequence" -> & #34; Luk vindue ".
  5. For at se real tid strøm og stimulering, skal du vælge "File" -> "live data Monitor". Et nyt vindue åbnes.
  6. I den nye Live-data Window, format skærm til test ved hjælp af autoscale funktionen, eller manuelt indtaste den maksimale og minimale y-værdier vises på skærmen.

3. Animal Set-up

BEMÆRK: Alle kraftmålinger er dem af en 11 uger gamle Lewis rotte. Der er en lineær korrelation mellem muskelmasse og kraft produktion (i newton). Da den alder rotte stiger, bør kraftværdierne produceret af benet stige.

  1. Sørg for, at dyret er i den rette plan anæstesi, før du fjerner den fra anæstesi kammer. Helt fjerne alle hår på den laterale side mellem anklen og bækken den eksperimentelle ben ved hjælp af en elektrisk hårklipper.
    BEMÆRK: Den korrekte plan af anæstesi er opnået, når dyret is ikke responderede på en tå knivspids. Det er nødvendigt at følge de retningslinjer, lagt frem, som hver institution Animal Care og brug Udvalg.
  2. Sende dyret i liggende stilling, sikrer næsen af ​​dyret sidder inde i anæstesi næsekegle så det forbliver på tilstrækkelig dybde af anæstesi.
  3. Regulere positionen af pedalen apparatet ved tre uafhængige knapper (figur 2). Brug af knopperne (A og B) for at justere fodpedalen, placere pedalen apparat ved sin længst til venstre og laveste stilling. Dette vil gøre det muligt korrekt positionering af dyrets fod samtidig give plads til senere manipulationer. I denne position, bruge knop på venstre side af sporet for at flytte apparatet enten mod eller længere væk fra forsøgslederen således at dyret ben ligger i en lige plan.
  4. Rengør ben med tre skift af jod og alkohol. Den jod bør forblive på benet i 30 sek.
  5. Juster dyret eller platform(Figur 2A, D), således at den udvidede ben sikrer fuldstændig kontakt mellem fodsålen og fodpedalen.
  6. Brug af medicinsk tape, fastgøre foden af dyret mod fodpladen (figur 2D). Det er afgørende, at hælen flugter mod bunden af ​​pedalen og hele foden er flad og vil ikke løsne fra pladen under testen.
  7. Find spændemekanismen at stabilisere benet. Skub stabiliserende pin i langt nok til at reducere bevægelse af benet og lås den på plads ved at dreje unbrakonøgle.
  8. I denne position, bruge knop C for at flytte apparatet enten mod eller væk fra forsøgslederen således at anklen, skinneben, og femur ligger i en lige linje (figur 2C). Sørg for, at benet er parallel med fodpedal. Foretag justeringer på banen og fine drejeknapper findes på bagsiden af ​​apparatet, at langsomt bevæge anklen så foden og skinneben er i en 90 ° position.
  9. Continue for at flytte benet så lårben og skinneben er i en 90 graders vinkel vinkelret (figur 2B). På dette tidspunkt, dyret er klar til elektroderne.

4. Anbringelse af elektroderne

  1. Aktiver "Instant Stim" ved at klikke på den orange knap mærket "Instant Stim".
  2. Placer begge elektroder overfladisk på den proksimale ende af tibialis anterior og flytte elektrodespidserne rundt, indtil pigge ses på live monitor. Ideelt set bør piggene være omkring 0,4 N.
    BEMÆRK: Elektroderne skal anbringes i nærheden af ​​og vinkelret på planet af peronealnerve, som igen løber lateralt fra knæet og vinkelret på skinnebenet.
  3. Sæt en nål langt nok til at stikke dermis, og knap i den muskulære lag. Flyt den anden elektrode rundt, indtil pigge ses på live monitor omkring 0,6 N. Indsæt nåle og klemme dem på plads ved hjælp af en hobby klemme eller medicinsk tape.
  4. ENdjust grove og fine justeringer for at finde maksimal kraft output.
  5. På høj effekt tofaset stimulator, vil der være to knapper i midten. Den ene er mærket "RANGE" og den anden "ADJUST". Drej "RANGE" knappen til ønskede maksimale strømstyrke.
    BEMÆRK: Toppene vil langsomt stige i størrelse, og den maksimale strømstyrke bestemmes som det niveau, hvor tre på hinanden følgende stimulationer resultere i identiske kontraktile respons. Modstå dreje strømstyrken højere end nødvendigt; den maksimale strømstyrke vil stimulere hele muskler til at trække sig, men nogen højere strøm vil resultere i rekrutteringen af ​​tilstødende muskler og potentielt antagonister så godt.
  6. Drej "ADJUST" knappen for at indstille den procentdel af "RANGE", der vil blive anvendt til at stimulere musklen. På dette tidspunkt, bør kraft læse omkring 1,0 N. Dette kan kræve en stigning eller et fald i strøm.
  7. Kontrollér elektroderne for at sikre, at de er sikre. StopØjeblikkelig Stim.
  8. På "Live-data", skal du klikke på "Start Sequence".
  9. Fortsæt med at overvåge kurverne ved at gå tilbage til Control-skærm, og klikke på "Analyse" knappen placeret over den orange "Instant Stim" knappen. Den tetanic kurve skal begynde at tage form omkring 60 Hz stimulation.

5. Efterbehandling Stimulering og Clean Up

  1. Efter sekvensen er færdig, skal du fjerne elektroderne og tørre af med 70% alkohol. Placer elektroderne i covers.
  2. Løsn knæet klemme og slukke anæstesi. Fjern dyret fra anæstesi gas og sende dyret i bugleje, stadig på varmepuden. Bevar rotten på 100% O 2 for et par minutter efter, at isofluran gas er blevet slukket for at holde rotten iltet. Dyret kan bevæge sig i første omgang, men ikke sende dyret tilbage tilbage til buret, indtil dyret kommer til bevidsthed. Hvis muskelømhed er bemærketpå nyttiggørelse, bør der gives en dosis af NSAID som angivet af dit dyr pleje udvalg.
  3. Sluk alle af maskinerne i trin 1.2, lukke softwaren, og fortsætte med at dataanalyse.
  4. Tør platformen og fodpedalen ned.

6. Data Analysis

BEMÆRK: Dataanalyse udføres for at passe en sekvens designet af dette laboratorium og ifølge lab protokoller. Analyse værdier, datapunkter af betydning, og andre aspekter af proceduren vil ændre sig afhængigt hensigten med brugeren.

  1. Åbn dataanalyse software.
  2. Klik på højt gennemløb menu til at aktivere analyse af flere datafiler (prøver) på et tidspunkt. Vælg "force Frekvens" Analyse.
  3. Klik på "Pick filer" knappen og åbne så mange gemte datafiler som ønsket.
  4. Vælg "Manual" i Cursor Placement Method kassen.
    BEMÆRK: Dette vil tillade brugeren at analysere alle datet inden for et ønsket tidsstempel, i modsætning til programmet automatisk vælge den analyse placering.
  5. Skift End Cursor tidsstempel til 2. Klik på knappen "Analyser" (Figur 1D).
  6. For at gemme tabellen og analysere data ved hjælp af et regneark, skal du klikke på "Save tabellen til ACSII knappen. Dette vil gemme filen, og den kan åbnes med et regneark på et senere tidspunkt.
  7. Åbn den gemte datafil i regneark.
  8. Opret en ekstra kolonne mærket "Absolute Maximum", og bestemme forskellen mellem baseline og de maksimale værdier for hver prøve. Dette vil give den samlede maksimale kraft produceret ved hver frekvens.
  9. For at bestemme moment, multipliceres hver kraftværdi ved længden af ​​vægtstangsarmen.
    BEMÆRK: I dette tilfælde ville der være repræsenteret af fodlængden af ​​dyret. Denne protokol anvender gennemsnittet eksperimentelt bestemte værdi på 30 mm. Brugeren har nu bestemt værdierne for maremt drejemoment produceret ved hver frekvens.
  10. Plotte disse værdier som en frekvens drejningsmoment kurve, eller, det maksimale drejningsmoment frembragt af dyret på tværs af alle stimulationsfrekvenser.
    BEMÆRK: Denne kan identificeres og bruges som et enkelt sammenligning mellem prøver.

Representative Results

Den tetanic kurve kan bruges til at skelne optimale resultater fra sub-optimale resultater. Denne kurve starter normalt at danne en frekvens på 60 Hz. Den vigtigste faktor for at opnå gode resultater er evnen til at stimulere musklen, så den producerer sin maksimale kraft og fastholder, at kraft i stivkrampe. Den ideelle kurve bør have en uafbrudt, skarp, lodret opsving på tidspunktet for stimulering, efterfulgt af en flad plateaufase med minimale svingninger, og en uafbrudt, skarp lodret fald periode på afslutning af stimulation (figur 4). Afvigelser fra den ideelle kurve er tegn på, at musklen er trætte (figur 5D), eller at musklen ikke bliver ordentligt stimuleret til at producere maksimal kraft (figur 5B - C). Sidstnævnte resulterer generelt fra ukorrekt elektrodeplacering fører til svigt af maksimal rekruttering af muskelfibre under stimulation. Et særkende, der tillader forskeren at afgøre, om et ikke-ideelle kurve er resultatet af ukorrekt elektrodeplacering eller patologiske ændringer til musklen er, om ikke den tetanic kurve er fuldstændig (fusioneret) eller ufuldstændig (ufusionerede). En ikke kondenseret, ufuldstændige tetanic kurve angiver, at elektroderne er malplaceret, hvilket resulterer i musklen ikke oplever en maksimal kontraktion. Et eksempel på en patologisk ændring i musklen kan observeres som nedsat maksimal kontraktion sammenlignet med kontrollen, eller et kontraktilt respons, der hurtigere uniform.

De tre forskellige typer af toppe i løbet af denne procedure repræsenterer forskellige elektrode- og ben positioner, og det kan ses i figur 3. De første toppe vil være omkring 0,4 N og forekommer, når den korrekte elektrodeplacering bestemmes overfladisk på huden (figur 3A). Det andet sæt toppe har higher amplitude, normalt omkring 0.5-0.6N (figur 3B) og forekommer, når elektroderne trænge igennem dermis. Efter disse er opnået, er benet og foden justeres for at maksimere kraft produktion, der opnås, når peak amplitude stiger til ca. 1N eller større (figur 3C). På dette tidspunkt kan Instant Stim slukkes og sekvensen kan begynde. Disse retningslinjer sikre nøjagtige og reproducerbare resultater og er centrale checkpoints i hele protokollen.

De endelige resultater kan være repræsenteret på forskellige måder afhængigt af de oplysninger, som brugeren ekstraheret fra kraft testen og det eksperimentelle design. I denne protokol, er den maksimale kraft, der måles på tværs af alle frekvenserne af stimulation, kan dog andre datapunkter være vigtige for en bestemt forsker eller anvendelse. Et eksempel er frekvensen af ​​stimulation ved hvilken tetanic kurve begynder at tage form. Than data kan sammenlignes med andre resultater fra et tidligere eller senere eksperiment på det samme dyr, eller for sammenligninger mellem forskellige behandlingsgrupper. Kraft produktion kan normaliseres ved kropsmasse at beregne isometrisk kraft, og give en mere objektiv vurdering af virkningen af ​​alder på den maksimale sammentrækning observeret. Selvom dyr af forskellig kropsvægt og alder vil producere forskellige maksimale kræfter, bør formen af ​​tetanic kurven være konsekvent mellem alle grupper, når proceduren er udført korrekt.

figur 1
Figur 1: Oversigt over Lever kontrolsystem og dataanalyse software til analyse (A) Oversigt over kontrol software, når du åbner programmet.. (B) Parametre for "Instant Stim." (C) Eksempel sekvens for kraft-frekvens stimulation. (D Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Kritiske aspekter for Positionering af Rat og placering af foden i apparatet (A) Rotten er i en liggende stilling med venstre fod forsvarligt fastgjort til fodpladen.. De rette vinkler, som foden, ben, og lår er cirklede. (B) den rette vinkel skabt af anklen er fremhævet. (C) Benet bør tilpasses i en lige flyet fra mund til kroppen. (D) Den elektrodeplacering er parallel og vinkelret på planet af peronealnerve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Repræsentative Peaks Demonstration betydningen af korrekt elektrodeplacering til Maximal force Produktion (A) Baseline peak tetaniske reaktioner observeret med elektroder placeret alt for overfladisk.. (B) Større toppe med elektroder indsat i det korrekte sted. (C) Overgang fra større toppe signalerer korrekt elektrodeplacering til optimal pre-sekvens peak amplitude som ben og fod positioner er optimalt justeret./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Optimal tetaniske Curve ved 100 Hz Denne kurve stigninger og fald kraftigt og har et fladt plateau fase. Dette eksempel viser korrekt elektrodeplacering og maksimal kraft stimulation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Repræsentative eksempler på Sub-optimale Tetanic Kurver opnået ved 100 Hz (A) Efter afslapning, denne kurve dips under grundlinjen. Dette er tegn på stimuleringaf antagonister. (B - D) Disse grafer er resultatet af forkert elektrodeplacering og ulige rekruttering af muskelfibre. De plateau faser demonstrerer store svingninger (B), en opadgående hældning (C), eller en nedadgående hældning (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol viser en forholdsvis enkel fremgangsmåde til udførelse af in vivo muskelfunktion test på den forreste crural rum af rotte bagben. Andre former for muskelfunktion test, herunder ex vivo og in situ-protokoller, kan også give vigtige oplysninger om muskel fysiologi. Men betydningen af in vivo funktionstest ligger i sin invasiv karakter, og den kendsgerning, at det mest præcist rekapitulerer endogene mekanismer muskelstimulation. For både ex vivo og in situ test, senen og / eller muskler er udsat for, og derfor skal holdes fugtig eller neddykket 41,42. In vivo-undersøgelse fjerner forstyrrende variabler af traumer og betændelse, der kan være forårsaget af de kirurgiske procedurer, der kræves til in situ muskelfunktion test; dette er især vigtigt, hvis målet om forsøget er at undersøge inflammatoriske og cellulære processer in vivo-forsøg kræver lidt kirurgisk dygtighed som musklen ikke er isoleret fra sine omgivelser og ikke kræver præcise knob at reducere muskel / sene glidning (som det er tilfældet for in situ eller ex vivo-test) 41. Desuden med tilstrækkelig praksis, hastigheden af korrekt elektrodeplacering og evnen til hurtigt at foretage justeringer for at opnå maksimal kraft produktion af musklen vil sikre, at protokollen færdiggørelse er hurtig og reproducible- både inden dyr og på tværs af forskellige brugere af det samme udstyr 39 . Det er gavnligt at begynde med en vurdering af hele forreste crural komponent som illustreret, før udskæring af mindre tilgængelige synergistiske muskler (EDL og HL) for mere direkte undersøgelse af TA musklen. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, kan man forholdsvis hurtigt opnå beherskelse af teknikken. Mens den her beskrevne procedure demonstrerer og understreger nytten af ​​en kraft frequency protokollen til at fremkalde stivkrampe og bestemme den maksimale kraft der produceres af en muskel, skal brugerne bestemme, hvilken type (r) af funktionelle test, der bedst informere deres specifikke eksperiment (r) og forskningsmæssige mål.

Der er flere kritiske trin, der bør omhyggeligt udføres for at sikre optimale og reproducerbare eksperimentelle resultater, det vil sige sammenhængende maksimal kraft produktion af musklen til forskellige stimulationsparametre. Flere af de vigtigste funktioner er skitseret i figur 2. Men korrekt placering og stabilitet af stimulerende elektrode er en absolut forudsætning for reproducerbar maksimal stimulation af peronealnerve. I denne henseende bør elektroderne placeres overfladisk. Det vil sige, hvis elektroden placering er for dybt, risikerer man direkte elektrisk stimulation af antagonistmuskler og dermed formindske størrelsen af ​​den observerede kontraktile respons af den forreste crural rum. Endvidereto elektroder skal placeres så tæt på hinanden som muligt for at reducere den elektriske modstand af den omgivende hud og bindevæv. Generelt elektrode positionering tæt til knæet og medialt til benet direkte opsporing kanten af ​​tibialis anterior, hvor den møder gastrocnemius giver ofte tilstrækkelig produktion kraft. Dette sikrer også, at elektroderne er anbragt tilstødende og vinkelret på planet af den peronealnerve, som igen, er vinkelret på skinneben og sideværts ned i benet fra knæet. Men den naturlige variation i anatomi mellem dyr kræver konstant årvågenhed for at sikre, at elektrode placering er optimeret fra sag til sag. Som sådan er der en vis grad af forsøg og fejl i forbindelse med elektrodeplacering, der er kraftigt formindsket af erfaringerne fra brugeren. Det antal gange elektroderne gennembore huden bør minimeres for at reducere hævelse og inflammation, hvilket nedsætter migasured kraft produktion. Det afhænger af, hvor nålene er oprindeligt placeret, men det anbefales at bevæge nålene to gange eller mindre især i området omkring knæskallen. Endelig, når elektroderne er anbragt i benet af dyret, mindre justeringer kan foretages til placeringen af ​​benet og den afgivne strøm gennem elektroderne. Dette bør ske samtidig overvåge kraft, der frembringes fra en enkelt spjæt. Foruden elektrode placering, kan justeringer også foretages til den spænding leveret over elektroderne. Men i opsætningen her beskrevne, er det vigtigt at være forsigtig, når at øge spændingen som en måde at øge kraft output, fordi den øgede spænding vil stimulere de nerver, der innerverer antagonist muskler.

Der er tre vigtige tekniske bekymringer, der skal overvåges for at sikre, at elektroden placering forbliver optimal. For det første skal foden af ​​bedøvede dyr være solidtforankret til fodpedal apparat, som måler den muskelkraft produktion (figur 2). Hvis foden ikke er sikkert forankret kan den sande kraft frembragt af musklen være ufuldstændigt oversat til krafttransducer. Ustabil fod fiksering introducerer også risikoen for at miste den optimale placering af elektroderne som bevægelse ud over normal muskelsammentrækning (dvs. foden bevæger sig væk fra fodpladen) kan medføre forskydning af elektroderne fra deres overfladiske position eller fordrive dem helt. Enten scenario vil falde den målte kraft. For det andet bør dyrets krop være helt liggende og på linie i en lige plan (figur 2). Korrekt positionering af dyr krop forhindrer små bevægelser af benet på grund af respiration, og også minimerer vridning af benet og bækkenet, muliggør en bedre placering og stadig kontakt af de stimulerende elektroder. Tredje, korrekt placering og forankring af knæet er critical at sikre, at benet forbliver stabil, og således, hjælper med at stabilisere den optimale placering af de stimulerende elektroder for at tillade konsistent aktivering af peronealnerve.

Der er et par yderligere punkter, som bør fremhæves. Først er det kommercielle muskel løftestang system designet til at udføre test på venstre ben, men opsætningen kan modificeres til at udføre test på det højre ben samt. For det andet kan muskel håndtag systemer vælges baseret på størrelsen af ​​dyret, så brugerne skal sikre, at platformen anvendt, er tilstrækkelig til at måle og støtte kraft frembragt af dyremodel for valg. Testbare muskler til udstyret platform er begrænset til dem, der inducerer plantar udvidelse eller dorsiflexion af foden. For det tredje bør det igen understreges, at elektrodeplacering kan være udfordrende og kræver tålmodighed og praksis at mestre teknikken. Elektroder også blevet kedeligt hurtigt med regelmæssig brug, så det er nyttigt at have flere reservedele sETS til, når det bliver svært at punktere huden overfladisk. For det tredje, der er beskrevet i denne rapport protokol anvender specifikke stimulation sekvenser og procedurer dataanalyse. Musklen løftestang styresystem software og data analyse software og data, det giver kan besvare mange andre eksperimentelle spørgsmål og dermed dens anvendelighed strækker sig ud over, hvad der er skitseret heri. Som sådan er brugere opfordres til at udforske ud over grænserne for software-protokol (er) præsenteres i dette dokument. Trods disse mindre begrænsninger, in vivo muskelfunktion test er en kraftfuld metode til at bestemme sundhed og kontraktile evne skeletmuskel, fordi det er minimalt invasiv og kan udføres ved flere lejligheder, over en længere tidsramme på det samme dyr. Kort sagt, denne type af driftsklar nytte gør systemet særligt dygtige til at teste effekten af ​​nye terapier for skeletmuskulatur skade eller sygdom hos rotter bagben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
  2. Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
  3. Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
  5. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
  6. Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
  7. d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
  8. Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
  9. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  10. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  12. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
  13. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
  14. Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
  15. Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
  16. Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
  17. Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
  18. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  19. von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
  20. Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
  21. Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
  22. Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
  23. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
  24. Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
  25. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
  26. Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
  27. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
  28. Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
  29. Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
  30. Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
  31. Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
  32. Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
  33. Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
  34. Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
  35. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
  36. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
  37. Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
  38. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
  39. Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
  40. Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
  41. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
  42. Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
  43. Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).

Tags

Bioengineering , Muskelkraft produktion peronealnerve stimulation tibialis anterior dorsiflexion tissue engineering regenerativ medicin skeletmuskulatur regenerering volumetrisk muskel tab muskelsygdom patologi
anvendelser af<em&gt; In vivo</em&gt; Funktionel Test af Rat tibialis anterior for Evaluering manipuleret væv Skeletal Muscle Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mintz, E. L., Passipieri, J. A.,More

Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter